CN1297664C - 表达二荧光基因之重组质粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一个重组质粒，其包含：(a)一个普遍存在的启动子，(b)一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该普遍存在的启动子的下游，(c)一个皮肤特异性或肌肉特异性的启动子，以及(d)另一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该皮肤特异性或肌肉特异性启动子的下游，其中，该普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性的启动子具有反向性，且普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性的启动子分别位于该荧光基因及该另一个荧光基因的上游，以具有可供所述基因转录的方向性。此外，本发明亦提供一种宿主细胞，一种产生转基因鱼及带有本发明质粒的转基因鱼。

Description

表达二荧光基因之重组质粒

技术领域

本发明涉及一个重组质粒，一种产生含有该重组质粒的转基因鱼、宿主细胞及转基因动物的方法。

背景技术

转基因鱼研究系利用基因由异源及同源的调节元件所驱动，并由组成型或组织特异性表达基因所产生的。调控元件包括抗冻蛋白、鼠金属硫蛋白、鸡的δ-结晶、鲤鱼β肌动蛋白、鲑鱼组织蛋白H3及鲤鱼α球蛋白的基因等等。然而，于转基因鱼中使用这些DNA元件有很大的缺点，包括表达效率低及转基因的镶嵌型表达。

将青鳉鱼(mekada)β肌动蛋白启动子所驱动的lac报道基因显微注射入青鳉鱼卵后，虽然表达很少且具有高度的镶嵌性，但还是会导致lacZ基因瞬时表达，甚至在第一子代也会表达出来。Hamada等人将绿色荧光蛋白与青鳉鱼β肌动蛋白启动子融合后，显微注射至鱼卵所产生出来的青鳉鱼胚胎的报告中也有类似的结果。(Hamada等，1998，MolMarine Biol Biotechnol 7：173-180)。

Chi-Yuan Chou等人发表了一个两端连接反向末端重复序列，以增加青鳉鱼体内转基因表达效率的DNA构建质粒。转基因在第0代及之后两代的表达都呈一致性(Chi-Yuan Chou等，2001，Transgenic Research 10：303-315)。此外，Chung-Der Hsiao等人也指出将腺相关病毒反向末端重复序列(AAV-ITRs)嵌入转基因后，会使得斑马鱼第0代的基因表达一致，并使转基因的转移很稳定(Chung-Der Hsiao等2001，DevelopmentalDynamics 220：323-336)。

斑马鱼(zebrafish；Danio rerio)为脊椎动物发育生物学研究的一种新的模式生物。以斑马鱼为实验模式有几个主要的优点，例如卵与胚胎的取得容易、胚胎形成过程的组织清晰、体外发育、世代时间短、及成鱼和幼鱼皆易于饲养等。

已有人利用包括大鼠肌凝蛋白轻链增强子(Moss，J.B.等，Greenfluorescent protein marks skeletal muscle in murine cell lines and zebrafish.Gene 173，8998，1996)、斑马鱼及吴郭鱼之第一型类胰岛素生长因子启动子(Chen，J.Y.等，Isolation and characterization of tilapia(Oreochromismossambicus)insulin-like growth factors gene and proximal promoter region(DNA Cell Biol.17，359-376，1998)等各种不同的基因启动子，将已知的荧光基因如GFP基因(其中包括EGFP基因)导入斑马鱼中。这些转基因实验的目的都是为了开发出一个可用于分析基因表达的GFP转基因系统或测试基因启动子中的调控DNA元件。

专利申请WO0049150揭示一种由单一荧光基因(如GFP)所表达的荧光转基因观赏鱼。不过，仍然未开发出任何一种可一致及稳定地表达出二种或二种以上之荧光基因的鱼类。

发明内容

本发明涉及一个重组质粒，包含：(a)一个普遍存在的启动子，(b)一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该普遍存在的启动子之下游，(c)一个皮肤特异性或肌肉特异性启动子，以及(d)另一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该皮肤特异性或肌肉特异性启动子之下游，其中，该普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性启动子具有反向性(adverse directional property)，且普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性启动子分别位于该荧光基因及该另一个荧光基因之上游，以具有可供所述基因转录之方向性。

