CN102451177A

CN102451177A - 丁基苯酞或其衍生物在制备促进血管生成药物中的应用

Info

Publication number: CN102451177A
Application number: CN2010105218438A
Authority: CN
Inventors: 黄如训; 裴中; 卢锡林; 曾进胜; 王冠蕾; 区景松; 郭海波
Original assignee: CSPC NBP Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: CSPC NBP Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2012-05-16

Abstract

本发明公开了丁基苯酞或其衍生物在制备促进血管生成药物中的应用。本发明丁基苯酞及其衍生物可对血管内皮细胞表面表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼模型和体外培养的人脐静脉内皮细胞模型均具有显著的促进血管生成的作用，因此可以用于制备促进血管生成的药物，在对其它缺血性相关疾病的应用中也具有潜在的价值。

Description

丁基苯酞或其衍生物在制备促进血管生成药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物用途领域，具体涉及丁基苯酞或其衍生物在制备促进血管生成药物中的应用。

背景技术

血管生成(angiogenesis)是在原有血管网基础上，通过刺激内皮细胞芽出而形成周围组织的小血管生长和侧支循环，生成新生血管的复杂过程。该过程涉及血管内皮细胞外基质降解、内皮细胞向基质降解处迁移、增殖、伸展及管状结构形成和内皮细胞外基质膜产生等多个步骤，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞和多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过渡或抑制血管系统使血管退化。

常用的成血管因子主要由血管内皮生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管生成因子(Ang-1)等。它们在血管新生过程中有协调、互补的作用。VEGF是内皮细胞的特异性有丝分裂原，它可通过与内皮细胞表面的受体VEGF-R1、VEGF-R2特异性结合，介导内皮细胞的迁移、增殖以构建起血管的腔体结构。FGF-1和FGF-2则分别于内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞表面受体FGFR-1和FGFR-2结合，在刺激血管的新生和增加血管强度与韧性方面起重要作用。Ang-1通过与其特异性受体Tie结合后，介导血管内皮细胞及其周围支持细胞参与后期血管的重建工作，在保护新生血管，防治血管渗漏方面起着积极作用。

目前的治疗性血管生成方法中最常用的是外源性促血管生长生成因子(如VEGF或Ang)的基因治疗与重组蛋白质治疗，但促血管生成生成因子转基因治疗存在免疫原性、调控困难；促血管生成生长因子重组蛋白静脉给药存在是否发生其他部位的血管异常生长，甚至发生肿瘤的风险；外源性促血管生成生长因子因半衰期短，难以通过血脑屏障，要反复给药，易出现副作用等问题，限制了其应用。

丁基苯酞(3-正丁基苯酞)又名芹菜甲素，是从芹菜籽中分离出来的一种有效成分，已作为一种多靶点抗脑缺血药，它还具有改善线粒体功能，抗氧自由基，降低细胞内钙水平以及抑制细胞凋亡等作用。中国专利CN03137457.3公开了左旋正丁基苯酞的预防和治疗痴呆的用途；中国专利CN200480029409.0公开了左旋丁基苯酞在制备预防和治疗脑梗塞的药物中的应用；氨丁苯酞对血小板聚集功能的影响。

国内外研究表明，缺血性脑损伤的病理机制非常复杂，有多个病理环节参与，是一个多基因和多靶点参与的过程。

丁基苯酞的动物药效学研究表明，恩必普可阻断缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节，具有较强的抗脑缺血作用，明显缩小大鼠局部脑缺血的梗塞面积，减轻脑水肿，改善脑能量代谢和缺血脑区的微循环和血流量，抑制神经细胞凋亡，并具有抗脑血栓形成和抗血小板聚集作用。恩必普可能通过降低花生四烯酸含量，提高脑血管内皮NO和PGI2的水平，抑制谷氨酸释放，降低细胞内钙浓度，抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制而产生上述药效作用。

