CN103540611B - 一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用能在全身普遍启动表达的启动子驱动可变色光诱导荧光的表达，从而提供了一种能够全身表达可变色光诱导荧光观赏鱼的方法及其由此获得的可变色光诱导荧光观赏鱼，并进一步提供了一种针对体表色素较多的鱼种进行基因改造，将其转化为一种能够全身表达可变色光诱导荧光的观赏鱼的方法以及由此获得的产品，同时为了保证生物安全性，对该观赏鱼实现了绝育。本发明同时还提供了针对其他水生生物，如虾、水母构建全身发可变色光诱导荧光的观赏品种的方法。因此，本发明实现了通过人工改变激发波长，让鱼在数秒内从一个颜色变成另一个颜色，产生有趣的观赏效果，扩展传统的观赏鱼市场的格局。

Description

一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法

技术领域

本发明涉及生产荧光观赏鱼的方法，特别是涉及生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法。

背景技术

观赏鱼是一个有全球市场的鱼类产业，而荧光鱼由于可以获得区别于传统鱼的引人注目的色彩、尤其在光线较暗的情况下有奇特的装饰效果，因此极大的改变了观赏鱼市场的格局。目前利用转基因技术可以在短时间内获得具有特定性状的鱼，而不需要通过传统的杂交技术来缓慢改变鱼的特性。利用转基因技术获得荧光观赏鱼已经取得了巨大的商业价值。

现有技术中已存在多种将外源基因置入鱼中的技术，包括微注射、病毒介导的基因整合基因重组、基因敲除、以及转座子等技术。目前，已有一些利用转基因技术构建荧光观赏鱼的报道，如台湾邰港公司将荧光蛋白连接启动子转入鱼内基因组中，获得了多个观赏鱼种；新加坡国立大学将四种特异性的启动子连接单一荧光，在荧光鱼的特定部位表达荧光基团。美国YorktownTechnology公司也通过特异性启动子驱动蓝色蛋白在鱼体内的表达。

荧光观赏鱼的现有技术（例如CN1590548A、CN1647625A、US7135613、US8232450、US7700825等）均存在以下弊端。首先，现有的荧光观赏鱼构建技术中实现的均是荧光蛋白的组织特异性表达，即仅在鱼的特定组织出现荧光，由此构建的荧光鱼从视觉角度缺乏一定的观赏性。其次，实现的均是单色荧光的表达，不能在外界的刺激下改变颜色，由此获得的荧光观赏鱼缺乏一定的互动性或趣味性。此外，一些鱼体自身体表色素沉淀较多，导致鱼体表面透明度降低，这不但屏蔽了激发光对荧光基团的激发，导致荧光基团发光效率低，而且遮阻了荧光基团的发射光到达体外，从而进一步降低了观赏性。上述专利为了在一定程度上挽救这个缺点，不得不用很强的启动子来驱动荧光基团的表达，但代价却是荧光基团的光毒性造成鱼的健康受到影响，使得鱼的寿命大大缩短。

此外，现有技术中所获得的荧光鱼均未实现绝育化，这样的转基因鱼种一旦进入自然环境，可能对自然界物种造成不可预知的潜在危害。

发明内容

本发明的目的是要克服现有技术中的至少一个缺陷，提供一种生产荧光蛋白能够全身表达并且在光刺激下荧光颜色可变的观赏鱼的生产方法。在本发明中，将这种新的鱼种称为“可变色光诱导荧光观赏鱼”。

进一步地，本发明还提供了生产可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体的方法，生产可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育体的方法以及针对体表色素较多的鱼种进行基因改造使其适于用来生产可变色光诱导荧光观赏鱼或使得所生产的可变色光诱导荧光观赏鱼能够更佳地全身表达可变色光诱导荧光。

本发明揭示的原理还可适用于其他水生生物（例如虾、水母等），构建全身发可变色光诱导荧光的其他观赏性水生生物。

本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法，包括以下步骤：

步骤A：构建可变色光诱导荧光蛋白的重组转座载体，其中所述可变色光诱导荧光蛋白选自PA-GFP、PA-RFP-1、PS-CFP2、Kaede、KiKGR、MonomericEos、Dendra-2、FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，优选为Kaede；

步骤B：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；

步骤C：筛选并鉴定出能够稳定表达可变色光诱导荧光蛋白的鱼种，以获得可变色光诱导荧光观赏鱼。

进一步地，所述重组转座载体中的启动子为能在鱼全发育期以及全身稳定驱动表达的启动子，优选为Ubiquitin启动子。

进一步地，所述重组转座载体为Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2载体，其序列结构如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，在所述步骤C之后还包括如下获得所述可变色光诱导荧光鱼的纯合体F3的步骤：

将所述步骤C中获得的所述可变色光诱导荧光观赏鱼与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F1，从所述杂合体F1中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1；

选取单只全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F2，从所述杂合体F2中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；

将筛选出的所述雌鱼和所述雄鱼进行交配，得到所述可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3从所述纯合体F3中筛选出含有可变色光诱导荧光蛋白的纯合可变色光诱导荧光观赏鱼。

进一步地，本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法还包括如下绝育步骤：

通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体；

将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的二倍体和所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体进行杂交，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育的三倍体。

进一步地，所述温度物理绝育处理法包括：将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵置于42℃的养鱼水中，热激10分钟。

进一步地，本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法还包括如下色素基因敲除步骤之一：

在所述步骤A之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者

在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。

进一步地，所述待处理鱼种为斑马鱼，被敲除的所述鱼体色素基因是斑马鱼golden基因。

进一步地，所述色素基因敲除步骤包括：

在所述斑马鱼或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的golden基因组外显子区域中，寻找NGG的特征序列，其中紧邻NGG之前20bp序列即为候选的目标序列；

将所述目标序列构建入pT7gRNA载体；

将含有所述目标序列的pT7gRNA载体与Cas9mRNA共同注射入所述斑马鱼的单细胞期受精卵或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵中，并将其培养成幼鱼；