本发明亦涉及一种含有本发明质粒之宿主细胞。

另外，本发明还涉及一个产生转基因鱼之方法，该方法包括：

a)将本发明之质粒导入鱼卵细胞或胚胎细胞中，及

b)使卵细胞或胚胎细胞发育成鱼，其中本发明之质粒导入此鱼之基因组中。

本发明进一步涉及一个可产生同时表达二种荧光基因的转基因鱼之方法，该方法包含下列步骤：

a)于适当的限制酶切割位置，以限制酶切割本发明之质粒，以获得两个质粒片段I及II，其中该质粒I含有本发明之质粒中所定义的a)及b)片段，而该质粒II含有本发明之质粒中所定义的c)及d)片段；

b)分别将该步骤a)之质粒A及B导入鱼卵细胞或胚胎细胞内；及

c)使该鱼同时表达出质粒I及II。

本发明亦涉及一种经由所发明的质粒转化过的转基因动物。

附图说明

图1显示表达二种荧光基因之转基因鱼的照片。

图2显示质粒A和质粒B连接后产生质粒C之流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种可将二种或二种以上(例如绿色及红色荧光)的基因导入鱼体内之重组质粒。这些鱼在一般的光源下，会呈现出均匀一致且强烈的荧光。

本发明提供一个重组质粒，包含：(a)一个普遍存在的启动子，(b)一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该普遍存在的启动子之下游，(c)一个皮肤特异性或肌肉特异性之启动子，以及(d)另一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该皮肤特异性或肌肉特异性启动子之下游，其中该普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性之启动子具有反向性，且普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性之启动子分别位于该荧光基因及该另一个荧光基因之上游，以具有可供所述基因转录之方向性。

文中提到术语“上游”及“下游”，意即当参考方向定义为从荧光基因的起始密码子至终止密码子的方向时，某一点位于和参考方向同一方向的一端，便称之为该点的“下游”，而和参考方向相反的一端则为该点的“上游”。

根据本发明，其普遍存在的启动子系用于驱动本发明之质粒表达出荧光基因。普遍存在的启动子及皮肤特异性或肌肉特异性之启动子具有反向性，且普遍存在的启动子位于该荧光基因之上游，以具有可供荧光基因转录之方向性。普遍存在的启动子优选地选自由β-肌动蛋白、elongation-1-α、18S-rDNA或5S-rDNA所组成的组。

根据本发明，皮肤特异性或肌肉特异性之启动子系用来驱动荧光基因之表达。皮肤特异性或肌肉特异性之启动子位于该荧光基因之上游，以具有可供荧光基因转录之方向性。具皮肤特异性或肌肉特异性之启动子优选地选自由α-肌动蛋白、肌钙蛋白(troponin)T、肌钙蛋白C、肌凝蛋白之重链、细胞角质蛋白II C型(cytokeratin type II C)或S-100所组成的组。

根据本发明，任何一种荧光基因都可被插入本发明质粒之启动子的上游。荧光基因优选地选自绿色、红色、黄色或蓝色荧光基因所组成的组。这些荧光基因可在市面上买得到，例如，可购自Clonteh LaboratoriesInc.、Lightools Research及BD Biosciences Pharmingen等。以选自由绿色和红色荧光基因组成的组为优选。

Hiroshi Otsuki等人指出，当使用普遍存在的启动子时，水稻作物包括愈合组织(calli)在内的所有部分都会出现绿色荧光(Hiroshi Otsuki，January 12-16，2002，Plant，Animal & Microbe Genomes X Conference)。根据本发明，绿色荧光基因可操控连接并插入本发明之普遍存在的启动子之下游。绿色荧光蛋白(GFP)最初系分离自某种水母(Aequorea victoria)，且可在市面上买得到。GFP和其它生物发光报道分子不同，它只要接触到紫外光或蓝光，便可散发出明亮绿光。所散发的绿光是由于水母发光蛋白(aequorin)的能量转移至GFP所致。GFP为一个238个氨基酸所构成、分子量为28kDa的蛋白质，其光谱主要吸收高峰为395nm、次要高峰为470nm、以及509nm之单一发射峰。GFP的优点在于它的荧光不具物种依赖性，且不需靠底物、辅因子或其它蛋白质即可发出绿光。已有人成功地利用数种如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞及植物细胞等宿主生物及细胞来表达出GFP。

