CN104604774A - 一种大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种利用遗传灭活的精子人工授精，通过静水压力抑制受精卵卵裂的原理，诱导大菱鲆同质雌核发育鱼苗的方法。选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，取上述精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为对照组；取上述剩余精液用预冷的Ringer氏液稀释，用紫外线将精子灭活。取灭活后的精液与卵子按体积比1:10-20比例进行授精；在受精卵第一次卵裂痕出现前10～20min，将受精卵置于静水压机加压容器内，以55～75MPa静水压进行处理6～8min。采用本方法可高效、稳定、可靠地诱导获得100％的大菱鲆同质雌核发育鱼苗。
Description
技术领域
本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法。
背景技术
大菱鲆(Scophthalmus maximus)属于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆属(Scophthalmus)，其生长快，自1992年自欧洲引入之后发展十分迅速，目前已经成为我国北方主要的海水养殖品种，养殖工艺和产业链也相对完善，每年的总产量超过10万吨，形成了颇具规模的产业。但是，近年来大菱鲆养殖业由于累代养殖和近亲交配，造成种质严重退化。因此采取有效方法，对大菱鲆进行遗传改良，获得良种已成当务之急。杂交是进行品种改良最有效的方法之一。通过不同品系的杂交，可以获得性状优良的品种。纯系是进行杂交育种的必需材料，而采用传统的方法获得近交纯系，往往要连续7-8代甚至十几代的近交选育。对于最低性成熟年龄2-3龄的海水养殖鱼类，就需要十几甚至几十多年的时间。由于时间过长，资金花费和养殖技术难度均较大，传统的培育纯系方法往往使人望而却步。雌核发育是单性生殖的一种，用遗传物质灭活的精子，激活卵子受精发育，随后通过抑制第二极体释放或者抑制早期卵裂使其恢复二倍体倍性，分别得到异质雌核发育二倍体及同质雌核发育二倍体，两者子代的遗传物质完全来自雌核，纯化度高，特别是后者的两套染色体几乎完全相同，仅需1-2代就可得到稳定的纯系，从而极大缩短了育种周期。因此，开展大菱鲆同质雌核发育诱导和培育研究，对于大菱鲆良种培育及其养殖业健康可持续发展是非常必要的；同时，也可以为其他鱼类同质雌核发育人工诱导方法的优化提供有益参考。
人工诱导鱼类同质雌核发育首先需要对精液进行灭活，由于大菱鲆精液浓度较低，活力较差，易在灭活过程中死亡，会导致受精率的下降。同时，同质雌核发育常采用静水压抑制卵裂获得，其诱导的成功率主要受处理时刻(处理起始的时间)、处理压力和处理时间(处理延续的时间)三个因素的影响。静水压处理过程中不合适的处理条件会导致受精卵加倍不完全形成非整倍体，或造成受精卵的损伤，也导致同质雌核发育鱼苗成活率下降。以上两点使得人工诱导大菱鲆同质雌核发育鱼苗具有很大的难度。目前，人工诱导同质雌核发育在鱼类中应用还较少。海水鱼类中仅在真鲷、欧鲈、大黄鱼、牙鲆中有过研究，而在大菱鲆中尚未见报道。由于不同鱼种最适的处理条件往往会有很大的差别，利用上述鱼种同质雌核发育诱导条件无法成功进行大菱鲆同质雌核发育二倍体诱导，从而制约了其应用。因此，对大菱鲆同质雌核发育诱导条件进行优化和明确是十分重要的。
发明内容
本发明目的在于提供一种大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法，
1)大菱鲆精液灭活及人工受精：
取精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为对照组；
另取精液用预冷的Ringer氏液稀释5-15倍，用剂量为36,000erg mm-2的紫外线将精子灭活，取灭活后的精液与卵子按体积比1:10-20比例进行授精，作为诱导组；
2)染色体诱导加倍
以对照组受精卵出现第一次卵裂痕的时间作为诱导组受精卵出现第一次卵裂痕的时间，在诱导组第一次卵裂痕出现前10-20min，将步骤1)诱导组受精卵置于静水压机加压容器内，在55-75MPa静水压下进行压力休克处理，处理6～8min后泄压，取出受精卵，置于海水中继续培育。
所述步骤1)中大菱鲆精液和卵子分别为选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，镜检其质量后，待用；其中，精进行镜检，选择精子活力高于IV级的精液；卵进行镜检，选择圆球形，无色透明，油球集中的卵子。
