CN114634951A - 一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，将Cas9 mRNA和靶序列gRNA混合后，在翘嘴鳜卵受精后的45分钟内，利用显微注射的方式对1细胞期受精卵动物极进行注射。本发明还公开了上述编辑方法在翘嘴鳜XY型生理雌鱼育种方面的应用，利用本发明得到的amhy基因突变F0代雄鱼进行传代得到的F1代中含有移码突变的雄鱼个体会发育为雌性。本发明第一次建立翘嘴鳜胚胎显微注射操作技术，并首次实现翘嘴鳜内源性基因的编辑操作，为开展翘嘴鳜基因功能研究及翘嘴鳜养殖品种的遗传改良提供强有力的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于鱼类分子育种技术领域，具体涉及一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法及其应用。
背景技术
翘嘴鳜（Sinipercachuatsi），属于鲈形目（Perciformes），鳜科（Sinipercidae），鳜属（Siniperca），在我国食用史极其悠久，在公元前2200年的《山海经》中即有“洛水多滕鱼，状如鳜”的记载。一直以来，翘嘴鳜凭借其肉质鲜美，营养丰富且无肌间刺的优点深受消费者喜爱。近年来，鳜鱼的水产养殖产量逐年攀升，根据2020年中国渔业统计年鉴，其水产养殖产量为37.6986万吨，具有巨大的经济价值，其中翘嘴鳜为主要养殖品种。值得注意的是翘嘴鳜的生长具有两性异形的特征，即同龄商品规格的翘嘴鳜，雌鱼的体重超过雄鱼约10-20%，因此实现翘嘴鳜全雌养殖具有更高的经济效益。
近年来，利用传统育种手段，翘嘴鳜取得较多成果，并获批了多个国家审定的新品种，包括翘嘴鳜华康1号，秋浦杂交鳜，长珠杂交鳜，以及2020年最新获批的翘嘴鳜广清1号和全雌翘嘴鳜鼎鳜1号。然而，翘嘴鳜的基因功能和遗传改良育种等方面研究却进展缓慢，一直受制于有效研究技术的缺乏。
CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年来发展起来基因组定向编辑和改造技术，主要是利用靶向特异的guide RNA，引导Cas9蛋白酶对靶向DNA序列完成特异性切割。该技术操作简单，对基因组切割效率高，目前已在多种鱼类中得到应用，包括斑马鱼、青鳉、黄颡鱼、半滑舌鳎、尼罗罗非鱼、斑点叉尾鮰、白斑狗鱼、虹鳟、鲤鱼、黄鳝等。但是，迄今为止，尚无在鳜鱼中实现基因编辑操作的报道。
因此，建立翘嘴鳜的基因编辑技术，既可以用于验证翘嘴鳜基因的功能，解读翘嘴鳜的性别决定及雌雄差异生长机制，又可以用于探索研制翘嘴鳜养殖新品系，为翘嘴鳜养殖提供遗传改良的新品种。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，通过体外转录合成靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA，将两者混合，然后采用显微注射的方式将混合物导入翘嘴鳜1细胞期的受精卵的动物极中，孵化后即可获得靶基因突变的翘嘴鳜。
本发明的第二目的在于提供上述方法在翘嘴鳜XY型生理雌鱼育种方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，将靶基因gRNA与Cas9 mRNA混合后，通过显微注射的方式注射到授精时间不超过45分钟的1细胞期受精卵的动物极中。
优选的，所述靶基因gRNA的终浓度为100~300 ng/µL，更佳为100ng/µL。
优选的，所述Cas9 mRNA的终浓度为300~600 ng/µL，更佳为500 ng/µL。
优选的，每颗受精卵的注射体积为2~5 nL，更佳为2 nL。
优选的，合成所述靶基因gRNA的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，采用T7 Endonuclease I酶切法和Sanger测序法对注射后受精卵的靶基因突变进行检测。
进一步的，采用T7 Endonuclease I酶切法和Sanger测序法对注射后受精卵的靶基因突变进行检测包括：选取注射过的受精卵和野生型受精卵并分别提取DNA，根据翘嘴鳜amhy基因靶向编辑位点上下游序列设计PCR引物，对DNA进行扩增，利用T7 Endonuclease I酶切法和Sanger测序法对注射后受精卵的靶基因突变进行检测，所述PCR引物序列如SEQID NO：4和SEQ ID NO：5所示。
优选的，注射后受精卵需要在亚甲基蓝染色液中静置孵育，后更换成曝气的自来水并用充气泵充气，使水中的卵能够上浮，孵化期间及时挑死卵，并每天换水一次，出膜后，转入圆桶继续养殖，孵化后3天左右，加入适口饵料鱼开口，并喂养至3月龄。
进一步的，注射后受精卵需要在浓度为1 mg/L亚甲基蓝染色液中静置孵育6小时以上，之后更换成曝气的自来水并用充气泵充气，气流使水中的卵能够上浮即可，孵化期间及时挑死卵，并每天换4/5的水一次，孵化出膜后，转入半立方米的圆桶继续养殖，孵化后3天左右，加入适口饵料鱼开口，并喂养至3月龄。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述方法在翘嘴鳜XY型生理雌鱼育种方面的应用。
