CN107205371A - 提高哺乳动物精子质量的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提高精细胞的受精能力的方法和装置。该方法包括采用非相干红光照射所述精细胞,根据包括特定持续时间的两个照射周期的至少一个序列的模式,采用非相干红光以不连续的方式进行照射,所述特定持续时间的两个照射周期由特定持续时间的中间黑暗周期间隔开。照射和黑暗的每个所述特定周期持续8至15分钟。该装置配置用于实施该方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于处理哺乳动物精液的方法,该方法不基于化学试剂,且其目的是通过但不限制于激活所述精液中包含的精子的运动力来增加精液的生育力,提高它们对应激的抗性,并在总体上提高精子成活力。
该方法基于将装有精液的容器暴露于电磁(可见光)辐射中进行处理。在等温环境中,将处理条件优化为特定的波长、时间和剂量值。
本发明属于哺乳动物的辅助生殖技术领域。
本发明包括一种在授精之前的步骤中使用的所有暴露变量经过验证和优化的方法以及设计用于在容器、插管、注射器、试管或类似系统中实施该方法的设备。
背景技术
精子成活力、活力和运动力描述了能顺利朝向卵子移动的精子功能。这些因素与精子质量直接相关,且在实现受精时比总精子数量更具有决定性。运动力不足的或不合适的精子不能到达卵子,这样不能自然受精。
精子迁移通过雌性生殖道(内部受精)或在合成液体中(体外受精)到达卵子的是成功受精的关键。另一方面,精子的运动力也是穿过卵子周围的细胞外基质所必需的。
精子运动力通过特定的生理变化激活,这些生理变化从一个物种到另一物种会有所不同。这些变化包括,例如,pH、钙离子浓度和特定配体(例如环腺苷磷酸)的改变。
不采用技术干预,活力低、不能动的精子或具有异常运动力的精子不会使卵子受精,这是生育力低或不育的一个主要原因。
在人工授精方法中,将精液悬浮液引入雌性生殖道。在人类不育治疗的范围内,那些具有运动力的精子进行预先获能和选择,然后将具有运动力的精子直接引入子宫中。
无论待处理的哺乳动物精子的类型如何,本专利的目的是采用基于暴露于特定条件的可见光的非化学处理来增加精子的运动力。
目前,存在不同实验室方案用于制备精液悬浮液、进行精子获能,且如果适用的话,选择具有合适运动力的细胞。一般而言,在特定的离子、营养浓度和特定的pH下制备这些悬浮液。
专利US 5,453,354公开了激活精子运动力的蛋白质性质的大分子以及通过从细胞外液中纯化大分子制备该大分子的相应方法。
专利US 7,780,230提供了包含从非洲爪蟾卵(Xenopus laevis)中纯化的细胞质提取物的组合物,其能够支持人类精子的活化和人类精子基因组的完全复制。
专利US 6,309,815提供了用于延长不能游动的精子的成活力的方法和组合物。该方法包括收集精子并采用储存缓冲溶液处理精子以大体上抑制精子的运动力,然后将精液在特定温度下储存一段时间,最后通过将抑制的精子与激活缓冲液混合以再激活精子至正常运动力。
另一方面,在2005年公开了公羊和鱼(罗非鱼)的精子对不同类型的光的反应[1],根据精子的类型和光的类型检测不同类型的反应。得出的结论是:哺乳动物(公羊)的精液的体外处理必须在没有光或在红光下进行,其中检测到运动力的轻微增加。
分析精子对一般可见光(整个光谱)的反应和所涉及的可能的细胞机制的研究[2]最近已经公开。该论文得出结论:短时间的光照射引起运动力的显著提高,但没有说明可见光谱(其指的是整个光谱)的具体范围或能量的具体数量。
采用特定波长激活哺乳动物精子运动力的第一种方法分别采用狗精液[3,4]和水牛精液[5]在655nm和532nm下进行。在第一个案例中,报道了光的类型和剂量与运动力之间的比例关系,在第二个案例中,验证了采用激光系统暴露的明确条件。该近期论文表明了采用激光作为原位改善精液质量以优化人工授精条件的技术的可能性。
虽然有证据表明光疗法可能适用于哺乳动物的人工授精疗法,但大部分研究至多对精液悬浮液的进行研究,且仅证实运动力的某些有限的增加,而没有评估用于确定精液质量的其它重要参数是否受到影响,以及它们是否实际上转化为现场试验中妊娠概率的增加或应当在现实条件的设备水平下应用的方法。
专利US 6379939描述了一种用于增加哺乳动物(特别是人类)的精细胞的受精能力的方法,并且其提出采用在扩展可见光范围(300至1000nm)中的具有1至1000mW/cm2强度的光照射所述精细胞且持续0.5至10分钟的时间,其中光不是由激光产生。
