TR201814868T4 - Transgenik mikroalgler ve bunların, proteinlerin oral yolla alımına yönelik kullanımı. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, en az bir ekzojen biyolojik aktif proteini ifade eden transgenik mikrolalgler ortaya koymaktadır. Protein-ifade eden mikroalgler, biyolojik olarak aktif proteinin hedef organizmaya, bozulmamış ve işlevsel formunda oral yolla iletimi için kullanılır. Alg içinde ifade edilen ekzojen proteinin özelliği, algleri tüketen konu üzerinde faydalı bir etkiye sahip olan en az bir spesifik aktivite başlatarak biyolojik olarak aktif olması ile karakterize edilir. Özellikle, transgenik mikroalgler, su ya da kara hayvanlarının sağlığı için hayvan besini olarak ya da insan sağlığı için gıda takviyesi olarak kullanılır.

Description

TARIFNAME TRANSGENIK MIKROALGLER VE BUNLARIN, PROTEINLERIN ORAL YOLLA ALIMINA YÖNELIK KULLANIMI BULUSUN ALANI Mevcut bulus, ekzojen biyolojik aktif proteinleri ifade eden transgenik mikroalgler ve bunlarin, hayvanlar ve insanlar için biyolojik aktif proteinlerin oral yolla alimina yönelik kullanimi ile ilgilidir.

BULUSUN GEÇMISI Biyoaktif proteinler, canli organizmalarin hücrelerinin islevi için elzemdir ve metabolik islemler, iletisim, savunma, hareket ve tasimanin katalizi dahil olmak üzere hücre aktivitelerinin çogundan sorumludur. Biyoaktif proteinlerin oral yolla alimi tipik olarak iki temel amaç için gereklidir: terapötik proteinlerin alimi ve insanlar dahil olmak üzere hayvanlar <üzerinde besinsel ya da baska faydali etkileri olan proteinlerin alimi.

Dünya çapinda besin için büyüyen talep, özellikler hayvansal protein için, hayvan yetistirmenin çevresel etkilerine karsi duyarlilik ile birlikte, karada ve de suda yasayan hayvanlarin verimliligini ve kilo alimini gelistiren sofistike tarimsal isletme aletlerinin gelistirilmesini gerekli kilmaktadir. Deniz hayvanlari proteinler açisindan daha saglikli bir kaynak olarak kabul edildiginden, baliklar, kabuklular ve yumusakçalar dahil olmak üzere deniz hayvanlarinin yetistirilmesine yönelik su ürünleri yetistiriciliginin gelisimi büyük önem tasimaktadir.

Ancak, su ürünleri yetistiriciligi aslinda, deniz hayvanlari ve baliklarin yetistirilmesi için halen tam olarak verimli bir sistem degildir. Tipik olarak baliklar, kabul edilebilir bir boyut ve agirliga kavusmak için nispeten uzun bir zaman araligina ihtiyaç duymaktadir. Ayrica, birçok balik türü verimsiz bir sekilde büyümekte, öyle ki balik popülasyonunda sorunlar ortaya çikmakta, bu da asiri derecede yavas büyüme, zayif morfoloji (süs baliklari için) ve benzeri sebeplerden dolayi popülasyonun bir kisminin kaybedilmesi ile sonuçlanmaktadir. Dahasi, yapay su ürünleri yetistiriciligi ortaminda, su hayvanlari bulasici hastaliklara karsi daha hassastir ve hastalik türediginde, yüksek ölüm oraniyla hizlica tüm popülasyona yayilabilir.

Bu nedenle, karada yasayan ve su çiftligi hayvanlarina yüksek maliyetli olmayan ve zahmetli çalisma gerektirmeyen terapötik ve besinsel proteinlerin uygulamasi yöntemlerine ihtiyaç vardir. Terapötik ya da besinsel proteinlerin insanlar tarafindan oral yolla alimi da oldukça talep edilen bir durumdur çünkü bu uygulama sekli profesyonel insan gücü gerektirmez ve belirtilen doza hasta uyumlulugunu büyük ölçüde arttirir. Bir proteinin biyolojik aktivitesi, protein aktivite hedefine ulasana kadar korunmasi gereken dizilisine ve/veya yapisina baglidir. Basarili sekilde oral yolla alim için, proteinlerin besinlerin ya da bir beslenme bilesiminin içine islenmesi esnasinda ve hayvanin sindirim sistemi yoluyla alimi boyunca meydana gelebilecek kimyasal ve enzimatik bozunumlardan korunmasi gerekmektedir. Ilaveten protein, hayvanin içine girmesini ya da hedef noktasina erisimini engelleyen yapisal engellerin üstesinden gelmelidir.

Mikroalgler (tek hücreli alg ya da bitkisel plankton), dünya üzerinde bulunan en genis ancak en az anlasilan mikroorganizma kralligini temsil etmektedir. Bitkilerin karada yetisen hayvanlar için oldugu gibi mikroalgler, su besin zincirindeki tüm bitkisel gidalarin dogal besin tabanini ve temel kaynagini temsil etmektedir. Alglerdeki rekombinant proteinlerin ifadesi bildirilmistir ve alg hücrelerinde ve özellikle de hücre plastid içinde ekzojen proteinlerin üretimi için çesitli yöntemler mevcuttur. ve bitkiler gibi siyanobakteriler ve ökaryotlar gibi prokaryotlar dahil olarak fotosentetik organizmalarda terapötik proteinleri ifade etme yöntemlerini açiklamaktadir. Ökaryotlarin dönüstürülmesi tercihen plastid genomuna, tipik olarak kloroplast genomuna olmaktadir. Basvuru, alg hücreleri içindeki belirli terapötik proteinlerin ifadesini açiklamaktadir.

Mikroalgleri proteinler için alim araci yapmak üzere çesitli girisimlerde bulunulmustur. Örnegin, Uluslararasi (PCT) Basvuru Yayin No. WO 01/98335, bir biyolojik olarak aktif proteinin bir konakçi hayvana iletilmesi için alim sistemleri ve yöntemleri açiklamaktadir. Ortaya konulan bu sistemler ve yöntemler, bir etkinlestiriciye çalisabilir sekilde bagli olan biyolojik aktif protein için bir nükleotid sekans kodlamasi içeren bir ifade vektörü ile dönüstürülen bir algal hücre elde etmeyi içerir. Gösterilen bir düzenlemede, biyolojik aktif protein bir antijenik epitoptur ve hayvana uygulanmasinin ardindan algal hücre konakçi hayvanda bir ürünleri yetistiriciliginde ya da tarimda yem bilesenleri olarak kullanilan ve ayni zamanda direnci ya da bagisikligi viral ya da bakteriyel patojenlere iletecek olan ya da aksi halde bahsedilen mikrobiyal hücreleri tüketen türlerin sagligini ve performansini gelistirecek olan ekzojen peptitler, proteinler ve/veya antikorlar da içeren mikrobiyal hücrelerin kullanimini açiklamaktadir. Mirobiyal hücreler maya, mantar, bakteri ya da algler olabilir. Proteinler ve/veya antikorlar, mikrobun kendisinin dogrudan genetik modifikasyonu ile ya da ilgili proteini ifade etmek için degistirilmis olan bir virüslü mikrobun enfeksiyonu ile mikrobiyal hücrelerin içinde ifade edilebilir. hayvanini enfekte eden bir patojenin özellikle bir ya da daha fazla anahtar epitoplarini hedef alan bir rekombinant molekülü ifade eden genetik olarak degistirilmis mikro algler ile su hayvanini dogrudan ya da dolayli olarak besleyerek bir su hayvanindaki bir hastaligin ya da bozuklugun engellenmesi, iyilestirmesi ya da tedavisi için yöntemler açiklamaktadir. aktarimini kolaylastirmak için bir protein enzimi ile alg hücre duvarini zayiflatmayi ya da kaldirmayi ve transgenik alg ya da bunun çogalimlarini içeren bir yem bilesimini içeren alglerde bir yabanci arzu edilen gen ürünü üretmek için yöntem açiklamaktadir. Bulus ayni zamanda, alglerde bovin laktoferisin (LFB) ifade etmek için bir modifiye edilmis nükleik asit ortaya koymaktadir.