优选的，所述应用包括：对注射后的受精卵进行孵化培育，进一步筛选获得F0代突变雄鱼，与正常雌鱼杂交获得F1代，筛选具有amhy移码突变的F1代XY雄鱼个体，即获得XY型生理雌鱼。
进一步的，所述应用包括：通过靶向编辑amhy基因，获得amhy基因F0突变雄鱼，然后将F0代突变雄鱼与正常雌鱼交配，从中获得的F1代，筛选具有amhy移码突变的雄鱼个体，其性腺发育为卵巢，即获得XY型生理雌鱼。
具体的，所述应用包括：通过显微注射amhy基因的靶向gRNA和Cas9 mRNA到翘嘴鳜受精卵的动物极，进一步筛选获得F0代突变雄鱼，与正常雌鱼杂交获得F1代，筛选具有amhy移码突变的F1代XY雄鱼个体，对其性腺进行组织学切片观察，发现含amhy移码突变的XY雄鱼性腺发育为卵巢，即获得XY型生理雌鱼。
优选的，使用T7 Endonuclease I酶切法，快速筛选F0代突变雄鱼，并将能够正常产精的突变个体与正常雌鱼交配获得F1代。
优选的，使用Sanger测序法，筛选F1代中amhy基因具有移码突变的XY雄鱼。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）目前尚无进行翘嘴鳜胚胎的显微操作技术，也没有进行翘嘴鳜内源基因编辑的相关技术报道，本发明首次在翘嘴鳜中建立内源基因精准编辑技术，为开展翘嘴鳜基因功能研究以及养殖品系的遗传改良提供强有力的技术手段；
（2）本发明首次建立翘嘴鳜显微注射后胚胎室内孵化技术，生产上，翘嘴鳜胚胎大多用环道或孵化桶进行大量孵化，而基因编辑胚胎数量不多，因此不宜用大型设施进行孵化，本发明首次通过亚甲基蓝溶液静置孵育的方式成功孵化出翘嘴鳜基因编辑后的胚胎，且胚胎存活率高达70%；
（3）利用本发明的显微注射手段进行基因编辑时，将Cas9 mRNA和靶基因gRNA的浓度分别调整为300~600 ng/µL和100~300ng/µL，通过显微注射导入1细胞期受精卵，可以获得靶基因突变率高达76%的翘嘴鳜胚胎，从而建立翘嘴鳜内源基因精准编辑技术；
（4）利用本发明中的amhy基因靶向gRNA，能够通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得含amhy基因移码突变的F1代XY型雄鱼，该XY型雄鱼性腺发育为卵巢，即为XY生理雌鱼，该结果也是首次证明了amhy基因为翘嘴鳜雄鱼的性别决定基因。
附图说明
图1为实施例1中CRISPR/Cas9敲除翘嘴鳜amhy基因靶向序列的选择及突变检测；
图2为实施例2中翘嘴鳜amhy基因敲除F0代突变个体筛选及突变类型统计；
图3为实施例2中翘嘴鳜amhy基因敲除F1代雄鱼突变类型统计及移码突变雄鱼与正常雌雄个体性腺组织学切片分析；
图4为实施例2中amhy基因敲除F1代突变个体与正常雌雄个体主要性别相关基因表达水平分析（不同字母a-g代表差异显著）。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明以编辑翘嘴鳜amhy基因为例，对本发明的方法进行说明。本发明以靶基因amhy为例，建立了翘嘴鳜内源基因精准的基因编辑技术，该技术可以用于研究翘嘴鳜基因的功能以及遗传品种的改良。
实施例1
（1）翘嘴鳜1细胞期受精卵的获取：
挑选性成熟的翘嘴鳜亲本，暂养于半立方米的圆桶中，雌鱼按0.006 mg/kg的剂量注射促黄体素释放激素A2（Luteiizing hormone releasing hormone A2, LHRHA2）（宁波第二激素厂）和3~5mg/kg剂量的注射用多潘立酮（Domperidone）（宁波三生生物科技有限公司）。注射后，将亲鱼放在水温22~25℃的圆桶中，等待22~26小时见到雌鱼浮上水面即可捞出来挤卵，并同时挤雄鱼的精子进行人工受精。先将精卵子混合均匀，然后用22~25℃的水激活精卵子进行授精，并用于显微注射。
（2）构建翘嘴鳜amhy基因的guide RNA和Cas9 mRNA：
根据已经验证的amhy转录本（如SEQ ID NO：1所示），使用CRISPR/Cas9靶序列设计网站（http://zifit.partners.org/ZiFiT/）进行amhy基因敲除靶标的设计，主要设计和筛选原则如下：（1）靶序列长度为19~24个碱基，5’端以GG或G幵头，靶序列后紧跟以NGG基序；（2）靶序列在外显子区，最好在靠近蛋白编码区5’端，以便使蛋白彻底变性；（3）用本地blast程序对靶序列进行全基因组检索，E-value设置上限为1E-10，blast到的非靶序列碱基一致性小于14 nt，以减少脱靶。
gRNA的合成所需的正向引物为amhy-gRNA-F: TAATACGACTCACTATAGGACGAGGCTCTGTGTGGCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（如SEQ ID NO：2所示），其中前17个碱基为T7启动子序列，后面20个碱基为gRNA骨架5’端部分序列，中间21个碱基为amhy基因的靶标序列（图1中A图）。反向引物为gRNA-R: AGCACCGACTCGGTGCCACT（如SEQ ID NO：3所示），为gRNA骨架3’端部分序列。