根据本发明，红色荧光基因可购自BD Bioscience Clontech。在实施本发明时，pDsRed2-1系用来作为红色荧光基因的来源。pDsRed2-1可编码出DsRed2，它是一种经过设计的DsRed变种，可较快成熟且较少非特异性聚集。DsRed2源自于香菇珊瑚的红色荧光蛋白(drFP583；Matz，M.V.，等(1999)Nature Biotech.17：969-973.)，它含有一连串的沉默碱基对变化，和人类的密码子选择偏好于哺乳细胞中高度表达相符合(Haas，J.，等(1996)Curr.Biol.6：315-324.)。在哺乳动物细胞培养中，当DsRed2组成型表达时，在转染的24小时内便可以荧光显微镜检测到散发出红色的细胞。在表达DsRed1的细菌及哺乳细胞系统中经常会观察到大的不可溶之蛋白质聚集，在表达DsRed2的细胞中会戏剧性地减少许多。较快成熟、且较易溶解的红色荧光蛋白也会使得宿主细胞较具耐受性。以DsRed2转染的哺乳动物细胞培养物无明显的存活率减少之征兆，而在那些测试的细胞株中，表达DsRed2的细胞所出现的形态(如附着力、光线折射)及生长特征和未转染过的对照组一样。pDsRed2-1是一个不含启动子的DsRed2载体，可用于监控插入多重克隆位点(MCS)中的不同启动子及启动子/增强子组合之转录作用。将位于DsRed2上游的序列改变为Kozak共有的翻译起始部位(Kozak，M.(1987)Nucleic Acids Res.15：8125-8148.)，以增加真核细胞中的翻译效率。在DsRed2基因下游的SV40多腺苷酸信号可引导DsRed2 mRNA的3’端作适当的处理。载体主要含有一个可供表达SV40T抗原的哺乳动物细胞进行复制的SV40起点、一个在大肠杆菌中用于繁殖的Puc复制起点、以及一个制造单股DNA的f1起点。一种具有新霉素抗药性盒(Neor)可利用G418来选出稳定转染的哺乳动物细胞，这个盒含有SV40早期启动子、Tn5之新霉素/卡那霉素抗药性基因、以及来自疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV TK)基因的多腺苷酸信号。在大肠杆菌中，盒上游的细菌启动子可表达出卡那霉素抗药性。

根据本发明，重组质粒本领域的标准分子技术，将含有普遍存在的启动子及一个荧光基因之质粒，以及含有皮肤特异性或肌肉特异性的启动子及另一个荧光基因之质粒结合起来所构成的。在实施本发明时，以限制酶切割含有普遍存在的启动子及绿色荧光基因的质粒，以得到一个4.7kb的片段。含有皮肤特异性或肌肉特异性的启动子及红色荧光基因的质粒也以限制酶切割而得到一段7.5kb的片段。经由接合步骤将所产生的4.7kb片段及7.5kb片段连接在一起。

本发明提供了一种含有本发明质粒的宿主细胞。根据本发明，可利用一些宿主系统来容纳本发明之质粒，这些宿主系统包括以重组噬菌体转化的细菌、质粒或粘粒DNA表达载体等微生物，以酵母表达载体转化的酵母，以病毒表达载体感染过的昆虫细胞系统，以病毒表达载体或细菌表达载体感染过的植物细胞系统，或动物细胞系统等，但不仅限于此。

本发明提供一种以本发明质粒转化过的转基因动物。根据本发明，此转基因动物可以是任何方便取得的动物，例如非人类之哺乳动物，如用于实验室测试过程中的啮齿类动物及鱼类就是一例。使用例如经由显微注射或注射重组载体之传统又方便的基因操作技术，将本发明质粒导入动物体内，便可方便地得到本发明之转基因动物。基因可经由导入细胞的前体而直接或间接进入动物的一个细胞或所有细胞中。基因操作技术包括经典的杂交育种、体外授精、导入可能会整合入染色体中或成为染色体外复制的DNA之重组DNA分子。转基因动物以转基因鱼为优选，而以自青鳉鱼、斑马鱼、七彩神仙鱼、金鱼、锵鱼、慈鲷、孔雀鱼、龙鱼、锦鲤、斗鱼或其它观赏鱼中所选出的转基因鱼为更优选。根据本发明，所发明之转基因鱼可表达出一种掺杂绿色及红色的颜色。