根据所述幼鱼的鱼体颜色的深浅筛选出色素基因敲除成功的幼鱼作为之后繁殖的种鱼，以制备出敲除了鱼体色素基因的待处理鱼种或生产出敲除了鱼体色素基因的可变色光诱导荧光观赏鱼。

本发明利用能在全身普遍表达的启动子驱动可变色光诱导荧光蛋白的表达，实现了通过人工改变激发波长，让鱼在数秒内从一个颜色变成另一个颜色的有趣的观赏效果；或者还可以让鱼体在某一种特定激发波长下，颜色还可以变回原来的颜色。这种加入了人为控制元素的荧光鱼能够更有效地装点所在的环境，增加人鱼互动，提高趣味性，极大地扩展了观赏鱼市场的格局。

根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。

附图说明

后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例，附图中：

图1是在根据本发明一个实施例的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法中构建的Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2载体的结构图。

图2是根据本发明一个实施例生产的可变色光诱导荧光观赏鱼的嵌合体F0的PCR验证图，其中水平箭头所标示的条带在600bp左右，此为目的条带；竖直箭头所标示的是没有条带的组，这样的组是本发明所不期望的。

图3A和图3B是根据本发明一个实施例生产的可变色光诱导荧光观赏鱼在激发光处理前后的荧光图，图中例示出的可变色光诱导荧光观赏鱼是同一条纯合子斑马鱼，其中图3A是没有发生光转换时，斑马鱼在450nm-550nm的激发光下的颜色，释放出绿色的发射光；图3B是用390nm左右的光照射斑马鱼1min后，斑马鱼体内的Kaede蛋白发生构像变化，在550nm-600nm的激发光照射下，释放出橘黄色的发射光。

图4是利用Realtime-PCR技术（实时荧光定量PCR技术）鉴定纯合子和杂合子的结果图。A组的两条线是杂合子和纯合子内参GAPDH的曲线，B组的三条线是实施例1步骤4中获得的纯合子Kaede的线，C组的三条线为实施例1步骤3中获得的杂合子Kaede曲线。A组的两条曲线起来的循环数都在10.5左右，说明内参GAPDH的表达量一致。B组比C组早起来一个循环左右，这说明B组Kaede的表达量高一倍。通过观察曲线起来数值的高低，可以判断纯合子B和杂合子C。

图5A、图5B和图5C是通过流式细胞仪（FACS）检测鱼的红细胞相对DNA含量来鉴定和区分多倍体鱼的鉴定结果图，其中图5A是二倍体鱼的鉴定结果图，B图是三倍体鱼的鉴定结果图，C图是四倍体鱼的鉴定结果图。

图6是golden基因敲除的分子生物学验证图。M表示标记（marker），G1和G2分别是色素敲除的纯合子和杂合子鱼的部分组织提出的基因组DNA，经过基因型鉴定PCR，退火并T7E1酶处理后的产物。NC是野生型斑马鱼的鱼的部分组织提出的基因组DNA，经过基因型鉴定PCR，退火并T7E1酶处理后的产物。G1-G1表示G1自己和自己退火，G1-NC是纯合子和野生型退火。由于纯合子golden靶标区域被切割，所以G1-NC退火后，可以形成错配，受到专门切割双链错配的酶T7E1切割，形成横向箭头所指部分的两条带。而纯合子本身不会形成错配，因此箭头所指区域没有带出现。G2-G2表示自己和自己退火，G2-NC是杂合子和野生型退火。由于杂合子本身既有被切割的golden靶标区域，也有未切割的靶标区域，所以可以形成错配，受到专门切割双链错配的酶T7E1切割，形成横向箭头所指部分的两条带。同理，G2-NC也出现切割的两条带。

图7A和图7B是在本发明的实施例2中进行色素基因敲除步骤前后后的鱼体颜色的比较图，其中图7A示出的是正常的斑马鱼，图7B示出的是敲除了golden基因后的斑马鱼。图7B所示斑马鱼的体色明显变浅，体表相对而言较为透明。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将首先描述本发明中采用的主要技术，然后结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

一.可变色光诱导荧光蛋白的选择

区别于普通的荧光蛋白（例如GFP,eGFP,RFP,DsRed等），可变色光诱导荧光蛋白在特定激发波长的刺激下，可以更改自身的颜色。目前已有的可变色光诱导荧光蛋白分为以下三类：不可逆光激活荧光蛋白（Irreversiblephotoactivatable fluorescent proteins）,光变换荧光蛋白（Photoshiftablefluorescent proteins）和可逆光激活荧光蛋白（Reversible photoactivatablefluorescent proteins）。这三类光诱导变色蛋白的代表分别是PA-GFP、Kaede和Dronpa。

在本发明的一些实施例中，主要采用Kaede可变色光诱导荧光蛋白来实现可变色光诱导荧光观赏鱼的构建。Kaede是一种从脑珊瑚（Trachyphylliageoffroyi）中克隆出来的、能够在紫外线350-400nm的激发下快速从绿色变成橘黄色的荧光蛋白。Kaede所包含的His-Tyr-Gly三肽是变色的核心区域。在紫外线的照射下，绿色荧光蛋白会以一种渐变的方式变成橘黄色荧光蛋白，橘黄色/绿色荧光强度比率增强2000倍以上。被紫外激发为橘黄色的荧光蛋白可以在正常的细胞有氧状态下稳定存在。同时，实验表明这种蛋白可以自由分布在整个细胞质内，因此其最初是被用来标记细胞。

此外，其他一些光诱导荧光蛋白，例如PA-GFP、Dronpa，也可作为可变色光诱导荧光蛋白应用于本发明的具体实施例中。

二.质粒构建相关元件的选择

本发明中实现转基因的技术包括病毒侵染法，Tol2技术和同源重组技术。上述转基因技术均可应用于本发明的具体实施例中。在本发明的实施例中，是将可变色光诱导荧光蛋白加入转座质粒，从而将特定的基因插入待处理鱼种例如斑马鱼的基因组中，实现稳定表达。

