CN103493768A - 一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法 - Google Patents

一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法。针对现有斑马鱼品系的绿色荧光蛋白不能在整个原肾小球、小管和导管中同时、均匀表达的缺陷，本发明提供了一种获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管和原肾导管中同时表达的斑马鱼的方法。本方法是以Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。本发明方法依照杂交亲本选育、配组繁殖、杂交性状筛选、杂交子代培育、杂交性状固定与保留几个步骤加以实施。本发明方法是一种分离元件杂交稳定整合的方法，实施过程简单易控，能够获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管与原肾导管中同时且均匀高效表达的斑马鱼品系，产品可以满足对斑马鱼原肾功能研究的整体性与完整性要求。

Description

一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法
技术领域
本发明涉及一种斑马鱼育种方法，特别是涉及一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的育种方法，属于生物技术领域。
背景技术
1962年，Shimomura等首次在维多利亚多管水母(Aequoria victoria)中发现了生物发光蛋白质即水母蛋白(aequorin)，并观察到一种在紫外线照射下发浅绿色荧光的副产物-绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。1974年，Shimomura等完成了GFP纯化，18年后Prasher等克隆出其基因，之后1994年Chalfie等在大肠杆菌细胞和秀丽隐杆线虫中实现了GFP的表达。GFP作为一种重要的生物标记蛋白，能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光。由于GFP具备荧光稳定、安全无毒害、易于检测和易于得到突变体等众多优势，从而被广泛应用于细胞生物学、分子生物学和微生物等研究领域。
斑马鱼原肾的发育与人类基本一致，其肾单位或肾小球的细胞组成极其相似，且具有结构简单的优势，因此研究者经常将斑马鱼作为理想的模式生物来研究人类肾脏发育与功能。斑马鱼的原肾由2个肾单位组成，2个肾小管分别将位于两侧的前肾导管和融合在一起的肾小球相连，前肾导管在尾部汇合连通至泄殖腔。受精后2～3天，斑马鱼胚胎中已具有能够完成渗透调节功能的原肾结构。为了更好地研究斑马鱼肾脏发育过程，研制GFP肾脏特异性表达的斑马鱼品系具有重要意义。2007年，Yan Liu等人制作出Na，K-ATPase alpha1A4:GFP转基因品系斑马鱼，实现了GFP在斑马鱼原肾小管和原肾导管中的特异性表达，但是在该品系斑马鱼的原肾小球中并没有特异绿色荧光表达。同年，Perner等利用转基因技术研制出wt1b:GFP品系斑马鱼。在该转基因斑马鱼品系受精后35h，能够观察到其原肾小球和近端部分的原肾导管中发出绿色荧光，但是在远端导管不能观察到特异的GFP表达。将上述两种品系斑马鱼用于原肾研究时，GFP不能在整个原肾小球、小管和导管中同时均匀地表达，从而影响了斑马鱼原肾功能研究的整体性和完整性。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供了一种获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管和原肾导管中同时表达的斑马鱼的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法，其特征在于：是以Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。
Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼是一种经由人工培育得到的前肾小管和前肾导管中呈现出绿色荧光蛋白特异性表达的斑马鱼品系，wt1b:GFP品系斑马鱼是一种经由人工培育得到的前肾小球、前肾小管中有部分绿色荧光蛋白表达的斑马鱼品系。本技术方案是利用Na,K-ATPasealpha1A4启动子和wt1b启动子组织特异性表达互补，通过分离元件杂交稳定整合，将其不同的绿色荧光蛋白表达性状加以集中整合，从而获得具有新性状特征的斑马鱼品系。所获得的斑马鱼品系在原肾小球、原肾小管与原肾导管中同时具备绿色荧光蛋白表达性状。
