CN105274140A - 肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法 - Google Patents

肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法 Download PDF

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黄晶
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肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，属于转基因领域，涉及斑马鱼。采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因的启动区序列；利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒；通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。选用一种新的荧光蛋白基因mCherry，应用了Tol2转座子体系来构建在肌细胞中特异表达的mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。

Description

肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法
技术领域
本发明属于转基因领域，涉及斑马鱼，尤其是涉及肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法。
背景技术
斑马鱼具有易于养殖、体外受精、胚胎透明、生活史短等优点，是研究脊椎动物早期发育的模型动物。在基础科学研究中，利用转基因技术，让荧光蛋白特异地表达在组织器官中，已成为一种重要的研究手段。伴随着基础研究的扩展，一些体表呈现绚丽色彩的转基因斑马鱼家系极具观赏效果。早在2003年，美国政府就批准了一部分转基因斑马鱼可作为观赏鱼上市销售，使得转基因斑马鱼进入大众视野，带来了显著的市场效益。
发明内容
本发明的目的在于提供肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法。
本发明包括以下步骤：
1)采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因(Myosinlightchain2，Mlc2f)的启动区序列；
2)利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒；
3)通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。
在步骤1)中，所述采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因(Myosinlightchain2，Mlc2f)的启动区序列的具体方法可为：
取斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据斑马鱼Mlc2f启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Mlc2f-fw:5’-AGCAAGCTTAGCCGACAGACTCACAGGATA-3’(下划线部分为HindIII酶切位点)，Mlc2f-rv:5’-ATGGGATCCAAGTCTGAAGCCGCGTAGTG-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)；以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸10min；扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-Mlc2f单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定。
在步骤2)中，所述利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒的具体方法可为：
用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pMD19T-Mlc2f和pCS2-mCherry质粒，切胶回收带有酶切位点的Mlc2f片段以及pCS2-mCherry骨架，连接、测序鉴定得到pCS2-Mlc2f-mCherry质粒；然后用HindIII/NotI双酶切pCS2-Mlc2f-mCherry和pminiTol2质粒，切胶回收Mlc2f-mCherry片段以及pminiTol2骨架，连接、测序鉴定得到pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒。
在步骤3)中，所述通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系的具体方法可为：
(1)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA：
用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGET3试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop2000测定浓度；
(2)mCherry转基因斑马鱼家系的建立：
产卵前一天将雌雄鱼以1∶(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天早上拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2-Mlc2f-mCherry(50ng/μL)和Tol2转座酶加帽mRNA(50ng/μL)的液体(总体积为2nL)注射到受精卵中；注射后的受精卵放在E3培养液(5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4)，置于28℃恒温培养箱中培养，并在注射后72h于荧光显微镜下观察筛选具有荧光信号的胚胎个体，作为Mlc2f-mCherry转基因鱼F0代进行孵化培养；F0代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得肌细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的斑马鱼纯合转基因家系。
本发明选用一种新的荧光蛋白基因mCherry，应用了Tol2转座子体系来构建在肌细胞中特异表达的mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。
附图说明
图1为pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒结构示意图。
图2为各个时期的转基因斑马鱼。在图2中，图A、B为受精26h后胚胎；C为初孵仔鱼；D为成鱼。在图A中，标尺为2mm，在图B中，标尺为500μm。
具体实施方式
1.1材料
1.1.1菌种与载体
pCS2-mCherry质粒来自本申请人实验室，Escherichia.coliDH5α菌株来自TaKaRa公司，pMD19T(Simple)质粒购自TaKaRa公司，Tol2转座子体系质粒pminiTol2、pT3TS-Tol2购自Addgene公司。
1.1.2酶与化学试剂
海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，限制性内切酶、T4连接酶购自NEB公司，mMESSAGET3(AM1348)试剂盒购自Ambion公司；
1.1.3实验动物
试验用斑马鱼属于Tuebingen家系，在本实验长年繁育。
1.1.4主要仪器设备
PCR仪(Mastercyclernexus，eppendorf公司)，离心机(Centrifuge5424，eppendorf公司)，荧光体式显微镜(M165FC，Leica公司)，气动皮升泵(PV830，WPI公司)，显微注射仪(M-152，Narishige公司)，立体解剖显微镜(S6D，Leica公司)，Nanodrop2000(Thermoscientific公司)。
1.2方法
1.2.1Mlc2f启动子的克隆
取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据NCBI上已报道的斑马鱼Mlc2f启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Mlc2f-fw:5’-AGCAAGCTTAGCCGACAGACTCACAGGATA-3’(下划线部分为HindIII酶切位点)，Mlc2f-rv:5’-ATGGGATCCAAGTCTGAAGCCGCGTAGTG-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)。以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸10min。扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-Mlc2f单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定。
1.2.2pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒的构建
用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pMD19T-Mlc2f和pCS2-mCherry质粒，切胶回收带有酶切位点的Mlc2f片段以及pCS2-mCherry骨架，连接、测序鉴定得到pCS2-Mlc2f-mCherry质粒。然后用HindIII/NotI双酶切pCS2-Mlc2f-mCherry和pminiTol2质粒，切胶回收Mlc2f-mCherry片段以及pminiTol2骨架，连接、测序鉴定得到pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒。
1.2.3体外合成Tol2转座酶加帽mRNA
用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGET3试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop2000测定浓度。
1.2.4mCherry转基因斑马鱼家系的建立
产卵前一天将雌雄鱼以1∶(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天早上灯亮后(08:00)拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2-Mlc2f-mCherry(50ng/μL)和Tol2转座酶加帽mRNA(50ng/μL)的液体(总体积为2nL)注射到受精卵中。注射后的受精卵放在E3培养液(5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4)，置于28℃恒温培养箱中培养，并在注射后72h于荧光显微镜下观察筛选具有荧光信号的胚胎个体，作为Mlc2f-mCherry转基因鱼F0代进行孵化培养。F0代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得肌细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的斑马鱼纯合转基因家系。
本发明构建了一种肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白的斑马鱼家系。为获得在能肌肉中高度表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼，首先采用PCR的方法，从斑马鱼基因组中得到了肌球蛋白轻链2基因(Myosinlightchain2，Mlc2f)的启动区序列，再利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，进而构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒(图1)。最后通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建了一个在肌肉细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系(图2)。本发明大大提高了斑马鱼的观赏价值，对转基因观赏鱼的研究提供了重要技术支持。

