CN103784972A - 干扰素调节因子9(irf9)及其抑制剂在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种干扰素调节因子9（IRF9）在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以IRF9基因敲除小鼠为实验对象，通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌缺血再灌注损伤模型，结果表明与WT小鼠对比，IRF9基因敲除小鼠心肌梗死面积明显减少，心功能明显改善。从而发现IRF9基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能，主要体现在IRF9基因能够恶化冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。针对IRF9的上述功能，提供IRF9作为药物靶标在研制冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中应用，及IRF9的抑制剂在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中应用。

Description

干扰素调节因子 9(IRF9) 及其抑制剂 在冠状动脉粥样硬化性心脏病 中的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种IRF9（interferon regulatory factor 9）及其抑制剂在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction，MI) 是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，是缺血性心脏病的常见类型，在急性心肌梗死发作后的几分钟内，缺血中央区的心肌细胞便会由于缺血而死亡，是严重威胁人类健康和生命的常见病之一。如何干预心肌缺血引发的心肌梗死及保护心脏愈来愈受到重视。而最有效挽救心肌梗塞的方法是尽快恢复缺血心肌的血流，即再灌注。目前，常采用溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成型术、动脉搭桥术、心脏外科体外循环等干预手段。然而，有效的再灌注只能挽救大约1／3人的生命。

无论在发达国家还是发展中国家，急性心肌梗死均是导致成年人病残和死亡的主要原因之一。虽然恢复心肌缺血区支配血管的血流灌注是改善患者生存率的主要治疗，但是血流灌注的恢复亦可导致“再灌注损伤”。心肌缺血／再灌注损伤(myocardial ischemia／reperfusion injury，MIRI)是指心肌在短时间内血供中断，恢复血供后一定时间内，原缺血心肌发生较血供恢复前更为严重的损伤。一般认为缺血的组织、器官在可逆损伤以前得到再灌注便可存活并恢复，但发现在有些情况下，经过一定时间缺血的组织器官并未发生明显的功能结构改变，在得到血液再灌注时却发生了不可逆性的损伤。有研究表明已经发生严重的缺血性损伤的细胞，再灌注并不使其损伤减轻，反而会加速细胞的死亡。在缺血引起的心肌细胞损伤中，心肌细胞代谢率明显降低，组织出现缓慢但较为明显的损伤。如果在缺氧基础上再复氧，这种损伤就会加快、加重。尽管再灌注重新提供给组织细胞氧及营养物质，但这种再复氧反而加速机体损伤是因为再复氧的同时也促进氧自由基释放。再灌注在机体多种病理、生理改变中发挥重要作用，缺血后再灌注将导致更严重的后果。研究发现，有多种因素在缺血再灌注损伤机制中发挥重要作用，包括炎症过程、氧自由基损伤、钙超载、氧化应激等。

心肌缺血／再灌注损伤己引起广大基础和临床工作者的高度重视，如何防治心肌缺血再灌注损伤的药物已成为研究的热点。然而，目前临床所应用的各种药物均有一定的局限性，还不能满足需要。寻找新的、安全有效的药物用于防治心肌缺血再灌注损伤成为医学研究的重要课题之一。

干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）家族现已发现有10个成员，其组成为IRF1～IRF10。现有的研究提示，IRF家族成员参与了广泛的生物学过程，主要涉及天然免疫和获得性免疫反应，调控细胞生长及生存、凋亡和增殖，参与造血，抗肿瘤形成等。IRF9又称为P48，干扰素刺激基因因子(IFN-stimulated gene factor 3γ, ISGF3γ)。目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV干扰素刺激应答元件样结构域结合后，其表达迅速上调可以增强IFN-α诱导的HBV mRNA水平的显著抑制。最近有报道，小鼠在IRF9 基因敲除（Knockout, KO）后，表现为增加小肠粘液和淋巴结里的T细胞及中性粒细胞数目，这提示IRF9 与炎症有着密切联系。（Lohoff M等，Nature reviews Immunology. 2005;5(2):125-35; Honda K等，Nature reviews Immunology. 2006; 6(9): 644-58.）

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供IRF9作为药物靶标在筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中应用。

