CN110237087A - 核糖体s6激酶抑制剂sl0101在制备治疗心血管疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制备应用领域，特别涉及核糖体S6激酶抑制剂SL0101在制备治疗心血管疾病药物中的应用。本发明的目的是提供一种治疗心血管疾病的药物，该药物包含通过孤儿核受体Nr4a3为药物靶点进行治疗的物质。优选的，所述物质的有效成分中包含有核糖体S6激酶抑制剂SL0101。一种孤儿核受体Nr4a3为靶点在制备筛选心血管疾病的药物中的应用。为核糖体S6激酶抑制剂SL0101的药物应用提供了十分广阔的前景和重要的意义。

Description

核糖体S6激酶抑制剂SL0101在制备治疗心血管疾病药物中的 应用

技术领域

本发明属于药物制备应用领域，特别涉及核糖体S6激酶抑制剂SL0101在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

背景技术

根据现有的统计数据显示，心血管疾病占据人类疾病负担的首位，而急性心肌梗死发病率和致死率逐年增高。目前，急性心肌梗死的治疗主要有通过即刻的经皮冠状动脉介入手术或通过注射激酶溶栓两种治疗方式。此外，我国的急性ST段抬高性心肌梗死流行病调查数据显示，截止到2011年，我国尚有高达45％的急性ST段抬高性心肌梗死患者未接受经皮冠状动脉介入手术或药物溶栓中的任意一种再通治疗。这也是导致急性心梗致死率居高不下的原因。

根据流行病调查数据显示，城市和农村地区的急性心肌梗死致死率都逐年增高，近年来随着经皮冠状动脉介入手术的普及，城市急性心肌梗死的致死率上升趋势有所减慢，而农村地区急性心肌梗死致死率则明显升高，从2012年至今，均远高于城市。造成这一现象的原因在于，第一，因经皮冠状动脉介入手术的设备昂贵，相关医护核技术人员的培养周期较长，导致在农村偏远地区，经皮冠状动脉介入手术未能普及。第二，注射激酶溶栓治疗效果有限，相当部分的急性心肌梗死患者的阻塞冠脉未能再通。

在科学研究中我们发现，心肌缺血持续一段时间后，心肌细胞内的死亡信号通路已经激活，此后即使接受经皮冠状动脉介入手术治疗，使得冠状动脉的血流再通，仍会有大量心肌细胞发生死亡，导致随后的心脏重塑和心力衰竭。所以，如果能通过药物干预缺血心肌细胞的死亡信号通路，减少急性心肌梗死后缺血心肌细胞的死亡，进而减少心脏重塑和心力衰竭。

蛋白质的磷酸化是调节蛋白质功能的重要方式之一，蛋白质的磷酸化通常通过激酶参与的级联反应进行。其中Ras-MAPK通路对于调节细胞增殖、细胞存活及细胞分化至关重要。MAPK家族包括四个成员，它们是ERK1/2,JNK,p38及ERK5。核糖体S6激酶(RSKs)是Ras-MEK-ERK1/2级联反应的下游成员，能够磷酸化蛋白质结构中的保守Arg-X-Arg-X-X-pSer/Thr基序。由于核糖体S6激酶在各种细胞中的作用底物不同，其在不同细胞中发挥了不同的作用。在肿瘤细胞中，核糖体S6激酶的激活能够促进细胞存活。而在缺血的脑和心脏中，核糖体S6激酶的激活会加重组织缺血损伤。鉴于核糖体S6激酶在肿瘤和其他疾病中发挥的重要作用，核糖体S6激酶成为了一个潜在的药物靶点。核糖体S6激酶抑制剂SL0101是从植物中提取的一种天然黄酮醇苷类化合物，化学名：kaempferol-3-O-(3″,4″-di-O-acetyl-α-l-rhamnopyranoside),又称为SL0101。SL0101能够显著抑制核糖体S6激酶的作用，但其在心肌缺血及心力衰竭中的作用尚未有报道。

即刻早期基因是一类能够在应激、缺氧及其他刺激后能够快速表达，并在受到刺激的早期参与调控细胞增殖，分化和死亡的基因。孤儿核受体Nr4a家族被报道是一组即刻早期基因，具有调控细胞增殖和死亡的作用。Nr4a家族包括3个成员，分别为Nr4a1(Nur77)，Nr4a2(Nurr1)，Nr4a3(Nor1)。该家族三个成员的蛋白结构都具有保守Arg-X-Arg-X-X-pSer/Thr基序，均能够被核糖体S6激酶磷酸化而发挥作用。

Nr4a3作为一种即刻早期基因，在调控细胞增殖、分化、代谢和免疫炎症等方面具有重要作用，但其功能具有组织器官的特异性，目前尚未有文献报道Nr4a3在急性心肌梗死或急性心梗后心力衰竭中发挥的作用。(参考文献：Maxwell M A,Muscat G E O.TheNR4Asubgroup:immediate early response genes with pleiotropic physiologicalroles[J].Nuclear receptor signaling,2006,4(1):nrs.04002.)。

因此本领域迫切需要以上述研究为基础，开发一种以有效的、新的、无毒副作用的用于治疗急性心肌梗死或心力衰竭的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗心血管疾病的药物，本发明通过实验，发现核糖体S6激酶(Ribosomal S6 Kinase,RSK)抑制剂SL0101以孤儿核受体Nr4a3为靶点制备治疗急性心肌梗死或心力衰竭的药物的应用，为核糖体S6激酶抑制剂SL0101的药物应用提供了十分广阔的前景和重要的意义。

Nr4a3基因最早由Keizaburo Miki实验室于1996年克隆，编码出的蛋白质由626个氨基酸组成，分子量约为68kDa(参考文献：Ohkura N,Ito M,Tsukada T,et al.Structure,mapping and expression of a human NOR-1gene,the third member of the Nur77/NGFI-B family[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Gene Structure andExpression,1996,1308(3):205-214.)。

本发明通过以下技术方案实现：

一种治疗心血管疾病的药物，该药物包含通过孤儿核受体Nr4a3为药物靶点进行治疗的物质。

优选的，所述物质的有效成分中包含有核糖体S6激酶抑制剂SL0101。

所述心血管疾病为急性心肌梗死或心力衰竭。

一种孤儿核受体Nr4a3为靶点在制备筛选心血管疾病的药物中的应用。

上述药物应用中涉及的心血管疾病为急性心肌梗死或心力衰竭。

1、本发明通过试验确定了Nr4a3表达与缺血、缺氧之间的关系:

本发明应用实时荧光定量PCR技术，分别检测了正常假手术组(Sham组)和通过结扎冠状动脉左前降支造成心肌梗死组(MI组)的小鼠心脏，以及正常氧组(Normoxia组)和缺氧处理组(Hypoxia组)的新生大鼠原代心肌细胞中Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3的mRNA表达情况。结果表明，发生心肌梗死的小鼠心脏和缺氧处理组的新生大鼠原代心肌细胞中，Nr4a3的mRNA表达明显上调，Nr4a1、Nr4a2的mRNA表达无明显变化。

本发明应用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术，分别从mRNA水平和蛋白质水平，检测了正常假手术组(Sham组)和通过结扎冠状动脉左前降支造成心肌梗死组(MI组)的小鼠心脏，以及正常氧组(Normoxia组)和缺氧处理组(Hypoxia组)的新生大鼠原代心肌细胞中不同时间点Nr4a3的表达变化情况。结果表明，发生心肌梗死的小鼠心脏和缺氧处理组的新生大鼠原代心肌细胞中，Nr4a3的mRNA和蛋白表达在缺血或缺氧早期即可发生明显上调。

2、Nr4a3基因敲除显著减少了心肌梗死后心肌细胞的死亡

本发明选用野生型小鼠、Nr4a3基因敲除小鼠进行试验，结果表明敲除Nr4a3基因显著增加了心梗后小鼠的存活率，降低了梗死面积，保护了心肌梗死后的心脏功能。

3、Nr4a3基因过表达显著促进了心肌细胞的死亡，导致了大量心肌细胞丢失和自发性心脏扩张。

本发明选用心脏特异性Nr4a3转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，Nr4a3在小鼠出生后随着α-MHC的开始表达后随之发生过表达。过表达Nr4a3的转基因小鼠在成年前大量死亡，生存率明显下降；小动物心超发现过表达Nr4a3的转基因小鼠心功能明显降低，心脏增大；取心脏组织石蜡包埋切片后Masson染色发现心脏大量心肌细胞丢失，心脏纤维化明显。

为获得能够稳定繁殖并有在时间和空间上有效控制Nr4a3的过表达，本发明又构建了可诱导型心脏特异性Nr4a3过表达小鼠。该Nr4a3过表达小鼠只有在注射他莫昔芬后才会发生Nr4a3的过表达。我们在小鼠达到10周龄后注射他莫昔芬诱导Nr4a3过表达。过表达Nr4a3小鼠在注射他莫昔芬后同样出现了大量死亡，生存率明显下降；小动物心超发现可诱导型心脏特异性Nr4a3过表达小鼠心功能明显降低，心脏增大；取心脏组织石蜡包埋切片后Masson染色发现心脏大量心肌细胞丢失，心脏纤维化明显。

4、Nr4a3在缺血缺氧条件下，通过促进细胞坏死和细胞凋亡加重心肌缺氧损伤。

本发明选用野生型小鼠、Nr4a3基因敲除小鼠进行试验，结果显示Nr4a3基因敲除小鼠在心梗后第1天和第3天的坏死细胞数目明显少于野生型小鼠。本发明又选用野生型小鼠、Nr4a3基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和心梗手术组，手术组给予冠状动脉左前降支结扎手术，假手术组开胸穿线但不结扎血管。结果显示Nr4a3基因敲除小鼠在心梗后第1天和第3天的凋亡细胞数目明显少于野生型小鼠。

本发明用siRNA敲低H9C2心肌细胞系中Nr4a3，Western Blot鉴定Nr4a3敲低成功，结果显示Nr4a3 KO小鼠心梗后心肌组织和Nr4a3敲低细胞缺氧后，Cleaved-caspase3均明显低于对照组。

此外，本发明用PI染色和Tunel染色检测Nr4a3转基因小鼠和条件性过表达小鼠中坏死和凋亡细胞数目。结果显示Nr4a3过表达小鼠即使没有缺氧处理，也会出现大量坏死和凋亡的细胞。透射电镜的结果也显示，Nr4a3条件性过表达小鼠的心脏出现大量线粒体肿胀，变形。

5、Nr4a3在缺血缺氧条件下出核转运至线粒体，促进线粒体上蛋白Bnip3整合进入线粒体膜，进而促进细胞发生线粒体介导的细胞死亡

本发明用免疫荧光染色方法检测正常氧和缺氧状态下，新生大鼠原代心肌细胞和H9C2细胞中Nr4a3的定位。结果发现，在正常氧状态下，Nr4a3位于细胞核内；而缺氧处理后，Nr4a3将转移至细胞核外，并定位于线粒体；又用免疫荧光方法检测小鼠和人的正常心肌及心肌梗死组织切片中Nr4a3的定位，结果显示在小鼠和人的正常心肌组织中，Nr4a3位于细胞核内，而心梗后，Nr4a3出核并定位于线粒体。用Western Blot方法检测正常组和缺氧组H9C2心肌细胞的细胞核和细胞浆中Nr4a3的含量，结果也显示缺氧后Nr4a3表达增高，并且细胞核内Nr4a3降低，细胞浆中Nr4a3表达增高。

本发明用Calcein-am/Mitotracker Red染色检测H9C2心肌细胞线粒体的膜孔开放，用TMRM和MitoTracker Green检测H9C2心肌细胞线粒体的膜电位。结果显示，siRNA敲低细胞Nr4a3后，缺氧处理后线粒体膜孔开放和膜电位下降都低于对照组细胞。

本发明用免疫共沉淀的方法证实，在缺氧状态下，Nr4a3出核后可与线粒体上蛋白Bnip3结合；免疫荧光也证实，在缺氧状态下，Nr4a3与Bnip3能够共定位于线粒体，Nr4a3可以通过促进Bnip3插入线粒体膜而影响线粒体膜孔开放和膜电位。

6、RSK抑制剂SL0101能够降低缺血缺氧状态下Nr4a3磷酸化并抑制其出核，从而减少缺氧后细胞的坏死和凋亡，减小心梗面积，改善心梗后心功能。

Nr4a家族三个成员结构相似，存在保守的磷酸化位点。Nr4a1的Ser354位，Nr4a2的Ser347位及Nr4a3的Ser377位能够被RSK磷酸化，该位点的磷酸化是Nr4a家族在各种刺激下出核，发挥非转录功能的必要修饰。本发明用免疫共沉淀的方法证实缺氧后Nr4a3的Ser377位能够被RSK磷酸化，并且该修饰能够被SL0101抑制。免疫荧光证实SL0101使得缺氧状态下Nr4a3的出核减少。PI和Tunel染色证实，SL0101处理能够减少缺氧后细胞的坏死和凋亡。动物实验也证实，SL0101能够减少心梗后梗死面积，改善心梗后心功能。