根据本发明的一个实施方案，本发明的质粒可用于产生出表达一种荧光、掺杂荧光及同时表达不同荧光的鱼。就表达一种荧光基因来说，利用适当的限制酶切割所发明的质粒，以产生出含有一种荧光基因的质粒片段。将所产生出来的一段质粒导入鱼的卵细胞或胚胎细胞内，以得到表达一种荧光基因的鱼。就表达掺杂荧光来说，将所发明的质粒导入鱼卵或胚胎细胞内，以得到表达掺杂荧光的鱼。就同时表达不同的荧光来说，将含有不同荧光基因的不同质粒导入鱼卵或胚胎细胞内，以得到同时表达不同荧光基因的鱼。

优选地，本发明质粒可用来产生出表达单一绿色荧光基因、单一红色荧光基因、掺杂绿色及红色荧光基因或同时表达绿色及红色荧光基因的鱼。就表达绿色荧光的鱼来说，以限制酶于适当的位置切割本发明之质粒，以得到一个含有普遍存在的启动子及操控连接并插入该普遍存在启动子的下游之绿色荧光基因的质粒。将所产生的质粒导入鱼卵或胚胎内，便可表达出绿色荧光。就表达红色荧光的鱼来说，以限制酶于适当的位置切割本发明之质粒，以得到一个含有皮肤特异性或肌肉特异性的启动子及操控连接并插入该皮肤特异性或肌肉特异性的启动子下游之红色荧光基因的质粒，并将所产生的质粒导入鱼卵细胞或胚胎细胞内，便可表达出红色荧光。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明提供了一个可产生出表达掺杂荧光的转基因鱼之方法，该方法包含a)将发明之质粒导入鱼卵细胞或胚胎细胞中，及b)让卵细胞或胚胎细胞发育成鱼，其中将所发明之质粒导入鱼的基因组中，以得到可表达出掺杂荧光的鱼。荧光基因以选自绿色、红色、黄色或蓝色荧光基因所组成的组为优选，如荧光基因选自绿色或红色荧光基因所组成的组则更优选。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明提供了一个可产生出同时表达两种不同荧光的转基因鱼之方法，该方法包含下列步骤：

a)以限制酶于适当的限制酶切割位置切割权利要求1的质粒后，可得到I及II两个质粒片段，其中质粒I含有权利要求1所定义之片段a)及b)，质粒II含有权利要求1所定义之片段c)及d)；

b)将步骤a)所述的各个质粒A及质粒B分别导入鱼卵细胞或胚胎细胞中，

c)使前述的鱼同时表达出质粒I及II。

根据本发明，从发明的方法所制造出来的鱼，可同时表达出两种不同的荧光。以限制酶于适当的位置切割本发明之质粒，以得到两个质粒，其中一个质粒含有普遍存在的启动子及一个操控连接并插入该普遍存在启动子的下游的荧光基因，另一个质粒则含有皮肤特异性或肌肉特异性的启动子及另一个操控连接并插入该皮肤特异性或肌肉特异性启动子下游的荧光基因。然后，将所产生的两个质粒分别导入鱼中，以各自表达出不同的荧光基因。荧光基因选自绿色、红色、黄色或蓝色荧光基因所组成的组为优选，如荧光基因选自于含有绿色及红色荧光基因的所组成的组则更为优选。

根据本发明的一个优选实施方案，从本发明方法所得到的鱼可同时显示出红色及绿色荧光。优选地，从本发明方法所得到的鱼可利用本领域已知的技术来进一步育种繁殖，以得到一致及稳定表达红色和绿色荧光的鱼类。

下列实施例进一步说明本发明，但非欲限制本发明之范围。

实施例

实施例1建构包含GFP序列的质粒

分离具皮肤特异性或肌肉特异性和能普遍存在地表达斑马鱼cDNA之无性繁殖株。cDNA无性繁殖系之分离与定序如Gong，Z.等在Gene201，87-98(1997)中所述。基本上，随机cDNA无性繁殖株是选自斑马鱼胚胎和成鱼之cDNA基因库，且经由单一定序反应来部份定序每一cDNA无性繁殖株。这段部分序列随后用来确认已定序无性繁殖株之潜在功能和组织特异性。

如图2所示，质粒A为一构建质粒之结构观。GFP由普遍存在之启动子所驱动。当质粒被NotI及PstI限制酶线性化后，以去氧核苷酸(dNTP)将其粘性末端填平，再自琼脂糖凝胶电泳中回收4.7kb之片段。此质粒依本发明说明构建质粒之组成。