此外，本发明所选取的启动子是可以在鱼种以及其他水生物品种的全发育时期、全身稳定普遍启动表达的启动子，由此来驱动可变色光诱导荧光蛋白在宿主中的表达，本发明所用的启动子被特别地优选为Ubiquitin启动子。将启动子和后续的可变色光诱导荧光蛋白编码基因连接在一起，整合入鱼及其他水生物基因组中。

三.基因整合的方法及鉴定

把不含内毒素的大提后的质粒，通过显微注射打入待处理鱼种的受精卵中，等待这些受精卵发育成幼鱼。鱼体透明，目的序列整合入基因组的鱼，会显示特定的变色荧光。将这些鱼收集并培育养大，得到可变色光诱导荧光观赏鱼（更具体地，此时得到的是可变色光诱导荧光观赏鱼的嵌合体F0）。

四.获得稳定表达的子代

选择生殖细胞中表达荧光的嵌合体F0和野生型进行杂交，后代中如果仍然有可变色光诱导荧光的个体，属于杂合体F1。将这些发荧光的杂合体F1的单个个体和野生型再次进行杂交，它们的后代仍然有荧光的是杂合体F2。由于杂合体F2来源于同一个父母（杂合体F1和野生型），因此插入的荧光片段在基因组的位置是一样的。将杂合体F2内的雌鱼和雄鱼杂交，在杂交获得的后代中，有1/4概率得到可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3。纯合体由于带有两倍于杂合体的基因，因此荧光亮度高于后者，可以通过荧光强度的办法来区分开。为了进一步验证，在不伤害鱼的生存能力前提下，将候选的荧光鱼剪去部分组织，通过Realtime-PCR技术进行鉴定，可将纯合体与各代杂合体及嵌合体区分开。

五.种鱼的多倍体化进行绝育

对可变色光诱导荧光鱼纯合体的单细胞期受精卵进行42℃热激处理10分钟，诱导产生多倍体（其中包括三倍体和四倍体）的可变色光诱导荧光鱼纯合体。通过将二倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体和四倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体杂交产生三倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体，由于三倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体是不可育的。所以这种三倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体不会和野生鱼种进行生殖，不会对自然界造成影响。

优选地，通过将生产出的可变色光诱导荧光鱼成鱼的尾巴减掉一些组织，从中提取相应基因，然后通过流式细胞仪（FACS）检测相对DNA含量，检测该基因的表达量，可以区分开二倍体、三倍体和四倍体。

保存四倍体的纯合体种鱼，将四倍体的纯合体种鱼和普通的鱼杂交产生三倍体后代。由于三倍体无法和二倍体产生可育后代，由此获得的三倍体可变色光诱导荧光观赏鱼是不可育的，不会对自然界产生物种方面的危害。

六.色素的清除

一些鱼种体表色素沉淀比较多，如前所述，荧光效果大打折扣。因此，需要对这些鱼体进行改造。本发明采用基因敲除技术，优选Cas9系统，通过对特定序列的色素基因——如斑马鱼中的golden基因，nacre基因和roy基因——进行切割敲除，从而可以达到去除鱼体色素的目的。由于本技术很强的普遍适用性和应用价值，因此理论上，它可以广泛适用于任何一种体表有色素沉积不透明影响荧光效果的水生生物。

具体地，在本发明中，可以在获得在可变色光诱导荧光观赏鱼之前，通过基因敲除技术对待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者也可以在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。

七.鱼种的选择

本发明优选采用Tol2转座技术。根据目前的文献报道和实验证据，该转座技术可以广泛地适用于鱼、两栖类动物以及鸡等多种动物，甚至在哺乳动物例如老鼠的细胞中也具有很高的转座效率。因此，本发明可以广泛地应用在各个鱼种，甚至在一些低等动物中也有潜在的应用价值。

本发明适用于几乎所有的鱼种，包括斑马鱼、鳉鱼、鲶鱼、慈稠、斗鱼、鲤科和加拉辛科等。慈稠包括非洲慈稠、南美慈稠、短稠、神仙鱼和七彩神仙鱼。斗鱼包括斗鱼和彩兔。鲶鱼包括鼠鱼、琵琶鱼或者翼甲鲶（Pterygoplichthys）。加拉辛科包括灯鱼和斧头鱼。鲤科包括锦鲤和金鱼。鳉鱼包括青鳉鱼、卵生鳉鱼或卵胎生鳉鱼。

同时，本发明还可适用于其它水生生物，包括虾，水母，乌贼，鱿鱼等。虾包括青虾、河虾、草虾、小龙虾、对虾、明虾、基围虾、琵琶虾、龙虾等。水母包括、钵水母纲和立方水母纲的200多种生物，也包含广义的具水母型(钟形或碟形)的刺胞动物，如水螅水母、管水母(包括僧帽水母)，不属钵水母纲的栉水母和海樽等。

实施例1可变色光诱导荧光观赏鱼的构建

步骤1：构建Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2载体

（1）目的片段的扩增和获取

PCR扩增目的片段：用以下引物PCR出目的片段Kaede（52℃，30个循环）：

Kaede-F-SpeI:GGACTAGT ATGAGTCTGATTAAAC；

Kaede-R-EagI:ATCGGCCG TTACTTGACGTTGTCC。

配方如表1所示。

表1

组分	用量
		ddH2O	20μL
2×PCR混合液(Biomed)	25μL
		PCR模板	1μL

Kaede-F-SpeI	2μL
		Kaede-R-EagI	2μL
总计	50μL

PCR程序设计：

第一步：95℃1min；

第二步：94℃30s；

第三步：52℃30s；

第四步：72℃1min；

第五步：返回到第二步，循环30次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

其中，PCR模板（PCR template）来源于人工合成的Kaede的序列。正向和反向引物是由Biomed公司合成的，其被稀释为10nM的工作浓度。2×PCR混合液购自于Biomed公司。总PCR体积是50μL。反应结束后，PCR管内的产物放在4℃冰箱保存，或者直接进行以下步骤。

