CN105671084A - 一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类种质构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法。以半滑舌鳎Dmrt1基因为例，通过构建Dmrt1基因的基因组编辑TALEN质粒，在体外转录为mRNA后转移到半滑舌鳎1-4细胞期的受精卵动物极，将受精卵培育为成鱼，采用PCR方法从中筛选出基因突变的F0代鱼，从而构建出基因定点突变的成鱼。本发明还提供一种培育基因发生定点突变的海水鱼类新种质的方法，是将上述F0代鱼与野生型鱼杂交，得到杂交子代鱼，然后检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖,筛选出基因双位点突变的F1代鱼，进一步杂交后即可获得纯合突变体系F2代鱼。本发明可使鲆鲽鱼类目的基因发生定点突变，为鲆鲽鱼类基因功能研究和新种质创制提供了一种新的方法。

Description

一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类种质构建方法及应用
技术领域
本发明属于海水鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑构建海水鲆鲽鱼类新种质的方法，即对半滑舌鳎等海水鲆鲽鱼类基因组中特定基因进行定点突变并培育为成鱼的方法。
背景技术
基因组编辑技术，是最近几年发展起来的对基因组进行定点修饰的一种基因操作技术，可以对基因组中的任何基因或序列进行定点敲除或将外源基因引入基因组中的特定位点。基因组编辑主要包括TALEN技术和CRISPR/Cas9技术。基因组编辑技术在海水鱼类基因功能分析和基因工程育种方面具有重大意义和应用价值，开展海水鲆鲽鱼类基因组编辑技术的研究，对于分析基因功能及培育定点突变的海水鲆鲽鱼类优良种质至关重要。但迄今国内外未见有关海水鲆鲽鱼类基因组编辑技术的研究报道，这也成为限制基因组编辑技术在海水鲆鲽鱼类基因功能分析和基因定点突变育种中成功应用的瓶颈因子。
半滑舌鳎(Cynoglossμssemilaevis)是一种近海温水性大型底栖鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖鱼类的主导品种之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体小、生长缓慢等原因，增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。开展半滑舌鳎雌雄特异基因的筛选鉴定及其功能的分析是揭示半滑舌鳎性别决定机制、探索雌雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。我们最近的研究表明DMRT1基因是半滑舌鳎Z染色体连锁、精巢特异表达的雄性决定基因，该基因表达就是生理雄鱼，表现为个体小、生长慢，而该基因不表达就是生理雌鱼，表现为生长快、个体大。而有关该基因敲除(突变)是否会对性腺发育、生理性别及鱼体大小产生影响，目前国内外均未见报道。因此，建立半滑舌鳎基因组编辑技术、进行DMRT1基因定点敲除研究，对于建立海水鲆鲽鱼类基因功能分析方法、研制基因定点突变海水鲆鲽鱼类新种质具有重要意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法，即通过将某一基因定点突变后构建海水鲆鲽鱼类突变体的方法，从而解决目前海水鲆鲽鱼类缺乏基因组编辑技术，难以通过基因组编辑培育新种质的问题。
本发明的构建海水鲆鲽鱼类突变体的方法，其具体步骤如下
1)基因组编辑TALEN质粒的构建：
在基因序列为SEQIDNO:1的半滑舌鳎Dmrt1基因的外显子1编码区起始密码子ATG下游80-140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16-18bp核苷酸，左右结合位点之间相隔15-17bp，结合位点序列5′端的起始碱基的上游碱基为T；构建Dmrt1基因的TALEN基因组编辑质粒；
2)基因组编辑质粒的体外转录：
将步骤1)构建的Dmrt1基因组编辑TALEN质粒转化大肠杆菌后进行培养，然后将基因组编辑TALEN质粒提取出来；用限制性内切酶NotI酶切基因组编辑质粒，使其线性化；体外转录成相应的mRNA，并进行纯化；
3)体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养：