Hepatit B yüzeyi proteinine ve diyatomdaPhaeodactylum tricornutum ilgili antijene karsi bir monklonal insan IgG antikorunun ifadesi açiklar.

Antikorlar, tam olarak olusmus ve islevsel ve toplam çözünebilir` proteinin % 8.7'si kadar birikmis olarak gösterilmistir ki bu algal kuru agirliginin grami basina 21 mg antikor ile uyumludur. Hepatit B yüzey proteini de islevsel olarak bulunmustur ve algler ile üretilen ve ticari antikorlar tarafindan taninmistir.

WO 01/98335, bir biyolojik olarak aktif proteinin bir konakçi hayvana iletilmesi için olanin aynisini kullanmanin alim sistemleri ve yöntemleri açiklamaktadir. Sistem, bir protein için bir nükleotidr sekansi kodlamar içeren› bir algal hücre içermektedir. Bu protein tercihen hücre yüzeyinde ya da sitoplazma içerisinde ya da transgenik algin bir örgenciginde konumlandirilan tercihen bir antijenik determinanttir.

Transjenik algler, konakçi hayvanda bir patojene bir bagisiklik tepkisi baslatmak için ve patojenden kaynaklanan bir hastaligi tedavi etme, iyilestirme ya da engelleme için kullanislidir.

Dae-Hyun ve ark. (Chlorella Ellipsoidae in Marine Biotechnology, Jan. 2002, p. 63-73), microalga Chlorella ellipsoidea protoplastlari içinde pisi baligi büyüme hormonu geninin stabil entegrasyounu ve islevsel ifadesini açiklamaktadir. Dönüstürülmüs klorellada beslenen pisi baligi yavrusu, 30 günlük beslemenin ardindan %25'lik bir büyüme artisi göstermistir. uygulamalarda patojen tedavisi ya da kontrolü için prokaryotik ve ökaryotik heteretrof alglerde islevsel olarak aktif rekombinant tekli zincir antikorlarin ifadesini açiklamaktadir. Chlamydomonas reinhardtii' nin, KDEL olan ER tutulum dizilisi ile, ER'de immunoglobülin isik Zincirlerini (ScFv) ifade edebilir ve su ürünleri patojenlerini, özellikle virüsleri inhibe etmek için kullanilabilir.

Ancak, halen karsilanmamis bir ihtiyaç bulunmakta ve üretim ve kullanim için kolay olan, proteinin biyolojik aktivitesini devam. ettiren ve biyolojik. olarak aktif proteinin sistematik sekilde emilmesini kolaylastiran bir oral yolla alim sistemine sahip olma hayli avantajli olacaktir.

BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, biyolojik olarak aktif proteinin kendi aktif formunda sistematik olarak emilmesini saglayarak, biyolojik olarak aktif proteinlerin bir organizmaya oral yolla verilmesi için bir algal bazli platform ortaya koymaktadir. Özellikle mevcut bulus, bir önceden belirlenmis hücre içi bölüm içerisinde en az bir ekzojen proteini ifade eden transgenik mikrolalgler saglamaktadir. Protein-ifade eden mikroalgler, hayvan besini ya da su hayvanlarini ve kara hayvanlarini beslemek için ve insanlar için besin takviyesi olarak 'uygulanabilir olan. besin katkisi olarak kullanilir.

Ekzojen proteinin özelligi, hedef organizmada faydali bir etkiye sahip olan en az bir spesifik aktivite baslatarak biyolojik olarak aktif olmasi ile karakterize edilir.

Mevcut bulus, ifade edilen proteinin aktif kaldigini ve bu algler su hayvanlari (baliklar ve kabuklular dahil) ve ayrica kara hayvanlari (fareler ve kümes hayvanlari dahil) tarafindan oral yolla tüketildiginde faydali bir etkiye sahip olan spesifik aktivitesini baslatir. Tipik olarak, protein bozulmamis formunda kalir. Herhangi bir belirli teori ya da hareket mekanizmasi tarafindan sinirlandirilmayi istemeksizin, korunan protein aktivitesi dokunulmamis mikroalgler içinde kendi konumlandirmasina atfedilebilir ve böylece mikroalgal hücre, proteini hayvanin sindirim sisteminde ve/veya. mide asidinde bozulmasina karsi koruyan dogal bir kapsülleme malzemesi islevi görür. Bu protein vokuoldeki mikroalgalde ifade edilir.

Böylece, bir duruma göre mevcut bulus, bir biyolojik olarak aktif ekzojeni sifreleyen en az bir dönüstürülebilir polinükleotid içeren bir ifade kaseti içeren bir transgenik ökaryotik mikroalg ortaya koymaktadir ve burada ifade edilen biyolojik olarak, aktif ekzojen, proteini, mikroalg hücrenin hücre vokuolüne hedeflenir.

Bazi düzenlemelere göre ifade kaseti ayrica, bir vakuol hedefleme peptidini sifreleyen bir polinükleotid içermektedir. Bazi düzenlemelere göre, ekzojen proteini vakuol içine hedefleyen peptid SEQ ID NO:4'te ortaya konan amino asit dizilisine sahip bir kisa vakuol öncü dizilisidir.

Diger düzenlemelere göre, kisa vakuol öncü peptidi sifreleyen polinükleotid, SEQ ID NO:18'de ortaya konan nükleik asit dizilisini içerir. Çesitli mikroalg türleri, mevcut bulusun ögretilerine göre kullanilabilir. Belirli düzenlemelere göre, mevcut bulusun ögretilerine göre kullanilan mikroalg bir deniz mikroalgidir.

Belirli düzenlemelere göre mikroalg, bunlarla sinirli olmaksizin asagidakilerden olusan gruptan seçilir: Phaeodactylum tricornutum; Dunaliella spp.; Nannochloropsis dahil oculata Nannochloropsis spp. , Künnochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana; Nannochloris spp., Tetraselmis suecica dahilTetraselmis spp., Tetraselmis chuii; Isochrysis galbana; Pavlova spp.; Amphiprora hyaline; Chaetoceros muelleri; ve Neochloris oleoabundans.

Belirli düzenlemelere göre Hdkroalg, asagidakilerden olusan gruptan seçilir: Phaeodactylum tricornutum, Nannochloris spp., Nannochloropsis spp. ve Dunaliella spp.

Belirli düzenlemelere göre mikroalg Phaeodactylum tricornutum'dur.

Mevcut bulusa ait transgenik mikroalg, aynisini tüketen hedef hayvanda bir etkiye sahip olan herhangi bir proteini ifade etmek için dönüstürülebilir.

Belirli düzenlemelere göre, ifade edilen proteinin moleküler agirligi 150 kDa'ya kadardir. Ifade edilen proteinin moleküler agirligi bu yüzden l40kDa, l30kDa, lZOkDa ya da llOkDa'ya kadar ya da l-lOOkDa araliginda olabilir. Ifade edilen proteinin moleküler agirligi ayrica l-SOkDa araliginda olabilir.

Belirli düzenlemelere göre proteinin, tüketim hayvanlarinin büyümesi ve hayatta kalmasindan en az biri üzerinde faydali bir etkisi vardir. Diger düzenlemelere göre protein, transgenik mikroalgler tüketen hayvan üzerinde terapötik bir etkiye sahiptir.