电泳并回收PCR产物：把PCR产物，加入10%的加样缓冲液（loadingbuffer）混匀，加入配好的1%的琼脂糖凝胶的样槽中，120V恒压20min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，比对参照梯状条带（ladder），在800bp左右，切下目的片段的琼脂糖胶。

用购买自全式金公司的胶回收试剂盒，进行胶回收，步骤如下：加入3倍体积的溶胶液GSB，65℃加热7min，其中反复颠倒混匀几次，至琼脂糖凝胶完全溶解，混合液体完全透明为止；待混合液体降到室温后，加入到胶回收柱子上，等待1min，6000g转速1min离心，把混合液再次加入柱子中，离心后丢弃溶液；在柱子中加入600μL漂洗液，6000g转速1min，弃液体。空转柱子离心，12000g转速2min甩干；将柱子放入65℃烘箱静置1min，每个柱子加入45μL预热过的超纯水，12000g转速1min离心下来，得到的溶液就是包含目的片段的溶液了。

扩增启动子序列：用和第一步PCR类似的过程，得到包含Ubiquitin启动子目的片段（Ubiquitin启动子序列来自于从斑马鱼提取出来的基因组）。扩增Ubiquitin启动子的上下游引物如下：

Ubiquitin启动子-F-HindIII:CCCAAGCTT TTAATCTCAAAAAACA；

Ubiquitin启动子-R-SpeI:GGACTAGT CCATGGTCCAGCCTGC。

（2）PCR产物和载体酶切

在50μL体系中，加入目的片段Kaede的PCR回收产物40μL，5μL的10X缓冲液，0.5μL的100X的BSA，2.5μL超纯水，1μL SpeI-HF内切酶（内切酶均来自NEB公司），1μL EagI内切酶，震荡混匀后，放于37℃水浴酶切1小时，之后放在65℃水浴20min热失火内切酶停止反应。

同样，对mini-Tol2载体用HindIII-HF和EagI内切酶，Ubiquitin启动子片段用HindIII-HF和SpeI-HF内切酶进行酶切1小时。之后，放在65℃水浴20min热失火内切酶停止反应。

酶切产物回收：对于50μL的酶切体系，加入150μL溶胶液GSB混匀，加到胶回收柱子上，室温静置1min后，6000g转速离心，再次把液体加入柱子，6000g转速离心。加入600μL漂洗液，12000g转速1min离心，丢弃液体，空转柱子12000g转速2min甩干。放入65℃烘箱1min晾干，加入预热过的40μL液体，12000g转速1min离心，得到的液体包含酶切后的产物。用Nano-drop仪（微量蛋白核酸仪）测量溶液包含的DNA浓度。

（3）连接

在10μL连接体系中，加入1μL的10X缓冲液，1μL的连接酶（T4连接酶，NEB公司），剩下的8μL体积，按照DNA的摩尔比1:1:1加入酶切后的mini-Tol2，Ubiquitin启动子和Kaede产物，进行三段连接。混匀后放于16℃恒温过夜连接24h以上。

（4）转化涂板，鉴定阳性克隆

连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中，冰浴30min后，加入到42℃水浴热激90s，放到冰上2min冷却。加入400μL的LB培养基，37℃摇床内复苏20min后取出。涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止。平板放在37℃培养箱过夜。

鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL白枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，取1μL作为PCR模板，加入Ubiquitin启动子-F和Kaede-R两个引物，52℃进行PCR反应20个循环。在0.7%的琼脂糖凝胶上，加入10%加样缓冲液混匀后，加入到琼脂糖凝胶的样孔内，120V恒压20min电泳。紫外照射下，对比参照梯状条带，在目的片段附近（4300bp）有条带的菌落，是阳性菌落，加入4mL带Amp+抗性的培养基摇菌，37℃过夜后提质粒。

提取质粒步骤如下：用2mL离心管12000g转速1min收集菌液，离心管底部可以看到黄色固体。丢弃上清液体。加入250μL溶液1，用枪头打均匀后，加入250μL溶液2，混匀。上下缓慢颠倒离心管6-8次，静置2min。可以看到溶液变清澈。加入350μL溶液3，上下缓慢颠倒6-8次，可以看到白色浑浊出现。12000g离心15min后，可以看到液体分为两层，底部白色絮状沉淀，上面液体澄清。小心吸取上清液体，加入到小提柱子上，静置1min后，12000g离心1min。把液体再次放在柱子上，12000g离心1min。加入600μL漂洗液，12000g离心1min。丢弃液体，空转柱子2min甩干。加入40μL预热的ddH2O液体，12000g离心洗脱，得到小提质粒产物。

用SP6作为测序引物，进行测序，比对序列，正确的即为构建成功的转座载体Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2载体。其序列为序列表中SEQ ID NO:1所示。

（5）目的产物大提质粒

将小提后的质粒送测序，找到序列完全一致的克隆。转化该质粒，涂在平板上，过夜培养。第二天，挑一个单菌落，到4mL带Amp+抗性的培养基的管子里摇菌16小时，再把这些菌液倒在200mL带Amp抗性的LB培养基，37℃摇菌16小时。通过大提质粒的试剂盒（购于Biomed公司），提取无内毒素的质粒。

步骤2：注射载体到鱼体内

（1）斑马鱼的饲养

斑马鱼饲养在28.5℃恒温的鱼房，保持14小时光照/10小时黑暗交替循环，每十升水的鱼缸培养的成鱼数目不超过十条，平时可以把雄鱼和雌鱼混合培养。保持养鱼系统日夜循环水，每天补充10%新鲜的去离子水，水的盐度用NaCl调节保持在450-500us/cm之间，pH用NaHCO3调节保持在7附近。用卤虫作为斑马鱼的饲料，每天三次，分别在上午8时，中午12时和下午17时左右，投喂前停止循环水，每十升鱼缸加入成活的卤水3mL，投喂后半个小时待鱼充分进食后开启循环水。及时清理残渣，避免污染系统。