将纯化好的TALENmRNA浓度调为90-110ng/μl；将TALENmRNA转入鲆鲽鱼类受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度的装有无菌海水的烧杯中进行培养；
所述的受精卵为处于1-4细胞期的受精卵；
所述的恒定温度，其中半滑舌鳎为22℃-23℃，牙鲆为14℃-16℃，大菱鲆为12℃-13℃；
4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测方法；
将孵化中的受精卵转移到装有海水的30L-50L的玻璃钢养殖缸中培养，在0.9L/min-3L/min的充气量和22℃-23℃的水温下，经过37.5-41.5h的孵化后鱼苗出膜；出膜后3天鱼苗开口摄食，此时投喂轮虫；12天后投喂卤虫无节幼体；50天后投喂卤虫成体和配合饲料；
待鱼苗长到5-7厘米时，剪其鳍条放入95％酒精中保存，采用常规的酚氯仿方法进行鳍条DNA的提取，将提取的DNA用作PCR模板，在目的基因靶位点两端设计PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型目的基因序列比较筛选出目的基因靶位点敲除的鱼苗；
本发明还提供一种培育基因发生定点突变的海水鲆鲽鱼类新种质的方法，是将上述方法筛选出的基因定点突变的F0代鱼与野生型鱼进行杂交，得到杂交子代鱼，然后剪取杂交子代鱼的鳍条提取DNA，做PCR测序，根据目的基因测序结果得出基因定点突变F0代鱼的可遗传突变类型，再以检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖获得F1代鱼，再以F1代鱼鳍条提取的DNA作为模板进行PCR测序，从中筛选出基因双位点突变的F1代鱼，将筛选出的F1代鱼作为父、母本，进行人工繁殖后即可获得纯合突变体系F2代鱼。
本发明可使鲆鲽鱼类目的基因发生定点突变，有效敲除目的基因，为鲆鲽鱼类基因功能研究和新种质创制提供了一种新的方法；解决了鲆鲽鱼类显微注射的胚胎难以养成的难题，为鲆鲽鱼类基因组编辑育种提供了有效的技术手段。
附图说明
图1：半滑舌鳎DMRT1基因5′端不翻译区和外显子1、内含子1序列及TALEN结合位点序列(字母大写为外显子1，加粗为起始密码子，TALEN1L为左边结合位点，TALEN1R为右边结合位点)；
图2：半滑舌鳎DMRT1基因TALEN-1L质粒核心原件示意图；
图3：半滑舌鳎DMRT1基因TALEN-1R质粒核心原件示意图；
图4：dmrt1-TALEN-1L与靶位点结合的蛋白模块序列图，其中大写字母为蛋白模块的蛋白序列，其中阴影部分为dmrt1-1LTALENrepeats，编码578个氨基酸，识别dmrt1外显子1上的左边17个特异核苷酸序列(CCCGCTGCAGGAACCAC)；下划线显示为C-terminalTALeffectorandFokIcleavagedomain，中括号标识为N-terminaleffector。矩形方框内显示为SP6启动子，加粗显示为NotI酶切位点；
图5：dmrt1-TALEN-1R与靶位点结合的蛋白模块序列图，其中大写字母为蛋白模块的蛋白序列，其中阴影部分为dmrt1-1RTALENrepeats，编码578个氨基酸，识别dmrt1外显子1上的右边17个特异核苷酸序列(AGCGTTTGTGGCCCTTC)；下划线显示为C-terminalTALeffectorandFokIcleavagedomain，中括号标识为N-terminaleffector。矩形方框内显示为SP6启动子，加粗显示为NotI酶切位点；
图6：Dmrt1基因敲除错配酶检测结果图；
图7：10尾半滑舌鳎Dmrt1可能的突变类型图；
图8：Dmrt1基因定点突变半滑舌鳎遗传雄性鱼苗性腺结构图：(1.Dmrt1TALEN敲除雄鱼性腺切片(4倍)；2.Dmrt1TALEN敲除雄鱼性腺切片(20倍)；3.正常雌鱼性腺切片；4.正常雄鱼性腺切片)
图9：Dmrt1基因敲除半滑舌鳎遗传雄性鱼苗性别相关基因的表达图(A:Cyp19a的表达模式；B：Dmrt1的表达模式；C：Foxl2的表达模式；D：Actin参照。Female:1-3为正常雌鱼；Dmrtko:4为Dmrt1基因突变雄鱼；Male:5-7为正常雄鱼)
图10：Dmrt1基因定点突变半滑舌鳎遗传雄鱼与正常雄鱼大小比较图(A：正常雌鱼；B：正常雄鱼；C：Dmrt1基因定点突变的雄鱼)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1、半滑舌鳎Dmrt1基因组编辑TALEN质粒的构建：