Yine ilave düzenlemelere göre hayvan bir su hayvanidir; ifade edilen protein, su hayvani morfolojisini etkileyebilir ya da bu protein, akuatik vücut deformasyonunun bir etkisine sahip olabilir. Vücut defromasyonu bunlarla sinirli olmaksizin, herhangi bir Hwrfolojik bozukluk, herhangi bir tipte vücut asimetrisi, bozuk vücut sekli, bozuk yüzgeç sekli, bozuk kuyruk sekli; bozuk Vücut/yüzgeç bölgesi, uzunluk ya da genislik orantilari; bozuk vücut/kuyruk bölgesi, uzunluk ya da genislik orantilari; bozuk kuyruk/yüzgeç bölgesi, uzunluk ya da genislik orantilari; ya da herhangi bir vücut bölümünde bozukluklari içermektedir. Ifade edilen protein ayni zamanda su hayvaninin vücut deformasyonunu da azaltabilir ya da giderebilir.

Diger' belirli düzenlemelere göre, transgenik Inikroalg, bir hormonu ifade eder. Bazi düzenlemelere göre bu hormon, bir büyüme hormonu, istah artirici hormon ve yumurtlama hormonundan olusan bir gruptan seçilir. Her olasilik, mevcut bulusun bir ayri düzenlemesini gösterir.

Belirli mevcut durumda spesifik düzenlemelere göre, ifade edilen protein bir balik büyüme hormonudur. Bazi düzenlemelere göre, balik büyüme hormonu SEQ ID NO:12'de ortaya konan amino asit dizilisine sahip Somon büyüme hormonudur. Balik büyüme hormonu SEQ ID NO:1'de ortaya konan nükleik asit dizilisine sahip polinükleotid tarafindan sifrelenebilir.

Ilave düzenlemelere göre, ifade edilen protein, SEQ ID NO:24'te (Katilimi No.: P68072) ortaya konan amino asit dizilisine sahip yumurtlama hormonudur. Yumurtlama hormonu SEQ ID NO:25'te ortaya konan nükleik asit dizilisine sahip polinükleotid tarafindan sifrelenebilir.

Yine diger düzenlemelere göre, ifade edilen protein, SEQ ID NO:20'de ortaya konan amino asit dizilisine sahip istah artirici hormondur. Istah hormonu SEQ ID NO:21'de ortaya konan nükleik asit dizilisine sahip polinükleotid tarafindan sifrelenebilir.

Ilave duruma göre mevcut bulus, mevcut bulusa ait transgenik mikroalgleri içeren bir yenilebilir bilesim ortaya koymaktadir. Bazi düzenlemelere göre, yenilebilir bilesim bir hayvan besin bilesimidir. Örneksel düzenlemelere göre, hayvan besin bilesimi su hayvanlarini beslemek içindir. Diger düzenlemelere göre, yenilebilir bilesim insan tüketimi Yukarida açiklandigi üzere, yenilebilir bilesim, biyolojik olarak aktif proteinlerin oral yollama alimi için kullanilir. Özellikle, yenilebilir bilesim hayvan tüketimi için oldugunda, yenilebilir bilesim temel olarak transgenik alglerden meydana gelebilir. Yenilebilir bilesim, tek basina ya da hayvan veya insan besinine bir katki olarak kullanilabilir.

Belirli düzenlemelere göre, hayvan konusu bir kara hayvani ya da su hayvanidir. Kara hayvani opsiyonel olarak, sigirlar, domuzlar, atlar, köpekler, kediler, fareler, siçanlar, tavsanlar, gine domuzlari, kümes hayvanlari ve benzerleri dahil olarak ancak bunlarla sinirli olmaksizin besin amaçli olarak ya da besin amaçli olmayarak (ikincisi is hayvanlari, evcil hayvanlar ve benzerleri dahil ancak bunlarla sinirli olmaksizin) beslenen herhangi bir hayvan olabilir. Kara hayvani opsiyonel olarak, baliklar, kabuklular ve Hercanlar dahil olarak ancak bunlarla sinirli olmaksizin besin amaçli olarak ya da besin amaçli olmayarak (ikincisi süs canlilari ve benzerleri dahil ancak bunlarla sinirli olmaksizin) beslenen herhangi bir' hayvan olabilir. Ilave düzenlemelere göre, hayvan konusu bir insandir.

Mevcut bulusun diger amaçlari, özellikleri ve avantajlari asagidaki açiklama ve çizimlerden anlasilir olacaktir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1, tam pPhaTl ifade vektörünün bir semasini gösterir.

SEKIL 2, farkli hücre içi organallerine hedeflenen Somon büyüme hormonunu ifade eden Phaeodactylum tricornutum türlerinin transgenik alglerinden çikartimlanan proteinlerin Western blotunu gösterir.

SEKIL 3, normal balik besini (kontrol) ile beslenen baliklara kiyasla, ER'ye (356) ya da vakuol'e (398) hedeflenen balik büyüme hormonunu (fGH) asiri üreten transgenik algler içeren balik ticari normal besini ile beslenen melek baliginin toplam büyüme performansini göstermektedir. Balik büyümesi, baslangiç balik agirligina göre agirlik ilavesinin yüzdesi olarak gösterilir.

SEKIL 4, baliklari, vakuol hedefli-fGH ifade eden algler (398) içeren normal besin ile beslemenin, normal balik besini ile beslenen baliklara kiyasla, 2 gr üzerine ulasan baliklarin sayisinda artisla sonuçlandigini göstermektedir.

SEKIL 5, Melek baliginin toplam agirligina besin takviyesi olarak. uygulanan transgenik algler asiri üretiminin fGH etkisini göstermektedir. 398 - % 4 vakuol hedefli-fGH ifade algleri içeren Normal balik yemi. Kontrol - sadece normal balik yemi. Balik büyümesi, baslangiç balik agirligina göre agirlik ilavesinin yüzdesi olarak gösterilir.

SEKIL 6, transgenik algleri asiri üreten vakuol hedefli fGH içeren balik normal besini tüketiminin koi baliklarinin seklindeki deformasyonlar üzerindeki etkisi gösterir. 398 - o 4 fGH ifade algleri içeren Normal balik besini. Kontrol - sadece normal balik besini.

SEKIL 7, japon baliginin toplam agirliginda transgenik algler asiri üretimi fGH tüketiminin etkisini göstermektedir. 398 - % 4 vakuol hedefli-fGH ifade algleri içeren Normal balik besini. Kontrol - sadece normal balik SEKIL 8, yabani tip Phaeodactylüm tricornutum (Sekil 8A), yabani tip Nannochloris (Sekil 8B) ve Phaeodactylum tricornutum ifade eden vakuol hedefli-balik büyüme hormonu (Sekil 8G) ile beslenen tuzlu su karidesinin (Artemia) resimlerini göstermektedir. Yemler canli algler olarak takviye edilmektedir.

SEKIL 9, yabani tip Nannochloris (kontrol) ile; yabani tip Phaeodactylum tricornutunz (w.t.) ile; ya da vakuole (398) hedeflenen Phaeodactylum tricornutum ifade eden fGH ile beslenen tuzlu su karidesinin Vücüt uzunlugunu göstermektedir. Yemler canli algler olarak takviye edilmektedir.

SEKIL 10, Macrobrachium rosenbergii karidesin agirliginda fGH ifade eden mikroalgler içeren besinlerin etkisini göstermektedir. 398 - alg vakuole hedeflenen transgenik algler asiri üreten balik büyüme hormonu ile takviye edilen normal besin ile beslenen karidesler. Kontrol - sadece normal besin ile beslenen karidesler. Karideslerin agirligi 6 hafta sonra ölçüldü.

SEKIL 11, yabani tip algler (Sekil llA) ile ya da vakuol hedefli GFP ifade eden algler (yapi 527, Sekil llB) ile beslenen Tilapia baliklarinin midelerinin floresans görüntülemesini göstermektedir. Resimler beslenmeden 4 saat sonra floresans isini altinda çekilmistir.