（2）配鱼和收卵

营养充足时雌鱼每周可以产卵一次，每次产卵平均200枚左右，雄鱼每周可以交配两次，选择7-18个月龄的斑马鱼，产卵量和质量最佳。配鱼时，在喂完晚餐后30分钟后，在配鱼的专用鱼缸中，加入雌雄比2:1放置不多于八条的斑马鱼，用隔板将雌雄分开，放入三分之二的养鱼水。

第二天早晨抽去隔板，雄鱼开始追逐雌鱼，一般在15分钟雌鱼开始排卵，雄鱼将精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培养皿中，去除死卵和杂物，用养鱼水洗涤几次，等待注射。

（3）准备注射用的质粒，mRNA

每个鱼卵需要注射Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2质粒和Tol2mRNA。Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2用大提后无内毒素的质粒。Tol2mRNA需要经过以下两步得到：体外转录和mRNA提取。

体外转录：将pT3TS Tol2载体进行以下线性化处理：取800ng pT3TS Tol2载体质粒，加入XbaI内切酶1μL，10×缓冲液2μL，其余体积是ddH2O，配成20μL的酶切体系，放在37℃的水浴锅内酶切2小时。反应结束后，加入1/20体积0.5M EDTA，1/10体积的5M NH4醋酸盐，2倍体积的无水乙醇。混匀，放在-20℃冷冻20分钟后取出。把液体移到新的离心管中，最高转速离心15分钟。吸取并丢弃上清液，晾干。加入ddH2O溶解，保证最终浓度在0.5-1ug/μL。产物中加入终浓度为100-200ug/mL的蛋白酶K和0.5%SDS，在50℃水浴中反应30分钟。将反应产物通过胶回收试剂盒的柱子回收DNA（购自于全式金）。步骤如下：首先，混合3倍体积GSB溶液，加入胶回收柱子，静置1分钟。14000g离心1min。加入500μL漂洗液，14000g离心1分钟。加入45μL水洗脱，14000g离心一分钟，得到线性化产物。

用购自于Ambion公司的mMessage mMachine试剂盒Kit进行体外转录，步骤如下。

按照表2所示配方，依次加入无核酸酶水（Nuclease-free Water），2XNTP/CAP溶液，10X反应缓冲液，UTP(可选，用作示踪剂)，线性模板DNA和酶混合液。

表2

用量	组分
		至20μL	无核酸酶水
10μL	2X NTP/CAP
		2μL	10X反应缓冲液
(1μL)	(可选，用作示踪剂)[α-32P]UTP
		0.1–1μg	线性模板DNA*
2μL	酶混合液

*使用0.1–0.2μg PCR产物模板或～1μg线性化质粒模板。

轻轻混匀，放在37℃水浴锅中反应2个小时。加入1μL TURBO DNase（脱氧核糖核酸酶），轻轻混匀，在37℃水浴中反应15分钟。保证全程操作用无RNA的枪头和水，以免RNase（核糖核酸酶）混入，降低mRNA的产量。

RNA的提取：用购自Ambion公司的MEGA清洁试剂盒进行这一步反应，步骤如下。在上步的产物加入洗脱液，添加到体积为100μL，轻轻混匀。加入350μL浓缩型结合溶液，轻轻均匀地混匀。加入250μL无水乙醇，用枪头吹打混匀。把混合溶液加入到RNA提取柱子上，10000g离心30秒。加入500μL洗出溶液，10000g离心。重复此过程一次。加入50μL65℃预热过的洗脱液到柱子，10000g离心回收，得到包含目的产物mRNA的溶液。测量浓度。

（4）注射鱼卵

制备注射皿，30mL的1.5%琼脂糖加热融化，倒入直径10cm的玻璃皿中，将模具轻轻覆盖于胶面，待胶凝固后，移走模具。加入少量养鱼水，保持界面湿润。准备注射针，将外径为1.02mm内径0.58mm的玻璃毛细管用拉针仪拉成针形。

受精卵排出后，再过约10分钟卵膜膨胀，随后数分钟内细胞形态变得规整，此时可以开始注射。用无齿镊在体视镜最高倍放大率下将针头折断少许，尽量断成斜切面。用微量上样吸头吸取1-5μL胚胎纤维注射液从针尾穿入注射针上样，随后将注射针插入持针器中固定。将胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液体，使液面刚刚没过鱼卵。

注射时，注射针从胚胎动物极插入到细胞质中和从卵黄中穿过抵达胞质中。每枚卵，Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2质粒注射20pg，Tol2mRNA25pg的混合物。用针尖拨动注射凹槽中的胚胎使细胞质方向与针尖方向一致或者相对，与水平面约成45度下针，扎入到位后踩动踏板注射，略保持后迅速退针，整个过程注意手不要抖动。

注射结束后，将胚胎移至含有养鱼水的10cm培养皿中，再转移到28.5℃的环境中培养，等待孵化。这段时间需要定期检测，去除死胚和脱下的卵膜，并更换养鱼水。大约到4-5天时，胚胎可以进食草履虫，此时应转移至小鱼喂养盒中。幼鱼12天起可以开始用草履虫和卤水混合喂养，注意及时清理鱼缸，保持水质良好。待幼鱼全部吃卤水时（此时幼鱼的腹部呈红色），可转入鱼房喂养。

上述显微微注射的方法同样适用于其他水生物，如括虾，水母，乌贼，鱿鱼等。

步骤3：嵌合体F0的筛选和鉴定

（1）荧光筛选

荧光蛋白在注射10h之后，即胚胎时期出现表达。选取16h为时间点，在荧光显微镜下观察胚胎，发现450-550nm波长激发后，胚胎颜色为绿色。用390nm左右波长的光短暂照射诱导后，胚胎的绿色消失，在550-600nm照射下变成橘黄色。上述可变色荧光的转化，符合Kaede蛋白特性，即Kaede蛋白在昏暗状态的吸收峰是500nm的波长，激发后的颜色是绿色，在明亮状态时的吸收峰在575nm波长，激发后的颜色是橘黄色