根据常规的杂交育种操作方法，本发明方法依照杂交亲本选育、配组繁殖、杂交性状筛选、杂交子代培育、杂交性状固定与保留几个步骤加以实施。在亲本选育中，挑选已达性成熟且具有良好绿色荧光蛋白表达性状的亲本斑马鱼，加以人工饲养作为亲本雌雄鱼。在配组繁殖中，采用常规配组繁殖方法获得斑马鱼受精卵。在杂交性状筛选中，于荧光显微镜下观察受精卵绿色荧光蛋白基因的表达情况，挑选出前肾小球、小管和导管中均有荧光显示的斑马鱼胚胎，采取进一步的杂交子代培育。在杂交子代培育中，采用人工饲养方法获得杂交子一代F1。在杂交性状固定与保留中，通过杂交子代自交获得稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼，再将其与普通斑马鱼测交，筛出100%全肾表达绿色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。
上述技术方案可以采取优化的人工繁殖手段，对杂交亲本选育、配组繁殖、杂交子代培育等步骤加以优化，以获得绿色荧光蛋白均匀高效地在全肾中特异性表达的斑马鱼品系。具体包括：
杂交亲本选育：将斑马鱼在循环水养殖系统中饲养，光周期为白昼14h、黑暗10h，水温26℃～29℃；每日投喂活体丰年虫或虾片3次，投食5min后清理与鱼粪、杂物及过量食物。饲养一定时间后作为亲本雌雄鱼。
配组繁殖：获得斑马鱼受精卵方法是：数量2:1的亲本雌雄鱼放入交配盒中隔离培养，交配盒置于26℃～29℃恒温环境中进行黑暗过夜培养，光周期为白昼14h、黑暗10h；培养结束，混合雌雄亲鱼，将底部有栅栏的内层交配盒倾斜放置在外层交配盒上并置于26℃～29℃恒温水浴中，待亲鱼产卵；亲鱼产卵25min～35min后，取出亲鱼，挑选收集交配盒底部的受精卵。
杂交性状筛选：受精卵在26℃～29℃恒温曝气水中培育24h～28h后检测绿色荧光蛋白斑基因的表达效果，挑选前肾小球、小管和导管中均有荧光的斑马鱼胚胎进行杂交子代培育。
杂交子代培育：受精后第1d～4d：所述斑马鱼胚胎在26℃～29℃环境恒温培育，获得幼鱼；受精后第5d～9d：幼鱼喂食卵黄水，每日喂食2次；受精后第10d～16d：幼鱼混合喂食丰年虫与滤网研磨的卵黄水，具体方法是先向幼鱼饲养容器中投入少量丰年虫，25min～35min后再加入滤网研磨的卵黄水，每日喂食至少2次；受精后第17d以后：幼鱼喂食丰年虫，每日喂食2次，每日更换一半养鱼水。培养至受精后3个月获得杂交子一代F1。
杂交性状固定与保留：杂交子一代F1经自交传代培养获得稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼，自交传代培养时采用与杂交子代培育相同的培育饲养方法获得自代子代；自交子三代斑马鱼与普通斑马鱼测交，筛选出100%全肾表达绿色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。
本发明是一种分离元件杂交稳定整合的方法，其技术效果与传统杂种优势有所区别。传统杂交优势常指两种遗传基础不同的植物或动物进行杂交后，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲。本发明方法则是将启动子组织特异性表达加以互补，通过分离元件杂交稳定整合，获得组织特异性同时表达的子代。这种方法同样可以适用于其他多种转基因斑马鱼转基因性状的集中与整合。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）方法实施过程简单易控；（2）方法能够获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管与原肾导管中同时且均匀高效表达的斑马鱼品系；（3）所得斑马鱼品系用于斑马鱼原肾功能的研究，利用绿色荧光蛋白在活体鱼中的表达可以随时观察在任何时期的原肾绿色荧光蛋白表达特征，可以满足对斑马鱼原肾功能研究的整体性与完整性要求。
附图说明
图1是亲本Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼在受精后48小时荧光图片。
图2是亲本wt1b:GFP品系斑马鱼在受精后48小时荧光图片。
图3是本发明获得的杂交子代斑马鱼在受精后48小时荧光图片。
图4是本发明获得的杂交子代斑马鱼在受精后48小时白光场图片。
图5是Apex1Morpholino(MO)注射后对斑马鱼原肾的发育影响荧光图片。（上斑马鱼是对照MO注射，下斑马鱼是Apex1MO注射）
图6是Apex1Morpholino(MO)注射后对斑马鱼原肾的发育影响白光场图片。（上斑马鱼是对照MO注射，下斑马鱼是Apex1MO注射）
