CN105230533B - 一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牙鲆雄核发育的诱导及检测方法。本发明的有益效果为：本发明提供的诱导及检测方法，只需对受精卵进行一定时间的冷休克处理，即可使卵内核遗传物质失活，达到与传统的雄核发育诱导技术中射线照射灭活相同的效果，并结合静水压处理，可快速的制备牙鲆雄核发育双单倍体。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法。
背景技术
牙鲆(Paralichthys olivaceus)，隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲽形目(Pleuronectiformes)，鲽亚目(Pleuronectoidei)，牙鲆科(Paralichthyidae)，牙鲆属(Paralichthys)，为暖温性底层凶猛海鱼，个体大的可达800mm以上，它具有个体大、肉质细嫩、脂满味美、易消化等特点，同时牙鲆又具有生长快、繁殖能力强、洄游性小、回归性强的特点，是中国、日本等国重要的海水增养殖鱼类。
牙鲆雌雄个体生长速度差异显著，在生产中，养殖全雌牙鲆比养殖普通牙鲆能大幅度提高了养殖产量，产生更大的经济效益。通过人工诱导雌核发育技术，能在短时间内生产全雌牙鲆并应用于养殖生产中。
雌核发育技术虽然能快速实现牙鲆的全雌化，但雌核发育的后代仅具有母本的遗传信息，这就在无形中排除了父本遗传信息的作用。在杂交一代中，某些性状的父本效应要高于母本效应，因此，有效的将父本的优良性状传递到杂交子代中对最大限度的利用杂交优势具有不可忽视的作用。
传统的雄核发育诱导技术，需要对未受精的卵子进行灭活处理。灭活通常是利用伽马射线、X射线或者紫外线照射来进行。虽然这些照射能有效的将卵子的遗传物质灭活，但需要特定照射源，特别是伽马射线、X射线，除照射源外，另需特定的安全防护装备以确保安全性。另外，所有的照射方法都需要卵子保护液来保护照射中的卵子的受精能力。综上所述，利用照射灭活方法进行鱼类的雄核发育诱导不太具有便利性。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，本发明所建立的方法，只需对受精卵进行一定时间的冷休克处理，即可使卵内核遗传物质失活，达到和射线照射灭活相同的效果。
本发明所采用的技术方案为：一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，包括以下步骤：
1)精子和卵子的采集：采集新鲜的牙鲆雄鱼精子和牙鲆雌鱼卵子；
2)人工授精：用林格氏液对所述精子进行稀释，得到精子稀释液，将所述精子稀释液和卵子进行混合，搅拌均匀后，向其中加入海水进行激活，得到经海水激活的精卵混合物；
3)冷休克处理诱导雄核发育单倍体：将经海水激活的精卵混合物转移至0-3℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理后，转移至孵化缸内；
4)诱导双单倍体：从孵化缸中选取上浮鱼卵，将所述上浮鱼卵转移至加压容器中，加压至600-700kg/cm2，持续5-8分钟，缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
5)仔鱼倍性鉴定：对步骤3)和步骤4)中孵化得到的仔鱼分别进行倍性鉴定。
林格氏液又被称为Ringer’s液，一种与哺乳动物的血液和淋巴大致等渗的盐溶液，Ringer’s溶液被广泛应用于组织、细胞和一些低等动物培养或保存。本发明中，林格氏液为海水鱼用林格氏液。
本发明中，经过冷休克处理后的受精卵会被诱导为雄核单倍体，所述雄核单倍体在高静水压的环境下会被诱导为双单倍体，本发明操作简单，方便快捷，对比传统的雄核发育诱导技术，具有明显优势。
优选的，所述诱导及检测方法中，步骤5)仔鱼倍性鉴定的评判标准为：对步骤3)中转移至孵化缸中孵化所得到的仔鱼用流式细胞仪进行倍性检测，检测结果中的单倍体，即为雄核发育单倍体；对步骤4)孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的二倍体，即为雄核发育双单倍体。
优选的，所述诱导及检测方法还包括：6)微卫星检测：使用微卫星引物对步骤3)得到的雄核发育单倍体进行父本遗传检测；使用微卫星引物对步骤4)得到的雄核发育双单倍体进行纯合性检验。
上述鉴定和微卫星检测，方便统计出最终诱导成功的结果和比例，对操作流程及参数做进一步优化。
优选的，步骤1)中在采集雄鱼精子和雌鱼卵子后，避光保存，并在解剖镜和显微镜下对精子和卵子进行筛选。在筛选过程中，选取透明、饱满、大小均一的卵子和游动时间长的精子，也就是说，选取从生物学的角度上说，繁殖力强的精子和卵子。