所述对照组为取精液用新鲜海水激活后，迅速与卵子按体积比1:100-200混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，受精后30min内再补加受精卵体积的10-15倍量新鲜海水，作为对照组；
所述诱导组为取精液用预冷的Ringer氏液稀释5-15倍，用剂量为36,000ergmm-2的紫外线将精子灭活，待对照组人工受精15～25min后，灭活后的精液用新鲜海水激活，迅速与卵子按体积比1:10-20比例混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，受精后30min内再补入卵子体积10-15倍量的新鲜海水，作为诱导组。
所述步骤1)中精液紫外灭活时温度保持在0～2℃。所述步骤1)诱导组中精液紫外灭活、灭活精液与卵子进行授精及受精卵早期孵育过程均在黑暗避光处进行。
本发明的优点和积极效果如下：
1.由于大菱鲆精液浓度相对较低，精子活力较差，且人工收集过程中往往不可避免的带入一定的海水，导致精子提前激活，影响其活力。本发明方法在诱导前对精液进行镜检，仅选择精子活力高于IV级的精液进行灭活处理，可保证灭活后精子的活力，避免了人力物力的浪费。
2.鱼类雌核发育精子灭活过程中，通过紫外线照射令精子中的DNA形成嘧啶二聚体，造成精子的遗传失活。自然光的照射可导致光复活，恢复精子的部分遗传活力，形成非整倍体受精卵，无法正常发育。同时，灭活过程中不合适的温度会对精子造成损伤，使其激活卵子的能力下降，降低受精率。以上两点都最终降低了人工诱导雌核发育鱼类的成活率。本发明针对大菱鲆精液浓度相对较低，精子活力较差的特点，对灭活过程的条件严格规范，精子灭活、人工授精及授精后受精卵早期孵育过程均在黑暗避光条件下进行，避免了光照导致精子遗传活力的回复，可保证人工诱导同质雌核发育大菱鲆的纯合度，并提高其成活率。本发明同时明确了大菱鲆精子紫外灭活过程的温度范围，在0-2℃条件下对大菱鲆精子进行紫外灭活，在保证灭活效果的同时也不会降低精子的活力。
3.不同的鱼种中，最适的同质雌核发育二倍体诱导条件往往会有很大的差别，以往国内外报道中，均未涉及大菱鲆同质雌核发育二倍体诱导的相关参数。本发明首次对大菱鲆同质雌核发育二倍体诱导的参数进行筛选优化，在保证处理时刻稳定的基础上，对处理压力强度和处理时间进行了优化，确定了最佳的处理参数范围；并按照本发明的操作过程可快速稳定的，得到大菱鲆同质雌核发育二倍体鱼苗，对于大菱鲆良种培育及其养殖业健康可持续发展具有重要价值。
附图说明
图1A、B、C分别为大菱鲆同质雌核发育诱导组发育情况图，其中A为胚体、B为初孵仔鱼和C为鱼苗。
具体实施方式
本发明是利用遗传灭活的精子与卵子进行人工授精，通过静水压力抑制受精卵卵裂的原理，诱导大菱鲆同质雌核发育鱼苗的方法。通过此方法对目前的海水鱼类同质雌核发育人工诱导方法进行了优化，可更加准确的确定诱导的处理时刻，提高了诱导的稳定性，能够得到高成活率的大菱鲆同质雌核发育鱼苗，为生产和进一步的实验研究提供了材料和技术支持。
下面结合实施例详述本发明。
实施例1
本实施例受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期所用海水温度为恒定的适宜大菱鲆卵受精及孵化的水温，即受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期海水温度均为14.5±0.1℃。
1)配子的采集
选取处于产卵产精盛期待产的亲鱼轻轻平放在软垫上，拭去其体表及生殖孔周围的水和污物，然后自后向前缓缓挤压，精卵分别挤入烧杯或者盆中备用。解剖镜下观察其卵呈圆球形，透明、油球集中、卵径适中、大小均一；其精液呈乳白色，浓度适宜，显微镜下加适量海水激活后精子活力为IV级、游动时间长。
2)人工受精
对照组人工受精：
取0.1mL精液，用少许海水激活后，迅速倒入10mL卵中，轻轻搅动使其混匀。再补充约10mL海水，受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约50mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约100mL同温新鲜海水。
诱导组精子紫外灭活：
取同批采集的精液用预冷至2℃的Ringer氏液稀释10倍，用剂量为36,000erg mm-2的紫外线将精子灭活，灭活在黑暗避光条件下进行。
诱导组人工受精：