SEKIL 12, yabani tip algler (Sekil 12A) ile ya da vakuol hedefli GFP ifade eden algler (Sekil 12B) ile beslenen Tilapia baliklarinin bagirsaklarinin floresans görüntülemesini göstermektedir. Resimler beslenmeden 5 saat sonra floresans isini altinda çekilmistir.

SEKIL 13, yabani tip algler (Sekil l3A) ile ya da vakuol hedefli GFP ifade eden algler (Sekil 13B) ile beslenen tuzlu su karidesinin Artemia kültürlerinin floresans görüntülemesini göstermektedir. Resimler beslenmeden 4 saat sonra floresans isini altinda çekilmistir.

SEKIL 14, yabani tip (WT) ile ya da vakuol hedefli GFP ifade eden algler ile beslenen karideslerin Macrobrachium rosenbergii parlak (Sekil l4A) ve floresans (Sekil l4B) isigi altinda çekilen resimlerini göstermektedir.

SEKIL 15, yabani tip (WT) ile ya da vakuol hedefli GFP ifade eden algler ile beslenen piliçlerden izole edilen karacigerlerin beslenmeden 6 saat sonra parlak (Sekil 15A) ve floresans (Sekil l5B) isigi altinda çekilen resimlerini göstermektedir.

SEKIL 16, alg-ifadeli fGH'nin balik kani içine emilimini göstermektedir. Tilapia baliklari, akuol-GFP ifade eden algler (yapi 527) ile ya da vakuol-fGH ifade eden algler (yapi 398) ile beslenmeye zorlanmislardir. Kandaki fGH seviyesi, spesifik olarak rekombinanta fGH karsi yönlendirilen ELISA ile belirlenmistir. Sonuçlar ortalama 6 SEM olarak gösterilmektedir. Sonuçlar 4 bagimsiz deneyin temsilcileridir.

SEKIL 17, alga vakuol içerisinde ifade edilen, GFP'nin bir aktif formunun, balik bagirsagindan kani içerisine bozulmamis ve islevsel bir formda emildigini göstermektedir.

Tilapia baliklari, vakuol-GFP ifade eden algler (yapi 527) ile ya da vakuol-fGH ifade eden algler (yapi 398) ile beslenmeye zorlanmislardir. Kandaki fGH seviyesi, floresans plaka okuyucu (515nm) kullanilarak belirlenmistir. Sonuçlar ortalama 6 SD olarak gösterilmektedir. Sonuçlar 3 bagimsiz deneyin temsilcileridir.

SEKIL 18, alga hücre vakuole hedeflenen ekzojen proteinlerin, balik sindirim sisteminde bozunuma ugramaktan korunmasini göstermektedir. Sekil l8A, vakuol-hedefli GFP ifade eden alglerden (yapi 527) elde edilen baslangiç GFP- floresanslarini; bu alglerin (GFP) ve vakuol-hedefli fGH ifade eden alglerden (yapi 398) toplam protein çikartimini gösterir. Sekil 18B, her biri yukarida açiklanan algler ya dar protein çikartimi ile beslenen Tilpia ;baliklarininr kan örneklerinden elde edilen floresansi gösterir. Kandaki fGH seviyesi, floresans plaka okuyucu (515nm) kullanilarak belirlenmistir. Sonuçlar ortalama 6 SD olarak gösterilmektedir.

SEKIL 19, algler hücre vakuole hedeflenen ekzojen fGH'nin, algler ile beslenen farelerin kanina ve karacigerine ulastigini gösterir. Fareler, vakuol-fGH ifade eden algler (yapi ile beslenmistir. Karacigerdeki fGH seviyesi, spesifik olarak rekombinanta fGH karsi yönlendirilen ELISA ile belirlenmistir. Sonuçlar ortalama 6 SD olarak gösterilmektedir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, biyolojik olarak aktif proteinlerin bir organizmaya, bu gibi proteinlerin ihtiyaci durumunda, oral yolla verilmesi için bilesimler ve yöntemler ortaya koymaktadir. Özellikle mevcut bulus, biyolojik olarak aktif proteinleri ve aynini içeren yenilebilir~ bilesimleri ifade eden mikroalgler ortaya koymaktadir. Mevcut bulus, proteinin biyolojik aktivitesinin, tüketilen algler içerisinde korundugunu ve ayrica proteinin transgenik mikroalgleri tüketen organizmalarin hücrelerinde veya dokularinda biyolojik aktivitesini uyguladigini göstermektedir.

Tanimlar kapsamlari ile kullanilmaktadir ve tipik olarak tatli su ve deniz sistemlerinde bulunan tek hücreli mikroskobik ökaryotik algleri refere etmektedir. Türlere bagli olarak mikroalglerin boyutu, birkaç mikrometreden (um) birkaç yüz mikrometreye kadar degisebilir. Terim, deniz ökaryotik mikrolalga ya da mikroalgler anlamina gelebilir. olan kodlama dizilisleri içeren bir nükleik asit (ör. DNA ya da RNA) sekansi anlamina gelir. Bir polipeptid, bir tam- uzunluklu kodlama dizilisi ile ya da bunun herhangi bir parçasi ile sifrelenebilir. "bunlarin parçasi" terimi, bir gene istinaden kullanildiginda o genin parçalari anlamina gelir. Parçalar boyut olarak, birkaç nükleotidden eksi bir nükleotid tüm gen dizilisine degiskenlik gösterebilir.

Böylece, "bir genin en azindan bir parçasini içeren bir nükleik asit dizilisi" genin parçalarini ya da genin tamamini içerebilir. kodlama bölgelerini de kapsar ve genin tam-uzunluk mRNA'nin uzunluguna denk gelecegi sekilde her iki uçta yaklasik 1 kb'lik bir mesafe için hem 5' hem de 3' uçlarinda kodlama bölgesine bitisik olarak konumlandirilan dizilisleri içerir.

Kodlama bölgesinin 5' ine konumlandirilan ve mRNA'da mevcut olan dizilisler 5' Çevrilmemis dizilisler olarak adlandirilir. 3' ya da kodlama bölgesinin asagi akisina konumlandirilan ve mRNA'da. mevcut olan dizilisler 3' çevrilmemis dizilisler olarak adlandirilir. terimleri, peptid baglari ile biri digerine bagli olan amino asit kalintilarinin bir dogrusal serisini belirtmek üzere tarifname boyunca aralarinda degistirilebilir olarak kullanilir. Terim ayni zamanda peptidleri de kapsamaktadir. dizilisi" terimleri burada degistirilebilir biçimde kullanilir. Bu terimler nüklotid dizilisleri ve benzerlerini kapsar. Bir polinükleotid, tek ya da çift sarmal, dogrusal ya da dallanmis olan ve opsiyonel olarak sentetik, dogal olmayan ya da degistirilmis nükleotid bazlari içeren RNA ya da DNA ya da bunlarin karisiminin bir polimeri olabilir. Terim ayni zamanda RNA/DNA hibridlerini de kapsamaktadir. Mevcut bulusun baglaminda kullanilan polinükleotidler, dönüstürülecek olan belirli mikroalga türlerinin bir dizgi kullanimini uygulayan ilgili proteinin amino asit dizilisine dayali olarak tasarlanabilir. aralarinda degistirilebilir olarak kullanilir ve ilgili proteini sifreleyen polinükleotidi içeren yapay olarak birlestirilmis ya da izole edilmis bir nükleik asit molekülünü ifade eder. Yapi ayrica, bazi durumlarda ilgili bir proteini de sifreleyebilen bir isaretleyici genini de içerebilir. Ifade kaseti ayrica, ilgili proteini sifreleyen polinükleotide isler sekilde baglanan uygun düzenleyici dizilisleri içerir. Düzenleyici dizilislerin bir yapi içine dahil edilmesinin seçenege bagli oldugunun takdir edilmesi gerekir, örnegin bu gibi dizilisler, bir konakçi hücrenin düzenleyici dizilislerinin kullanilacagi durumlarda gerekli olmayabilir.