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
实施例一
如图1～图4所示，采用本发明方法获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼。
1、杂交亲本选育
选用Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼作为杂交用亲鱼。作为亲本的斑马鱼在胚胎期或幼鱼期已经过荧光筛选，保证Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系亲鱼的肾小管与前肾导管中呈现出绿色荧光蛋白的特异性表达，wt1b:GFP品系亲鱼前肾小球、前肾小管中有部分绿色荧光蛋白的表达。图1是亲本Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼在受精后48小时荧光图片；图2是亲本wt1b:GFP品系斑马鱼在受精后48小时荧光图片。
选择Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼雄、雌性各10条、wt1b:GFP品系斑马鱼雌、雄性各10条作为亲鱼。亲鱼均已达性成熟，且应该具备成鱼体形正常、体色发亮、鱼鳞和鱼鳍没有破损、游动灵活捕食敏捷、没有异常行为等良好特征。
将选择好的40条亲鱼饲养于循环水养殖系统中，保证光周期为：白昼14h、黑暗10h；水温26℃～29℃；每日投喂活体丰年虫或虾片3次，投食5min～10min后将未吃完的食物及鱼粪等杂物及时清理吸出。
2、配组繁殖
分两组进行繁殖：第一组中，Na,K-ATPase alpha1A4:GFP斑马鱼作为父本，wt1b:GFP品系斑马鱼作为母本；第二组中，Na,K-ATPasealpha1A4:GFP斑马鱼作为母本，wt1b:GFP品系斑马鱼作为父本。
在产卵前夜，分别在两组中选择2条雌鱼与1条雄鱼（雌雄鱼比例2:1）放入交配盒中，插入透明挡板，使得雌雄鱼分别位于挡板两侧。之后将交配盒置于26℃～29℃恒温环境中进行黑暗过夜饲养，光周期为白昼14h，黑暗10h。
培养结束，于次日上午取出透明挡板，将底部有栅栏的内层交配盒倾斜放置在外层交配盒上并置于26℃～29℃恒温水浴中，保持周围环境安静，让雌雄鱼进行自行追逐产卵。鱼卵经过内层交配盒的栅栏掉入外层交配盒底部。
追逐过程进行30min左右，将亲鱼取出，挑选收集交配盒底部的受精卵，并将其置于放有干净曝气水的培养皿中于26℃～29℃恒温培养箱进行培养；早、晚各换水一次，并将死去的胚胎及时清除。
3、杂交性状筛选
受精卵在26℃～29℃恒温曝气水中培育24h后使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白斑基因的表达效果；挑选前肾小球、小管和导管中均有荧光的斑马鱼胚胎进行杂交子代培育。将没有荧光或者已死去的胚胎从培养皿中去除。
4、杂交子代培育
将杂交性状筛选获得的理想胚胎进行正常培育，具体步骤如下：
受精后第1d～4d：
将死去的胚胎或幼鱼剔除并更换干净曝气水，新鲜水的温度应与原水一致，确保斑马鱼胚胎在26℃～29℃恒定水温的稳定环境中进行培育直至获得幼鱼。
受精后第5d～9d：
此时期幼鱼能够在水中游动并开口，可开始喂食卵黄水。卵黄水是将煮熟的鸡蛋剥壳取出卵黄，研磨后过细目滤网（0.2mm孔径）加水制成。用胶头滴管吸取适量滴入幼鱼饲养容器中，每日喂食2次。喂食卵黄水后，幼鱼生存的水质容易变化，因此每日至少换水一次，并清理容器底部多余卵黄。
受精后第10d～16d：
从受精后第10d起开始混合投喂丰年虫和卵黄水。投食时，先喂少量丰年虫，等候30min左右再喂少量卵黄水，确保所有幼鱼均能进食。每日喂食至少2次。每日换水1～3次，每次更换一半饲养水。
受精后第17d以后
从受精后第17d，可以只喂食丰年虫，每日2次。每日更换一半饲养水。
幼鱼能够成功进食丰年虫，且身体成长迅速、抵抗力增强，可将其移入循环水养殖系统，与成鱼一起饲养。
5、杂交性状固定与保留
杂交子代培育至受精后3月龄后，采用自交传代培养固定杂交性状，获得稳定遗传的杂交子代。采用自交传代培养中采用与前述杂交子代培育方法一致的方法获得子代。图3为本发明获得的杂交子代斑马鱼在受精后48小时荧光图片；图4为本发明获得的杂交子代斑马鱼在受精后48小时白光场图片。
自交3代及以后，将稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼与普通斑马鱼测交，筛选出100%全肾表达绿色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。