PCR反应体系包括：2xTaq Plus Master Mix II (Vazyme, China) 5 μL，amhy-gRNA-F和gRNA-R引物各0.5 μL (10μM)，含gRNA骨架序列的质粒DR274（如SEQ ID NO：6所示）模板0.5μL（100ng），ddH2O 3.5 μL。
PCR扩增反应条件：先95℃5 min; 95℃30 s, 50℃退火20 s，72℃延伸10 s，共37个循环; 最后72℃延伸1 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶分离，并将符合预期大小的条带切胶，使用E.Z.N.A胶回收试剂盒（Omega，美国）进行回收，并用DEPC水进行溶解，部分样品送北京擎科生物科技有限公司进行测序。
待测序核实准确后，即可开始体外转录。gRNA的体外转录使用T7 High Yield RNATranscription Kit（Vazyme，China）进行，主要步骤包括：向无酶PCR管加入10 x reactionbuffer 2 μL，ATP，GTP，UTP和CTP solution各2 μL，RNA polymerase mix 2 μL，PCR产物回收模板200~500ng，补DEPC水到20 μL，混匀后，37℃孵育3~4 h，加入1 μLDNase I，37℃孵育15 min，消化DNA模板。最后，使用HiPure RNA Pure Micro Kit（Magen，China）进行纯化回收，主要步骤包括：首先用DEPC水调整样品体积到100 μL，然后加入300 μL Buffer RP，涡旋混匀10 s，室温静置5 min，加入600 μL无水乙醇，涡旋混匀15 s，将HiPure RNA 柱子套在收集管上，把前面得到的混合液转移至柱子中，10,000 g 离心30-60 秒，弃滤液，加入500 μL Buffer RW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中，静置2 min，10,000 g 离心30-60 秒，重复此步骤一次，然后将柱子套到1.5mL离心管中，加入15~30 μLRNase Free Water 至柱子膜中央，放置1 min，然后13,000 g 离心1 min即可。然后用超微量分光光度计Nanodrop2000进行浓度检测，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析其完整性，最后放到-80℃冰箱备用。
首先将西南大学王德寿和李明辉老师赠送的Cas9质粒用XbaI限制性内切酶进行线性化处理，即37℃水浴3 h，然后取少量反应液进行琼脂糖凝胶电泳确认质粒是否完全切开，对于完全切开后的质粒，使用GenElute™PCR纯化试剂盒（Sigma，Germany）进行直接回收。然后使用mMESSAGEmMACHINET7 Kit（ambion）进行Cas9 mRNA的体外转录，主要操作步骤包括：向无酶PCR管中加入10 x reaction buffer 2 μL，2 x NTP/CAP 10 μL，T7 EnzymeMix 2 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，线性化Cas9质粒模板800ng~1μg，然后补DEPC水到20μL，37℃孵育2~3 h，加入1 μLTURBO DNase，37℃孵育15 min。向得到反应体系中30 μLLiCl和30 μlDEPC水，-20℃放置1 h以上，4℃离心30 min，然后吸去上清液，然后加入用DEPC水配置的70%乙醇，上下颠倒数次，然后4℃离心5 min，吸去上清液，室温晾干15 min，加入20μLDEPC水进行溶解，轻轻吹打溶解后，测定RNA的浓度并电泳检测其完整性，最后放到-80℃冰箱备用。
（3）显微注射翘嘴鳜1细胞期受精卵：
将刚授精的翘嘴鳜受精均匀摆放到1%琼脂糖凝胶制备的凹槽中，在体视显微镜下观察细胞的动物极，并调整到合适的倍数。然后将Cas9 mRNA和amhy-gRNA混合，并加入少量无RNA酶的酚红，终浓度Cas9 mRNA和amhy-gRNA分别调整为500 ng/µL和100 ng/µL，加入玻璃注射针中。玻璃注射针采用WPI品牌水平拉针仪（PUL-1000）拉制，拉针参数为heat: 710，Force: 300，Distance: 9.00，Delay: 0。最后使用WPI品牌的显微注射系统（PV820）对1细胞期受精卵动物极进行注射，使用氮气加压，每颗受精卵注射量为2 nL左右，室温条件下，受精卵1细胞期只能维持45分钟，需在受精后45分钟内完成注射。
（4）显微注射翘嘴鳜胚胎的孵化与养殖：
将显微注射后的翘嘴鳜胚胎转入1%的亚甲基蓝染色液中静置孵育6小时以上，静置孵育时间不宜过长，同时显微注射后的胚胎比较脆弱，剧烈震动容易导致其死亡。静置孵育6小时后即可转入20 L左右的桶用充氧泵充氧孵化，直至破膜。孵化期间及时挑死卵，并每天换4/5的水一次，出膜后，将破膜后的鳜鱼小苗转入半立方米体积的桶中养殖，破膜第3天后，观察到鳜鱼苗能够快速平游，即可逐渐放入适口饵料鱼喂养，持续喂养至3月龄以上。
（5）显微注射翘嘴鳜胚胎突变检测：
