CN105660490B - 一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，在诱导有丝分裂雌核发育双单倍体前，先对所用母本的纯合度进行鉴定，筛选出纯合度高的亲本，再进行诱导，从而提高了诱导效率。利用本发明，可以在牙鲆上实现有丝分裂雌核发育双单倍体的批量化、规模化诱导，从而为牙鲆生物学性状的功能基因挖掘、数量性状控制位点定位以及良种的克隆化奠定坚实基础。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术技术领域，具体涉及一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法。
背景技术
有丝分裂雌核发育是一种用射线灭活的精子激活卵子，再在特定时期对卵子施以物理或化学方法抑制其卵裂的特殊生殖方式。通过诱导有丝分裂雌核发育所获得的个体称为双单倍体，具有基因组完全纯合的特点。双单倍体是极为珍贵的育种基础材料，基于双单倍体可快速建立纯合克隆系和杂合克隆系。无论纯合克隆系或杂合克隆系，都是进行数量性状定位、功能基因挖掘以及全基因组测序的最佳材料。模拟实验显示，利用双单倍体进行全基因组范围的QTL定位，具有比其他交配模式更好的检测能力。
在作物上，基于双单倍体所形成的克隆系因其系内整齐一致、无杂合位点等特点，无论在育种实践还是基础研究中，与经过多代连续自交而产生的系相比具有一定的优越性。这也成为北美和欧洲商业化育种主要的选系方法。
在鱼类上，基于双单倍体的育种研究一直进展缓慢。虽然在一些鱼类上成功的诱导了双单倍体及克隆系。这个和作物上有较大的差距。究其原因，双单倍体的低诱导效率和低成活率是众多潜在原因中最为重要的两个。这大大的制约了鱼类育种中双单倍体技术的应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法。本发明通过对诱导有丝分裂雌核发育双单倍体前，先对所用母本的纯合度进行鉴定，筛选出纯合度高的亲本，再进行诱导，从而提高了诱导效率。
本发明所采用的技术方案为：一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，在进行有丝分裂雌核发育诱导之前，先进行纯合度的鉴定和筛选：使用微卫星标记对母本进行纯合度的鉴定，并筛选母本进行双单倍体的雌核发育诱导。
在本发明中，筛选纯合度大于0.2000的母本进行双单倍体的雌核发育诱导。
优选地，利用覆盖牙鲆24个染色体的24个微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定。
本发明中，所使用的微卫星标记，为覆盖牙鲆24个连锁群(对应牙鲆24条染色体)的24个高重组率微卫星标记，使用所述微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定，能够得到更为全面的牙鲆纯合度数据。
所述微卫星标记的重组率均大于0.667。所述重组率是根据所述微卫星标记与着丝粒之间在第一次减数分裂四分体时期发生交换频率的高低来计算的。理论上来说，如果不存在交叉干涉，微卫星标记与着丝粒之间的重组率最大为0.667。重组率越高，代表发生交换的频率越高。
连锁群序号和对应的微卫星标记的信息见表1
表1：微卫星标记信息表
按照上表从上到下的顺序，发明人提供了符合《专利法》规定的序列表，序列表的编号从SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：48。
优选地，所述提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，包括以下步骤：
A、纯合度的鉴定和筛选；
B、精子和卵子的采集：采集牙鲆雌鱼卵子和雄性真鲷精子；
C、精子灭活：用Ringer’s液对精子进行稀释，随后用紫外线进行照射灭活；
D、人工授精：将卵子和灭活后的精子混匀，并激活孵化；
E、诱导双单倍体：孵化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行静水压处理，处理结束后，将卵子转移至孵化缸孵化。
在进行传统的有丝分裂雌核发育诱导之前，筛选纯合度高的母本，能够得到更高的诱导效率，即更高的孵化率和更低的畸形率；在诱导孵化完成之后，对获得的后代进行纯合度检验，以验证诱导有丝分裂雌核发育的效果。
Ringer’s液又被称为林格氏液，一种与哺乳动物的血液和淋巴大致等渗的盐溶液，Ringer’s液被广泛应用于组织、细胞和一些低等动物培养或保存。本发明中，林格氏液为海水鱼用林格氏液。
优选的，步骤E诱导双单倍体之后，还包括纯合度检验：用上述微卫星引物对有丝分裂雌核发育诱导所获得的个体进行纯合度检验。