Claims (6)

1.肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1)采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因的启动区序列；
2)利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒；
3)通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。
2.如权利要求1所述肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于在步骤1)中，所述采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因的启动区序列的具体方法为：
取斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据斑马鱼Mlc2f启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Mlc2f-fw:5’-AGCAAGCTTAGCCGACAGACTCACAGGATA-3’，下划线部分为HindIII酶切位点，Mlc2f-rv:5’-ATGGGATCCAAGTCTGAAGCCGCGTAGTG-3’，下划线部分为BamHI酶切位点；以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸10min；扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-Mlc2f单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定。
3.如权利要求1所述肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于在步骤2)中，所述利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒的具体方法为：
用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pMD19T-Mlc2f和pCS2-mCherry质粒，切胶回收带有酶切位点的Mlc2f片段以及pCS2-mCherry骨架，连接、测序鉴定得到pCS2-Mlc2f-mCherry质粒；然后用HindIII/NotI双酶切pCS2-Mlc2f-mCherry和pminiTol2质粒，切胶回收Mlc2f-mCherry片段以及pminiTol2骨架，连接、测序鉴定得到pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒。
4.如权利要求1所述肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于在步骤3)中，所述通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系的具体方法为：
(1)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA：
用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGET3试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop2000测定浓度；
(2)mCherry转基因斑马鱼家系的建立：
产卵前一天将雌雄鱼以1∶(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天早上拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2-Mlc2f-mCherry和Tol2转座酶加帽mRNA的液体注射到受精卵中；注射后的受精卵放在E3培养液，置于28℃恒温培养箱中培养，并在注射后72h于荧光显微镜下观察筛选具有荧光信号的胚胎个体，作为Mlc2f-mCherry转基因鱼F0代进行孵化培养；F0代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得肌细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的斑马鱼纯合转基因家系。
5.如权利要求4所述肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于含有质粒pminiTol2-Mlc2f-mCherry用50ng/μL，Tol2转座酶加帽mRNA用50ng/μL，液体总体积为2nL。
6.如权利要求4所述肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于所述E3培养液的组成为：5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4。
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