Hussein Z M等人的“The effect of diode laser and light emitting dioseon the bacterial contamination of semen medium for artificial insemination”(“二极管激光器和发光二极管对用于人工授精的精液介质的细菌污染的影响”)公开了一种新的光学方法,其采用二极管激光器(DL)和商业廉价的发光二极管(LED)抑制细菌在含有增量介质的精液中生长。根据所推荐的方法,将样品浸入冷水中并暴露在两种不同的光源(LED和DL)持续不同的暴露时间,暴露时间从0变化至20分钟。在整个吸管长度上以整数距离照射样品。采用不同的机械频率重复最后的步骤,所述不同的机械频率由两个信号源的旋转快门切割光束而产生。除了黑暗对照组(未暴露于光的长期精液)之外,检测所有暴露的细菌计数和精子成活力。
需要提供现有技术的替代方案,现有技术缺乏详细的信息,同时仅允许使用不基于激光器的光学系统工作,具有明显的操作缺点:现场工作设备的价格和实施的可能性。
发明内容
鉴于现有技术和现有成果,本发明人致力于以光疗法作为提高精液质量的方法的研究,但是是在人类生殖中心或动物农场中建立原位方案。先前的实验室结果已经证实了这种目的并且在现实条件下得到确认,确定了:在冷却或恒温条件下在用于容纳这种流体的常规容器上进行该种处理的光周期、光剂量、暴露时间和装置。
本发明描述了采用不基于激光的光学系统处理哺乳动物的精子溶液的条件。在这种情况下,限定了波长的具体范围、曝光时间和运动力最大时精子溶液的使用时间,从而确保精子的最佳授精能力。
为了这个目的,本发明在第一方面提供了用于增加(例如哺乳动物)精细胞的受精能力的方法,与已知技术类似,该方法包括采用非相干红光照射所述精细胞。
然而,本发明的第一方面的方法的特征在于,根据包括特定持续时间的两个照射周期的至少一个序列的模式,采用非相干红光以不连续的方式进行照射,所述特定持续时间的两个照射周期由特定持续时间的中间黑暗周期间隔开,如本发明人确认的,对于所期望的目的,其产生非常有益的结果。
照射和黑暗的每个特定周期可以具有8至15分钟的持续时间。所述持续时间优选为10分钟。此外,所提及的暴露和黑暗周期可以具有相同或不同的持续时间。
另一方面,红光可以具有620nm至630nm的波长。
根据一个实施例,将包含所述精细胞的至少一种精液样品在稀释剂中稀释,并将所提及的照射施加于稀释样品的至少一部分上。同样地,也可以将稀释样品的至少一部分或所述精液样品的未稀释部分引入一容器中,该容器具有所述照射红光的波长能透过的壁,所述照射可以施加于所述容器上。因为容器的壳体,精液保存在黑暗中。
根据一个实施例,容器是试管或微量离心管,并且具有适于授精处理的尺寸。
优选冷藏保存精液样品的稀释部分或未稀释部分,至少直到立即在其上施加红光照射之前的时间和/或在所述施加期间。
同样地,可以将精液样品的一部分或多部分在经受所提及模式的红光照射之后,在大体16-21℃的等温介质中温育。一般而言,以不同周期的进行温育,在每个周期之后,所述方法包括对精液样品的一部分或多部分进行分析对照,用于至少确定精子的功能性成活力和运动力的状态。
本发明的第二方面提供了一种用于增加(例如哺乳动物)精细胞的受精能力的装置,所述装置包括非相干红光照明构件,所述构件配置和布置为采用非相干红光照射所述精细胞。该第二方面的装置的特征在于,所述装置配置用于实施本发明的第一方面的方法,其包括:
-控制构件,控制所述照明构件,以根据所述不连续模式进行所述照射,
-支撑件,支撑所述精细胞的至少一个容器,并且容器的壁能透过所述照射红光的波长;和
-壳体,其内部容纳所述支撑件和由所述支撑件支撑的容器,所述照明构件布置为朝向至少一个容器发射光。
该装置还可以包括冷却构件,所述冷却构件配置和布置用于冷却容纳在壳体内的元件。控制构件优选地至少针对待施加的照射的模式(照射波长、焦点和持续时间)是可编程的。
一旦根据本发明的原理进行精细胞处理,就能验证活动的精子的百分比和它们的运动力水平相对于它们的先前基线水平得到提高,以及它们的抗应激能力也得到提高。
因为所有提高活动的精子的成活力和运动力的因素在成功的卵子受精过程中是关键因素,所以细胞成活力和活力的这种增强将增加受精的概率。
附图说明
基于以下参考附图的若干实施例的详细描述,将能更好地理解前文的和其它的优点和特征,这些附图必须以说明性和非限制性方式解释,其中:
图1是2ml管中的小样本的示例;
图2是在50ml容器中的稀释样品的示例。
具体实施方式
为了证实前述的证据和光疗法对提高精细胞运动力-成活力的不同描述性参数和精细胞对环境应激(其被视为在37℃超过1小时的时间)的耐受性的影响的实际大小,采用猪的精液作为哺乳动物模型进行不同的实验室研究。