优选的，步骤2)中所述林格氏液与精子的体积比为1:30-1:50，且所述精子稀释液和卵子的体积比为1:10-1:30；加入的海水温度为15-19℃。
优选的，步骤3)经海水激活的精卵混合物在10秒内转移至0-3℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理的时间为15-60分钟。
优选的，步骤4)中孵化缸中的培育温度为15-19℃，培育45-71分钟后，进行洗卵，并选取上浮鱼卵。经过数据分析，在实验室条件下，上述配比得到的效果较好。
进一步的，步骤4)中所述上浮鱼卵转移至静水压机进行加压，并在30秒内达到所需压力，持续5-8分钟缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
优选的，步骤5)中在对仔鱼裂解后，使用DAPI染色后，再进行倍性鉴定。
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。使用所述DAPI对DNA进行染色，再用激光激发检测荧光含量，便可得出DNA的相对含量，从而得知倍性。
优选的，步骤6)中微卫星检验使用的微卫星引物为：Poli1359TUF、HLJYP38、Poli1446TUF、BDHYP181。
雄核发育单倍体父本遗传检测使用微卫星引物Poli1359TUF和微卫星引物HLJYP38；雄核发育双单倍体纯合性检验使用微卫星引物Poli1446TUF和微卫星引物BDHYP181。
其中，微卫星引物Poli1359TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：1所示；R：如SEQ ID NO：2所示；
微卫星引物HLJYP38的序列为：
F：如SEQ ID NO：3所示；R：如SEQ ID NO：4所示；
微卫星引物Poli1446TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：5所示；R：如SEQ ID NO：6所示；
微卫星引物BDHYP181的序列为：
F：如SEQ ID NO：7所示；R：如SEQ ID NO：8所示。
上述微卫星检验属于现有技术，本行业技术人员可以轻易得到，在此就不再赘述。
本发明的有益效果为：
1、本发明运用雄核发育的方法，可以有效的固定父本的优良遗传性状，并快速的给予纯化用于杂交种的制备，可最大限度的发挥杂种优势。
2、本发明提供的雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，只需对受精卵进行一定时间的冷休克处理，即可使卵内核遗传物质失活，达到和传统的雄核发育诱导技术中射线照射灭活相同的效果。
3、传统的雄核发育诱导及检测方法在对卵子进行照射时，需要使用特定的保护液来保护卵子的受精能力。不同鱼类的卵子需要不同的保护液，因此针对特定的鱼，需要进行不同保护液保护效果的实验，费时费力。本发明所建立的方法，只需将卵子和精子进行正常的受精，无需事先进行照射，同时也免除了保护液的使用。
4、本发明首次利用冷休克结合静水压的方法，成功诱导了牙鲆的雄核发育双单倍体。在本发明中，对相关参数进行了优化，在确保成功率的基础上，对冷休克持续时间进行了优化，确定了最佳的参数范围。按照本发明所建立的方法及参数，可快速的诱导获得牙鲆的雄核发育双单倍体。
附图说明
图1是实施例3中雄核发育单倍体的倍性检测图；
图2是实施例3中雄核发育双单倍体的倍性检测图；
图3是实施例3中雄核发育单倍体在微卫星Poli1359TUF位点的父本遗传微卫星鉴定图；♀：母本；♂：父本；h1-8：单倍体；d1-5：正常受精二倍体；
图4是实施例3中雄核发育单倍体在微卫星HLJYP38位点的父本遗传微卫星鉴定图；♀：母本；♂：父本；h1-8：单倍体；d1-5：正常受精二倍体；
图5是实施例3中雄核发育双单倍体在微卫星Poli1446TUF位点的纯合性鉴定图。♂：父本；1-8：双单倍体子代；
图6是实施例3中雄核发育双单倍体在微卫星BDHYP181位点的纯合性鉴定图。♂：父本；1-8：双单倍体子代。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步描述。
实施例1
一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，包括以下步骤：
1)精子和卵子的采集和筛选：采集新鲜的牙鲆雄鱼精子和牙鲆雌鱼卵子，在采集雄鱼精子和雌鱼卵子后，避光保存，并在解剖镜和显微镜下对卵子和精子进行筛选，在筛选过程中，选取透明、饱满、大小均一的卵子和游动时间长的精子；