但是现有技术没有教导丁基苯酞可以用于制备促进血管生成的药物。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中对丁基苯酞的应用研究中的不足，提供丁基苯酞在制备促进血管生成药物中的新用途，并揭示丁基苯酞在发挥促进血管生成作用的作用机制——丁基苯酞是通过激活Erk1/2通路促进bFGF的表达，从而促进血管生成。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

丁基苯酞或其衍生物在制备促进血管生成药物中的应用。

进一步地，上述丁基苯酞为消旋丁基苯酞，所述衍生物在体内代谢为消旋丁基苯酞。

发明专利CN101337891A公开了根据前药原理，结构式如式I的化合物在体内能释放NO和丁基苯酞，所述化合物结构式如下：

其中A为C₂～C₈烷基、C₂～C₈烯烃基、C₂～C₈烯烃基、苯基或取代苯基、芳杂环或取代芳杂环；所述取代苯基被1个或多个选自于羟基、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、-CH＝CHCOO(CH₂)_n，n＝2～6取代的苯基，各取代基可以相同或不同；所述芳杂环为1至4个杂原子的5至7元芳香环，所述杂原子独立的选自O、S或N；所述取代芳杂环可任选被1个或多个选自于C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基或卤素取代，各取代基可以相同或不同；

R为二甲胺、二乙胺、吡咯、哌啶、吗啡啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、N-苯基哌嗪、N-苄基哌嗪或N-叔丁氧羰基哌嗪。

因此，所述化合物在体内代谢为丁基苯酞，也必然具有促进血管生成的效果。

作为优选，R为吗啉基；A为

所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。

作为优选，R为哌啶基；A为

所述衍生物为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。

作为优选，R为二乙胺基；A为

所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。

作为优选，R为二乙胺基；A为

所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯。

作为优选，R为吗啉基；A为

所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯。

作为优选，R为二乙胺基；A为C4烷基，所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。

作为优选，R为吗啉基；A为C4烷基，所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。

作为优选，R为哌啶基；A为C4烷基时，所述衍生物为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。

作为优选，R为二乙胺基；A为苯环上间位取代基为C2烷基时，所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。

作为优选，R为哌啶基；A为苯环上间位取代基为C2烷基时，所述衍生物即为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。

作为优选，R为吗啉基；A为苯环上间位取代基为C2烷基，所述衍生物即为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。

作为优选，所述衍生物包括[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。

李江、王晓良等公开了消旋2-(a-羟基戊基)苯甲酸钾盐在体内具有与消旋丁基苯酞一致的组织分部与代谢特征(参见dl-PHPB的体内外转化及药代动力学研究，中国药理通讯2007年第二十四卷第三期，50-51)。CN1234541C公开了2-(a-羟基戊基)苯甲酸盐在防治心脑血管疾病方面具有与丁基苯酞相似的药理作用，根据化药药物代谢动力学，本领域人员可以合理预期，结构式如式Ⅱ所示的2-(a-羟基戊基)苯甲酸盐在体内均可离解为丁基苯酞，也必然具有促进血管生成的效果。

更优选地，所述衍生物为2-(a-羟基戊基)苯甲酸盐，结构式如式Ⅱ所示：

其中，M为一价金属离子或是二价金属离子，n＝2或n＝3。

作为优选，2-(a-羟基戊基)苯甲酸盐中所述M为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子、镁离子或锌离子。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)丁基苯酞或其衍生物用于治疗缺血性脑血管疾病的显效率为78.2％，总有效率为94％，并具有见效快、用药安全的特点。丁基苯酞或其衍生物具有出色的安全性单一体结构，同时具有多种药理作用，通过提高脑血管内皮NO和PGI2的水平，降低细胞内钙浓度，抑制谷氨酸释放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等机制，作用于脑缺血所致的多个病理环节；