1.基因组编辑TALEN质粒的构建方法：
根据半滑舌鳎Dmrt1基因的基因组序列SEQIDNO:1，在外显子1编码区起始密码子ATG下游80-140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16-18bp核苷酸，左右结合位点之间相隔15-17bp，左边结合位点的序列为5’-CCCGCTGCAGGAACCAC-3’(SEQIDNO:4)；右边结合位点的序列为5’-AGCGTTTGTGGCCCTTC-3’(SEQIDNO:5)；结合位点序列5′端起始碱基的上游碱基应该为T。
构建TALEN质粒的主要步骤为：首先按照选定的17个碱基的TALEN结合位点序列(图1)，利用Addgene公司的试剂盒TALENGoldenGatetoolkit中4种重复可变双氨基酸残基位点(RVD)质粒模块(可分别识别A、T、G、C)，选择分别识别结合位点1-10个碱基的10个RVD质粒模块与试剂盒中的pFUS_A质粒经BsaI酶切后连接为pFUS_A重组质粒，选择分别识别第11-16个碱基的6个RVD模块质粒与试剂盒中的pFUS_Bn质粒经BsaI酶切后连接为pFUS_Bn重组质粒，测序验证后的两种重组质粒再与试剂盒中的pCS2-TALEN-ELD、pCS2-TALEN-KKR、识别最后一个碱基的RVD模块质粒一起经Esp3I酶切连接，即构建为最终的dmrt1-TALEN-1L或dmrt1-TALEN-1R质粒(如图2-图5)，其中dmrt1-TALEN-1L和dmrt1-TALEN-1R的序列分别为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3(图4和图5)。采用此种方法构建的TALEN质粒经验证有90％的克隆序列正确。这样设计构建的TALEN基因组编辑质粒具有高的突变效率，而脱靶率较低。
2.Dmrt1TALEN质粒的扩培
(1)将Dmrt1TALEN质粒与感受态细胞轻轻混匀，然后在冰上放置40min。
(2)将Dmrt1TALEN质粒和感受态细胞的混合物放置于42℃水中，进行90秒热击，然后立即放置于冰上冷却2分钟。
(3)加入1mLLB液体培养基，放到37℃摇床里，培养1h，转速为150rpm。
(4)取100μL菌液涂布于含有Amp的LB平板上。
(5)将平板放置于37℃培养箱中培养12-16h，待长出单克隆菌落后接种到1ml的LB液体培养基中，过夜培养。
(6)将过夜培养的菌液接种至100ml的LB培养基中，培养12h。
(7)将培养后的菌液离心去上清，收集沉淀。
(8)用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，并测定质粒浓度。
(9)利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，看大小是否是Dmrt1TALEN质粒的大小，看是否是两条或三条电泳条带。
3.Dmrt1TALEN菌种保存。取6个离心管，每个离心管装入上一步骤中第6小步骤过夜培养的菌液500ul，再分别加入500ul50％灭菌甘油；先-20℃保存4h，再转移至-80℃保存。
4.Dmrt1TALEN质粒保存于-20℃。
实施例2、基因组编辑质粒的体外转录：
将基因组编辑(TALEN)质粒转化大肠杆菌后进行培养，采用质粒提取试剂盒将基因组编辑质粒提取出来；用相应的限制性内切酶NotI酶切基因组编辑质粒，使其线性化；采用商业来源的体外转录试剂盒将线性化的质粒转录成相应的mRNA，并进行纯化。
下面以半滑舌鳎Dmrt1基因组编辑(TALEN)质粒的体外转录为例进行详细说明。
一)体外转录所需的Dmrt1TALEN质粒通过两种方式获取。
(一)-80℃下保存的半滑舌鳎Dmrt1TALEN菌种扩大培养
1.将-80℃下保存的菌种从超低温冰箱取出来，解冻后接种至100ml的LB培养基中，培养12h。
2.将培养的菌液离心去上清，收集沉淀。
3.本实施例用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，并测定质粒浓度。
4.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，看大小是否是Dmrt1TALEN质粒的大小，看是否是两条或三条电泳条带。
(二)Dmrt1TALEN质粒转化大肠杆菌扩大培养
1.将Dmrt1TALEN质粒与感受态细胞轻轻混匀，然后在冰上放置40min。
2.将Dmrt1TALEN质粒和感受态细胞的混合物放置于42℃水中，进行90秒热击，然后立即放置于冰上冷却2分钟。