Organizma, isler sekilde baglanan bir etkinlestirici dizilisi, ilgili proteini sifreleyen bir polinükleotid ve bir sonlandirma dizilisi içeren bir ifade kaseti içerebilir. tekli nükleik asit parçasinda, birlesimi anlamina gelir ve böylece birinin islevi digeri ile düzenlenir. Örnegin bir etkinlestirici, o kodlama dizilisinin ifadesini düzenleyebildiginde bir kodlama dizilisi ile isler sekilde baglanir (yani, kodlama dizilisi etkinlestiricinin transkripsiyonel kontrolü altindadir). Kodlama dizilisleri, bir sens ya da antisens oryantasyonunda düzenleyici dizilislere isler sekilde baglanabilir. sekliyle, bir DNA polimerinin protein kodlama bölgesini bitiren (yani ilerleyen) 5' e kadar yukari akis konumlandirilan bir DNA dizilisi anlamina gelir. Dogada bilinen çogu etkinlestiricinin konumu kopyasi çikarilan bölgeden önce gelir. Etkinlestirici, bir gen ya da bunun bir parçasinin ifadesini aktiflestiren bir anahtar olarak islev görür. Gen aktiflestirilirse, kopyasi çikarildigi ya da transkripsiyonda yer aldigi söylenir. Transkripsiyon, genden mRNA'nin sentezini içerir. Etkinlestirici bu nedenle, bir transkripsiyonel düzenleyici eleman olarak görev yapar ve ayni zamanda genin. mRNA içine transkripsiyonunun baslamasi için bir alan saglar. Etkinlestiriciler, yerel bir genden bütünlügü ile türetilebilir ya da dogada bulunan farkli etkinlestiricilerden türetilen farkli elemanlardan olusturulabilir ya da hatta sentetik DNA segmentleri içerebilir. Farkli etkinlestiricilerin, bir genin ya da bir parçasinin ifadesini farkli dokularda ya da hücre tiplerinde veya gelisimin farkli asamalarinda ya da farkli çevresel kosullara cevaben yönlendirebildigi teknikte uzman kisilerce anlasilmaktadir. Çogu durumda, düzenleyici dizilislerin kesin sinirlari tamamen belirlenmemis oldugundan, kimi varyasyonun DNA parçalarinin özdes etkinlestirici aktivitesine sahip olabilecegi ayrica anlasilmaktadir. Bir genin çogu zaman çogu hücrede ifade edilmesine yol açan etkinlestiriciler yaygin olarak "Olusturucu etkinlestiriciler" olarak adlandirilmaktadir.

Etkinlestirici, bir Olusturucu etkinlestirici, bir endüklenmis etkinlestirici ya da bir dokuya özgü etkinlestirici olabilen, organizmaya ait yerel etkinlestirici ya da bir heterolog etkinlestirici olabilir.

Teknik alanda, mikrolaglerde aktif oldugu bilinen her etkinlestirici mevcut bulusun ögretilerine göre kullanilabilir. Sinirlayici olmayan örnekler, fukoksantin klorofil protein A (fcpA); B (fch); C (fcpC) ve E (fcpE) etkinlestiriciler ve de herhangi bir isik hasat kompleksi (Lhc) etkinlestiricidir. Isiksiz hasatla ilgili etkinlestiriciler de kullanilabilir ve bunlarla sinirli olmaksizin asagidakileri içerir: nopalin sentaz etkinlestirici; Agrobacterium tumefaciens'in Ti plazmidinden poli-adenilasyon dizilisleri; tubB"nin etkinlestirici bölgesi; bakteriyofajdan A PL etkinlestirici; CaMV 358 etkinlestirici; bakteriyel to etkinlestirici; isi sok proteini 7OA etkinlestirici (HSP7OA); ve Rubisco küçük altbirim 2'nin (RBCSZ) bir etkinlestiricisi.

Burada kullanildigi üzere "besin" terimi insan ya da kara ve su hayvanlari dahil olmak üzere hayvan tüketimi için besin anlamina gelir.

Burada kullanildigi üzere "su ürünleri yetistiriciligi" terimi kontrol edilen kosullar altinda yetistirilen su organizmalarini ifade etmektedir. Bir "su organizmasi", tatli ya da tuzlu su olabilen suda yetisen bir organizmadir. Su organizmalari, bunlarla sinirli olmaksizin, baliklar, ör. levrek, çizgili levrek, tilapia, yayin baligi, çipura, gökkusagi alabaligi, zebra baligi, eskina baligi, japon baligi, Koi baligi, Melek baligi ve sazan; kabuklular, Ör. penaeid. karidesi, tuzlu su karidesi, tuzlu. su ve tatli su karidesi, ve Artemya; ve rotiferalar.

Bulusu gerçeklestirmek için belirli düzenlemeler Mevcut bulusun ögretileri, mevcut bulusun en azindan bazi durumlarinin uygulanmasi için sinirlayici olmayan örnekler olarak hayvanlara özellikle de su ürünleri yetistiriciliginde büyütülen hayvanlara ve model kara hayvanlarina istinaden asagida gösterilmektedir.

Mevcut durumda kullanilabilir olan su ürünleri yetistiriciligi sistemleri genellikle açik ya da kapali olarak siniflandirilir. Açik sistemler tipik olarak, bir göl ya da akarsu gibi bir su kaynaginda bir ag kafes insa edilmesi ile olusturulur. Kapali sistemler genellikle, suyun bir aritma sistemi araciligiyla tanktan ve tanka geri pompalandigi, bir kapali tank içinde suyu devirdaim ettirir.

Su ürünleri yetistiriciligi sistemleri, baliklar, kabuklular ve yumusakçalar gibi su hayvanlarini, öncelikli olarak gida ürünleri ve ayni zamanda süs canlilari olarak farkli kullanimlar için pazarlanabildikleri bir boyuta büyütmek için kullanilir. Ayrica, baliklar ya da diger su hayvanlari için gelismis bir besin açiklanmaktadir. Uygun besin, su ürünleri yetistiriciligi sistemlerinin Önemli bir parçasini olusturur; ayrica, gelismis büyüme (uzunluk ve/veya kilo alimini gelistirme dahil), gelismis büyüme sablonu (özellikle vücut deformasyonunu azaltma ya da giderme), cinsel olgunlasma ya da diger bir yasam döngüsü asamasi zamanini kisaltma, gelismis genel saglik (hayatta kalma oranini artirma dahil) ya da bunlarin kombinasyonlarini içeren gelismis sonlanima sahip besin üretimi için araç ve yöntemler de açiklanmaktadir.

Biyolojik olarak aktif bir protein içeren yenilebilir bir bilesimin oral yolla uygulanmasi çiftçiligin yani sira su ürünleri yetistiriciliginde de önemli bir ekonomik degerdir ve bilesenin her hayvana tek tek uygulanmasi gerekliligini ortadan kaldirmaktadir.

Terapötik yenilebilir bilesimler, profesyonel insan gücü gerektirmediginden (örnegin bir terapötik bilesigin damar içi uygulanmasi gerekliligi) ve tüketimi kolay oldugundan ve böylece hastalarin önerilen dozu almaya uyum göstermelerini arttirdigindan insanlar için de oldukça arzu edilmektedirler.