本发明的另一目的在于提供一种IRF9的抑制剂在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以IRF9基因敲除小鼠为实验对象，通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌缺血再灌注损伤模型，结果表明与WT小鼠对比，IRF9基因敲除小鼠心脏梗死面积明显减少，心功能明显好转。这提示IRF9基因具有恶化心脏功能的作用，能促进心肌梗死的发展，IRF9基因发挥着促进冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的作用。为研究防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。

针对IRF9的上述功能，提供IRF9作为药物靶标在筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用。

针对IRF9基因的上述功能，提供IRF9的抑制剂在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用。

一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物，包含IRF9。

所述的IRF9的抑制剂优选为IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干扰载体或IRF9的抗体中的一种。

本发明的研究成果表明，IRF9 KO小鼠在结扎冠状动脉引起的心肌缺血再灌注损伤中，小鼠的心脏梗死面积明显变小，心脏功能明显好转。证明IRF9基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病模型中有着重要的恶化作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明发现IRF9基因的新功能，即IRF9基因能够恶化冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。

2.本发明针对IRF9在恶化冠状动脉粥样硬化性心脏病中的作用，为研制冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物提供靶标。

3.本发明针对IRF9在恶化冠状动脉粥样硬化性心脏病中的作用，提供IRF9的抑制剂在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用。

附图说明

图1是小鼠在MI手术后的梗死染色图。

A为WT和IRF9-KO小鼠I/R手术后24h的TTC染色图；

B为AAR面积统计柱状图；C为梗死面积统计柱状图；

图2是WT和IRF9-KO小鼠I/R模型后的超声检测心功能结果图。

A为收缩期末压(mmHg) ；

B为射血分数(%) ；

C为左室内压最大上升速率(mmHg/sec) ；

D为左室内压最小上升速率(mmHg/sec) ；

图3是WT和IRF9-KO小鼠I/R模型后的TUNEL染色及结果统计柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养：

实验动物：8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6品系的野生型小鼠（WT，购自北京华阜康生物科技有限公司）、IRF9基因敲除小鼠（IRF9-KO，C57BL/6J背景，购买自RIKEN BRC 公司（BRC 编号：RBRC00916））。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】心肌缺血／再灌注损伤（MIRI）模型获得

1. 实验动物分组：雄性C57BL/6品系小鼠（WT）、IRF9基因敲除小鼠（KO）通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌缺血／再灌注损伤模型。随机分为4组，每组：C57BL/6品系小鼠假手术组（WT SHAM）及I/R术组（WT MI）、IRF9基因敲除小鼠假手术组（KO SHAM）及I/R术组（KO MI）。

2. I/R模型采用结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌缺血／再灌注损伤，模型操作流程：

2.1 称重麻醉备皮：用电子天平于动态模式下准确称取小鼠体重（g），用双蒸水准确配置3%戊巴比妥钠溶液，轻轻摇动使其充分溶解，采用80mg/kg体重剂量，计算所需戊巴比妥钠溶液体积后用1mL注射器准确抽取相应体积溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒（约3min）后，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发（充分暴露手术区）。

2.2 气管插管：麻醉一定时间（约20-30min）后，夹趾检测无反应即可开始手术。打开外置光源、显微镜开关，打开呼吸机，设置好各参数（呼吸频率100bpm、恒压16-17mmHg），将小鼠门齿用橡皮经固定在自制斜面上，外置光源照向小鼠颈部，眼科镊拉出小鼠舌头 调节光源亮度及位置，此时可见小鼠声门随呼吸呈开闭运动，声门开启时将气管插管沿声门送入气管，取下小鼠接上呼吸机，观察小鼠呼吸状况，胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功，即可进行下步手术，整个手术过程用加热垫维持小鼠体温在37℃左右。

2.3 开胸：小鼠采用右侧卧位，用医用胶带固定好小鼠四肢（左前肢位于右前肢前以充分暴露手术区），用医用碘酊及75%医用酒精对手术区皮肤进行消毒清洁处理，用眼科剪在左前肢下0.5cm处沿肋骨走向剪开皮肤，逐层分离筋膜、肌肉等组织（尽量避开较大血管，若不能避免则先行阻断再剪断血管），用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，用显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支（LAD）或所在区域。