3.加入1mLLB液体培养基，放到37℃摇床里，培养1h，转速为150rpm。
4.取100μL菌液涂布于含有Amp的LB平板上。
5.将平板放置于37℃培养箱中培养12-16h，待长出单克隆菌落后接种到1ml的LB液体培养基中，过夜培养。
6.将过夜培养的菌液接种至100ml的LB培养基中，培养12h。
7.将培养后的菌液离心去上清，收集沉淀。
8.用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，并测定质粒浓度。
9.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒，看大小是否是Dmrt1TALEN质粒的大小，看是否是两条或三条电泳条带。
二)Dmrt1TALEN质粒的体外转录
1.根据测定的质粒的浓度，取适量的质粒，使其达到1ug。
2.用限制性内切酶NotI酶切质粒，使其线性化。
酶切反应体系：
反应温度：37℃
反应时间：2-3h
3.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否被切开。如果酶切后的质粒比原质粒的bp数少，说明已切开；否则没有切开，可以继续酶切。
4.用mMESSAGE试剂盒把线性化的质粒体外转录成mRNA。
5.体外转录成的mRNA必须经过纯化才能进行显微注射，本实施例用的是Sigma体外转录纯化试剂盒。
6.用琼脂糖凝胶电泳检测体外转录的mRNA的质量如何。
7.测定体外转录的mRNA的浓度，根据浓度把Dmrt1TALEN的左右臂mRNA都调整为200ug/ul，然后等体积混合。
8.-20℃或-80℃下保存Dmrt1TALENmRNA。
实施例3、体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养
将纯化好的TALENmRNA浓度调为90-110ng/ul；收集发育正常的处于1-4细胞期的鲆鲽鱼类受精卵；采用常规方法将100-300pg的TALENmRNA转入受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度(半滑舌鳎为22℃-23℃，牙鲆为14℃-16℃，大菱鲆为12℃-13℃)下装有无菌海水的烧杯中进行培养，并且向烧杯中加入10000x的1％亚甲基蓝溶液(每100ml无菌海水加入2ul)，每3-5h将存活的受精卵转入新的加亚甲基蓝的无菌海水中。本培养方法比传统的孵化池流水培养孵化率提高5％-10％。
下面以向半滑舌鳎受精卵转移Dmrt1TALENmRNA为例进行详细说明。
一)Dmrt1TALENmRNA向半滑舌鳎受精卵转移
1.将刚受精的卵进行消毒和漂洗，放入无菌海水，移至培育箱培养，温度设定为22℃。
2.将Dmrt1TALENmRNA准备好，解冻后12000rpm离心5min，放到4℃冰箱备用。
3.40分钟后取少量受精卵在解剖镜下观察，直到观察到大部分受精卵动物极隆起，开始准备TALENmRNA转移。
4.将发育正常的1-4细胞期的受精卵整齐排列在琼脂糖胶板的凹槽中，凹槽宽0.9-1mm,深1mm。采用常规方法将100-300pg的TALENmRNA转入受精卵的动物极。
二)受精卵的培养
1.转移TALENmRNA后的受精卵要及时放入装有22℃-23℃的无菌海水的500ml烧杯的培养箱中进行培养，培育箱的温度设定在22℃。
2.向无菌海水中加入亚甲基蓝溶液，每100ml无菌海水中加入2ul10000x的1％亚甲基蓝溶液(1g亚甲基蓝溶于100ml灭菌水中)。
3.每隔3-5h换一次烧杯中的加亚甲基蓝溶液的无菌海水，并清除沉到杯底的死卵。
4.在培育箱中培养大概26-35h后，将50-300粒胚胎转移到体积为30-50L的玻璃钢水槽中培养，水槽中装海水20-30L，水温为22-23℃。
实施例4：基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测；
将孵化中的受精卵转移到30L-50L的养殖缸中培养，在0.9L/min-3L/min的充气量和22℃-23℃的水温下，经过37.5-41.5h孵化后鱼苗出膜。出膜后3天鱼苗开口摄食，此时投喂轮虫；12天后投喂卤虫无节幼体；50天后投喂卤虫成体和配合饲料。
待鱼苗长到5-7厘米时，可以剪其鳍条放入95％酒精中保存。采用常规的酚氯仿方法进行鳍条DNA的提取，将提取的DNA用作PCR模板，在目的基因靶位点两端设计特定PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型目的基因序列比较筛选出目的基因靶位点敲除的鱼苗。