为检测靶向突变效率，在显微注射24小时后，随机选取20颗左右的显微注射胚胎进行突变检测。首先用PCR标本处理液（东盛，中国）对胚胎进行DNA粗提，主要步骤是取20颗显微注射胚胎（Mutant）和野生型胚胎（WT）放入1.5 mL离心管中，加入180 µL ExtractionSolution，涡旋振荡，95℃温浴15min，加入20µL Neutralization Solution，充分振荡，5000rpm离心2min，上清即为DNA粗提液。根据翘嘴鳜amhy基因靶向编辑位点上下游序列设计PCR引物，正向引物amhy-F1为：CGTAACTGGTGTCTGCGAG（如SEQ ID NO：4所示），反向引物amhy-R1为：TGGAGGCTAATGAGGTCTTT（如SEQ ID NO：5所示）。PCR反应体系包括：2xTaq PlusMaster Mix II (Vazyme, China) 10μL，amhy-F1和amhy-R1引物各1μL (10μM)，上述粗提DNA模板2 μL，ddH2O6μL。PCR扩增反应条件：先95℃5 min; 95℃30 s, 55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环; 最后72℃延伸5 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶分离，并将符合预期大小的条带切胶，使用E.Z.N.A胶回收试剂盒（Omega，美国）进行回收，并用DEPC水进行溶解。
部分样品用T7 Endonuclease I酶进行酶切突变检测，酶切反应退火体系：10 ×T7 Endonuclease I Reaction Buffer 2 μL，胶回收PCR产物200 ng，补水到19 μL，退火程序为：95℃5 min，95℃-85℃ -2℃/s，85℃-25℃ -0.1℃/s，4℃∞。在退火产物中加1 μL的T7 Endonuclease I酶，37℃孵育15 min，将酶切产物直接以2%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，显微注射的胚胎粗提DNA PCR退火产物能够被T7 Endonuclease I酶切开，而对照组不能，而T7 Endonuclease I酶能识别并切割不完全配对DNA、十字型结构DNA、Holliday结构或DNA 分叉点、异源双链DNA 及低速切割带切刻位点的双链DNA，因此说明显微注射组胚胎靶序列位置存在多种突变，即amhy-gRNA和Cas9 mRNA能够成功诱导amhy基因靶序列发生突变（图1中B图）。
部分样品送北京擎科生物科技有限公司进行sanger测序，测序结果显示在靶序列位置出现套峰，说明靶序列发生改变，PCR在靶序列位置扩增出多种不同的序列，即此位置发生了突变（图1中C图）。并通过TA克隆的方法连接到pGEM-T Easy 载体上，并转化到Trelief™ 5α Chemically Competent Cell（擎科，中国）感受态细胞中，主要转化步骤包括：向100 μL冰上融化的感受态细胞中加入连接产物，轻轻混匀，冰上静置5 min，然后42℃水浴热激45~60 s，迅速转移至冰上，静置2 min，向离心管中加入500 μL不含抗生素的无菌液体LB培养基，37℃摇床培养45分钟，5000 g离心2 min，弃掉450μL上清液，加入IPTG（200mg/ml）4 μL，X-gal（20mg/ml）40 μL，均匀涂布到含氨苄抗生素的固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜，并随机挑取30个白斑菌落进行测序。结果共检测到8种突变类型，即在靶序列位置附近出现不同程度的碱基缺失，总体突变率约为76%，其中比例最高的突变类型为8碱基的缺失，约占20%（图1中D图）。
实施例2
（1）F0代翘嘴鳜突变个体筛选及突变类型分析：
将显微注射得到的F0代雄鱼养到3月龄，每条鱼剪鳍条，DNA提取及PCR反应，胶回收等参照实施例1。用T7 Endonuclease I酶对F0代雄鱼鳍条PCR回收产物进行酶切突变检测，酶切反应及程序如上。结果显示F0-3和F0-10两个个体能被成功切开（图2中A图）。为了进一步了解这两条鱼的突变率及突变类型，将两条鱼的PCR产物进一步连接pGEM-T Easy载体，进行转化挑菌测序。结果显示，发现F0-3个体突变率约为40%，主要包含6种突变类型，最丰富的突变类型为14个碱基的插入突变，约为13%（图2中B图），F0-10个体突变率为60%，主要包含10种突变类型，最丰富的是8个碱基的缺失突变，约为13%（图2中C图）。
（2）突变个体传代及F1代突变类型及性腺发育分析：