作为一种具体的实施方式，步骤B精子和卵子的采集中，挤压筛选得到的雌性牙鲆，将卵子挤入烧杯中，避光保存备用；积压筛选得到的雄性真鲷，将精液挤入注射器中，显微镜检查精子活力，并对精子进行筛选备用。
优选地，步骤C精子灭活中，用海水鱼用Ringer’s液对精子进行稀释，精子和海水鱼用Ringer’s液的质量比为1:40；稀释后用紫外线对精子进行照射，照射剂量为73mJ/cm2；照射后的精子避光保存，并在显微镜下检查筛选备用。
优选地，步骤D人工授精中，将卵子和灭活后的精子混匀，用17℃的过滤海水激活，并在17℃的孵化箱内孵化60min。
优选地，步骤E诱导双单倍体中，孵化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行650kg/cm2的静水压处理6min；处理结束后，将精卵混合物转移至孵化缸，流水孵化；并统计受精率和孵化率。
受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
孵化率为孵化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
本发明中，采用使用紫外线灭活的真鲷精子对牙鲆卵子进行受精处理，以上参数是发明人根据所用的实验材料的属性并结合多次试验所作出的最优选择，当然，本领域技术人员也可根据现有技术采用不同的试验参数，在此就不再赘述。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法。本发明通过对诱导有丝分裂雌核发育双单倍体前，先对所用母本的纯合度进行鉴定，筛选出纯合度高的亲本，再进行诱导，从而提高了诱导效率。利用本发明，可以在牙鲆上实现有丝分裂雌核发育双单倍体的批量化、规模化诱导，从而为牙鲆生物学性状的功能基因挖掘、数量性状控制位点定位以及良种的克隆化奠定坚实基础。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，包括以下步骤：
A、纯合度的鉴定和筛选；利用覆盖牙鲆24个连锁群的24个高重组率微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定，筛选纯合度大于0.2000的母本进行双单倍体的雌核发育诱导。
B、精子和卵子的采集：筛选纯合度高的雌性牙鲆，轻置于软垫上，用毛巾覆盖全身，以防其拍打软垫，用干毛巾轻轻擦去其生殖孔周围的污物和水，沿生殖腺自鱼体后部向前轻轻的缓慢挤压，将卵子挤入1000ml的干净烧杯中，避光保存，备用；筛选处于繁殖盛期的雄性真鲷，用毛巾覆盖全身，用干毛巾轻轻擦去其生殖孔周围的污物和水，沿生殖腺自鱼体后部向前轻轻的缓慢挤压，将精液挤入5ml的注射器中，显微镜检查精子活力，筛选游动时间长的精子备用；
C、精子灭活：用海水鱼用Ringer’s液对精子进行稀释，精子和海水鱼用Ringer’s液的质量比为1:40；稀释后用紫外线对精子进行照射，照射剂量为73mJ/cm2；照射后的精子避光保存，并在显微镜下检查活力，选取游动时间长的精子备用；
D、人工授精：将卵子和灭活后的精子混匀，用17℃的过滤海水激活，并在17℃的孵化箱内孵化60min；
E、诱导双单倍体：孵化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行650kg/cm2的静水压处理6min；处理结束后，将精卵混合物转移至孵化缸，流水孵化；并统计受精率和孵化率。
受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；
孵化率为孵化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比。
F、纯合度检验：用微卫星引物对有丝分裂雌核发育诱导所获得的个体进行纯合度检验。
试验例
为验证本发明的诱导效率，发明人做了如下试验：
本试验例中，分为四组平行实验，四组分别为对照组、实验一组、实验二组和实验三组，其中对照组不经母本纯合度的鉴定和筛选步骤，直接进行雌核发育诱导，实验组均按照实施例1中纯合度的鉴定和筛选步骤之后，再进行雌核发育诱导。实验一组采用杂合克隆做母本、实验二组采用有丝分裂杂合子做母本；实验三组采用减数分裂雌核发育一代做母本。每个组别统计最终的受精卵、孵化率以及检测纯合度，检测结果见表2和表3：
表2：受精卵、孵化率以及畸形率统计表
| 组别 | 受精率(％) | 孵化率(％) |
| 对照组 | 3.07 | 1.41 |
| 实验一组 | 61.30 | 35.57 |
| 实验二组 | 38.87 | 26.87 |
| 实验三组 | 63.13 | 28.31 |