本发明的有益效果为：

本发明通过动物实验和人的心脏标本检测发现，即刻早期基因Nr4a3参与急性心肌梗死导致的心脏损伤，Nr4a3与急性心肌梗死后心脏功能和生存率密切相关。核糖体S6激酶(Ribosomal S6 Kinase,RSK)抑制剂SL0101，能够以Nr4a3为靶点，抑制Nr4a3的磷酸化，进而抑制其促细胞坏死和细胞凋亡的作用，减轻心肌梗死后心肌细胞死亡，从而减少心肌梗死面积，减少心肌梗死后死亡率。

本发明为核糖体S6激酶抑制剂SL0101以Nr4a3为治疗靶点进行药物制备的应用中提供了科学依据。

附图说明

图1是本发明中涉及到的心脏特异性Nr4a3转基因小鼠的构建策略图，其中图1a、图1b为受委托公司所采用的PiggyBac转座子转基因载体构建过表达小鼠。图1c为阳性小鼠鉴定策略和鉴定结果图。

图2是条件性心脏特异性Nr4a3过表达小鼠的构建策略图，其中，图2a为受委托公司所采用的Cre2flox+P系统构建条件性过表达小鼠。图2b为阳性小鼠鉴定策略和鉴定结果图。

图3是实施例1中小鼠心脏组织中Nr4a3表达量变化图，其中，图3a为Nr4a家族三个成员Nr4a1、NR4A2、Nr4a3在正常和心肌梗死后1天的心脏组织中mRNA的变化，仅Nr4a3在心梗后升高最明显。图3b，3c分别为，mRNA水平和蛋白水平Nr4a3在小鼠心梗后不同时间点的变化情况，Nr4a3在心梗早期即可增高。

图4是实施例2中新生大鼠原代心脏细胞中Nr4a3表达量变化图，其中，图4a为Nr4a家族三个成员Nr4a1、NR4A2、Nr4a3在正常氧和缺氧处理组的新生大鼠原代心肌细胞中mRNA的变化，仅Nr4a3在心梗后升高最明显。图4b，4c分别为，mRNA水平和蛋白水平Nr4a3在缺氧不同时间点的变化情况，Nr4a3在缺氧早期即可增高。

图5是实施例3中WT小鼠和Nr4a3 KO小鼠在心肌梗死后的心功能、心梗面积、细胞坏死和凋亡情况图。其中，图5a是M型心脏超声图，图5b是心超量化结果，Nr4a3 KO小鼠心梗后心功能明显好于心梗后WT小鼠。图5c是Masson染色图，图5d是梗死面积和梗死后室壁厚度的量化结果，Nr4a3 KO小鼠心梗面积低于WT小鼠，Nr4a3 KO小鼠心梗后心室壁厚度高于WT小鼠。图5e是不同时间点细胞坏死数目(PI染色)，图5f是不同时间点凋亡细胞数目(TUNEL染色)，Nr4a3 KO小鼠在心梗后不同时间点的坏死和凋亡细胞数都小于WT小鼠。

图6是实施例4中心肌特异性Nr4a3转基因小鼠(Tg-Nr4a3)和条件性心肌特异性Nr4a3过表达小鼠(Nr4a3 KI Myh6-Cre+)的心功能、心肌纤维化、细胞凋亡情况图。其中，图6a是WT和Tg-Nr4a3小鼠M型心脏超声图，图6b是WT和Tg-Nr4a3小鼠心超量化结果，Tg-Nr4a3小鼠表现出自发性扩张性心肌病，心功能显著低于对照组小鼠。图6c是WT和Tg-Nr4a3小鼠心肌TUNEL染色图，Tg-Nr4a3小鼠心肌大量凋亡细胞；图6d是Nr4a3 KI Myh6-Cre-和Myh6-Cre+小鼠M型心脏超声图，图6e是Nr4a3 KI Myh6-Cre-和Myh6-Cre+心超量化结果，在注射他莫昔芬诱导心肌细胞Nr4a3过表达后，Myh6-Cre+组小鼠表现出自发性扩张性心肌病，心功能显著低于对照的Myh6-Cre-组小鼠。图6f是Nr4a3 KI Myh6-Cre-和Myh6-Cre+心肌TUNEL染色图，图Myh6-Cre+小鼠心脏中有大量凋亡细胞。图6g是WT和Tg-Nr4a3小鼠心脏Masson染色结果，Tg-Nr4a3小鼠心脏中大量心肌细胞丢失，心脏中大量纤维化。图6h是Nr4a3 KI Myh6-Cre-和Myh6-Cre+小鼠心脏Masson染色结果，注射他莫昔芬后，Myh6-Cre+小鼠心脏中大量心肌细胞丢失，心脏中大量纤维化。图6i是Nr4a3 KI Myh6-Cre-和Myh6-Cre+小鼠心肌电镜检测结果，注射他莫昔芬诱导心肌细胞Nr4a3过表达后,Myh6-Cre+小鼠心肌细胞中大量线粒体变形肿胀。

图7是实施例5中Nr4a3在正常状态和缺氧缺血状态下在组织和细胞中定位及敲低Nr4a3对缺氧处理的细胞线粒体膜孔开放和线粒体膜电位影响图。其中图7a是缺氧前后大鼠原代心肌细胞中Nr4a3的定位，图7b是缺氧前后H9c2细胞中Nr4a3的定位，图7c是小鼠正常和心梗组织中Nr4a3的定位，图7d是人的非梗死心肌和梗死心肌组织中Nr4a3的定位；正常状态下Nr4a3位于细胞核内，缺氧或缺血时，Nr4a3位于细胞质并且能够与线粒体标志蛋白Hsp60共定位。图7e是WB检测正常和缺氧组H9c2细胞中Nr4a3在细胞核和细胞质组分中的变化，缺氧处理使Nr4a3由细胞核向细胞质转移。图7f是线粒体膜孔开放检测，图7g是膜孔开放荧光定量统计。图7h是线粒体膜电位检测，图7i是膜电位荧光定量统计。Nr4a3敲低能够减少缺氧时线粒体膜孔开放和膜电位的下降。