2.4 结扎冠状动脉：于显微镜下找到LAD走向或可能所在位置（小鼠LAD走行于左心耳与肺动脉圆锥间，多发出于左心耳下缘处），用无齿持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘1mm处进针，肺动脉圆锥旁出针，进针深度0.5mm，宽度为1mm，缝线从LAD下方穿过，稳定5s后，在心脏表面结扎处放置一长度2mm，大小为10号的聚乙烯塑料棒（要求表面光滑，大小为取出棒后结扎线不会压迫血管），后在其上打一活结，轻拉以结扎LAD（力度以能完全阻断LAD血流为准，宁轻勿重），剪去线头，结扎成功，则可见左室前壁明显由鲜红色变为苍白而不再恢复。（Sham组不结扎LAD，直接关胸）。

2.5 缺血再灌：自结扎LAD成功，心肌缺血60分钟时，打开胸腔，松开结扎线，用显微镊迅速准确的抽去聚乙烯塑料棒，使结扎的LAD再通，缺血心肌恢复血流，完成心肌缺血再灌注，再灌注成功，可见因缺血而变苍白的心肌重新恢复至鲜红色，维持再灌注24h。

2.6 关胸：缺血再灌完成后，6-0缝线完全缝合胸腔开口（保证无缝隙、无错位）关闭胸腔，5mL注射器接套管经切口插入胸腔，抽取1mL气体，6-0缝线由内向外逐层缝合各层肌肉，后用5-0缝线将皮肤切口缝合完整。

2.7 术后管理：术后密切关注小鼠状态，有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，放入干净的饲养笼，填写手术记录卡片，放回IVC笼架饲养，密切关注小鼠术后状态以及死亡情况并做好相应记录。

【实施例2】2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)-伊文思蓝（Evans blue）双染色测心肌梗死面积

缺血再灌注24h后，80mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠，剪开胸腔，分离出主动脉，连同主动脉一起切取心脏，心脏保存在4℃生理盐水中，将23号针头置入升主动脉根部，不穿过主动脉瓣，结扎固定。准备37℃ 3-4 mL的TTC磷酸缓冲液(PH=7.4)从主动脉缓慢灌注心脏，当心肌变为砖红色时停止注射。重新结扎LAD，然后通过主动脉均匀缓慢灌注约2mL 2.5%的伊文思蓝，并使心肌缺血区域面朝上，防止流出的伊文思蓝污染心脏表面。待心脏变蓝后停止灌注并用生理盐水充分冲洗，清洁心脏表面并挤压心脏以排除残留于心腔中伊文思蓝。充分吸干心脏表面和心腔中的生理盐水，保存于-20℃冰箱中。待心脏冷冻固定后，将心脏置于切片器中，从心尖开始连续切厚度为1mm的切片，一共 5片。

梗死面积测量：采用高分辨率解剖显微镜对每片心肌组织两面进行拍照。采用图像分析软件（IPP软件）对切片分析，TTC染色后梗死区为白色，未梗死区为砖红色，伊凡思蓝染色后整片切片面积减去蓝色区域为缺血危险区(AAR)。以缺血危险区（AAR）／左心室区域(LV) 百分比表示AAR面积，梗死区／AAR百分比表示梗死面积。

TTC是脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白色。在体染色梗死区、缺血区和非缺血区的边界较离体染色清晰，以心肌横截面能清晰区分白色为梗死区，红色为缺血区，蓝色为非缺血区。

小鼠TTC染色及梗死面积统计结果见图1。经过I/R缺血60min再灌注24小时后，IRF9-KO小鼠梗死面积较野生型小鼠降低。

【实施例3】心肌缺血再灌注模型小鼠心功能检测

1 PV检测血流动力学

1.1前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

1.2 PV检测

碘酒及75%酒精消毒后，剪开小鼠颈部皮肤，依次分离肌肉和软组织，并游离出右颈总动脉，于血管下穿过双线并结扎远心端，同时活结结扎近心端。用血管剪在远心端剪一切口（1/3-1/2管径），于体视显微镜下将Millar1.4F超微导管迅速插入右颈总动脉，同时穿一缝线将导管和血管结扎。打开近心端活结，将导管沿右颈总动脉-升主动脉插入左心室内，连接Powerlab生物信号采集处理系统。观察记录仪上波形情况，调节导管的位置使波形图清晰且稳定。监测小鼠心功能指标。测量小鼠收缩期末压（End-systolic Pressure）、射血分数（Ejection Fraction）、左室内压最大上升速率 (dP/dt max)及左室内压最小上升速率（dP/dt min)等指标。