挑出有荧光的胚胎继续培养至幼鱼。幼鱼Ubiquitin启动子在斑马鱼全生命周期普遍表达，因此在幼鱼时，仍然会有以上的荧光。将幼鱼放在10cm皿中，再次检查是否都有荧光，丢弃没有荧光的幼鱼，剩下的就是嵌合体F0。

（2）分子生物学验证

荧光鉴定后，还可以进一步采用PCR分子生物学手段，证实荧光蛋白目的基因Kaede的转入。在显微镜下挑出有荧光的斑马鱼，为了进一步验证是否真的含有目的基因Kaede，依次编号并取尾部组织，提取基因组后PCR。产物通过琼脂糖凝胶电泳检测

剪下鱼尾，采用组织提取DNA的试剂盒，提取组织的基因组。以基因组作为模板，用以下引物扩增目的序列，结果显示目的条带为600bp左右（见附图2）。产物通过琼脂糖凝胶电泳，对获得的条带凝胶回收，送测序，所得测序结果与Kaede蛋白吻合。由此获得的即为正确的嵌合体F0。

Kaede-F:TTATGGAAGGCAATGTAAACGG

Kaede-R:TTCTGAAGTCACATCGGTAATG

步骤4：纯合子的获得和鉴定

（1）纯合子的获得

由于嵌合体不是稳定表达的，因此需要进一步获得可以稳定表达的后代。将得到的嵌合体F0和野生型进行大量杂交，后代中仍然显示步骤3中所述荧光特性的个体属于杂合体F1。F1荧光鱼是荧光基因已经整合在基因组当中的个体。将单个杂合体F1和野生型再次进行大量杂交，它们的后代仍然有荧光的是杂合体F2。把F2个体拿出单独培养到成鱼。采用步骤2中所述的培养鱼和杂交鱼的方法，将F2内雌雄鱼杂交，获得的后代中，有1/4概率得到纯合体F3。

（2）纯合体的鉴定

首先通过荧光鉴定，在荧光镜下通过观察荧光强度的办法来简单区分开，纯合体带有两倍于杂合体的基因，因此获得的纯合体荧光亮度高于嵌合体。纯合体荧光鱼在激发光刺激下所发荧光的变化特点与Kaede荧光蛋白的特点符合，结果见附图3。

选取荧光强度高于嵌合体的候选荧光鱼，剪去鱼尾部分组织，用组织提取RNA试剂盒，提出其中的RNA，通过实时定量PCR（RT-PCR）来检测。根据图4结果可见，由于纯合体的两个姐妹染色体都有荧光基因，而杂合体只有一个，因此本发明通过荧光筛选获得的纯合体中，荧光蛋白的RNA水平更高。荧光筛选结果与分子生物学验证结果一致。

步骤5：种鱼的多倍体化以及绝育鱼的培育

用步骤2中所述的配鱼方法，收集大量受精卵。把这些单细胞期的卵置于42度的养鱼水中，热激10分钟。之后再收集回来，放置于正常的培养胚胎的环境中饲养。待这些受精卵长到幼鱼后，进行倍体的鉴定，区分开其中的二倍体，三倍体和四倍体，以及其它倍体。

对每条鱼进行标号，相应地剪掉鱼尾巴一些组织。通过流式细胞仪（FACS）检测红细胞的DNA相对含量，区分二倍体，三倍体和四倍体，结果见附图5。同时，采取核型分析的方法，对第一种方法得到的结果，再次进行验证。取尾部组织，观察处于细胞分裂中期的细胞，细胞内染色体数目是二倍体染色体数目两倍的就是四倍体。

保存四倍体的纯种鱼，通过将四倍体鱼和普通鱼杂交产生三倍体后代。由于三倍体鱼无法和野生的二倍体产生可育后代，因此由此获得的三倍体鱼种是不可育的，即使放到自然界中，不会对自然界产生物种方面的危害。

除了采用温度激休克法外，还可以采用静水压法和电休克等物理办法，或者通过细胞松弛素B，秋水仙素，聚乙二醇，6-二甲基氨基嘌呤等化学物质的处理，将一部分处于囊胚期的卵进行多倍化。

实施例2以体表色素沉淀较多的鱼种为材料构建可变色光诱导荧光观赏鱼

在本实施例中将以斑马鱼golden基因的敲除为例进行说明。

步骤1：构建靶标序列的gRNA载体

首先在NCBI（美国国家生物技术信息中心）的网站上查到斑马鱼的golden基因的基因组序列。找到外显子的区域，锁定目标序列为GTGCAGGAGAGGAAAGATGG。

然后，为构建靶标序列gRNA，合成以下引物：

gRNA-F：CACCGTGCAGGAGAGGAAAGATGG

gRNA-R：ATACCCATCTTTCCTCTCCTGCAC

将终浓度为10nM的引物gRNA-F和gRNA-R等体积混合在一起（各取25μL，总体积50μL）。在PCR仪上，进行退火。程序如下：98℃5min，自然冷却到室温。然后对退火产物进行磷酸化处理，配方如下：10×T4PNK缓冲液，rATP2μL，T4PNK酶1μL，退火产物50pmol，加入ddH2O至总体积50μL。放在37℃水浴反应30min，反应结束后放在65℃水浴失活。

按照以下配方酶切：对pT7gRNA载体进行酶切，配方如下：2μL BBSI内切酶，10μL10×缓冲液，0.5μL100×BSA，800ng pT7gRNA骨架载体，其余体积用ddH2O填充，总体积50μL。反应结束后，65℃水浴20min失活内切酶。

回收酶切产物。在50μL的酶切混合溶液和磷酸化混合液中，分别各加入150μL GSB溶液（购自于全式金），混合均匀。移至胶回收柱子上，静置2min后，12000g离心1min。把液体载体加入到回收柱上，再次离心12000g1min。丢弃液体。在柱子中加入600μL漂洗液，12000g离心1min。丢弃液体，空转离心柱2min，甩干剩余的漂洗液。加入30μL预热过的ddH2O到离心柱，12000g离心1min，得到的液体包含酶切产物。