2)人工授精：用林格氏液对所述精子进行稀释，所述林格氏液与精子的体积比为1：30，得到精子稀释液，将所述精子稀释液和卵子进行混合，所述精子稀释液和卵子的体积比为1:10，搅拌均匀后，向其中加入海水进行激活，海水温度为15℃，得到经海水激活的精卵混合物；
3)冷休克处理诱导雄核发育单倍体：经海水激活的精卵混合物在10秒内转移至3℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理的时间为60分钟，冷休克处理后，转移至孵化缸内流水孵化；
4)诱导双单倍体：孵化缸中的培育温度为15℃，培育71分钟后，进行洗卵，从孵化缸中选取上浮鱼卵，将所述上浮鱼卵转移至静水压机进行加压，并在30秒内达到600kg/cm2，持续8分钟后，缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
5)仔鱼倍性鉴定：对步骤3)中转移至孵化缸中孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的单倍体，即为雄核发育单倍体；对步骤4)孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的二倍体，即为雄核发育双单倍体。
6)微卫星检测：使用微卫星引物对步骤3)得到的雄核发育单倍体进行父本遗传检测；使用微卫星引物对步骤4)得到的雄核发育双单倍体进行纯合性检验；使用的微卫星引物为：Poli1359TUF、HLJYP38、Poli1446TUF、BDHYP181。
雄核发育单倍体父本遗传检测使用微卫星引物Poli1359TUF和微卫星引物HLJYP38；雄核发育双单倍体纯合性检验使用微卫星引物Poli1446TUF和微卫星引物BDHYP181。
其中，微卫星引物Poli1359TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：1所示；R：如SEQ ID NO：2所示；
微卫星引物HLJYP38的序列为：
F：如SEQ ID NO：3所示；R：如SEQ ID NO：4所示；
微卫星引物Poli1446TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：5所示；R：如SEQ ID NO：6所示；
微卫星引物BDHYP181的序列为：
F：如SEQ ID NO：7所示；R：如SEQ ID NO：8所示。
本实施例中，冷休克处理组的受精率为69.10％，孵化率为51.69％，单倍体诱导率为2.17％。冷休克加静水压组的受精率为58.63％，孵化率为23.22％，双单倍体诱导率为0.81％。
受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
孵化率为孵化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；
单倍体诱导率为单倍体仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；
双单倍体诱导率为开口期二倍体仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
实施例2
一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，包括以下步骤：
1)精子和卵子的采集和筛选：采集新鲜的牙鲆雄鱼精子和牙鲆雌鱼卵子，在采集雄鱼精子和雌鱼卵子后，避光保存，并在解剖镜和显微镜下对卵子和精子进行筛选，在筛选过程中，选取透明、饱满、大小均一的卵子和游动时间长的精子；
2)人工授精：用林格氏液对所述精子进行稀释，所述林格氏液与精子的体积比为1：50，得到精子稀释液，将所述精子稀释液和卵子进行混合，所述精子稀释液和卵子的体积比为1:30，搅拌均匀后，向其中加入海水进行激活，海水温度为17℃，得到经海水激活的精卵混合物；
3)冷休克处理诱导雄核发育单倍体：经海水激活的精卵混合物在10秒内转移至0℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理的时间为15分钟，冷休克处理后，转移至孵化缸内流水孵化；
4)诱导双单倍体：孵化缸中的培育温度为17℃，培育59分钟后，进行洗卵，从孵化缸中选取上浮鱼卵，将所述上浮鱼卵转移至静水压机进行加压，并在30秒内达到650kg/cm2，持续6分钟后，缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
5)仔鱼倍性鉴定：对步骤3)中转移至孵化缸中孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的单倍体，即为雄核发育单倍体；对步骤4)孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的二倍体，即为雄核发育双单倍体。