由Laplace定理可知：S=Pr/2h，P为心室内压，r为心腔内径，h为心壁厚度。在心脏压力负荷过重的情况下，为适应心脏做功增加，室壁厚度增加，左室室壁应力增加，提高心脏收缩功能起到早期代偿的机制；但持续的压力超负荷，可促进心肌肥厚，导致心肌细胞的坏死及凋亡，心脏的收缩和/或舒张功能受到损害，最终发展为慢性心力衰竭甚或心源性猝死。本研究运用心脏血流动力学检测评价心功能。

图2是WT和IRF9-KO小鼠I/R模型后的血流动力学检测结果。与WT SHAM组相比，WT小鼠I/R术后24h表现出心功能减弱。通过血流动力学指标的检测，我们观察到术后24h WT小鼠收缩期末压（End-systolic Pressure）、射血分数（Ejection Fraction）、左室内压最大上升速率 (dP/dt max)及左室内压最小上升速率（dP/dt min)均比其SHAM组降低，KO小鼠术后Ejection Fraction，dp/dt max和dp/dt min则比WT组要高，且差异有统计学意义。

【实施例4】小鼠心肌细胞凋亡情况测定检测

1. 取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满10%KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用，再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于10%KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

2. 病理学检测

2.1制备石蜡标本切片

制备石蜡标本切片，主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2 TUNEL 染色

用TUNEL试剂盒染色检测凋亡。 (TUNEL试剂盒：ApopTag® Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit （S7111，Chemicon）):

1）将石蜡切片置于烤箱中，60℃烤片30分钟；

2）二甲苯，5分钟×3次；

3）100%乙醇，5分钟×2次；95%乙醇，5分钟；70%乙醇，5分钟；

4）ddH₂O漂洗，5分钟×2次；

5）蛋白酶K 37℃孵育15分钟；

6）PBS漂洗5min×2次；

7）直接滴加Equilibration Buffer于组织上（13μL/cm²），室温孵育至少10s；

8）弃去Equilibration Buffer，滴加TdT Enzyme工作液（77ulReaction Buffer +33ulTdT Enzyme）于组织上（11μl/cm²），于湿盒于37℃孵育1h；

9）将切片置于盛有Stop/Wash Buffer工作液(1ml Stop/Wash Buffer+34ml ddH2O)的染色缸中振荡15s后室温孵育10min（等待过程中，将适当量的Anti-Digoxigenin Conjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室温下，使其平衡至室温）；

10）PBS漂洗1min×3次；

11）轻轻甩去组织多余残留的液体，将组织周围液体吸3滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液（53%Blocking Solution+47%Anti-Digoxigenin Conjugate））于组织上（13μL/cm²），于湿盒中室温避光孵育30min；

12）PBS漂洗2min×4次(每次换新的PBS)；

13）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen ，S36939）封片；荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4℃保存。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。

心肌组织细胞凋亡情况测定结果见图3所示，我们检测了IRF9-KO小鼠和野生型小鼠术后24小时心肌细胞凋亡情况。TUNEL 细胞凋亡检测显示，IRF9-KO小鼠肝细胞凋亡明显比野生型小鼠降低，这提示IRF9与心肌细胞缺血/再灌注时死亡相关。这些结果表明，抑制IRF9表达可以改善心肌组织缺血/再灌注损伤，且可能与心肌细胞凋亡密切相关。

我们的研究成果表明，IRF9基因敲除小鼠在结扎心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌缺血／再灌注损伤中，我们发现IRF9基因敲除后，小鼠心脏梗死面积明显减少，心功能明显好转。证明IRF9基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病模型中有着重要的恶化作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种IRF9作为药物靶标在筛选治疗脑卒中疾病药物中的应用。

2. 一种IRF9的抑制剂在制备治疗脑卒中疾病药物中的应用。

3.一种治疗脑卒中疾病的药物，其特征在于：包含IRF9。

4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的药物，其特征在于：所述的IRF9的抑制剂为IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干扰载体或IRF9的抗体中的一种。

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