CN108929879A - 一种抗细菌感染鱼类模型及其制备方法和用途 - Google Patents
一种抗细菌感染鱼类模型及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗细菌感染鱼类模型及其制备方法和用途，具体公开了一种提高鱼类抗菌能力的方法，其包括如下步骤：1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2‑hsp‑Myc‑npsn载体；2)将载体通过显微注射至鱼体内并以anti‑Myc免疫荧光染色，获得抗菌能力提高的鱼类。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种斑马鱼模型。
背景技术
Npsn(nephrosin)属于虾红素蛋白家族(astacin family)的一员，并且具有肽链内切酶活性。虾红素蛋白家族属于金属锌蛋白酶超家族的一员，在蛋白质消化、个体背腹轴确定以及形态发生中起着重要的作用。已有的相关研究分析了斑马鱼造血组织的ESTs序列以及整体原位杂交(Whole-mount In Situ Hybridization,WISH)实验，发现了Npsn特异性表达在斑马鱼血管以及造血组织中的基因，并且可以标记斑马鱼的中性粒细胞。
然而已有的实验技术仅仅说明了npsn表达在斑马鱼中性粒细胞中，并没有说明其在中性粒细胞中的作用，本发明构建npsn基因过表达的稳定可遗传的转基因品系，这种品系可以增强鱼类抗菌能力，显著提高细菌感染情况下的存活率，对渔业大规模养殖预防细菌感染非常有利。
发明内容
为了解决上述问题，提高鱼类抗菌能力，本发明一个方面提供了一种提高鱼类抗菌能力的方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F 0代；将F 0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留，即得到F1代具有抗菌能力的鱼类；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得经热激处理后稳定具有抗菌能力的鱼类；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次。
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，热激处理频率为每周热激处理两次。
本发明另一个方面提供了一种抗细菌感染的鱼类模型的制备方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F 0代；将F 0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留并养殖至成鱼，即得到抗细菌感染的鱼类模型；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得经热激处理后稳定抗细菌感染的鱼类模型；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次。
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，共热激两次，热激处理频率为每周热激处理两次。
本发明再一个方面提供了一种npsn过表达鱼类的制备方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F 0代；将F 0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留并养殖至成鱼，即得到npsn过表达鱼类；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得经热激处理后稳定npsn过表达鱼类；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次；
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次。
本发明再一个方面提供了一种降低鱼类感染细菌后炎性因子水平的方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F 0代；将F 0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留并养殖至成鱼，得到感染细菌后炎性因子水平降低的鱼类；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得在经热激处理后稳定的在感染细菌的情况下炎性因子水平降低的鱼类；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次，热激处理频率为每周热激两次；
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，共热激两次，热激处理频率为每周热激处理两次。
在本发明的技术方案中，所述鱼类选自硬骨鱼类，优选为斑马鱼。由于npsn在硬骨鱼类具有高度保守性，所以相同方法也可用于其他硬骨鱼类。
本发明再一个方面提供了Npsn蛋白或者基因作为药物靶点在筛选和/或制备预防和/或治疗细菌感染的药物中的用途。
根据本发明的研究结果，出于本案例的实验结果，发明人发现了npsn过表达可以提高斑马的抗菌能力，因此可以认为Npsn蛋白具有抑菌能力或者杀菌功效，且Npsn在硬骨鱼类中具有高度保守性，因此可以提取Npsn蛋白制成药物，在硬骨鱼类养殖过程中使用此药物来预防细菌感染，同时也可以作为杀菌的药物治疗硬骨鱼类的细菌感染。
本发明再一个方面提供了npsn激动剂在制备预防和/或治疗鱼类细菌感染的药物中的用途。
由于Npsn在体内具有抑菌或杀菌的功效，因此npsn激动剂可以通过激活npsn的表达来达到预防和治疗鱼类细菌感染的效果。Npsn激动剂可作为渔业养殖使用，提高硬骨鱼类的抗菌能力。
本发明的制备方法是非诊断和治疗目的的。
有益效果
1、本发明构建了npsn过表达的转基因斑马鱼Tg(hsp:Myc-npsn)。
2、本发明方法可以有效的提高鱼类的抗菌和抗感染能力。
3、本发明抗感染能力强的转基因鱼类可以稳定遗传。
附图说明
图1：npsn过表达斑马鱼的构建。A.pTol2-hsp-Myc-npsn载体的主要元件。B.Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼的anti-Myc免疫荧光染色，其中野生型斑马鱼的染色结果为阴性对照组。
图2：npsn过表达能够显著提高宿主抵抗大肠杆菌感染的能力。A.npsn过表达斑马鱼感染大肠杆菌实验过程的示意图。B.AB野生型斑马鱼和Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼感染大肠杆菌后生存率分析。log-rank test，***p＜0.001，n＞60。
图3：npsn过表达斑马鱼在感染大肠杆菌后炎症反应较为缓和且清除细菌能力增强。A.qRT-PCR检测大肠杆菌注射卵黄囊2小时后(2hpi)il-1b、il-8、tnfa和tnfb的相对表达量(标准化注射PBS组)。t检验，***p＜0.001，**p＜0.01，n＝30。B.AB野生型斑马鱼和Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼感染大肠杆菌后体内残余大肠杆菌量数目统计分析。#，未检测到。t检验，*p<0.05，n＝50。
具体实施方式
实施例1npsn过表达斑马鱼的构建实验
克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体(如图1A所示)；