实施例二
采用本发明方法获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼。其与实施例一相同之处不再重复，其不同之处在于：
3、杂交性状筛选
受精卵在26℃～29℃恒温曝气水中培育28h后使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白斑基因的表达效果；挑选前肾小球、小管和导管中均有荧光的斑马鱼胚胎进行杂交子代培育。将没有荧光或者已死去的胚胎从培养皿中去除。
实施例三
采用本发明方法获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼。其与实施例一相同之处不再重复，其不同之处在于：各阶段培养水温条件26℃～29℃调整为28.5℃。
实施例四
采用本发明方法获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼。其与实施例二相同之处不再重复，其不同之处在于：各阶段培养水温条件26℃～29℃调整为28.5℃。
试验例一
如图5、图6所示，本发明方法获得的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼胚胎应用于肾脏基因功能研究试验。
利用实施例四繁殖获得的利用全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼胚胎（受精后3d）为材料，开展影响肾脏发育的相关基因功能研究。图5、图6是Apex1Morpholino(MO)注射后对斑马鱼原肾发育产生畸形的图片。图5、图6显示对照组斑马鱼原肾发育正常，Apex1敲低组肾管变短且畸形，这表明Apex1基因对肾脏的发育具有重要作用。

Claims (10)

1.一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法，其特征在于：是以Na,K-ATPase alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在受精卵在26℃～29℃恒温曝气水中培育24h～28h后检测绿色荧光蛋白基因的表达效果，挑选前肾小球、小管和导管中均有荧光的斑马鱼胚胎进行杂交子代培育。
3.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：受精卵在26℃～29℃恒温曝气水中培育24h后检测绿色荧光蛋白基因的表达效果。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述杂交子代培育方法是：
受精后第1d～4d：所述斑马鱼胚胎在26℃～29℃环境恒温培育，获得幼鱼，
受精后第5d～9d：幼鱼喂食卵黄水，每日喂食2次，
受精后第10d～16d：幼鱼混合喂食丰年虫与卵黄水，具体方法是先向幼鱼饲养容器中投入少量丰年虫，25min～35min后再加入滤网研磨的卵黄水，每日喂食至少2次，
受精后第17d以后：幼鱼喂食丰年虫，每日喂食2次，每日更换一半饲养水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养水温条件是28℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：杂交子代培育获得的杂交子代斑马鱼经自交传代培养获得稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼与普通斑马鱼测交，筛选出100%全肾表达绿色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：受精卵获取方法是：
数量2:1的亲本雌雄鱼放入交配盒中隔离培养，交配盒置于26℃～29℃恒温环境中进行黑暗过夜培养，光周期为白昼14h、黑暗10h，
培养结束混合雌雄亲鱼，将底部有栅栏的内层交配盒倾斜放置在外层交配盒上并置于26℃～29℃恒温水浴中，待亲鱼产卵，
亲鱼产卵25min～35min后，取出亲鱼，挑选收集交配盒底部的受精卵。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：作为亲本的斑马鱼在循环水养殖系统中饲养，光周期为白昼14h、黑暗10h，水温26℃～29℃；每日投喂活体丰年虫或虾片3次，投食5min后清理鱼粪、杂物及过量食物。
10.权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述培养水温条件是28℃。
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