Bir duruma göre mevcut bulus, bir biyolojik. olarak aktif ekzojeni sifreleyen en az bir dönüstürülebilir polinükleotid içeren bir ifade kaseti içeren bir transgenik ökaryotik mikroalg ortaya koymaktadir ve burada ifade edilen biyolojik olarak aktif ekzojen proteini, mikroalg hücrenin hücre vokuolüne hedeflenir. Çesitli alg türleri, mevcut bulusun ögretilerine göre kullanilabilir. Belirli düzenlemelere göre alg, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir deniz mikroalgidir: Phaeodactylum tricornutum; Dunaliella spp.: Nannochloropsis dahil oculata Nannochloropsis spp. , Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana; Nannochloris spp., Tetraselmis suecica dahilTetraselmis spp., Tetraselmis chuii; Isochrysis galbana; Pavlova spp.; Amphiprora hyaline; Chaetoceros muelleri; ve Neochloris oleoabundans. çapraz kesitten gelir ve bunlari temsil eder türlerin çok genis taksonomik Tablo 1: Ökaryotik alglerin bazilarinin filojenisi Tür Familya Takim Sube Alem Phaeodactylum Phaeodactyl Naviculales Bacillariop Chromalveola aceae hyta ta (devami) Tür Familya Takim Sube Alem Dunaliella Dunaliellac Chlamydomona Chlorophyta Viridaeplant Nannochloris Coccomyxace Chlorococcal Chlorophyta Viridaeplant Tetraselmis Chlorodendr Chlorodendra Chlorophyta Viridaeplant Nannochlorops Monodopsida Eustigmatale Heterokonto Chromobiota is ceae s phyta Pavlova Pavlovaceae Pavlovales Haptophyta Chromobiota Guiry, M D ve Guiry> G M. 2013. AlgaeBase. Dünya çapinda elektronik yayin, Irlanda, Galway Ulusal Üniversitesi'ne göre filojeni.

Belirli spesifik düzenlemelere göre, mevcut bulusun Ögretilerine göre kullanilan transgenik mikroalg fitoplanktonun bölümünü olusturan ve iliman iklimlerden gelen bir diatomaceous tek hücreli algdir. Bu alg, dönüsüme kolayca uyum saglar ve dönüstürülmüs alg su ürünleri yetistiriciliginde iyi sekilde büyütülür. Ek olarak bu alg, nontoksik ve nonpatojeniktir ve özellikle baliklar ve deniz omurgasizlari ve ayrica kara hayvanlari olmak üzere hayvanlar için besin kaynagi olarak kullanilabilir.

Mevcut bulusa ait transgenik mikroalglerin birincil kullanimi bir yenilebilir bilesim olaraktir. Algal hücrede ifade edilen ekzojen proteini bilesimi aktif formunda tüketen konunun hedef hücresine ya da dokusuna ulasmalidir ki burada konu su ya da kara hayvani ve insanlardir. Biyolojik olarak aktif bir proteinin oral yolla alinmasinin temel engellerinden birisi, proteinin oral yolla alinan ürünün hazirlanmasi ve depolanmasi ve bundan sonra sindirim sisteminde hedef konunun gövdesi içindeki süreçleri boyunca çevresel kosullara karsi hassasiyetidir.

Mevcut bulus simdi, mikroalgin bir hücre içi bölümü içerisinde ifade edilen ekzojen proteinin, su ve de kara hayvanlari tarafindan tüketildiginde aktivitesini korudugunu göstermektedir. Herhangi bir belirli teori ya da hareket mekanizmasi tarafindan sinirlandirilmayi istemeksizin, protein aktivitesi, algal biyokütlenin büyümesi ve islemesi boyunca dis sert ortamdan ve dahasi algleri tüketen konu hayvanin sindirim sisteminin ortamindan proteini koruyan bir kapsüllenme formu olarak görev yapabilen bozulmamis alg hücresi tarafindan özellikle hücre çeperleri tarafindan korunabilir.

Mevcut bulusa göre, ekzojen protein mikroalg hücre vakuolü içerisinde ifade edilir. Ekzojen proteini, alg kloroplast içerisinde ifade etme, mevcut bulustan açik bir sekilde çikarilmistir.

Proteinlerin oralla yolla aliminda çözülmesi gereken diger bir` problem, proteinlerin ve peptidlerin, nüfuz etmelerini kati sekilde sinirlayan hedef hayvan konusunun gastrointestinal epitalyel hücre zarlari içerisine girmesidir. Minimum derecede bir lipofilisite proteinlerin, hücreler arasi emilim için epitalyel hücre zarlari içine bölümlenmesi için gereklidir. Beklenmedik sekilde, mevcut bulus simdi, bitki vakuolü içinde ifade edilecek olan polinükleotidlerin hedeflenmesinin, ifade edilmis, biyolojik olarak aktif proteinin transgenik mikroalgleri tüketen hayvanin kan akisi içine verimli sekilde aktarilmasini sagladigini göstermistir. Proteinin vakuol içine hedeflenmesi, kloroplastlar dahil olmak üzere diger hücre bölümleri içine hedeflenmesine göre avantajli olmustur.

Vakuoller, bir hücrenin hücre içi zari sisteminin bölümüdür; bu nedenle, sadece bir tek hipotez ya da hareket mekanizma ile sinirlandirilmak istemeksizin, peptidlerin ya da proteinlerin, hücre içi zari sisteminin parçasi olan mikroalg hücre vakuolüne hedeflenmesi, alg bir kez tüketildiginde hayvanin sindirim sistemi boyunca emilimi artirabilir ve çeperleri hayvan konusu tarafindan bozunuma ugaratilir.

Emilimdeki bu gibi bir artis, peptid ve protein moleküllerinin "algilanan" lipofilisitesini, epitelyal hücre zarlari ile arttirmadan kaynaklanabilir ki bu bagirsak boyunca 'verimli emilim› ile sonuçlanir. Ilaveten, proteinin vakuol boyunca saglanmasinin, proteinin depolama stabilitesini arttirmasi da mümkündür. Yukaridakilerin çesitli kombinasyonlari da bir rol oynayabilir. Herhangi bir durumda, proteinin vakuol içine hedeflenmesi, asagida daha detayli olarakr açiklandigir ve örneklendirildigi üzere oral yolla uygulanan proteinlerin islevsel verimliligini açik sekilde arttirir.

Ek olarak, mikroalgler ile ifade edilen ekzojen protein, transgenik algleri tüketen hayvan konusunun epitalyel hücre zarlari tarafindan alinimini arttirmak üzere tasarlanabilir.

Mevcut bulusun baglaminda kullanildigi üzere ifade kaseti ayrica, ifade edilmis ekzojen proteinin bir ksenogenik hücre ya da doku tarafindan alinimini arttiran bir protein alanini sifreleyen bir polinükleotid içerebilir.

Belirli alinim gelistirme alani, transgenik mikroalgleri tüketen konu hayvanin türlerine bagli olan, ksenogenik hücre tipine göre seçilir. Ifade kaseti ayrica, bir` hücre içine geçici peptid (CPP) sifreleyen bir polinükleotid içermektedir. CPP, bunlarla sinirli olmaksizin, Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimina (SEQ ID No:9) göre sentezlenen Insan Immun Yetmezligi virüsünden l trans-aktiflesen transkripsiyonel aktiflestirici (TAT) ya da bunun parçasi; ve Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimina (SEQ ID No:7) göre sentezlenen bir fibroblast büyüme faktörünün zar yer degistiren dizilisi (MTS) ya da bunun parçasi. Çesitli biyolojik aktivitelere sahip proteinler, mevcut bulusun ögretilerine göre mikroalg hücrede ifade edilebilir.

Belirli düzenlemelere göre protein, transgenik mikroalg tüketen konu üzerinde terapötik bir etkiye sahiptir. Belirli düzenlemelere göre protein, transgenik mikroalg tüketen konunun büyümesini iyilestirir. Yine ilave düzenlemelere göre protein, transgenik mikroalgler tüketen konunun hayatta kalmasini iyilestirir. Yine ilave düzenlemelere göre protein, transgenik mikroalgler tüketen konunun çogalma oranini iyilestirir.