实施例2建构一段包含红色荧光蛋白序列的质粒

如实施例1，质粒B为如图2所示构建质粒之结构观。DsRed由皮肤特异性或肌肉特异性之启动子所驱动。当质粒被PstI限制酶线性化后，以去氧核苷酸(dNTP)将其粘性末端填平，再自琼脂糖凝胶电泳中回收7.5kb的片段。此质粒依本发明说明构建质粒之组成。

实施例3通过连接质粒A和B来构建质粒

如图2所示，质粒C为一构建质粒之结构，表示为经由限制酶NotI所切割之线性化片段，或是经由限制酶NotI或SalI所切割之线性化片段。此质粒依本发明说明用于基因转移的构建质粒之组成。

实施例4引入质粒及荧光镜检

在人工条件十四小时光照与十小时黑暗下及以Tetramin(TetraGermany)饲育斑马鱼。受精三十分钟内收集卵且去除连结细丝。将受精卵保持在6℃直到用DNA片段显微注射为止，该DNA片段(如以NotI切割之线性化质粒C或以NotI及SalI切割之线性化质粒C)于第一次分裂前，以10μg/ml浓度注入细胞质。在26℃于蒸馏水中培育经注射卵。在明亮域下用解剖立体显微镜(MZAPO，Leica，Germany)观察胚胎。检测绿及/或红色荧光之暗域发光系以配备GFP及/或红色荧光蛋白之立体显微镜执行。用带有ISO 400底片与底片定时曝光之控制器之相机拍照。

实施例5：制造可表达两种荧光之转基因斑马鱼

斑马鱼繁殖

将一池的雄性及雌性斑马鱼养在一个60×20×30厘米之玻璃鱼缸，将温度设在28.5℃及14小时的照光周期。每天以丰年虫喂鱼两次，之后，挑选出数对强壮之雄性与雌性斑马鱼，并置于一个附有收集卵的网子之30×10×20厘米的孵育槽中。为了建立转基因株，将一对转基因鱼和野生种养在22×14×13厘米的缸中。

基因转移和原种转基因鱼(transgenic founder)之筛选

以塑料毛细管收集受精卵，并放在架子内。在开口10μm的玻璃针中装满线性化的质粒溶液，并以矿物油固定。接着将体积2-4nl的DNA样本显微注射至单细胞之受精卵中。将注射过之受精卵放在含有低浓度的甲基蓝溶液之培养皿中孵化，并置于设定28℃之培养箱中。于第三天时，使用荧光显微镜即可观察到表达出荧光的胚胎。五天后，将荧光斑马鱼移至饲养之鱼缸中。12周后便可达到性成熟。

荧光转基因斑马鱼之种系传递的产生

将带有荧光表达的推定原种转基因鱼和野生株进行杂交。转基因F2)第二代)由两个荧光F1之间互相杂交而来，这种鱼终其一生都可观察到荧光的表达。

实施例6：荧光转基因鱼的潜在应用

荧光转基因鱼在市场上可用来作为观赏鱼。可进行GFP转基因动物与野生鱼类或另一种转基因鱼的配种来开发出稳定的转基因株。经由分离出更多的斑马鱼基因启动子，例如具有眼睛特异性、骨特异性、尾巴特异性等，以及/或经由传统的方法饲养这些转基因斑马鱼，便可制造出更多种类的荧光转基因斑马鱼。

因为蓝色荧光蛋白(BFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因及青绿色荧光蛋白(CFP)基因都可于Clonetech买得到，因此利用相同的技术便可产生出多种颜色的荧光鱼。例如，在具有眼睛特异性的启动子之下带有GFP、在具有皮肤特异性的启动子之下带有BFP、以及在具有肌肉特异性的启动子之下带有YFP的转基因鱼，将出现下列多种的荧光色：绿眼、蓝皮肤及黄眼睛。将具有不同组织特异性的启动子及荧光蛋白基因重新组合后，将可创造出更多不同颜色变化的转基因鱼。利用相同组织来表达二种或二种以上不同的荧光蛋白，便可创造出一种中间色。