在对照组人工受精25min后，取15mL灭活的精液，用少许海水激活后，迅速倒入150mL同批采集的卵中，轻轻搅动使其混匀。再补充约150mL海水，受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约800mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约1500mL同温新鲜海水。人工授精以及受精卵早期孵育过程均在黑暗避光条件下进行。
3)处理时刻的确定
人工受精后，用解剖镜随时观察对照组及诱导组的受精卵发育情况。发现对照组受精后103min时，受精卵刚刚开始出现第一次卵裂痕，记录为诱导组的第一次卵裂痕时间，
此时诱导组的处理时刻为第一次卵裂痕出现前20min，即受精后83min。
4)大菱鲆同质雌核发育的诱导
在处理前1min(受精后82min)左右时，将大菱鲆受精卵连海水转移至静水压机加压容器内，即将达到处理时刻时迅速将压力升至55MPa，处理8min后泄压，取出受精卵，置于同温海水中继续培育。
5)受精率、孵化率的计算
受精率为发育到囊胚期卵数占全部上浮卵数的百分数；孵化率为初孵仔鱼数占全部上浮卵数的百分数。
本实施例中，诱导组共获得初孵仔鱼约4800尾，受精率为70.2％，孵化率为4.3％。
实施例2
本实施例受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期所用海水温度为恒定的适宜大菱鲆卵受精及孵化的水温，即受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期海水温度均为15.0±0.1℃。
1)配子的采集
选取处于产卵产精盛期待产的亲鱼轻轻平放在软垫上，拭去其体表及生殖孔周围的水和污物，然后自后向前缓缓挤压，精卵分别挤入烧杯或者盆中备用。解剖镜下观察其卵呈圆球形、透明、油球集中、卵径适中、大小均一；其精液呈乳白色，浓度适宜，显微镜下加适量海水激活后精子活力为V级(加少许海水激活后精子游动迅速，无法看清运动轨迹)、游动时间长。
2)人工受精
对照组人工受精：
取0.1mL精液，用少许海水激活后，迅速倒入15mL卵中，轻轻搅动使其混匀，再补充约30mL海水。受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约100mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约200mL同温新鲜海水。
诱导组精子紫外灭活：
取同批采集的精液用预冷至1℃的Ringer氏液稀释5倍，用剂量为36,000erg mm-2的紫外线将精子灭活，灭活在黑暗避光条件下进行。
诱导组人工受精：
在对照组人工受精20min后，取灭活的精液，用少许海水激活后，迅速倒入与对照组同批采集的卵中进行受精、洗卵和孵育方法同对照组，精卵比例为1:15。人工授精以及受精卵早期孵育过程均在黑暗避光条件下进行。
3)处理时刻的确定
人工受精后，用解剖镜随时观察对照组及诱导组的受精卵发育情况。发现对照组受精后95min时，受精卵刚刚开始出现第一次卵裂痕，记录为第一次卵裂时间，
此时诱导组的处理时刻为第一次卵裂痕出现前15min，即受精后80min。
4)大菱鲆同质雌核发育的诱导
在处理前1min(受精后79min)左右时，将大菱鲆受精卵连海水转移至静水压机加压容器内，即将达到处理时刻时迅速将压力升至65MPa，处理7min后泄压，取出受精卵，置于同温海水中继续培育。
5)受精率、孵化率的计算及倍性鉴定
受精率为发育到囊胚期卵数占全部上浮卵数的百分数；孵化率为初孵仔鱼数占全部上浮卵数的百分数。
本实施例中，诱导组共获得初孵仔鱼约5070尾，受精率为84.0％，孵化率为3.3％。
实施例3
本实施例受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期所用海水温度为恒定的适宜大菱鲆卵受精及孵化的水温，即受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期海水温度均为15.5±0.1℃。
1)配子的采集
选取处于产卵产精盛期待产的亲鱼轻轻平放在软垫上，拭去其体表及生殖孔周围的水和污物，然后自后向前缓缓挤压，精卵分别挤入烧杯或者盆中备用。解剖镜下观察其卵呈圆球形、透明、油球集中、卵径适中、大小均一；其精液呈乳白色，浓度适宜，显微镜下加适量海水激活后精子活力为IV级、游动时间长。
2)人工受精
对照组人工受精：