Belirli örneksel düzenlemelere göre, transgenik mikroalg, bir hormonu ifade eder. Bazi düzenlemelere göre bu hormon, istah artirici hormon, gonadotropin salinimi hormonu (yumurtlama hormonu) ve bir büyüme hormonundan olusan bir gruptan seçilir. Büyüme hormonu bir balik büyüme hormonu olabilir.

Mevcut bulusun, mevcut bulusa. ait transgenik mikroalglerin asilar için bir ekzojen protein kaynagi olarak kullanilmasini hariç tutmaktadir.

Teknik alanda bilindigi üzere mikrolagleri dönüstürmek için olan herhangi bir yönteni mevcut bulusun Ögretilerine göre kullanilabilir. Dönüstürme yöntemleri, partikül bombardimani, elektroporasyon, mikroporasyon, ekojen DNA mevcudiyetinde vortekslenen hücreler, asitle yikanan küreler ve polietilen glikol-aracili dönüstürmeyi içermektedir. Ökaryotik alglerin dönüstürülmesi için yöntemler ve araçlar örnegin Uluslararasi Tipik olarak, transgenik algleri yapmak için vektörleri hazirlamak üzere, ekzojen proteini sifreleyen polinükleotid, ilk olarak bir ifade vektörü, algal genom içine entegre olabilen bir plazmid, içine klonlanir. Bu gibi bir ifade vektöründe, ekzojen proteini sifreleyen DNA dizilisi, bir ifade dizilisine yani mRNA sentezini yönlendiren bir etkinlestiriciye çalisir sekilde baglanir. Yukarida açiklandigi üzere, etkinlestirici, bir endojen etkinlestirici, yani alglerde normal olarak mevcut olan genlerin transkripsiyonunu yönlendiren bir etkinlestirici olabilir. Vektör ayrica, dönüstürülen alglerin seçimini saglamak için bir reziztans genini sifreleyen bir polinükleotid içerebilir ya da vektör, zeosin ve fileomisine reziztans veren bir proteini sifreleyen bir polinükleotid içerebilir.

Dönüstürülmüs alglerin kosullarini kültürlemek, teknik alanda uzman kisilerce bilindigi ve asagida örneklendirildigi üzere kullanilan alg türüne baglidir. Tipik olarak algler fotosentezi mümkün kilan kosullar altinda büyür. Fotosentez günes isigi ve COZ gerektirdiginden ve mikroalgler, büyümek için uygun gübreler ile karistirilan ya tatli, aci ya da deniz suyu da gerektirdiginden, mikroalgler örnegin açik havuzlarda ve göllerde yetistirilebilir. Ancak, açik sistemler kapali sistemlere göre kirlilige daha yatkindir ve üstelik açik su haznelerinde yetisen genetigi degistirilmis mikroalgler çevre için tehlikeli olarak kabul edilebilir.

Ilaveten, açik sistemlerde su sicakligi, COZ konsantrasyonu ve isik kosullari üzerinde daha az kontrol sahibi olunur.

Büyüme sezonu çogunlukla konuma baglidir ve tropikal bölgeler haricinde yilin ilik aylari ile sinirlidir. Ancak bir açik sistemin, kapali sisteme göre kurulumu ve/veya korunmasi daha Mikroalgleri yetistirmek için diger bir yaklasim ise, örnegin bir "sera-tipi" yapi gibi bir yapi ile gölet ya da havuzu kapatmak gibi bir yari-kapali sistem kullanmaktir. Bu, daha küçük. bir sistem. ile sonuçlanabilirken, bir açik sistemle iliskili problemlerin çogunu isaret eder. Bir yari-kapali sistemin avantajlari, istenen mikroalglerin, bir istilaci organizma üzerinde, ilgili mikroalglerin büyümesi için gerekli olan besinler için istilaci organizmadan üstün gelmesine izin verilerek dominant olmasini saglayabilmesi ve büyüme sezonunu uzatabilmesidir. Örnegin, eger sistem isitilir ya da sogutulursa, mikroalgler yil boyunca büyüyebilir.

Alternatif olarak mikroalgler, asfotobiyoreaktörler gibi kapali alanda yetistirilebilirler ve burada ortam açik sistemler ya da yari kapali sistemlere göre daha siki kontrol altinda tutulur. Bir fotobiyoreaktör, reaktör içine fotojenik enerji girdisi saglamak üzere bazi tiplerde isik kaynagi barindiran bir biyoreaktördür. Fotobiyoreaktör terimi, ortama kapali olan ve ortam ile dogrudan gaz ve kirlilik degisimine sahip olmayan bir sistemi ifade edebilir. Bir fotobiyoreaktör, fototrofik sivi hücre süspansiyon kültürlerinin kontrollü biyokütle üretimi için tasarlanan bir kapatilmis, isiklandirilmis kültür tanki olarak açiklanabilir. Fotobiyoreaktörlerin örnekleri, örnegin cam hazneler, plastik/cam borular, tanklar, plastik mansonlar ve torbalar içerir. Fotosentezi sürdürmek için gerekli olan enerjiyi saglamak üzere kullanilabilen isik kaynaklarinin örnekleri, örnegin floresan ampuller, LED'ler ve dogal günes isigi içerir. Bu sistemler kapali oldugundan organizmanin büyümek için ihtiyaç duydugu her sey (örnegin, karbondioksit, besinler, su ve isik) biyoreaktör içine verilmelidir.

Fotobiyoreaktörler, kurulumlari ve korunmalari için gereken maliyetlere ragmen, açik sistemlere göre birkaç avantaja sahiptir, bunlar örnegin, kirlenmeyi en aza indirebilir ya da engelleyebilir, kültür kosullari üstünde daha iyi bir kontrol sunabilir (örnegin pH, isik, karbondioksit ve sicaklik), su buharlasmasini engelleyebilir, gazsizlastirma sebebiyle karbondioksit kayiplarini azaltabilir ve daha yüksek hücre konsantrasyonlarina izin verebilir. Diger taraftan, sogutma, karistirma oksijen birikiminin ve biyo kirlenmenin kontrolü gibi, fotobiyoreaktörlerin belirli gereklilikleri, açik sistemler ya da yari kapali sistemlere göre bu sistemlerin insa edilmelerini ve isletilmelerinin daha pahali hale getirmektedir. Fotobiyoreaktörler, devamli olarak hasat edilmeleri (daha büyük hacimli yetistirme sistemlerinin çogunlugu ile birlikte oldugundan) ya da her seferinde bir parti hasat edilmesi için (örnegin polietilen torba yetistirme ile) kurulabilir. Bir üretim fotobiyoreaktör, örnegin besinler, mikroalgler ve su ile kurulur ve mikroalglerin üretim toplanana kadar büyümelerine izin verilir. Bir kesintisiz fotobiyoreaktör örnegin ya devamli ya günlük ya da sabit zaman araliklarinda hasat edilebilir.

COZ, burada açiklanan sistemlerin. herhangi birine, örnegin mikroalgleri ihtiva eden sivinin yüzeyinin altindan COZ içinde kabarciklandirma ile iletilebilir. Ayni zamanda, sivi içine COZ enjekte etmek için püskürtücüler de kullanilabilir.

Püskürtücüler örnegin, fiskiyeli çesmeler, karbonatörler, havalandirici aygitlar, gözenekli taslar ve difüzörler olarak adlandirilan delikli disk ya da boru tertibatlaridir.

Burada açiklanan sistemlerde kullanilabilen besinler örnegin, nitrojen (N03 ya da NH4 formunda), fosfor ve iz metaller (Fe, Mg, K, Ca, Co, Cu, Mn, Mo, Zn, V, ve B) içermektedir.

Besinler örnegin bir kati formda ya da bir sivi formda gelebilir. Besinler eger bir kati formda ise, örnegin mikroalgleri ihtiva eden siviya iletilmeden önce ;%1 da bir fotobiyoreaktöre iletilmeden önce tatli ya da tuzlu su ile karistirilabilir.