下面以半滑舌鳎Dmrt1基因定点突变鱼苗的养殖与检测为例进行详细说明。一)半滑舌鳎Dmrt1基因定点突变鱼苗的养殖
1.受精卵在培育箱中孵化大概26-35h后，转移到体积为30L的圆形水槽中，孵化37.5-41.5h后，鱼苗孵化出膜。
2.三天后鱼苗开口，投喂小球藻和轮虫。轮虫投喂量为5-10个/ml，轮虫投喂时间为3-22日龄，这期间投喂小球藻并且适时观察鱼缸里的轮虫数量，保证在约10个/ml左右。10天后将鱼苗转移到新的养殖缸中进行养殖，转移过程中一定要仔细，动作不能太大以免伤着鱼苗。
3.当鱼苗出膜15天之后开始投喂卤虫无节幼体，开始保持2个/ml，随着鱼苗长大，数量也增多，但是轮虫的投喂量要逐渐减少直至伏底停止投喂，这期间要适时进行吸底和倒缸工作，保证鱼苗在优良的水质环境下生长。
4.鱼苗伏底后第5天，可将鱼苗轻轻转移到100L鱼缸中养殖。
5.鱼苗伏底后开始驯化投喂150-250um粒径的配合饲料，卤虫无节幼体投喂到50-60天；小型卤虫成体50-60天后与配合饲料并喂，这段期间每次鱼苗吃饱后都要及时把残饵清除，以免影响水质。配合饲料的大小可根据鱼苗的大小灵活掌握。
6.每隔7-15天，对鱼苗药浴一次，保证鱼苗健康。
二)半滑舌鳎Dmrt1基因定点突变鱼苗的检测
1.待鱼苗长到5-7厘米时，可以剪其鳍条，保存于95％酒精中。
2.提取DNA作PCR模板
(1)取鳍条50mg去除酒精后放入0.5ml离心管中，加入500μl的裂解液(10mmol/LTris-CL,PH8.0；100mmol/LEDTA,PH8.0；100mmol/LNaCL；0.5％SDS),15μl的蛋白酶K(10mg/mL)，轻轻混匀，55℃消化1h，每半小时摇动一次，消化至澄清。
(2)在裂解好的样品中加入500μl的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，晃动10min后12000rpm离心10min，取上清液300μl。
(3)重复步骤(2)一次。
(4)在上清液中加入600μl预冷的无水乙醇沉淀DNA，用70％无水乙醇洗涤两次。待酒精挥发完全后，用50μl的灭菌超纯水溶解。
3.PCR检测Dmrt1基因定点突变
进行PCR引物设计时，预扩增出带有突变位点的DNA片段长度约为350bp，突变位点不能位于片段中央，这样才能在错配酶检测过程中切割出两条大小不同的条带。PCR引物序列分别为
上游引物Dmrt1TALEN-S:5′-CGGGCAAAGGGAGAAGG-3′；
下游引物Dmrt1TALEN-A:5′-AAAAACATCTCCTGAGGGCTAA-3′。
反应体系及条件如下：
反应条件
4.用错配酶(T7核酸内切酶I，T7E1)酶切PCR产物检测突变位点
将突变体DNA与野生型鱼的DNA的PCR产物分别进行加热变性(95℃5min)、退火复性(自然冷却至室温)处理；然后反应体系中加入0.5ulT7E1酶，37℃反应30min后，2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图6所示，野生型鱼只有一条未被切开的350bp的条带，而突变体DNA除了有一条350bp的条带外还存在两条被切开的条带(200bp和150bp)。
反应体系
5.PCR产物的单克隆测序
(1)PCR产物跑1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后用胶回收试剂盒(天根)回收纯化。
(2)纯化产物与pMD18-T(Takara公司)连接，连接反应根据Takara公司产品说明书进行。
(3)将连接产物与感受态细胞轻轻混匀，然后在冰上放置40min。
(4)将连接产物和感受态细胞的混合物放置于42℃水中，进行90秒热击，然后立即放置于冰上冷却2分钟。
(5)加入1mLLB液体培养基，放到37℃摇床里，培养1h，转速为150rpm。
(6)取100μL菌液涂布于含有Amp的LB平板上。
(7)将平板放置于37℃培养箱中培养12-16h，待长出单克隆菌落后接种到1ml的LB液体培养基中，过夜培养。
(8)进行菌落PCR检测出阳性克隆，将阳性克隆送测序公司测序。
菌落PCR反应体系
反应条件
对17尾转移了Dmrt1TALENmRNA的鱼进行检测，其中10尾发生了基因定点突变，突变效率为58.82％。突变类型如图7。由测序可知，Dmrt1TALEN成功突变了Dmrt1基因，突变位点在距离起始密码子下游100bp-120bp处，存在不同数目的碱基突变，其中含有缺失3的倍数(不移码)和非3的倍数(移码)的碱基，根据转录翻译原理，会产生变异的蛋白，从而影响相关功能。综上所述，本发明的方法在Dmrt1TALEN的相关位点选择、转入到受精卵的时机选择和产生的相关突变等方面效果都是非常好的，达到了较高的突变效率。