图8是实施例6中Nr4a3与线粒体上蛋白Bnip3共定位，并促进缺氧时Bnip3整合进线粒体膜结果图。其中图8a是IP检测Nr4a3能够与Bnip3共定位。图8b是免疫荧光检测Nr4a3能够与Bnip3共定位于线粒体。图8c是WB检测Nr4a3敲低不影响Bnip3的表达和线粒体定位。图8d是WB检测Nr4a3敲低影响Bnip3在缺氧条件下整合进入线粒体膜。

图9是实施例7中核糖体S6激酶抑制剂SL0101降低缺氧时Nr4a3磷酸化，并抑制Nr4a3出核定位于线粒体，从而减少缺氧时细胞坏死和凋亡。图9a是免疫共沉淀检测经SL0101处理后缺氧心肌细胞中磷酸化Nr4a3。图9b是免疫荧光检测经SL0101处理后缺氧心肌细胞中Nr4a3的线粒体定位的量。图9c是免疫荧光检测SL0101处理后缺氧H9c2细胞的坏死情况。图9d是免疫荧光检测SL0101处理后缺氧H9c2细胞的凋亡情况。

图10是实施例8中，SL0101能够改善心梗后WT小鼠心功能，减少其梗死面积；而对Nr4a3 KO小鼠的心功能和梗死面积无明显改善的结果图。其中图10a接受和不接受SL0101处理的WT组和Nr4a3 KO组小鼠心梗后第3天心功能量化结果。图10b是接受和不接受SL0101处理的WT组和Nr4a3 KO组小鼠心梗后第3天的TTC染色结果。图10c是接受和不接受SL0101处理的WT组和Nr4a3 KO组小鼠心梗后第14天的Masson染色结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

本实施例中用到的模型为：选用10-12周龄、体重在24-28g，遗传背景为C57BL/6的雄性小鼠，包括野生型小鼠(WT)、全身性Nr4a3基因敲除小鼠(Nr4a3-KO)、心脏特异性Nr4a3转基因小鼠(TG-Nr4a3)及条件性心脏特异性Nr4a3过表达小鼠(Nr4a3-KI)为实验对象。

SD大鼠为大鼠(rat；rattus norregicus)的一个品系，本发明所使用的新生SD大鼠购买自上海斯莱克实验动物有限公司。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在上海交通大学医学院附属瑞金医院的SPF级实验动物中心。

饲养条件:室温维持22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

核糖体S6激酶抑制剂SL0101购自加拿大多伦多研究化学(Toronto ResearchChemicals,TRC),货号S560000。

(1)全身性Nr4a3基因敲除小鼠

全身性Nr4a3基因敲除小鼠由日本庆应义塾大学Yoshimura教授提供，(小鼠信息详见参考文献1.Sekiya T,Kashiwagi I,Yoshida R,et al.Nr4a receptors areessential for thymic regulatory T cell development and immune homeostasis[J].Nature immunology,2013,14(3):230.参考文献2.Sekiya T,Kondo T,Shichita T,etal.Suppression of Th2and Tfh immune reactions by Nr4a receptors in mature Treg cells[J].Journal of Experimental Medicine,2015,212(10):1623-1640.)

(2)心脏特异性Nr4a3转基因小鼠

心脏特异性Nr4a3转基因小鼠委托上海南方模式生物科技股份有限公司构建。构建策略如图1所示，其中图1a，图1b为受委托公司所采用的PiggyBac转座子转基因载体构建过表达小鼠。图1c为阳性小鼠鉴定策略和鉴定结果。

(3)条件性心脏特异性Nr4a3过表达小鼠

条件性心脏特异性Nr4a3过表达小鼠委托上海南方模式生物科技股份有限公司构建，构建策略如图2所示，其中，图2a为受委托公司所采用的Cre2flox+P系统构建条件性过表达小鼠。图2b为阳性小鼠鉴定策略和鉴定结果。

实施例1

野生型小鼠假手术组和心肌梗死模型组心脏中Nr4a家族成员(Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3)的表达及不同时间点Nr4a3的表达。

1、采用冠状动脉左前降支结扎术建立小鼠心肌梗死模型，模型操作流程:

(1)麻醉:将小鼠置于麻醉诱导盒中，3％异氟烷诱导麻醉，约5分钟后小鼠处于麻醉状态。

(2)气管插管:用胶带固定鼠尾，再用5-0丝线将小鼠上门齿固定于手术台上。迅速将气管插管经声门准确插入气管内，然后将气管插管与呼吸机连接，若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。最后用胶带固定气管插管，1％异氟烷维持麻醉。

(3)术区准备:将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，再用脱毛膏将小鼠左胸前手术区短毛彻底脱净。

(4)冠状动脉左前降支结扎：

(A)心肌梗死模型(MI)组:取右侧卧位，用75％酒精对手术区域皮肤消毒。持眼科摄将左胸部皮肤捏起，用眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第4肋水平打开胸腔，用撑开器撑开肋间隙，心脏暴露后可在左心耳下缘见到一根向下走行的粉色血管，即为冠状动脉左前降支。将7-0带线缝合针穿过该血管左右心肌组织，打一方结，结扎该血管，结扎完毕后可见心脏前壁变苍白，表示结扎成功。再用5-0带线缝合针8字缝合肋间隙，关闭胸腔，最后缝合皮肤切口。

(B)假手术(sham)组：在暴露冠状动脉左前降支后，只在其两侧穿线而不结扎，其余步骤同急性心肌梗死模型组。

(5)术后护理：手术中冠状动脉左前降支结扎，关闭胸腔，缝合皮肤后，关闭异氟烷，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

2.取材

打开分析天平，调零。小鼠称重后，先将小鼠麻醉，再处死小鼠。用眼科弯摄夹住心底部血管，剪下整个心脏，迅速置于预冷的PBS中，轻轻挤出心腔内血液，灭菌纱布蘸干心脏后，称重并记录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，液氮罐中保存，后用于进一步分子生物学检测。

3.检测假手术组小鼠和急性心肌梗死模型组小鼠心脏中Nr4a家族成员(Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3)的表达和不同时间点Nr4a3的表达。