将酶切退火产物连接到载体中。配方如下：1μL T4连接酶，1μL T4连接缓冲液，6μL退火酶切回收产物，2μL酶切pT7gRNA载体回收产物。放在16℃连接2h。

连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中，冰浴30min后，加入到42℃水浴热激90s，放到冰上2min冷却。加入400μL的LB培养基，37℃摇床内复苏20min后取出。涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止。平板放在37℃培养箱过夜。

鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL白枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，取1μL作为PCR模板，加入验证引物。余下的9μL液体放在37℃摇床扩增。

gRNA-backbone-F：GGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAG

gRNA-R：ATACCCATCTTTCCTCTCCTGCAC

52℃进行PCR反应20个循环。在0.7%的琼脂糖凝胶上，加入10%加样缓冲液混匀后，加入到琼脂糖凝胶的样孔内，120V恒压20min电泳。紫外照射下，对比参照梯状条带（ladder），在目的片段附近（300bp）有条带的菌落，是阳性菌落。把相应的还有菌的9μL液体加入到4mL带Amp+抗性的LB培养基中，37℃摇床上过夜。第二天小提质粒（Biomed小提试剂盒），步骤如下：用2mL离心管12000g转速1min收集菌液，离心管底部可以看到黄色固体。丢弃上清液体。加入250μL溶液1，用枪头打均匀后，加入250μL溶液2，混匀。上下缓慢颠倒离心管6-8次，静置2min。可以看到溶液变清澈。加入350μL溶液3，上下缓慢颠倒6-8次，可以看到白色浑浊出现。12000g离心15min后，可以看到液体分为两层，底部白色絮状沉淀，上面液体澄清。小心吸取上清液体，加入到小体柱子上，静置1min后，12000g离心1min。把液体再次放在柱子上，12000g离心1min。加入600μL漂洗液，12000g离心1min。丢弃液体，空转柱子2min甩干。加入40μL预热的ddH2O液体，12000g离心洗脱，得到小提质粒产物。

用T7作为测序引物进行测序，以最终确定得到的产物序列是否正确。序列正确的质粒就是构建成功的pT7golden target gRNA载体.

步骤2：体外转录及RNA回收

体外转录：

将Cas9-pXT表达载体和上文构建好的pT7golden target gRNA载体线性化处理。步骤如下：取800ng Cas9-pXT7质粒，加入XbaI内切酶1μL，10X缓冲液2μL，其余体积是ddH2O，配成20μL的酶切体系，放在37℃的水浴锅内酶切2小时。取800ng pT7golden target gRNA载体，加入XbaI内切酶1μL，10X缓冲液2μL，其余体积是ddH2O，配成20μL的酶切体系，放在37℃的水浴锅内酶切2小时。

反应结束后，加入1/20体积0.5M EDTA，1/10体积的5M NH4acetate，2倍体积的无水乙醇。混匀，放在-20℃冷冻20分钟后取出。放在小离心管中，最高转速离心15分钟。吸取并丢弃上清液，晾干。加入ddH2O溶解，保证最终浓度在0.5-1μg/μL。产物中加入终浓度为100-200μg/mL的蛋白酶K和0.5%SDS，在50℃水浴中反应30分钟。将反应产物通过胶回收试剂盒的柱子回收DNA（全式金）。首先，混合3倍体积GSB溶液，加入胶回收柱子，静置1分钟。14000g离心1min。加入500μL漂洗液，14000g离心1分钟。加入45μL水洗脱，14000g离心一分钟，得到线性化产物。

用mMessage mMachine Kit（Ambion公司）进行体外转录，步骤如下。

按照表3所示配方，依次加入无核酸酶水，NTP/CAP溶液，10X缓冲液，UTP，线性化产物，酶。

表3

用量	组分
		至20μL	无核酸酶水
10μL	2X NTP/CAP
		2μL	10X反应缓冲液
(1μL)	(可选，用作示踪剂)[α-32P]UTP
		0.1–1μg	线性模板DNA*
2μL	Enzyme Mix

*使用0.1–0.2μg PCR产物模板或～1μg线性化质粒模板。

轻轻混匀，放在37℃水浴锅中反应2个小时。加入1μL TURBO DNase，轻轻混匀，在37℃水浴中反应15分钟。保证全程操作用无RNA的枪头和水，以免RNase混入，降低mRNA的产量。

RNA的提取：用MEGA清洁试剂盒（Ambion公司）进行这一步反应，步骤如下。在上步的产物加入洗脱液，添加到体积为100μL，轻轻混匀。加入350μL浓缩型结合溶液，轻轻均匀地混匀。加入250μL无水乙醇，用枪头吹打混匀。把混合溶液加入到RNA提取柱子上，10000g离心30秒。加入500μL洗出溶液，10000g离心。重复此过程一次。加入50μL65℃预热过的洗脱液到柱子，10000g离心回收，得到包含目的产物mRNA的溶液。测量浓度。

步骤3：显微注射受精卵

收卵：

在喂完晚餐后30分钟后，在配鱼的专用鱼缸中，加入雌雄比2:1放置不多于八条的斑马鱼，用隔板将雌雄分开，放入三分之二的养鱼水。第二天早晨抽去隔板，雄鱼开始追逐雌鱼，一般在15分钟雌鱼开始排卵，雄鱼将精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培养皿中，去除死卵和杂物，用养鱼水洗涤几次，等待注射。

注射：

制备注射皿，30mL的1.5%琼脂糖加热融化，倒入直径10cm的玻璃皿中，将模具轻轻覆盖于脚面，待胶凝固后，移走模具。加入少量养鱼水，保持界面湿润。准备注射针，将外径为1.02mm内径0.58mm的玻璃毛细管用拉针仪拉成针形。

受精卵排出后，再过约10分钟卵膜膨胀，随后数分钟内细胞形态变得规整，此时可以开始注射。用无齿镊在体视镜最高倍放大率下将针头折断少许，尽量断成斜切面。用微量上样吸头吸取1-5μL胚胎纤维注射液从针尾穿入注射针上样，随后将注射针插入持针器中固定。将胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液体，使液面刚刚没过鱼卵。