实施例5、基因定点突变鱼组织结构观察方法
取突变鱼目的基因作用的性腺和肝脏等相关组织和野生型鱼的相关组织，用Bouin固定液固定4-16h，然后保存在70％酒精里。固定后的组织经过修整、常规洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片等步骤制成石蜡切片。石蜡切片进行苏木素和伊红染色(HE染色)后可在显微镜下观察基因敲除鱼的性腺结构或其它相关组织的结构。
下面以半滑舌鳎Dmrt1基因定点突变鱼苗的性腺组织结构观察为例进行详细说明。
1.性腺组织的固定与保存
分别取一年龄的Dmrt1基因突变雄鱼和野生型雌鱼、雄鱼的性腺，用Bouin液固定4-16h；固定好后用70％酒精洗涤几次，保存在70％酒精中。
Bouin液的配制：
2.性腺组织切片的制作
(1)组织修整。将固定好的组织上受挤压或不需要的部分进行修整，选择好的包埋部分。
(2)组织洗涤。用70％酒精洗涤修整好的组织块，洗涤3次。
(3)组织脱水。脱水的步骤与时间：
(4)组织透明。透明的步骤与时间：
(5)组织浸蜡。浸蜡的步骤与时间：
(6)石蜡包埋。迅速将熔蜡倾倒于金属包埋框里，再用加热的镊子夹取已经浸蜡完成的组织块，放到框里的熔蜡中，将切面朝下，这些步骤都应在包埋框里的熔蜡未凝结前完成；待石蜡充分凝固后，推开包埋框，取出蜡块；修整蜡块，使蜡块底面呈长方形或正方形，尤其蜡块的上下两面是平行的。
(7)石蜡切片。用石蜡切片机切片，切片的厚度在5um-7um；切好的蜡带轻轻地平整地放入装有45℃-47℃蒸馏水的摊片机中；待切片完全伸展开来，用镊子将切片平整地转移到载玻片上，然后将载玻片放到烤片机上，有蜡带的一面朝上，50℃-60℃烘烤3-4h，可将烤好的切片放到-20℃保存。
3.苏木素-伊红染色(HE染色)
Mayer苏木素染液配制：
水溶性伊红染液配制：
(1)水化。水化步骤：
(2)染色。染色步骤：
(3)脱水、透明和封片。步骤如下：
4.性腺组织切片观察
将中性树脂胶封好的片子放到尼康显微镜下观察，结果显示，精巢发育不正常，横切面外形是卵巢的圆形；内部结构退化，不能正常进行减数分裂，形成不了正常的精子；中间有一个正常精巢没有而正常卵巢才有的空腔，退化区域有类似卵细胞结构(如图8)。
实施例6、基因定点突变鱼性腺中性别相关基因的表达检测
取突变鱼目的基因作用的组织和野生型鱼的组织，放入液氮中保存，用TRIZOL方法或RNA提取试剂盒的方法提取组织中的总RNA；将总RNA反转录成cDNA；用半定量或荧光定量的方法检测相关基因的表达情况。
下面以半滑舌鳎Dmrt1基因敲除鱼性腺中性别相关基因Dmrt1、Cyp19a、Foxl2的表达为例进行详细说明。
本实验采用半定量的方法对Dmrt1、Cyp19a、Foxl2基因进行表达量分析。
Actin引物(最佳退火温度为60℃)：
上游引物:5′-GCTGTGCTGTCCCTGTA-3′；
下游引物:5′-GAGTAGCCACGCTCTGTC-3′
Dmrt1引物(最佳退火温度为62℃)：
上游引物:5′-CCGGACGGCTTCGTGTC-3′；
下游引物:5′-CTTCCACAGGGAGCAGGCAGT-3′
Cyp19a引物(最佳退火温度为55℃)：
上游引物:5′-AATGGAAGGTGTAGCGGC-3′；
下游引物:5′-GTTTTGGAATGATTGGTCG-3′
Foxl2引物(最佳退火温度为60℃)：
上游引物:5′-GCACCCAATCCGTTCAGC-3′；
下游引物:5′-GCCATTTCGTCACCCTCT-3′
半定量反应体系
通过内参基因Actin的表达分析得出各个cDNA的量，如下表：
注：F1、F2、F3：半滑舌鳎野生型雌鱼；Dmrt1敲除：半滑舌鳎Dmrt1定点突变的雄鱼；M1、M2、M3：半滑舌鳎野生型雄鱼
PCR反应条件
通过半定量分析得出，相比野生型雄鱼，Dmrt1基因突变雄鱼的精巢中Dmrt1基因的表达量大大降低；但是Dmrt1基因突变雄鱼精巢中雌性相关基因Cyp19a和Foxl2表达量升高，其中Foxl2的表达量显著升高(如图9)。
实施例7、Dmrt1基因定点突变鱼生长性能比较
观察比较Dmrt1基因突变鱼在外部形态上与野生型鱼的差异；分别测量突变鱼和野生型正常鱼的体长、体宽、体重，通过数据分析，检测基因定点突变后鱼苗的生长发育情况。
下面以半滑舌鳎Dmrt1基因突变鱼的生长性能为例进行详细说明。