于繁殖季节，将两条突变F0代雄鱼个体与正常雌鱼进行交配，催产方法如上。对F1代雄鱼个体进行突变检测类型检测，随机挑取30个雄鱼子代进行直接测序看突变类型，仅检测到三种突变类型，其中移码突变类型只有一种，即单碱基的插入突变，该突变类型所占比例约为11%（图3中A图）。进一步将F1代养到2月龄，采用PCR产物直接测序的方法对雄性子代进行测序，获得正常雄鱼（WT）以及含不同amhy基因突变类型的个体。对30日龄和60日龄含amhy基因移码突变个体性腺分别进行组织学切片检测，发现F1代移码突变个体性腺30日龄出现卵原细胞（O: oogonium）和初级卵母细胞（PO: primary oocyte），同时期正常雄鱼均能正常发育为精巢，出现精原细胞（SG: spermatogonia），正常雌鱼卵巢也出现卵原细胞（O: oogonium）和初级卵母细胞（PO: primary oocyte），60日龄移码突变个体出现卵黄积累前期的卵母细胞（PVO, pre-vitellogenic oocytes）（图3中B图）。说明amhy基因发生移码突变的个体性腺向雌性化发育。另外，还对早期发育过程中性别相关基因进行了表达分析，发现dmrt1和amh基因在30日龄的移码突变个体（30d-T）中表达水平明显低于雄性个体（30d-M），而与雌性个体（30d-F）表达水平接近（图4中A图和图4中B图），移码突变个体gsdf基因的整体表达水平也与雌鱼保持一致（图4中C图），此外，在孵化25天和30天的移码突变个体性腺中，foxl2基因表达水平明显高于雄性个体（图4中D图），而cyp19a1a基因则在孵化20天的移码突变个体性腺中即表现出明显的高表达，甚至略高于雌鱼性腺中的表达水平，在25天和30天的表达水平也明显高于雄鱼，接近雌鱼表达水平（图4中E图）。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> 抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone)
<400> 1
atgtttgttt tggatgtgtt ctactgtgga gcatttatac tctgctggac gaggctctgt 60
gtggccgtgg atgtcctaca tggacagcaa ctgaccctgg gcaacagcac tacaatgaca 120
gagcaaagcc taaaagacat ccttactggt ggaaaaccag gaagtaacat cggcatgacc 180
ccacttctgc ttttctcagg ggaaaaagca actgatacaa gatatgcaca tatttctggt 240
tcatccccga tgtcttcact gacctcctcc tttctctgtg aactgaagca gttcctgggt 300
gatgtcttgc ctcagaacca ccctcagtcc cttcggctca agctggactc cttacagtcc 360
ctgcctcccc taccactagg cttatcctcc agtgaaacct tgctggcagg actgatcaac 420
tcctcggcca ccaccatctt ctctttccct agctggggct ccatgtttca cgtgcatcat 480
ggagagttgg ccctgtctcc tgcactaatt gaggagctca ggcagagact ggagcagaca 540
gtgacgcaga taatggaggt aataaggaag aaggtggtgg gtcacagagc cacagagaga 600
ctgggaaggc tcaaagaact cattgcattt ccgaagaagg atccagcagc aggagaaagc 660
cagtaccgtg catttcttct gctgagagcg ctgcagacgg tggcccgtgt gtatgaggtg 720
cagagaggac agcgggttat aagagctgcc cccaacaacc cagtaagggg caacgtatgc 780
aggttgagca gcctcaccgt gtcccttgaa aggcaccttg tgggtccaaa cactgccaac 840
atcaacaact gccatggttc ttgtgctttc cccatggtca ataccaacaa ccatgcagtc 900
ctgctcaagt cctacattga caatgaaaat gtggatgagc gggcgccatg ctgtgtgcct 960
gtgtcctatg atgttctgga ggtggtggac ttgaaccaac atgggactta cctctccatt 1020
ataccagatg tggtggcaaa ggagtgtgga tgccgctaa 1059
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taatacgact cactatagga cgaggctctg tgtggccggt tttagagcta gaaatagc 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgtgtaaa acgacggcca gtttatctag tcagcttgat tctagctgat cgtggaccgg 60
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acgggaaacg tcttgcttga agccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg 720
gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg 780
gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt 840