注射时，注射针从胚胎动物极插入到细胞质中和从卵黄中穿过抵达胞质中。将Cas9-pXT7载体转录出的Cas9mRNA（稀释至300ng/μL），pT7goldentarget gRNA载体转录出的gRNAmRNA（20ng/μL）共同打入斑马鱼的单细胞期受精卵中。每枚卵注射，Cas9mRNA量为25pg，gRNA mRNA量为25pg的混合物。用针尖拨动注射凹槽中的胚胎使细胞质方向与针尖方向一致或者相对，与水平面约成45度下针，扎入到位后踩动踏板注射，略保持后迅速退针，整个过程注意手不要抖动。

注射结束后，将胚胎移至含有养鱼水的10cm培养皿中，再转移到28.5℃的环境中培养，等待孵化。这段时间需要定期检测，去除死胚和脱下的卵膜，并更换养鱼水。大约到4-5天时，胚胎可以进食草履虫，此时应转移至小鱼喂养盒中。幼鱼12天起可以开始用草履虫和卤水混合喂养，注意及时清理鱼缸，保持水质良好。待幼鱼全部吃卤水时（此时幼鱼的腹部呈红色），可转入鱼房喂养。

步骤4：鉴定完成基因敲除的鱼体

提取组织DNA：将注射过的胚胎培养到幼鱼时，依次编号并取一点尾部的组织，进行基因型鉴定。

用MightyAmp Genotyping Kit基因组提取试剂盒快速提取基因组DNA。步骤如下：将组织放入已加入100μL提取液的PCR管中，加入1μL蛋白酶K混匀.放在65℃水浴锅中加热5分钟，再放到98℃的热水中加热2分钟，然后降至室温。室温下离心，使组织材料沉淀，上清为PCR模板。

PCR基因组DNA：

合成以下引物：

golden-F:AGAATGCGAGTGAGTGTGTGCAGC

golden-R:ACGTGGCTCCAGCAACATCCTGCG

表4

名称	用量	终浓度
			2×MightyAmp缓冲液	25μl	1×
引物golden-F	15pmol	0.3μM
			引物golden-R	15pmol	0.3μM
提取液	≦2.5μl
			MightyAmp DNA聚合酶	1μl	1.25U/50μl
ddH2O	高达up to50μl	50μL

按照表4中的体系，并进行如下的PCR程序设定，进行PCR反应。

第一步：98℃2min；

第二步：98℃10s；

第三步：60℃15s；

第四步：68℃30s；

第五步：返回第二步，如此反复30次；

第六步：68℃10min。

反应结束。得到实验组PCR产物。

基因型鉴定：设计golden-F和R按照上述配方，对野生型的斑马鱼进行同样的操作，得到对照组PCR产物。将实验组和对照组PCR产物按如下体系（参见表5）于95℃5min，然后自然冷却到室温进行退火处理。分别加入0.5μL T7E1酶（NEB）于上述三组处理中，37℃反应30min后跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析突变效果。由于T7E1酶切割不完全配对的DNA双链，因此如果发生基因序列的缺失，退火后，有一定比例正常的序列和有序列缺失的序列形成双链，这部分序列就会被切开。

表5

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在500bp特征条带下方，出现两条非常明显的条带，说明鱼的基因组发生了Cas9介导的序列特异性切割，即golden基因的靶点序列附近发生序列的切除，影响golden基因的正常表达（即golden基因敲除）。结果见附图6。

步骤5：基因敲除种鱼的获得

选取golden基因敲除的幼鱼进行培养，待长到成鱼后，鱼体体表相对透明也证实色素基因敲除成功，结果见附图7。由于纯合子基因敲除鱼完全没有golden基因，而杂合子还残留了一定的golden基因可以表达，因此杂合子体表相对还是有颜色，可以作为识别二者的标志。在获得色素基因成功敲除的鱼种后，按照实施例1中步骤1-步骤5的方法构建转基因的可变色光诱导荧光观赏鱼。

至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

Claims (7)

1.一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法，包括以下步骤：

步骤A：构建可变色光诱导荧光蛋白的重组转座载体Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2，该重组转座载体的序列结构如SEQ ID NO:1所示；

步骤B：将重组转座载体和Tol2 mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；

步骤C：筛选并鉴定出能够稳定表达可变色光诱导荧光蛋白的鱼种，以获得可变色光诱导荧光观赏鱼。

2.根据权利要求1所述的方法，在所述步骤C之后还包括如下获得所述可变色光诱导荧光鱼的纯合体F3的步骤：

将所述步骤C中获得的所述可变色光诱导荧光观赏鱼与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F1，从所述杂合体F1中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1；

选取单只全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F2，从所述杂合体F2中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；

将筛选出的所述雌鱼和所述雄鱼进行交配，得到所述可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3从所述纯合体F3中筛选出含有可变色光诱导荧光蛋白的纯合可变色光诱导荧光观赏鱼。

3.根据权利要求2所述的方法，还包括如下绝育步骤：

通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体；

将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的二倍体和所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体进行杂交，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育的三倍体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度物理绝育处理法包括：

将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵置于42℃的养鱼水中，热激10分钟。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括如下色素基因敲除步骤之一：

在所述步骤A之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者

在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，

所述待处理鱼种为斑马鱼，被敲除的所述鱼体色素基因是斑马鱼golden基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述色素基因敲除步骤包括：

在所述斑马鱼或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的golden基因组外显子区域中，寻找NGG的特征序列，其中紧邻NGG之前20bp序列即为候选的目标序列；

将所述目标序列构建入pT7 gRNA载体；

将含有所述目标序列的pT7 gRNA载体与Cas9 mRNA共同注射入所述斑马鱼的单细胞期受精卵或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵中，并将其培养成幼鱼；

根据所述幼鱼的鱼体颜色的深浅筛选出色素基因敲除成功的幼鱼作为之后繁殖的种鱼，以制备出敲除了鱼体色素基因的待处理鱼种或生产出敲除了鱼体色素基因的可变色光诱导荧光观赏鱼。