(2)本发明丁基苯酞或其衍生物可用于制备通过血管生成改善血供挽救缺血性组织的治疗药物，该药物疗效确切，能用于制备治疗需要通过血管生成改善血供的缺血性疾病的药物，同时也是丁基苯酞继脑缺血适应症外的又一新的适应症。

附图说明

图1为Dose-effect relationship of NBP Angiogenic Effects丁基苯酞促血管生的量效关系；

图2为Effect of NBP on HUVEC Invasion In Vitro丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞侵入能力的影响；

图3为Effect of NBP on HUVEC Migration In Vitro丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响；

图4为Effect of NBP on Tube Formation by HUVEC丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞管形形成的影响；

图5为Effect of inhibitor on NBP-induced blood vessel formation in SIVs ofTg(fli:EGFP)zebrafish血管生成抑制剂对丁基苯酞促fli:EGFP转基因斑马鱼血管生成的影响；

图6为Effect of NBP on FGF-2 expression in HUVECs丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞FGF-2蛋白表达的影响。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐述本发明，但实施例不对本发明做任何限定。

实施例1 丁基苯酞对转基因斑马鱼的促血管生成作用

(一)材料与方法

1.药物：丁基苯酞，无色至淡黄色油状液体。溶于DMSO，贮存浓度80mmol/L，保存于-20℃备用。

2.fli 1-EGFP转基因斑马鱼饲养和胚胎的收集

性成熟转基因斑马鱼约3个月大。全自动化控温控光和水处理、循环的斑马鱼专用养殖系统日常维护成鱼，水温度为28.5℃，pH 7.0左右，12小时昼夜时间交替，以孵化的盐水虾和热带鱼饲料交叉喂养。配2％琼脂糖制备注射平皿。将一雌一雄的转基因斑马鱼放置到塑料缸中，透明化板障分离雌雄鱼，阻止其交配产卵。让每对鱼均经历明暗交替的光线变换后，清晨9点鱼房亮灯即拔板，20分钟左右将雌鱼产下并体外受精形成的受精卵于一个细胞期用滤网收集。

3.药物处理及分组

待胚胎分裂至16-256细胞期时，将鱼卵随机置于96孔培养板中。实验组每孔载入3个胚胎及鱼水(速溶海盐40g加蒸镏水1000ml)200ul，于6hpf(hourpostfertilized，受精后小时数)时，加样，使加药后终浓度为10、50、100、150、200uM/ml；28℃培养箱中培养至96hpf，于倒置荧光显微镜下，观察flk-GFP转基因斑马鱼的血管生成情况。由于丁基苯酞先溶解于DMSO中，使用时用去离子水稀释，最终DMSO的终浓度为0.2体积％，所以于同一培养板中，留出两列孔，只加养鱼水和0.2体积％DMSO，作为正常对照组。

4.丁基苯酞促血管生成作用强度

注射之前，以特定参数在高温强力作用下瞬间拉断毛细管玻璃针，分别得到两根一端封闭且细直的注射针，使用锻针仪和磨针仪于光学显微镜下将封闭端切磨形成一小口，尖端粗细适中，保证可以穿破胚胎的膜同时最小限度的损伤胚胎。显微注射前把受精卵整齐地排列在注射盘中的凹槽内，用2.5uL的Eppendorf移液器吸取配制好的VEGF，将注射针插入显微操作持针仪，用钩针调整胚胎位置，用注射针在一个细胞期将1.5ng的VEGF从卵膜注射到细胞质中。注射完毕，立即收集所有注射胚胎，置28℃生化培养箱和养殖水中孵育。

5.荧光显微镜观察斑马鱼胚胎的血管生成

培养至96hpf，于倒置荧光显微镜下，观察fli 1-EGFP转基因斑马鱼的血管生成情况。胚胎脱膜或剥膜后，用吸管将其转移到凹槽玻片上，滴入0.08％Tricaine将其麻醉，在凹槽玻片上，滴3质量％甲基纤维素，用吸管吸取鱼胚，竖直放置待鱼胚下沉到管口，轻轻挤压稍许将其滴到甲基纤维素表面。用发针拨动鱼胚，调整其姿势使适合观察，在倒置荧光显微镜下进行绿色荧光血管的观察。计算肠下血管篮里的血管数和/或突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数。观察、拍照完毕后，在甲基纤维素上滴Holt Buffer将其软化，然后温和地吹吸以释放胚胎。将胚胎放回培养液中待其自然苏醒。