用猪的精子进行研究,因为它们是容易获得的材料,且因为它们是用于结果外推至其它哺乳动物(包括人)的良好模型。
使用来自15头年龄为2-3岁且来自5个不同品种(皮特兰猪、杜洛克猪、大白猪、比利时长白猪和英国长白猪)的健康成年雄性猪的样品进行研究。这些样品通过手动刺激获得,立即在商业稀释剂中稀释至最终精子浓度为3×107个精子/ml,终体积为90mL,并在16-17℃保存。
将1.5mL的两个等分试样沉积在微量离心管中,将一个等分试样在16-17℃下温育作为对照组,并且通过图1中描述的装置将其它等分试样暴露于不同的光刺激程序中。
实施的光刺激程序具体如下:
(A)暴露于红光中10分钟,停止10分钟和暴露于红光中10分钟。
(B)暴露于红光中15分钟,停止10分钟和暴露于红光中15分钟。
(C)暴露于红光中20分钟,停止10分钟和暴露于红光中20分钟。
一旦已经进行过处理,将不同的对照等分试样和处理的等分试样引入37℃的恒温槽中,温育不同的时间(15、30、60和90分钟),之后进行分析对照以确定功能性成活力和运动力的状态。
所述分析对照是:
1)通过采用台盼兰/吉姆萨(Trypan blue/Giemsa)双重染色法[6]来评估运动力和结构完整的顶体的百分比
2)通过计算机辅助运动力分析(CASA)进行精子运动力分析,测量以下参数:曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)、线性指数(LIN)、前向性指数(STR)、摆动性指数(WOB)、头侧位移的平均幅度(ALH)和平均最佳交叉频率(BCF)。
通过将不遵循正态分布的数据进行对数变换(log transformation)来统计评价5个独立测试的结果。通过SAS统计包的LSMEANS方法确定显著性差异(p<0.05)。
表1.实验1.90分钟时,对照组和处理组A、B和C之间的显著差异(*)
*大于对照组#小于对照组
这些研究确定了,过长持续时间的剂量(暴露于非相干红光的照射的时间)没有任何效果或其结果不是最佳的,并且就提高运动力-成活力而言,阳性反应和两种情况中至少2次非相干红光暴露与好确定的(well determined)持续时间的中间黑暗周期的组合强相关。一般而言,处理组A和B处理显示出清楚的保护效应,显著提高了精子的存活,处理组A中获得的值比处理组B中的值水平高。因此,处理组A被认为是到实验时为止所评估的所有处理组中最好的,且被认为是在现实情况中哺乳动物辅助生殖的应用的起点。
为了验证不连续处理(具有中间停止周期)相对于等效的但以连续方式给光的处理是否有明显的提高,采用与上面描述的相同的材料和方法评估以下治疗方案。
光刺激程序是:
(再次用处理组A和未暴露的对照组)
(D)暴露于红光中10分钟,
(E)暴露于红光中20分钟
(F)暴露于红光中30分钟
(G)暴露于红光中45分钟
表2.实验2.90分钟时,对照组和处理组A、D、E、F和G之间的显著性差异(*)
*大于对照组 #小于对照组
基于表1和2中显示的结果的结论,我们推断,不连续处理对哺乳动物精液(使用来自不同种类的猪的精液作为模型)的性质有极大的提高,相反,连续处理使精液的性质恶化,这些性质是受精的关键。
从上文推断得出,在10-10-10的刺激模式(照射10分钟,随后停止10分钟和照射最后的10分钟)中,采用非相干红色LED光(例如波长为620-630nm)的受控光刺激显著提高了猪的精子的热应激抗性,所述猪精子预先在商业稀释剂中稀释,所述商业稀释剂在16-17℃下冷却,是在农场中人工授精常规使用的稀释剂。
这种光刺激模式也使得这些精子实现孕酮诱导的体外顶体反应的能力的提高。这些体外结果表明光刺激对精子具有显著的影响,不仅提高抵抗环境应力的能力,而且提高穿透卵子的能力。作为整体和作为最终结果,两种效应可以提高光刺激的精子的受精能力,随后提高体内生育力和多育性的结果,特别是在环境应激可能降低所述生育力的和多育性的条件下。
应用的示例将是在养猪场中,其中环境温度正在损害生殖能力。
第二个应用例子将是在人类生殖的范围内,其中由于环境的和/或有机的原因导致的运动力的缺乏与男性不育有关。
由于猪是在代谢上与人类似并且在不同医学领域上被接受为模型的动物,且由于第二个示例的实际演示在伦理上是不可行的,事先并没有至少采用动物模型加以证明,该方法在哺乳动物中的有效性采用猪作为模型来验证。
在育种场中沿用在上文描述的针对商业化精液剂量的光刺激方法并使用上文描述的设备(图2)进行的研究中,采用子宫颈授精的方式处理7种不同批次的,总共n=195的发情雌性猪。以与采用光刺激的精液悬浮液(n=78)处理的每批雌性猪的平行方式,采用未处理的悬浮液(n=117)对第二批进行授精。结果见下表:
表3.对照组和采用光刺激的商业化剂量进行受精的组的生育力百分比
n,妊娠的雌性猪的数量
%,相对于组总数的生育力百分比
对照组的95%置信区间的生育结果为(90.85-97.01)%,处理的雌性猪的95%置信区间的生育结果为(95.07-100)%。统计平均比较检验(单尾配对t检验)得出p=0.0448,证明,尽管对照组中生育力的较高百分比表示该研究是在具有高生育率百分比的非常高效的育种场中进行,两组之间仍存在显著差异。
必须强调的是,一旦妊娠结束,在100头雌性猪的批次中具有阳性受精的2头雌性猪的差异与每批次的至少16个后代的差异是等同的(每个个体平均有8个后代),其对家畜的产量具有明显增殖效应。
对照组妊娠的雌性猪的95%置信区间的活产数据为13.73(12.82-14.45),采用光刺激精液处理的妊娠的雌性猪的95%置信区间的活产数据为14.31(13.29-15.33)。这些结果表明,一旦妊娠,采用光刺激的精液不会降低其多产性。
本发明的保护范围由所附的权利要求限定。
参考文献
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Claims (15)
1.一种提高精细胞的受精能力的方法,其包括采用非相干红光照射所述精细胞,其特征在于:根据包括特定持续时间的精细胞照射的两个周期的至少一个序列的模式,采用非相干红光以不连续的方式进行所述照射,所述特定持续时间的精细胞照射的两个周期由特定持续时间的中间黑暗周期间隔开,照射和黑暗的每个所述特定周期具有8至15分钟的持续时间。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述照射的两个周期和所述中间黑暗周期的持续时间相同。
3.根据权利要求1所述的方法,其中照射和黑暗的每个所述特定周期具有10分钟的持续时间,所述照射的两个周期和所述中间黑暗周期的持续时间相同。
4.根据权利要求1所述的方法,其中照射和黑暗的所述周期具有不同的持续时间。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述红光具有620nm至630nm的波长。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其包括在稀释剂中稀释包含所述精细胞的至少一种精液样品,并将所述照射施加于所述稀释样品的至少一部分上。
7.根据权利要求6所述的方法,其包括将所述精液样品的所述至少一部分或未稀释部分引入一容器中,所述容器具有所述照射红光的波长能透过的壁,并将所述照射施加于所述容器上。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述容器是具有适于人类或动物生殖的合适尺寸的试管或微量离心管。
9.根据权利要求6至8所述的方法,其包括冷藏保存精液样品的所述至少一个稀释的或未稀释的部分,至少直到立即在其上施加红光照射之前的时间和/或在所述施加期间。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法,其包括将精液样品的一部分或多部分在经受所述红光照射模式之后在大体上16-21℃的等温介质中温育。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,其包括以不同的周期进行所述温育,在每个周期之后,所述方法包括对精液样品的一部分或多部分进行分析对照,用于至少确定精子的功能性成活力和运动力的状态。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述精细胞是哺乳动物精细胞。
13.一种用于增加精细胞的受精能力的装置,包括非相干红光照明构件,所述照明构件配置和布置为采用非相干红光照射所述精细胞,所述装置的特征在于,其配置用于实施根据前述权利要求中任一项所述的所述方法,其中所述装置包括:
-控制构件,控制所述照明构件,以根据所述不连续模式进行所述照射,
-支撑件(1),支撑用于容纳所述精细胞的至少一个容器(2),所述容器的壁能透过所述照射红光的波长;和
-壳体,其内部容纳所述支撑件(1)和由所述支撑件支撑的容器,所述照明构件布置为朝向至少一个容器发射光。
14.根据权利要求13所述的装置,包括冷却构件,所述冷却构件配置和布置用于冷却容纳在所述壳体内的元件。
15.根据权利要求13或14所述的装置,其中所述控制构件至少针对待施加的照射的模式是可编程的。
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