6)微卫星检测：使用微卫星引物对步骤3)得到的雄核发育单倍体进行父本遗传检测；使用微卫星引物对步骤4)得到的雄核发育双单倍体进行纯合性检验；使用的微卫星引物为：Poli1359TUF、HLJYP38、Poli1446TUF、BDHYP181。雄核发育单倍体父本遗传检测使用微卫星引物Poli1359TUF和微卫星引物HLJYP38；雄核发育双单倍体纯合性检验使用微卫星引物Poli1446TUF和微卫星引物BDHYP181。
其中，微卫星引物Poli1359TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：1所示；R：如SEQ ID NO：2所示；
微卫星引物HLJYP38的序列为：
F：如SEQ ID NO：3所示；R：如SEQ ID NO：4所示；
微卫星引物Poli1446TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：5所示；R：如SEQ ID NO：6所示；
微卫星引物BDHYP181的序列为：
F：如SEQ ID NO：7所示；R：如SEQ ID NO：8所示。
本实施例中，冷休克处理组的受精率为39.13％，孵化率为31.40％，单倍体诱导率为10.63％。冷休克加静水压组的受精率为32.30％，孵化率为23.96％，双单倍体诱导率为1.11％。
其中：受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
孵化率为孵化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；
单倍体诱导率为单倍体仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；
双单倍体诱导率为开口期二倍体仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
实施例3
一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，包括以下步骤：
1)精子和卵子的采集和筛选：采集新鲜的牙鲆雄鱼精子和牙鲆雌鱼卵子，在采集雄鱼精子和雌鱼卵子后，避光保存，并在解剖镜和显微镜下对卵子和精子进行筛选，在筛选过程中，选取透明、饱满、大小均一的卵子和游动时间长的精子；
2)人工授精：用林格氏液对所述精子进行稀释，所述林格氏液与精子的体积比为1：40，得到精子稀释液，将所述精子稀释液和卵子进行混合，所述精子稀释液和卵子的体积比为1:20，搅拌均匀后，向其中加入海水进行激活，海水温度为19℃，得到经海水激活的精卵混合物；
3)冷休克处理诱导雄核发育单倍体：经海水激活的精卵混合物在10秒内转移至1℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理的时间为30分钟，冷休克处理后，转移至孵化缸内流水孵化；
4)诱导双单倍体：孵化缸中的培育温度为19℃，培育45分钟后，进行洗卵，从孵化缸中选取上浮鱼卵，将所述上浮鱼卵转移至静水压机进行加压，并在30秒内达到700kg/cm2，持续5分钟后，缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
5)仔鱼倍性鉴定：对步骤3)中转移至孵化缸中孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的单倍体，即为雄核发育单倍体；对步骤4)孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的二倍体，即为雄核发育双单倍体。
6)微卫星检测：使用微卫星引物对步骤3)得到的雄核发育单倍体进行父本遗传检测；使用微卫星引物对步骤4)得到的雄核发育双单倍体进行纯合性检验；使用的微卫星引物为：Poli1359TUF、HLJYP38、Poli1446TUF、BDHYP181。雄核发育单倍体父本遗传检测使用微卫星引物Poli1359TUF和微卫星引物HLJYP38；雄核发育双单倍体纯合性检验使用微卫星引物Poli1446TUF和微卫星引物BDHYP181。
其中，微卫星引物Poli1359TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：1所示；R：如SEQ ID NO：2所示；
微卫星引物HLJYP38的序列为：
F：如SEQ ID NO：3所示；R：如SEQ ID NO：4所示；
微卫星引物Poli1446TUF的序列为：