将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F 0代；将F 0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行39℃，1小时的热激处理，每12小时处理一次启动npsn基因表达，并且利用anti-Myc抗体染色技术，将Myc+胚胎保留，养至成鱼即稳定过表达npsn的斑马鱼转基因系，被称作Tg(hsp:Myc-npsn)。
F1代斑马鱼自交产生F2代同样保留有pTol2-hsp-Myc-npsn，利用剪尾基因型鉴定以及F2代与野生型斑马鱼交配获得子代，进行热激处理以及anti-Myc抗体染色，观察后代Myc+胚胎比例，即可区分出F2代母本斑马鱼pTol2-hsp-Myc-npsn纯合子或杂合子。
通过抗体染色结果可知，F0代斑马鱼瞬时过表达npsn，热激处理后具有瞬时提高的抗感染能力，而F1代Myc+以及F2代稳定遗传，不同时期热激处理后均可获得抗感染能力，其后代鱼类也同样获得提高的抗感染能力。
实施例2npsn过表达对宿主抵抗大肠杆菌感染效果实验
将Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼和AB野生型斑马鱼感染大肠杆菌，并且在进行大肠杆菌感染实验前将两组同时进行39℃，2小时的热激处理，在感染大肠杆菌后每12小时进行热激处理一次，并且感染大肠杆菌后每天统计鱼体的生存率，具体实验流程如图2A所示。结果显示，npsn过表达后斑马鱼的存活率比野生型斑马鱼显著提高(如图2B所示)，这说明npsn过表达能够增强斑马鱼抵抗大肠杆菌的能力。
实施例3npsn过表达导致斑马鱼感染大肠杆菌后早期炎性因子水平显著降低，清除细菌能力更强。
利用qRT-PCR技术，在野生型斑马鱼和Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼中，分别检测了在大肠杆菌感染早期相关炎性因子的表达水平，结果显示，npsn过表达后，il-1b、il-8、tnfa和tnfb的相对表达量(标准化注射PBS组)相对于野生型斑马鱼显著下降(如图3A所示)，说明npsn过表达斑马鱼体内的炎症反应较为缓和。
同时我们检测了大肠杆菌菌群在野生型斑马鱼和Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼体内增殖的数量，发现在感染大肠杆菌后两天(2days post infection：2dpi)，在野生型斑马鱼和Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼中大肠杆菌的数量都有所上升，但是Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼中增殖的速度明显减慢，导致在1dpi和2dpi，Tg(hsp:Myc-npsn)转基因斑马鱼体内残留较少的大肠杆菌(如图3B所示，靠左侧两列为PBS对照组，其未检测到菌落数)。这说明npsn过表达可以加强斑马鱼中性粒细胞控制大肠杆菌感染的能力，使大肠杆菌在体内繁殖速率减慢，清除细菌能力加强，进而减轻了感染程度。
以上实施例仅用于说明作用，不用于限制权利要求保护范围。
Claims (7)
1.一种提高鱼类抗菌能力的方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F0代；将F0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留，即得到F1代具有抗菌能力的鱼类；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得经热激处理后稳定具有抗菌能力的鱼类；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次；
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，热激处理频率为每周热激处理两次。
2.一种抗细菌感染的鱼类模型的制备方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F0代；将F0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留并养殖至成鱼，即得到抗细菌感染的鱼类模型；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得经热激处理后稳定抗细菌感染的鱼类模型；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次；
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，共热激两次，热激处理频率为每周热激处理两次。
3.一种npsn过表达鱼类的制备方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F0代；将F0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留并养殖至成鱼，即得到npsn过表达鱼类；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得经热激处理后稳定npsn过表达鱼类；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次；
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，共热激两次；热激处理频率为每周热激处理两次。
4.一种降低鱼类感染细菌后炎性因子水平的方法，其包括如下步骤：
1)克隆npsn基因编码区(CDS)，并且将其插入到pTol2载体的热休克启动子后，在npsn编码区后加入编码标签蛋白Myc的序列，构建成pTol2-hsp-Myc-npsn–载体；
2)将载体通过显微注射将pTol2-hsp-Myc-npsn载体和转座酶RNA的混合物注射至单细胞期受精鱼卵内，养至成鱼，即为F0代；将F0代与野生型鱼类交配获得F1代，将获得的受精卵或胚胎进行热激处理，并且以anti-Myc抗体染色筛选Myc阳性胚胎保留并养殖至成鱼，得到感染细菌后炎性因子水平降低的鱼类；
可选地，所述F1代具有抗菌能力的鱼类继续进行繁殖获得在经热激处理后稳定的在感染细菌的情况下炎性因子水平降低的鱼类；
优选地，所述热激处理为36-42℃处理0.5-2小时，每8-16小时热激处理一次，共热激两次，热激处理频率为每周热激两次；
更优选地，所述热激处理为39℃处理1小时，每12小时热激一次，共热激两次，热激处理频率为每周热激处理两次。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述鱼类选自硬骨鱼类，优选为斑马鱼。
6.npsn蛋白或者基因作为药物靶点在筛选和/或制备预防和/或治疗细菌感染的药物中的用途。
7.npsn激动剂在制备预防和/或治疗鱼类细菌感染的药物中的用途。
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| CHING-HSIANG HUNG 等: "Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zinc endopeptidase of the astacin family", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
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