tacagatgag atggtcaggc taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa 900
gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc cagggaaaac 960
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ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa 1380
acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcactt 1440
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gggcctttct gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1560
aaatcgatgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1620
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1680
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1740
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1800
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tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 1980
ctgcgctctg ctgaagccag ttacctcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 2040
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 2100
aaaggatctc aagaagatcc tttgattttc taccgaagaa aggccca 2147
Claims (9)
1.一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征是该方法包括：将靶基因gRNA与Cas9mRNA混合后，通过显微注射的方式注射到授精时间不超过45分钟的1细胞期受精卵的动物极中，所述靶基因gRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征是：所述靶基因gRNA的终浓度为100~300 ng/µL，所述Cas9 mRNA的终浓度为300~600 ng/µL，每颗受精卵的注射体积为2~5nL。
3.根据权利要求1所述翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征是：合成所述靶基因gRNA的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征是：采用T7Endonuclease I酶切法和Sanger测序法对注射后受精卵的靶基因突变进行检测，包括：选取注射过的受精卵和野生型受精卵并分别提取DNA，根据翘嘴鳜amhy基因靶向编辑位点上下游序列设计PCR引物，对DNA进行扩增，利用T7 Endonuclease I酶切法和Sanger测序法对注射后受精卵的靶基因突变进行检测，所述PCR引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。
5.根据权利要求1所述翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征是：注射后受精卵需要在亚甲基蓝染色液中静置孵育，后更换成曝气的自来水并用充气泵充气，使水中的卵能够上浮，孵化期间及时挑死卵，并每天换水一次，出膜后，转入圆桶继续养殖，孵化后3天左右，加入适口饵料鱼开口，并喂养至3月龄。
6.权利要求1所述方法在翘嘴鳜XY型生理雌鱼育种方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是包括以下步骤：对权利要求1的方法获得的受精卵进行孵化培育，进一步筛选获得F0代突变雄鱼，与正常雌鱼杂交获得F1代，筛选具有amhy移码突变的F1代XY雄鱼个体，即获得XY型生理雌鱼。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是：采用T7 Endonuclease I酶切法进一步筛选F0代突变雄鱼，并将能够正常产精的突变个体与正常雌鱼交配获得F1代。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征是：采用Sanger测序法筛选F1代中具有amhy移码突变的XY雄鱼个体。
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