取0.15mL精液，用少许海水激活后，迅速倒入30mL卵中，轻轻搅动使其混匀。再补充约120mL海水，受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约300mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约400mL同温新鲜海水。
诱导组精子紫外灭活：
取同批采集的精液用预冷至0℃的Ringer氏液稀释15倍，用剂量为36,000erg mm-2的紫外线将精子灭活，灭活在黑暗避光条件下进行。
诱导组人工受精：
在对照组人工受精15min后，取灭活的精液，用少许海水激活后，迅速倒入与对照组同批采集的卵中进行受精、洗卵和孵育方法同对照组，精卵比例为1:20。人工授精以及受精卵早期孵育过程均在黑暗避光条件下进行。
3)处理时刻的确定
人工受精后，用解剖镜随时观察对照组及诱导组的受精卵发育情况。发现对照组受精后88min时，受精卵刚刚开始出现第一次卵裂痕，记录为第一次卵裂时间。
此时诱导组处理时刻为第一次卵裂痕出现前10min，即受精后78min。
4)大菱鲆同质雌核发育的诱导
在处理前1min(受精后77min)左右时，将大菱鲆受精卵连海水转移至静水压机加压容器内，即将达到处理时刻时迅速将压力升至75MPa，处理6min后泄压，取出受精卵，置于同温海水中继续培育。
5)受精率、孵化率的计算及倍性鉴定
受精率为发育到囊胚期卵数占全部上浮卵数的百分数；孵化率为初孵仔鱼数占全部上浮卵数的百分数。
本实施例中，诱导组共获得初孵仔鱼约9800尾，受精率为83.6％，孵化率为2.6％。
由上述结果表明，本发明操作过程简单快速，结果稳定、重复性好，可用于大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导生产。
Claims (5)
1.一种大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于：
1)大菱鲆精液灭活及人工受精：
取精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为对照组；
另取精液用预冷的Ringer氏液稀释5-15倍，用剂量为36,000erg mm-2的紫外线将精子灭活，取灭活后的精液与卵子按体积比1:10-20比例进行授精，作为诱导组；
2)染色体诱导加倍
以对照组受精卵出现第一次卵裂痕的时间作为诱导组受精卵出现第一次卵裂痕的时间，在诱导组第一次卵裂痕出现前10-20min，将步骤1)诱导组受精卵置于静水压机加压容器内，在55-75MPa静水压下进行压力休克处理，处理6～8min后泄压，取出受精卵，置于海水中继续培育。
2.按权利要求1所述的大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于：所述步骤1)中大菱鲆精液和卵子分别为选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，镜检其质量后，待用；
其中，精进行镜检，选择精子活力高于IV级的精液；卵进行镜检，选择圆球形，无色透明，油球集中的卵子。
3.按权利要求1所述的大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于：
所述对照组为取精液用新鲜海水激活后，迅速与卵子按体积比1:100-200混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，受精后30min内再补加受精卵体积的10-15倍量新鲜海水，作为对照组；
所述诱导组为取精液用预冷的Ringer氏液稀释5-15倍，用剂量为36,000ergmm-2的紫外线将精子灭活，待对照组人工受精15～25min后，灭活后的精液用新鲜海水激活，迅速与卵子按体积比1:10-20比例混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，受精后30min内再补入卵子体积10-15倍量的新鲜海水，作为诱导组。
4.按权利要求1所述的大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于：
所述步骤1)中精液紫外灭活时温度保持在0～2℃。
5.按权利要求1所述的大菱鲆同质雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于：
所述步骤1)诱导组中精液紫外灭活、灭活精液与卵子进行授精及受精卵早期孵育过程均在黑暗避光处进行。
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