2014年5-9月进行半滑舌鳎受精卵的基因突变实验，将转移了Dmrt1基因TALENmRNA的受精卵孵化成鱼苗后精心培育成大鱼，于2015年8月取养殖12-15个月的DMRT1基因突变鱼、野生型正常雄鱼和野生型正常雌鱼各3尾进行体重、体长测量。将鱼用冰水麻醉，分别测量体长、体宽、体重数据，并拍照(如图10)。测量结果见表1。由表可见，3尾Dmrt1基因定点突变雄鱼的体重平均为241.2克，体长平均为33.7cm；野生型雄鱼的平均体重为110.3克，平均体长为26.1cm；野生型雌鱼的平均体重为296.8克，平均体长为35.9cm；由此可见，Dmrt1基因定点突变雄鱼的平均体重为普通野生型雄鱼的2.2倍，其生长速度明显高于野生型雄鱼，和野生型雌鱼的生长速度类似，说明通过Dmrt1基因定点突变可以大幅提高雄鱼的生长速度，创制出快速生长的半滑舌鳎新种质。
表1：DMRT1基因突变鱼和野生雌鱼、雄鱼的生长对比
实施例8、基因定点突变鲆鲽鱼类新种质的创制与应用
将采用上述方法筛选出的基因定点突变的F0代鱼与野生型鱼进行杂交，得到杂交子代鱼，然后剪取杂交子代鱼的鳍条提取DNA，做PCR测序，根据目的基因测序结果得出基因定点突变F0代鱼的可遗传突变类型，再以检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖获得F1代，再以F1代鱼鳍条提取的DNA作为模板进行PCR测序，从中筛选出基因双位点突变的F1代鱼，将筛选出的F1代鱼作为父母本，进行人工繁殖后即可获得纯合突变体系F2代鱼。
下面以半滑舌鳎Dmrt1基因突变的雄鱼繁殖后代鱼苗为例进行详细说明。
1.先取野生型半滑舌鳎雌鱼卵子，将雌性亲鱼置于干净湿海绵上，并用湿毛巾盖住鱼头部。轻轻擦干净生殖孔，用手从尾部向前方向挤压生殖腺，将卵挤出。
2.选取Dmrt1基因突变后能产生精子的雄性亲鱼，用同样的方法挤出雄鱼精子。用经过消毒的干燥玻璃吸管将精液吸入装卵子的烧杯内，采用干法授精，授精后将受精卵置于23℃过滤海水中孵化。
3.对繁殖出的后代鱼苗家系取样，提DNA作为PCR模板。
(1)取鳍条50mg去除酒精后放入0.5ml离心管中，加入500μl的裂解液(10mmol/LTris-CL,PH8.0；100mmol/LEDTA,PH8.0；100mmol/LNaCL；0.5％SDS),15μl的蛋白酶K(10mg/mL)，轻轻混匀，55℃消化1h，每半小时摇动一次，消化至澄清。
(2)在裂解好的样品中加入500μl的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，晃动10min后12000rpm离心10min，取上清液300μl。
(3)重复步骤(2)一次。
(4)在上清液中加入600μl预冷的无水乙醇沉淀DNA，用70％无水乙醇洗涤两次。待酒精挥发完全后，用50μl的灭菌超纯水溶解。
4.PCR检测Dmrt1基因敲除鱼后代的突变类型
PCR引物序列分别为
上游引物Dmrt1TALEN-S:5′-CGGGCAAAGGGAGAAGG-3′；
下游引物Dmrt1TALEN-A:5′-AAAAACATCTCCTGAGGGCTAA-3′。
反应体系及条件如下：
反应条件
5.用PCR产物的错配酶(T7核酸内切酶I，T7E1)检测
将突变体DNA与野生型DNA的PCR产物混合进行加热变性(95℃5min)、退火复性(自然冷却至室温)处理；然后反应体系中加入0.5ulT7E1酶，37℃反应30min后，％2琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果
反应体系
6.PCR产物的单克隆测序
(9)PCR产物跑1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后用胶回收试剂盒(天根)回收纯化。
(10)纯化产物与pMD18-T(Takara公司)连接，连接反应根据Takara公司产品说明书进行。
(11)将连接产物与感受态细胞轻轻混匀，然后在冰上放置40min。
(12)将连接产物和感受态细胞的混合物放置于42℃水中，进行90秒热击，然后立即放置于冰上冷却2分钟。
(13)加入1mLLB液体培养基，放到37℃摇床里，培养1h，转速为150rpm。
(14)取100μL菌液涂布于含有Amp的LB平板上。
(15)将平板放置于37℃培养箱中培养12-16h，待长出单克隆菌落后接种到1ml的LB液体培养基中，过夜培养。
(16)进行菌落PCR检测出阳性克隆，将阳性克隆送测序公司测序。
菌落PCR反应体系
反应条件