通过使用重金属(例如镉、钴、铬)或荷尔蒙(例如雌激素、雄性素或其它类固醇荷尔蒙)可诱导的启动子，可开发出一种用来监控环境污染及评估人类饮用及水耕用的水质之生物感测系统。在这样的一个生物感测系统中，当如重金属及雌激素(或其衍生物)之类的污染物在水中环境达到域值浓度时，转基因鱼便会发出绿色的荧光(或其它颜色，视所使用之荧光蛋白基因而定)。此一生物感测系统优于传统的分析方法，因其速度快、可看得见、以及可直接鉴别出水中环境所发现到的复杂混合物中的特定化合物，且便于携带或较不需要附属的仪器。除此之外，生物感测系统也可提供有关生物毒性之直接信息，且其为生物所能分解及可再生的。

数种物质的环境监控，亦可通过创造出一种具有可编码出由对各种物质有反应的启动子所驱动之不同颜色的荧光蛋白的基因之转基因鱼，然后便可观察到鱼在环境中所显示出的特定颜色。或者，也可以特有的载体来转化一些鱼，然后可将这些鱼掺入用来监测环境的鱼群中，并观察每一只鱼所表达出来的颜色。

此外，荧光转基因鱼在科学研究材料的市场中应该也具有价值，因为它们可用于如追踪细胞品系及细胞迁移之胚胎方面的研究。表达GFP之转基因鱼的细胞也可用来作为细胞移植及细胞核移植实验中的细胞及遗传标记。

本发明已成功地证明可在斑马鱼上建构两个荧光基因，这也能用于其它种类的鱼，例如青鳉鱼、金鱼、包括锦鲤在内的鲤鱼、鳅鱼、吴郭鱼、吻仔鱼、鲶鱼、天使鱼、七彩神仙鱼、鳗鱼、斗鱼、虾虎鱼、马甲鱼、孔雀鱼、剑尾鱼(红剑)、hatchet鱼、摩利鱼、淡水鲨鱼等。

以上所述者，仅为本发明部份优选实施例的说明，故凡应用本发明说明书及权利要求书的等效方法的变化，理应包含在本发明之专利范围内。

Claims (9)

1.一个重组质粒，包含：(a)一个普遍存在的启动子，(b)一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该普遍存在的启动子的下游，(c)一个皮肤特异性或肌肉特异性的启动子，以及(d)另一个荧光基因，该基因可操控连接并插入该皮肤特异性或肌肉特异性启动子的下游，其中该普遍存在的启动子与该皮肤特异性或肌肉特异性启动子具有反向性，且该普遍存在的启动子与该皮肤特异性或肌肉特异性启动子分别位于该荧光基因及该另一个荧光基因的上游，以具有供所述基因转录的方向性。

2.权利要求1的重组质粒，其中该普遍存在的启动子选自由β-肌动蛋白、elongation-1-α、18S-rDNA或5S-rDNA所组成的组。

3.权利要求1的重组质粒，其中该皮肤特异性或肌肉特异性的启动子选自由α-肌动蛋白、肌钙蛋白(troponin)T、肌钙蛋白C、肌凝蛋白重链、细胞角质蛋白II C型(cytokeratin type II C)或S-100所组成的组。

4.一种宿主细胞，其包含权利要求1的质粒。

5.一种产生转基因鱼的方法，该方法包含：

a)将权利要求1的质粒导入鱼卵细胞或胚胎细胞中，以及

b)使该卵细胞或胚胎细胞发育成鱼，其中权利要求1的质粒导入此鱼的基因组中。

6.权利要求5的方法，其中所述鱼选自由青鳉鱼、斑马鱼、七彩神仙鱼、金鱼、鳉鱼、慈鲷、孔雀鱼、龙鱼、鲤鱼或斗鱼所组成的组。

7.一种制造同时表达两种不同荧光基因的转基因鱼的方法，该方法包含下列步骤：

a)在适当的限制酶切割位置，以限制酶切割权利要求1的质粒，以获得两个质粒片段I及II，其中该质粒片段I含有权利要求1所定义的a)及b)片段，而质粒片段II则含有权利要求1所定义的c)及d)片段；

b)分别将该步骤a)的质粒片段I及II导入鱼卵细胞或胚胎细胞内，及

c)使该鱼同时表达出质粒片段I及II。

8.权利要求7的方法，其中该荧光基因选自由绿色、红色、黄色或蓝色荧光基因所组成的组。

9.权利要求8的方法，其中该荧光基因选自由绿色或红色荧光基因所组成的组。