(1)分别选取野生型小鼠假手术(Sham)组和心肌梗死(MI)组术后第1天的心脏，提取RNA后进行实施荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Nr4a家族成员(Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3)的表达。检测结果如图3a所示，与Sham组心脏组织相比，MI组心脏组织中，mRNA水平仅Nr4a3表达上调，而Nr4a1、Nr4a2表达无明显变化。

(2)分别选取野生型小鼠假手术(Sham)组和心肌梗死(MI)组术后第6小时，第12小时，第1天，第3天，第7天的小鼠心脏，提取蛋白质和RNA后，分别用蛋白质免疫印迹技术和实施荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测蛋白水平和mRNA水平的Nr4a3的表达。检测结果如图3b，3c所示，Nr4a3的在心梗后早期12小时即可表达增高，后维持较高水平。

实施例2

原代心肌细胞缺氧处理后Nr4a家族成员(Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3)的表达及不同时间点Nr4a3的表达。

1.原代新生SD大鼠心肌细胞提取和培养

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠10只，75％酒精全身消毒，用眼科剪心脏，预冷PBS中洗去血液，放入盛有10mL DMEM/F12培养基的10cm培养皿中。

(2)逐一取下心脏后，并将心脏剪成1-2mm3的组织块。转入到放有转子的50ml小烧杯中，吸去DMEM/F12，加入浓度为1mg/ml的II型胶原酶消化液10ml，置于水浴磁力搅拌器上。转速为120转/分，消化10min后，静止数秒钟，弃去第一次的消化液。

(3)再次加入II型胶原酶消化液10ml，转速为120转/分，消化10min。收集消化液，加入相同体积的含10％胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，并置于冰上保存。重复消化操作大约10-12次后，组织块变成絮状，可不再消化。

(4)将收集好的心肌细胞悬液合并，用70μm细胞滤网过滤后，1200rpm转速离心5min，弃去上清。在离心管中加入适量的DMEM/F12培养基重悬细胞。

(5)将细胞接种在10cm的培养皿中，差速贴壁2小时，2小时后吸取未贴壁的细胞悬液用70um细胞筛网过滤后，根据细胞悬液的总量加入BrdU抑制成纤维细胞增长(BrdU终浓度为0.1mM)，混匀之后，加入到新的培养皿中培养，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2.检测正常氧处理(Normoxia)组和缺氧处理(Hypoxia)组中Nr4a家族成员(Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3)的表达和不同时间点Nr4a3的表达

(1)分别选取正常氧处理(Normoxia)组和缺氧处理(Hypoxia)组培养24小时的原代心肌细胞，提取RNA，qPCR方法两组原代心肌细胞中，Nr4a家族成员(Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3)在mRNA水平的表达，检测结果如图4a所示，与Normoxia组原代心肌细胞相比，Hypoxia组原代心肌细胞中，mRNA水平仅Nr4a3表达上调，而Nr4a1、Nr4a2表达无明显变化。

(2)分别选取正常氧处理(Normoxia)组和缺氧处理(Hypoxia)组培养3、6、12、24小时的原代心肌细胞，提取蛋白质和RNA后，分别用蛋白质免疫印迹技术和实施荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测蛋白水平和mRNA水平的Nr4a3的表达。检测结果如图4b,4c所示，Nr4a3的在缺氧早期6小时即可表达增高，后维持较高水平。

实施例3

野生型和Nr4a3敲除小鼠心梗术后心梗面积、纤维化程度检测，心梗后坏死细胞，凋亡细胞的检测及心梗后心功能的检测。

1.制备小鼠心肌梗死模型：选取10-12周龄，体重24-28g的野生型和Nr4a3敲除小鼠，分为野生型假手术(WT sham)组、野生型心梗手术组(WT MI)，Nr4a3敲除假手术(Nkosham)组、Nr4a3敲除心梗手术组(Nko MI)，假手术组每组6只，心梗手术组每组26-28只，造模方法同前。术后1天和14天，用小动物超声仪检测每组小鼠心功能，术后第14天取心脏石蜡包埋，切片，进行Masson染色，检测其心梗面积和纤维化程度。术后1天和3天，取心脏石蜡包埋，切片，进行TUNENL染色，检测心梗后凋亡细胞数目。术后第1，3天，术后小鼠取心脏前1小鼠腹腔注射碘化丙锭(PI)。取心脏后用OTC包埋剂包埋，冰冻切片，用PBS洗去包埋剂,复染DAPI后即可荧光显微镜下检测PI和DAPI双阳性细胞的坏死细胞数目。

2.小鼠心功能的检测

(1)小鼠诱导麻醉:挥发罐中加入异氟烷至安全刻度后拧紧加药口盖子，拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀，维持出气压力在0.2-0.3mPa。再将挥发罐出口与麻醉诱导盒连通，将待检测小鼠放入麻醉诱导盒中，3％异氟烷诱导麻醉5分钟。小鼠麻醉后将挥发罐出口与麻醉维持导管连通，将小鼠头部伸入麻醉维持导管的套头内，以1％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

(2)心功能检测：小鼠取仰卧位，固定四肢和尾巴。用脱毛膏脱去小鼠胸前毛发后涂抹适量的超声耦合剂，用小鼠心脏专用探头检测小鼠心功能。选取标准左心室长轴切面，记录B超和M超。测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、短轴缩短率(FS)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)及射血分数(EF)等相应参数。

结果如图5a，5b所示，Nr4a3 KO小鼠心梗后心功能明显好于心梗后WT小鼠。

3.马松(Masson)染色

(1)已用多聚甲醛液固定包埋的切片，在脱蜡水化后，放入Bouin氏液作用一晚或置37℃温箱内1-2小时，然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色；

(2)Weigert氏铁苏木素(A、B液等比例混合液)染5-10分钟，流水稍洗；

(3)1％盐酸酒精(75％酒精99份加浓盐酸1份)分化，流水冲洗数分钟；

(4)丽春红酸性品红染液染5-10分钟，流水稍冲洗；

(5)磷钼酸溶液处理约5分钟，不用水洗直接用苯胺蓝染液复染5分钟；

(6)1％醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次；

(7)无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；

(8)显微镜下拍照，Image J软件分析心梗面积和纤维化程度。

结果如图5c，5d所示，Nr4a3 KO小鼠心梗后心梗面积明显低于心梗后WT小鼠。

4.坏死细胞和凋亡细胞检测

(1)坏死细胞检测：冰冻切片室温下避光放置5分钟，PBS洗去OCT包埋剂，再用DAPI染5分钟，PBS洗3次后即刻封片。用荧光显微镜检测PI和DAPI双阳性的坏死细胞，拍照后统计相同视野下凋亡细胞数目。