6.统计分析

数据资料以均数±标准差(x±s)表示。统计学处理由计算机运用SPSS 11.0软件进行，组间差异比较用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

(二)实验结果

养鱼水和0.2体积％DMSO的两组正常对照组fli 1-EGFP转基因斑马鱼的肠下血管篮里的血管数都在4-6条之间，突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率为7±3％、8±2％。VEGF组突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率为86±4％。丁基苯酞作用浓度为10、50、100、150、200uM/ml时突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率分别为14±3％、65±3％、71±5％、78±3％、81±3％，与对照组比较，均P＜0.01(见图1)。

本实施例结果表明，丁基苯酞在新生血管的发生和发展中具有明显作用，且呈现剂量依赖(50-200uM)效应。因此，丁基苯酞不仅能成为治疗缺血性脑卒中的药物，对于其它缺血性相关疾病也具有潜在的应用价值，且可能成为该类疾病预防和治疗的核心药物。

实施例2 丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞的促血管生成作用

(一)材料与方法

2.人脐静脉内皮细胞的培养和实验分组

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)采用F-12K培养，于37℃5％CO₂培养箱中进行培养。细胞培养瓶及实验中采用的24孔板在使用前先覆盖一层含有0.1％的明胶，实验中取2-5代进行实验。实验分为阳性对照组(VEGF)、丁基苯酞组及对照组。阳性对照组含浓度为20ng/ml的VEGF和0.1体积％DMSO，丁基苯酞组设为10、50、100、150、200uM/ml 5个剂量组，对照组只加含有0.5体积％FBS和0.1体积％DMSO的培养液。

3.细胞侵入实验检测丁基苯酞对细胞侵入能力的影响

本实验采用Transwell chamber进行。利用微孔滤膜(孔径8uM)把小室分隔上、下二层。实验前滤膜的上、下层预先覆盖体积比分别为1∶30和1∶100(用PBS稀释)的Matrigel。取HUVEC按每孔5×10⁴/300ul注入chamber上层。chamber下层按500ul/孔注入含药液的培养液，每个剂量组设3个复孔，继续培养7小时后，取出chamber，经PBS蘸洗后，用3.7质量％多聚甲醛固定，擦净滤膜内表面细胞，采用浓度为20ug/ml的Hoechst 33342染色，撕下微孔滤膜于载玻片上，100倍荧光显微镜下随机选取3个视野拍照，经Metamorph Imaging Series计算侵入下层的细胞数目。

4.细胞迁移实验检测加药后细胞迁移能力

取HUVEC按每孔1×10⁵/500ul接种于24孔板。正常培养24小时后弃去培养液，换上只含有0.5体积％FBS的培养液预处理24小时以达到细胞同步化。然后，用单位为100ul的移液器滴头在每个孔中沿培养板底部呈“一”字形划痕，在50倍倒置荧光显微镜和CCD相机下每孔任意选取3个视野拍照以记录划痕区的相对距离。按500ul/孔加入含药培养液，每个剂量组设3个复孔，继续培养16小时后，参照先前拍照方式记录加药后划痕区的相对距离。