F：如SEQ ID NO：5所示；R：如SEQ ID NO：6所示；
微卫星引物BDHYP181的序列为：
F：如SEQ ID NO：7所示；R：如SEQ ID NO：8所示。
本实施例中，冷休克处理组的受精率为32.11％，孵化率为27.45％，单倍体诱导率为0.83％。冷休克加静水压组的受精率为26.12％，孵化率为18.76％，双单倍体诱导率为0.37％。
受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
孵化率为孵化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；
单倍体诱导率为单倍体仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；
双单倍体诱导率为开口期二倍体仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)精子和卵子的采集：采集新鲜的牙鲆雄鱼精子和牙鲆雌鱼卵子；
2)人工授精：用林格氏液对所述精子进行稀释，得到精子稀释液，将所述精子稀释液和卵子进行混合，搅拌均匀后，向其中加入海水进行激活，得到经海水激活的精卵混合物；
3)冷休克处理诱导雄核发育单倍体：将经海水激活的精卵混合物转移至0-3℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理后，转移至孵化缸内；
4)诱导双单倍体：从孵化缸中选取上浮鱼卵，将所述上浮鱼卵转移至加压容器中，加压至600-700kg/cm2，持续5-8分钟，缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体；
5)仔鱼倍性鉴定：对步骤3)和步骤4)中孵化得到的仔鱼分别进行倍性鉴定。
2.根据权利要求1所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤5)仔鱼倍性鉴定的评判标准为：对步骤3)中转移至孵化缸中孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的单倍体，即为雄核发育单倍体；对步骤4)孵化所得到的仔鱼，进行倍性检测，检测结果中的二倍体，即为雄核发育双单倍体。
3.根据权利要求1或2所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，还包括：6)微卫星检测：使用微卫星引物对步骤3)得到的雄核发育单倍体进行父本遗传检测；使用微卫星引物对步骤4)得到的雄核发育双单倍体进行纯合性检测。
4.根据权利要求3所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤1)中在采集雄鱼精子和雌鱼卵子后，避光保存，并在解剖镜和显微镜下对精子和卵子进行筛选。
5.根据权利要求3所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤2)中所述林格氏液与精子的体积比为1：30-50，且所述精子稀释液和卵子的体积比为1:10-30；加入的海水温度为15-19℃。
6.根据权利要求3所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤3)经海水激活的精卵混合物在10秒内转移至0-3℃的海水中进行冷休克处理，冷休克处理的时间为15-60分钟。
7.根据权利要求3所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤4)中孵化缸中的培育温度为15-19℃，培育45-71分钟后，进行洗卵，并选取上浮鱼卵。
8.根据权利要求7所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤4)中所述上浮鱼卵转移至静水压机进行加压，并在30秒内达到所需压力，持续5-8分钟缓慢泄压后，将所述上浮鱼卵转移至孵化箱内流水孵化；即可得到含有雄核发育双单倍体个体的牙鲆群体。
9.根据权利要求3所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤5)中在对仔鱼裂解后，使用DAPI染色后，再进行倍性鉴定。
10.根据权利要求3所述的牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法，其特征在于，步骤6)中微卫星检测使用的微卫星引物为：Poli1359TUF、HLJYP38、Poli1446TUF、BDHYP181。
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