(2)凋亡细胞检测：石蜡切片脱蜡水化，用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞数目，凋亡细胞的细胞核为绿色，并能够与DAPI共定位呈现为蓝绿色，拍照后统计相同视野下凋亡细胞数目。

结果如图5e，5f所示，Nr4a3 KO小鼠心梗后第1天和第3天，坏死细胞和凋亡细胞的数明显均低于心梗后WT小鼠。

实施例4

心肌特异性Nr4a3转基因小鼠(Tg-Nr4a3)和心肌特异性Nr4a3条件性过表达小鼠(Nr4a3 KI)心脏凋亡细胞数目，心脏纤维化程度检测，心功能检测及心肌电镜检测

1.小鼠心功能的检测：

(1)小鼠分为WT组和Tg-Nr4a3组，取12周龄小鼠进行心功能检测，方法同实施例3所述。结果如图6a，6b所示，Tg-Nr4a3小鼠自发性的心脏扩大，心功能降低。

(2)小鼠分为Nr4a3 KI Myh6 Cre-组和Nr4a3 KI Myh6 Cre+组，取10周龄小鼠连续5天注射他莫昔芬，20mg/kg/d，诱导Nr4a3过表达，分别在注射他莫昔芬后的第3，7，14天进行心功能检测，方法同实施例3所述，结果如图6d，6e所示，Nr4a3 KI Myh6 Cre+小鼠在注射他莫昔芬诱导心肌Nr4a3表达后，心脏变大，心功能降低。

2.心脏凋亡细胞数目检测

(1)小鼠分为WT组和Tg-Nr4a3组，取12周龄小鼠进行心功能检测后，取心脏石蜡包埋，切片，并进行TUNEL染色，方法同上所述。结果如图6c所示，Tg-Nr4a3组小鼠心脏中有大量凋亡心肌细胞。

(2)小鼠分为Nr4a3 KI Myh6 Cre-组和Nr4a3 KI Myh6 Cre+组，取10周龄小鼠连续5天注射他莫昔芬，20mg/kg/d，诱导Nr4a3过表达，在注射他莫昔芬后的14天进行心功能检测后，取心脏石蜡包埋，切片，并进行TUNEL染色，方法同上所述，结果如图6f所示，Nr4a3KI Myh6 Cre+组小鼠在注射他莫昔芬后，心脏中有大量凋亡心肌细胞。

3.马松(Masson)染色

(1)小鼠分为WT组和Tg-Nr4a3组，取12周龄小鼠进行心功能检测后，取心脏石蜡包埋，切片，并进行Masson染色，方法同上所述。结果如图6g所示，Tg-Nr4a3组小鼠心肌纤维化明显，大量心肌细胞丢失。

(2)小鼠分为Nr4a3 KI Myh6 Cre-组和Nr4a3 KI Myh6 Cre+组，取10周龄小鼠连续5天注射他莫昔芬，20mg/kg/d，诱导Nr4a3过表达，在注射他莫昔芬后的14天进行心功能检测后，取心脏石蜡包埋，切片，并进行Masson染色，方法同上所述，结果如图6h所示，Nr4a3KI Myh6 Cre+组小鼠在注射他莫昔芬后，心肌纤维化明显，大量心肌细胞丢失。

4.心肌电镜检测

小鼠分为Nr4a3 KI Myh6 Cre-组和Nr4a3 KI Myh6 Cre+组，取10周龄小鼠连续5天注射他莫昔芬，20mg/kg/d，诱导Nr4a3过表达，在注射他莫昔芬后的14天进行心功能检测后，取心脏后立即用戊二醛固定，委托上海交通大学医学院公共技术平台电镜室进行电镜检测，结果如图6i所示，Nr4a3 KI Myh6 Cre+组小鼠在注射他莫昔芬后，心肌线粒体大量丢失，肿胀变形。

实施例5

缺氧或缺血条件下，Nr4a3由细胞核向线粒体转移，并促进线粒体膜孔的开放，使线粒体膜电位下降

1.细胞缺氧培养：正常氧组放在正常培养箱中培养(37℃，5％CO2)，缺氧组三气培养箱中缺氧培养(37℃，5％CO2，95％N2)。

2.免疫荧光检测细胞Nr4a3细胞内的定位：

(1)24孔板内放入圆形盖玻片，分为上述4组细胞，培养36小时；

(2)吸去培养基，PBS清洗一次，再用4％多聚甲醛固定5分钟；

(3)吸去固定液，PBS清洗3次，0.2％Triton-X处理5分钟；

(4)吸去Triton-X,PBS清洗3次，用5％的BSA封闭室温30分钟；

(5)吸去封闭液，加入用含1％BSA的PBS按1：100比例稀释的Nr4a3(小鼠来源)和Hsp60(羊来源)抗体，4℃孵育过夜；

(6)吸去一抗，PBS清洗3次，加入用PBS按1：1000比例稀释的荧光二抗(488抗鼠+594抗羊)，室温避光孵育1小时；

(7)吸去荧光二抗，PBS清洗3次，加入细胞核染料DAPI，室温染色5分钟；

(8)吸去DAPI，PBS清洗3次，钩起培养板底部含有细胞的圆形盖玻片，倒扣在含有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，指甲油固定四周。

(9)荧光显微镜检测。

3.Nr4a3在大鼠原代心肌细胞和H9c2心肌细胞中的定位检测：

(1)分离新生大鼠原代心肌细胞，方法同实施例2，分为缺氧组和非缺氧组。细胞培养方法同上，培养36小时后，免疫荧光方法检测Nr4a3的定位情况，结果如图7a所示，Nr4a3在正常氧状态下位于细胞核内，而缺氧后向细胞核外转移，并且能够与线粒体标志物Hsp60共定位。

(2)将H9c2细胞分为缺氧组和非缺氧组，细胞培养方法同上，培养36小时后，免疫荧光方法检测Nr4a3的定位情况，结果如图7b所示，Nr4a3在正常氧状态下位于细胞核内，而缺氧后向细胞核外转移，并且能够与线粒体标志物Hsp60共定位。