5.管形形成实验观察加入丁基苯酞后细胞分化情况

微量移液枪头和24孔板在冰上预冷，从-20℃冰箱中取出Matrigel放在4℃冰箱中过夜，使之成为液态。在24孔板中每孔注入300ul体积比为1∶1(用PBS稀释)的Matrigel小心摇动使之均匀分布于孔的各个部位，并避免产生气泡。所有操作必须在冰上进行。然后将24孔板放入37℃5％CO₂培养箱中30分钟。经过清洗、消化后的用含有0.5体积％PBS的培养液进行收集，按每孔1×10⁵/500ul接种于覆盖Matrigel的24孔板中。每个剂量组设3个复孔，继续培养6小时后，在50倍荧光显微镜下每孔随机选取3个视野进行拍照，通过的图像处理软件计算管道交叉点的数目。

6.统计分析

(二)实验结果

1.细胞迁移实验

细胞划痕后16小时，VEGF组划痕区相对距离明显减少，细胞迁移率为60.00％。丁基苯酞组浓度在10、50、100、150、200uM/ml时细胞迁移率分别为5.00％、13.33％、35.00％、46.67％、53.33％(见图2)。与对照组比较，除10uM浓度组外，均P＜0.01，表明丁基苯酞能够明显增强HUVEC的迁移能力，且作用呈量-效关系。

2.细胞侵入实验

通过Transwell chamber检测丁基苯酞对细胞侵入能力的影响，VEGF能很大程度地诱导HUVEC由微孔滤膜上层侵入到下层，侵入率为59.22％；丁基苯酞组侵入下层的细胞数目也明显增多，浓度为10、50、100、150、200uM/ml时细胞侵入率分别为3.70％、20.37％、31.48％、44.44％、50.00％(见图3)。与对照组比较，除10uM浓度组外，均P＜0.01，表明丁基苯酞能够明显增强HUVEC的侵入能力，且作用呈量-效关系。

3.管形形成实验

与对照组比较，VEGF组形成管状结构的数目明显增多，加入丁基苯酞后其管状结构也有所增多，并逐渐交织成网。图像经分析量化后发现：管状分枝点的数目对照组为19/视野，VEGF组为31/视野，丁基苯酞组浓度在10、50、100、150、200uM/ml时其数目分别为20、21、23、26、28/视野(见图4)，与对照组比较，除了10uM/ml组外，其余组均P＜0.01。表明丁基苯酞能明显促进管状结构的形成，且作用呈量-效关系。

本实施例结果表明，丁基苯酞能够明显促进血管内皮细胞侵入、迁移和管状结构的形成，丁基苯酞在新生血管的发生和发展中具有明显作用，且呈现剂量依赖(50-200uM)效应。

实施例3 丁基苯酞促血管生成作用机制研究

(一)材料与方法

2.fli 1-EGFP转基因斑马鱼饲养和胚胎的收集：同实施例1。

3.药物处理及分组

实验分养鱼水组、0.2体积％DMSO组、10uM/L SU5402组、10uM/L SU5416组、100uM/L丁基苯酞+10uM/L SU5402组、100uM/L丁基苯酞+10uM/LSU5416组、100uM/L丁基苯酞组。待胚胎分裂至16-256细胞期时，将鱼卵随机置于96孔培养板(U底)中。每孔载入3个胚胎及鱼水(速溶海盐40g加蒸镏水1000ml)200ul，于6hpf(hourpostfertilized，受精后小时数)时，加样。28℃培养箱中培养至96hpf，于倒置荧光显微镜下，观察flk-GFP转基因斑马鱼的血管情况。

4.人脐静脉内皮细胞的培养和实验分组：

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)采用F-12K培养，于37℃5％CO₂培养箱中进行培养。实验分为阴性对照组、100uM/L丁基苯酞组、100uM/L丁基苯酞组+10uM/L ERK抑制剂U0126组、10uM/L U0126组。