表3：24对微卫星引物鉴定结果表
上表说明：随着母本纯合度的提高，雌核发育双单倍体的诱导效率有上升的趋势(受精率、孵化率上升，后代纯合个体比例上升)。利用本发明所提供的技术方案，能使牙鲆有丝分裂雌核发育的诱导更为可行、成功率更高。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，其特征在于，在进行有丝分裂雌核发育诱导之前，先进行纯合度的鉴定和筛选：使用微卫星标记对母本进行纯合度的鉴定，并筛选母本进行双单倍体的雌核发育诱导。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用覆盖牙鲆24个染色体的24个微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、纯合度的鉴定和筛选；
B、精子和卵子的采集：采集牙鲆雌鱼卵子和雄性真鲷精子；
C、精子灭活：用Ringer’s液对精子进行稀释，随后用紫外线进行照射灭活；
D、人工授精：将卵子和灭活后的精子混匀，并激活孵化；
E、诱导双单倍体：孵化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行静水压处理，处理结束后，将卵子转移至孵化缸孵化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤E诱导双单倍体之后，还包括纯合度检验：用微卫星引物对有丝分裂雌核发育诱导所获得的个体进行纯合度检验。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤B精子和卵子的采集中，挤压筛选得到的雌性牙鲆，将卵子挤入烧杯中，避光保存备用；挤压筛选得到的雄性真鲷，将精液挤入注射器中，显微镜检查精子活力，并对精子进行筛选备用。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤C精子灭活中，用海水鱼用Ringer’s液对精子进行稀释，精子和海水鱼用Ringer’s液的质量比为1:40；稀释后用紫外线对精子进行照射，照射剂量为73mJ/cm2；照射后的精子避光保存，并在显微镜下检查筛选备用。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤D人工授精中，将卵子和灭活后的精子混匀，用17℃的过滤海水激活，并在17℃的孵化箱内孵化60min。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤E诱导双单倍体中，孵化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行650kg/cm2的静水压处理6min；处理结束后，将精卵混合物转移至孵化缸，流水孵化；并统计受精率和孵化率。
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| CN101690469A (zh) * | 2009-10-14 | 2010-04-07 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法 |
| CN104920255A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-09-23 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 牙鲆f3代生长快纯系构建方法 |
| CN105230533A (zh) * | 2015-08-04 | 2016-01-13 | 中国水产科学研究院北戴河中心实验站 | 一种牙鲆雄核发育双单倍体的诱导及检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 基于双单倍体牙鲆挖掘与生长性状连锁的微卫星标记;刘永新等;《东北农业大学学报》;20120221;第42卷(第9期);第104-110页 * |
| 有丝分裂雌核发育牙鲆的微卫星鉴定;刘海金等;《中国水产科学》;20101124;第17卷(第5期);第889-894页 * |
| 牙鲆有丝分裂雌核发育二倍体的制备;刘永新等;《中国水产科学》;20140222;第21卷(第1期);第197-202页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105660490A (zh) | 2016-06-15 |
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