(3)将H9c2细胞分为缺氧组和非缺氧组，细胞培养方法同上，培养36小时后，收获细胞，用细胞核/细胞质分离试剂盒(Biovison公司，货号：K266)分离细胞的细胞核和细胞质，并用蛋白质免疫印迹技术检测正常氧和缺氧组H9c2细胞的细胞核核细胞质中Nr4a3量的变化。结果如图7e所示，Nr4a3在正常氧状态下位于细胞核内，而缺氧后Nr4a3位于细胞质中。

4.Nr4a3在小鼠和人的心脏组织中的定位检测：

(1)制作小鼠心肌梗死模型，方法同实施例1。在心梗后第1天取心脏后石蜡包埋，切片。脱蜡水化后用柠檬酸进行抗原修复，5％BSA封闭30分钟，封闭后加入用含1％BSA的PBS按1：100比例稀释的Nr4a3(小鼠来源)和Hsp60(羊来源)抗体，4℃孵育过夜；次日切片用PBS清洗3次，加入用PBS按1：1000比例稀释的荧光二抗(488抗鼠+594抗羊)，室温避光孵育1小时；吸去荧光二抗，PBS清洗3次，加入细胞核染料DAPI，室温染色5分钟；吸去DAPI，PBS清洗3次，干燥后滴上抗荧光淬灭封片剂，指甲油固定四周。荧光显微镜检测。结果如图7c所示，在对照组小鼠心脏组织切片中，Nr4a3定位于细胞核内，而心肌梗死组织中,Nr4a3能够出核并与线粒体标志蛋白Hsp60共定位。

(2)人的心脏组织来源于尸检标本，包埋切片后免疫荧光方法同上。结果如图7d所示，在对照组小鼠心脏组织切片中，Nr4a3定位于细胞核内，而心肌梗死组织中,Nr4a3能够出核并与线粒体标志蛋白Hsp60共定位。

5.缺氧处理后线粒体膜孔开放度核线粒体膜电位检测：

(1)用Nr4a3siRNA(从Thermo购买)敲低H9c2细胞中Nr4a3，将H9c2细胞分成正常氧组，正常氧+Nr4a3siRNA组，缺氧组，缺氧+Nr4a3siRNA组。细胞培养方法同前。

(2)细胞培养36小时后，用Calcein-am和MitoTracker-Red对各组细胞进行染色，染色后用CoCl₂处理5分钟，共聚焦显微镜检测荧光强度。Calcein-am是绿色的线粒体膜电位染料，当线粒体膜孔开放时，CoCl₂可以进入到线粒体内，消除Calcein-am的荧光。MitoTracker-Red是红色的线粒体探针，其膜电位不受CoCl₂影响。所以Calcein-am的绿色荧光和MitoTracker-Red红色荧光共定位的黄色荧光强度代表膜孔开放情况，黄色荧光越多代表膜孔开放越少。结果如图7f所示,正常氧情况下，Nr4a3敲低与否不影响线粒体膜孔开放。在缺氧情况下，Nr4a3敲低能够减少膜孔开放。

(3)细胞培养36小时后，用TMRM和MitoTracker-Green对各组细胞进行染色，共聚焦显微镜检测荧光强度。TMRM为红色荧光，其荧光强度与线粒体膜电位成正比，而MitoTracker-Green为绿色荧光，其荧光强度与线粒体膜电位无关。TMRM与MitoTracker-Green共定位的黄色荧光强度代表线粒体膜电位高低，黄色荧光越多代表线粒体膜电位越高。结果如图7g所示,正常氧情况下，Nr4a3敲低与否不影响线粒体膜孔电位。在缺氧情况下，Nr4a3敲低能使持线粒体膜电位下降程度减少。

实施例6

缺氧条件下，Nr4a3与线粒体膜上蛋白Bnip3结合，并促进其进入线粒体膜

1.Nr4a3与Bnip3共定位检测：

(1)免疫共沉淀方法检测Nr4a3与Bnip3共定位情况：H9c2细胞分为正常氧和缺氧组，细胞培养方法同前。培养36小时后用IP裂解液收获细胞。用Nr4a3与磁珠共孵育形成磁珠抗体复合物，然后将磁珠抗体复合物加入细胞IP裂解液中，富集裂解液中的Nr4a3。最后用蛋白质免疫印迹检测Bnip3是否和Nr4a3一起被富集下来。结果如图8a所示，在正常氧状态下，Nr4a3不与Bnip3结合，而缺氧条件下，Nr4a3与Bnip3能够结合。

(2)免疫荧光方法检测Nr4a3与Bnip3共定位情况：H9c2分为在正常氧和缺氧组，培养方法同前。细胞免疫荧光方法同前。分别检测Bnip3是否定位于线粒体，Bnip3与Nr4a3是否能够共定位。结果如图8b所示，在缺氧条件下，Bnip3表达上调，并能够与线粒体标志蛋白Hsp60共定位，而且能够与Nr4a3共定位。

2.线粒体膜上Bnip3结合情况检测：

(1)Bnip3定位于线粒体。正常氧状态下Bnip3表达量低，与线粒体通过化学键结合。该结合状态能够被碱性溶液解除，Bnip3可从线粒体膜上洗脱。在缺氧状态下，Bnip3表达明显上调，并且由松散结合状态转变为整合进线粒体膜，该状态下Bnip3不能够被碱性液体从线粒体膜上洗脱。

(2)H9c2细胞分成正常氧组，正常氧+Nr4a3siRNA组，缺氧组，缺氧+Nr4a3siRNA组。细胞培养方法同前。用线粒体分离试剂盒(Biovision，货号K256)分离各组细胞中线粒体，并用Na2CO3(0.1M,pH 11.5)冰上处理各组线粒体分钟，蛋白质免疫印迹技术检测各组线粒体膜上Bnip3的结合情况。结果如图8c所示，敲低Nr4a3后不影响Bnip3的表达和在线粒体上的定位，但图8d结果显示，敲低Nr4a3后Bnip3整合进线粒体膜的数量降低。

实施例7

SL0101通过抑制缺氧条件下Nr4a3Ser377位点的磷酸化而抑制其出核，并减少坏死和凋亡。

1.细胞缺氧培养：H9C2细胞分为正常氧组，缺氧组，正常氧+SL0101组，缺氧+SL0101组共4组，正常氧组和正常氧+SL0101组放在正常培养箱中培养(37℃，5％CO2)，缺氧组和缺氧+SL0101组放在三气培养箱中缺氧培养(37℃，5％CO2，95％N2)，SL0101终浓度为100uM。