5.丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞bFGF蛋白表达的影响

不同处理的HUVEC分别经冷PBS冲洗3次，加入预冷细胞裂液裂解蛋白120000g离心30min，上清为胞浆蛋白。取40μg的细胞蛋白与等量4×SDS加样缓冲液混匀，置100℃加热蛋白变性5min，点样于SDS-PAGE胶(WISP3，MMP-1用12％SDS-PAGE胶，Collagen type II用7.5质量％SDS-PAGE胶)中电泳，再电转移至PVDF膜上。PVDF膜用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1h，用1mg/L的bFGF抗体加PBST温育2h，PBS洗膜5min×3次，1∶5000抗兔辣根过氧化物酶的PBST温育1h，PBST洗膜10min×3次，ECL(Santa cruz公司)化学发光自显影1min，洗片显带，β-actin多克隆抗体温育同一PVDF膜作内参照。所有杂交信号在BioRad-Jeldoc2000图像分析系统进行光密度扫描，数值以各干预组与β-actin的比值表示。

6.统计分析

(二)实验结果

1.血管生成抑制剂对丁基苯酞促血管生成的影响

养鱼水和0.2％DMSO的两组正常对照组fli 1-EGFP转基因斑马鱼的肠下血管篮里的血管数都在4-6条之间，突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率为8±2％。10uM/L SU5402组、10uM/L SU5416组、100uM/L丁基苯酞+10uM/L SU5402组、100uM/L丁基苯酞+10uM/L SU5416组、100uM/L丁基苯酞组突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率分别为6±1％、6±2％、7±3％、33±9％、35±12％，与对照组比较，SU5402组、SU5416组、100uM/L丁基苯酞+10uM/L SU5402组突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率均明显减少，而100uM/L丁基苯酞+10uM/L SU5416组并没有减少(见图5)。

2.丁基苯酞对人脐静脉内皮细胞bFGF蛋白表达的影响

丁基苯酞组bFGF表达明显增强，阴性对照组、ERK抑制剂U0126组、丁基苯酞加ERK抑制剂U0126组的bFGF表达没有明显变化(见图6)。

本实施例结果表明，VEGF受体-2(VEGFR2/KDR)抑制剂SU5416对丁基苯酞促进斑马鱼的血管生成不产生任何作用，然而FGF受体抑制剂SU5402却显著抑制丁基苯酞对斑马鱼的促血管生成作用，说明了丁基苯酞对斑马鱼的促血管生成作用是与FGF受体相关。在人脐静脉血管内皮细胞Western免疫印迹分析中，丁基苯酞明显增强bFGF表达，而ERK抑制剂U0126即明显抑制了苯酞对bFGF的表达，结果表明，丁基苯酞是通过激活Erk1/2通路促进bFGF的表达，从而促进血管生成。

Claims

1.丁基苯酞或其衍生物在制备促进血管生成药物中的应用。

2.根据权利要求1所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于所述丁基苯酞为消旋丁基苯酞。

3.根据权利要求1所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于所述丁基苯酞的衍生物在体内代谢为消旋丁基苯酞。

4.根据权利要求3所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于所述丁基苯酞的衍生物结构式如式I或II所示：

式I中，A为C₂～C₈烷基、C₂～C₈烯烃基、C₂～C₈烯烃基、苯基、取代苯基、芳杂环或取代芳杂环；R为二甲胺、二乙胺、吡咯、哌啶、吗啡啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、N-苯基哌嗪、N-苄基哌嗪或N-叔丁氧羰基哌嗪；式II中，M为一价或二价金属离子，n为2～3。

5.根据权利要求4所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于式I中，所述取代苯基是被羟基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、-CH＝CHCOO(CH₂)_n中的一个或多个基团取代的苯基，各取代基相同或不同，其中，n为2～6。

6.根据权利要求4所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于式I中，所述芳杂环为1～4个杂原子的5～7元芳香环，所述杂原子独立的选自O、S或N。

7.根据权利要求4所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于式I中，所述取代芳杂环是被C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、卤素中的一个或多个基团取代取代的芳杂环，各取代基相同或不同。

8.根据权利要求4所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于式II中，所述M为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子、镁离子或锌离子。

9.根据权利要求4所述丁基苯酞或其衍生物的应用，其特征在于所述丁基苯酞的衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯或[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。