7.半滑舌鳎Dmrt1基因位于Z染色体上，所以雄鱼(ZZ)有一对Dmrt1等位基因，而雌鱼(ZW)只有一条染色体上有Dmrt1基因序列；已知Dmrt1全部敲除的雄鱼精子发生受阻，而且比正常雄鱼生长快2-3倍(如图10)。
(1)根据测序结果筛选出Dmrt1基因突变(F0代)鱼中性腺发育并可繁殖的个体培育成熟，用Dmrt1基因敲除的F0代雄鱼和F0代雌鱼合理配对得到F1代鱼，然后以携带基因突变F1代鱼为父、母本，合理配对获得Dmrt1基因敲除的纯合品系F2代鱼；
(2)杂交实验获得的后代鱼经过测序筛选出携带Dmrt1基因突变的鱼苗，加以培育，达到性成熟时，以这些鱼为父母本繁殖后代，再从这些鱼繁殖出的后代中筛选得到Dmrt1基因敲除纯合品系。
由此可见，本方法可以获得海水鱼类基因定点突变品系，在半滑舌鳎等海水鱼类遗传育种中具有重大的应用价值和广阔的推广前景。

Claims (7)

1.一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法，其特征在于，所述的方法包含有如下的步骤：
1)基因组编辑TALEN质粒的构建：
在基因序列为SEQIDNO:1的半滑舌鳎Dmrt1基因的外显子1编码区起始密码子ATG下游80-140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16-18bp核苷酸，左右结合位点之间相隔15-17bp，结合位点序列5′端的起始碱基的上游碱基为T；构建Dmrt1基因的TALEN基因组编辑质粒；
2)基因组编辑质粒的体外转录：
将步骤1)构建的Dmrt1基因组编辑TALEN质粒用限制性内切酶NotI酶切，使其线性化；体外转录成相应的mRNA，并进行纯化；
3)体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养：
将纯化好的TALENmRNA转入鲆鲽鱼类受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度的无菌海水中进行培养；
4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测；
将存活的受精卵进行孵化培养，待鱼苗长到5-7厘米时，提取鳍条DNA用作PCR模板，在Dmrt1基因靶位点两端设计PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型鱼的目的基因序列进行比较,筛选出目的基因靶位点突变的鱼苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)其中左边结合位点的序列为SEQIDNO:4；右边结合位点的序列为SEQIDNO:5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中TALENmRNA的浓度调为90-110ng/μl。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的受精卵为处于1-4细胞期的受精卵。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中所述的恒定温度，其中半滑舌鳎为22℃-23℃，牙鲆为14℃-16℃，大菱鲆为12℃-13℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中将存活的受精卵进行孵化培养，具体是将孵化中的受精卵转移到装有海水的30L-50L的玻璃钢养殖缸中培养，在0.9L/min-3L/min的充气量和22℃-23℃的水温下，经过37.5-41.5h的孵化后鱼苗出膜；出膜后3天鱼苗开口摄食，此时投喂轮虫；12天后投喂卤虫无节幼体；50天后投喂卤虫成体和配合饲料。
7.一种培育基因发生定点突变的海水鲆鲽鱼类新种质的方法，是将权利要求1所述的方法筛选出的基因定点突变的F0代鱼与野生型鱼进行杂交，得到杂交子代鱼，然后剪取杂交子代鱼的鳍条提取DNA，做PCR测序，根据目的基因测序结果得出基因定点突变F0代鱼的可遗传突变类型，再以检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖获得F1代鱼，再以F1代鱼鳍条提取的DNA作为模板进行PCR测序，从中筛选出基因双位点突变的F1代鱼，将筛选出的F1代鱼作为父、母本，进行人工繁殖后即可获得纯合突变体系F2代鱼。
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