2.Nr4a3磷酸化检测：上述4组细胞培养36小时，IP裂解液收集，用Nr4a3抗体富集Nr4a3,再在蛋白质免疫印迹技术中用p-Ser/Thr抗体检测富集的Nr4a3的磷酸化的情况。结果如图9a所示，缺氧能够使Nr4a3磷酸化，而SL0101能够抑制缺氧时Nr4a3的磷酸化。

3.免疫荧光检测各组细胞Nr4a3细胞内的定位：

(1)24孔板内放入圆形盖玻片，分为上述4组细胞，培养36小时；

(2)吸去培养基，PBS清洗一次，再用4％多聚甲醛固定5分钟；

(3)吸去固定液，PBS清洗3次，0.2％Triton-X处理5分钟；

(4)吸去Triton-X,PBS清洗3次，用5％的BSA封闭室温30分钟；

(5)吸去封闭液，加入用含1％BSA的PBS按1：100比例稀释的Nr4a3(小鼠来源)和Hsp60(羊来源)抗体，4℃孵育过夜；

(6)吸去一抗，PBS清洗3次，加入用PBS按1：1000比例稀释的荧光二抗(488抗鼠+594抗羊)，室温避光孵育1小时；

(7)吸去荧光二抗，PBS清洗3次，加入细胞核染料DAPI，室温染色5分钟；

(8)吸去DAPI，PBS清洗3次，钩起培养板底部含有细胞的圆形盖玻片，倒扣在含有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，指甲油固定四周。

(9)荧光显微镜检测。

结果如图9b所示，Nr4a3在缺氧时出核，SL0101能够抑制Nr4a3在缺氧情况下的出核。

4.细胞坏死和细胞凋亡检测：

(1)上述4组细胞培养36小时，洗去培养基后PBS清洗一次，加入Calcein/PI染料，室温孵育15分钟后即可检测染色情况，Calcein染成绿色的为存活细胞，PI染成红色的为死亡细胞的核。拍照后统计相同倍数视野下坏死细胞数目，结果如图9c所示，SL0101能够降低缺氧时心肌细胞的坏死。

(2)上述4组细胞培养48小时，洗去培养基后PBS清洗一次，4％多聚甲醛固定5分钟，吸去固定液后PBS清洗三次，用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞数目，凋亡细胞的细胞核为绿色，并能够与DAPI共定位呈现为蓝绿色，拍照后统计相同视野下凋亡细胞数目，结果如图9d所示，SL0101能够降低缺氧时心肌细胞的凋亡。

实施例7

SL0101能够减轻心肌梗死后心脏缺血损伤

1.制备小鼠心肌梗死模型：选取10-12周龄，体重24-28g的野生型WT和Nr4a3敲除小鼠，分为WTMI组、Nr4a3MI组、WTMI+SL0101组、Nr4a3MI+SL0101组，心肌梗死模型方法同前，每组小鼠在心梗前12小时和心梗后即刻给予SL0101腹腔注射一次(SL0101溶解在1：1的聚氧乙烯蓖麻油EL和乙醇混合液中，配成浓度为25mg/ml的储存液，给药时用无菌生理盐水9：1稀释储存液配成2.5mg/ml的工作液，根据小鼠体重按10mg/kg给药)。

2.心功能检测：心梗术后第3天检测心功能，小鼠心脏超声方法同实施例3所述，结果如图10a所示，SL0101能够改善WT小鼠心肌梗死后心功能，但对Nr4a3 KO小鼠心梗后的心功能改善不明显。

3.TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)染色

(1)原理：TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。

(2)TTC 1.5％10ml，现配，避光存放；

(3)小鼠麻醉后开胸，剪开右心耳，从心尖部注入10ml PBS；

(4)冲净血液后迅速剪下整颗心脏，放入PBS中洗净表面血液；

(5)吸干表面水分后放入-40℃冰箱中速冻30min；

(6)用锋利刀片将心脏从心尖到心底切成均匀5片；

(7)将心脏切片放入小皿中，加入TTC溶液，转移至37℃干燥箱中孵育20min；

(8)吸净TTC溶液，PBS清洗一次；

(9)吸净PBS，4％多聚甲醛固定；

(10)拍照记录结果，左心室白色为完全梗死区，粉色为梗死边缘区，鲜红色为非梗死区。

上述4组小鼠心梗后第3天心超检测后，取心脏进行TTC染色，结果如图10b所示，SL0101能够减小WT小鼠心肌梗死面积，但对Nr4a3 KO小鼠心梗后的心梗面积改善不明显。

4.马松(Masson)染色

上述4组小鼠心梗后第14天取心脏进行Masson染色，结果如图10c所示，SL0101能够减小WT小鼠心肌梗死面积，但对Nr4a3 KO小鼠心梗后的心梗面积改善不明显。

综合上述实施例的实验结果可知，在急性心肌梗死疾病模型中，Nr4a3基因在缺血缺氧后表达升高，通过与Bnip3结合，促进其进入线粒体膜，促进了心肌细胞的凋亡和坏死，使得心肌梗死后心功能和生存率的降低。而Nr4a3基因敲除小鼠显著抑制了心肌细胞的凋亡和坏死，改善了心功能。Nr4a3心肌特异性转基因小鼠和条件性心肌特异性Nr4a3过表达小鼠在Nr4a3过表达后表现为自发性的心肌细胞丢失和心脏纤维化。通过抑制剂SL0101抑制Nr4a3的磷酸化，进而抑制其出核，具有抑制心肌细胞坏死、凋亡和减小心梗面积，改善心梗后心功能和的作用。因此，核糖体S6激酶(Ribosomal S6 Kinase,RSK)抑制剂SL0101以孤儿核受体Nr4a3为靶点制备治疗急性心肌梗死及心力衰竭的药物的应用，具有十分广阔的前景和重要的意义。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种治疗心血管疾病的药物，其特征在于，该药物包含通过孤儿核受体Nr4a3为药物靶点进行治疗的物质。

2.根据权利要求1所述的治疗心血管疾病的药物，其特征在于，所述物质的有效成分中包含有核糖体S6激酶抑制剂SL0101。

3.根据权利要求1或2所述的治疗心血管疾病的药物，其特征在于：所述心血管疾病为急性心肌梗死或心力衰竭。

4.一种孤儿核受体Nr4a3为靶点在制备筛选心血管疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述心血管疾病为急性心肌梗死或心力衰竭。