Mikroalgler, büyük ölçek kültürlerde yetistirilebilir, burada büyük ölçek kültürler, yaklasik 6 litreden fazla ya da yaklasik 10 litreden fazla ya da yaklasik 20 litreden fazla hacimlerdeki kültürlerin yetismesi anlamina gelir. Büyük ölçekli yetisme, 50 litre ya da daha fazla, 100 litre ya da daha fazla ya da 200 litre ve yukarisindaki hacimlerde kültürlerin yetismesi de olabilir.

Optimum büyüme sicakligi tipik olarak yaklasik 20°C ila yaklasik 25°C'dir ancak bu, türe baglidir. Mikroalg hücreleri, hasattan önce 105 ila lOB/ml'lik bir yogunluga ulasabilir.

Bir tür art-hasat isleme, oral tüketim için ya da bir gida tüketimi olarak malzeme hazirlamak için kullanilabilir.

Konvansiyonel islemler tipik sekilde, içinde alglerin büyüdügü sivi kültüründen algal biyokütlenin en azindan kismi ayrilmasini içerir. Opsiyonel olarak, algal biyokütle, homojenize edilebilir ve/veya hedef konu ve uygulama sekline bagli olarak çesitli boyutlardaki peletlere sekil vermek üzere kurutulabilir. Diger hazirlama sekilleri, püskürtme kurutma, akiskan yatakli kurutma ya da hatta malzemeyi bir sivi süspansiyon olarak saglamayi içerir.

Mevcut bulusun hasat edilen transgenik Inikroalgleri, kendi kendine uygulanabilir, yenilebilir seyrelticiler, yardimci maddeler ya da tasiyicilar da içeren bir yenilebilir bilesim içine formüle edilebilir. Mikroalgler ya da aynisini içeren mikroalgler ayrica gida katkisi olarak da kullanilabilir.

Bazi düzenlemelere göre, yenilebilir bilesim bir hayvan besin bilesimidir. Belirli mevcut spesifik düzenlemelere göre, hayvan besin bilesimi su hayvanlari ve kara hayvanlarini beslemek içindir. Diger düzenlemelere göre, yenilebilir bilesim insan tüketimi içindir.

Asagidaki örnekler, bulusun bazi düzenlemelerini tam olarak göstermek amaciyla gösterilir. Ancak bunlar hiçbir sekilde bulusun genis kapsamini sinirlayici olarak yorumlanmamalidir. ÖRNEKLER Bu örnekler, mevcut bulusun düzenlemelerinin en azindan bazi yönlerinin spesifik uygulamalari ile ilgilidir. Örnekler sadece gösterimleme amaçlidir ve hiçbir sekilde sinirlayici olmalari istenmemektedir.

Malzemeler & Yöntemler Somon büyüme hormonu geninin sentezi Somon büyüme hormonunun amino asit dizilisi (erisim No.

AAT02409), bir eriskin somon büyüme hormonunu sifreleyen bir polinükleotidin sentezi için temel olarak kullanilmistir (SEQ belirtilmistir). Polinükleotid sentezi, "Entelechon GmbH"nin Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimi kullanilarak gerçeklestirilmistir ve böylece SEQ ID NO:l'de gösterilen bir yeni polinükleotid dizilisini olusturur. Bu yeni dizilis, bu dizgi kullanimi bu protein için henüz kullanilmamis oldugundan önceden açiklanmamistir. Dahasi, bu spesifik dizilis, asagida daha detayli olarak ele alindigi üzere, Phaeodactylum tricornutum ile daha etkili sekilde ifade edilecek sekilde tasarlanmistir.

ER'ye hedeflenen Somon büyüme hormonu geninin yapimi fGH büyüme hormonu geni, asagidakilere göre Bip-fGH (nükleik asitler: SEQ ID NO: 17; amino asitler: SEQ ID No:3) üretmek için, Bip endoplazmik retikulm öncü dizilisini (Kilian O ve asitler: SEQ ID NO:16; amino asitler: SEQ ID No:2) sifreleyen bir polinükleotide 5' ucunda kaynastirilmistir: Bip öncü dizilisi, asagidaki primerler kullanilarak Phaeodactylum tricornutum genomik DNA'dan kuvvetlendirilmistir: Ileri BiP: GGAATTCATGATGTTCATGAGAATTGC (SEQ ID NO:36) Geri Bip-fGH-VZ ACGCTGGTTTTCAATCACGGTACCCATCTT (SEQ ID Bip öncü dizilis ürünü, asagidaki primerler kullanilarak kuvvetlendirilmistir: Ileri BiP GGAATTCATGATGTTCATGAGAATTGC (SEQ ID NO:38).

Geri Bip-fGH-VZ ACGCTGGTTTTCAATCACGGTACCCATCTT (SEQ ID fGH, asagidaki primerler kullanilarak kuvvetlendirilmistir: Ileri Bip-fGH-VZ AAGATGGGTACCGTGATTGAAAACCAGCGT (SEQ ID Geri fGH BglII GAGATCTGAGGGTGCAGTTGG (SEQ ID NO:41).

Bip öncü dizilisi, bir üçüncü PCR araciligiyla fGH'ye, kuvvetlendirilmis PCR ürünlerini (Bip, fGH) ve BIP+ Revf BglII için bahsedilen primerleri kullanarak kaynastirilmistir ve bu, SEQ ID NO:17'de öne sürülen nükleik asit dizilisine ve SEQ ID NO:3'de öne sürülen amino asit dizilisine sahip 356 ile ifade edilen yapi ile sonuçlanir.

Vakuole hedeflenen Somon büyüme hormonu geninin yapimi fGH sifreleme polinükleotidi, bir vakuol Öncü dizilisine (nükleik asitler: SEQ ID NO:18; amino asitler: SEQ ID No:4) ' ucunda, HA tag'a (nükleik asitler: SEQ ID NO:47; amino asitler: SEQ ID No:5) 3' ucunda vakuol-fGH-HA polinükleotid (nükleik asitler: SEQ ID NO:19; amino asitler: SEQ ID No:6) üretmek için, asagidakilere göre kaynastirilmistir: Sentetik fGH, asagidaki primerler kullanilarak kuvvetlendirilmistir: Ileri fGH EcoRl GGAATTCATGGGCCAAGTCTTTCTCTTG (SEQ ID Geri fGH BglII GAGATCTGAGGGTGCAGTTGG (SEQ ID NO:41). Ürün, EcoRI, BglII kullanilarak bir pPhaTl-HA plazmidine baglanmistir. fGH-HA sablonu, asagidaki primerler kullanilarak kuvvetlendirilmistir: Ileri fGH BamHI: GGATCCATTGAAAACCAGCGTTTGTTCAAC (SEQ ID Geri Hind HA: AAGCTTTTACTGGGCGGCGTAGTCCGGGACGTCGTAGGGGTA (SEQ ID NO:44).

PCR ürünü, BamHI ve Hindlll tarafindan pPhaTl içine klonlanmistir.

Vaküol öncü dizilisi, asagidaki primerler kullanilarak Phaeodactylum tricornutum cDNA'dan kuvvetlendirilmistir: ECORl-Vac.

BamHl-Vac. fGH-HA ve vakuol öncü dizilisi, EcoRI ve BamHI ile baglanmistir ve bu, SEQ ID NO:6'da öne sürülen amino asitler dizilisine sahip polipeptidi sifreleyen SEQ ID NO:19'da öne sürülen nükleik asit dizilisine sahip olarak 398 ile belirtilmektedir.

Vaküole hedeflenen GFP-sifreleyen polinükleotidin yapimi Yukarida açiklanan yapida, balik büyüme hormonunu sifreleyen polinükleotid, BamHI ve HindIII tarafindan bir GFP sifreleyen polinükleotid (SEQ ID NO:29'da öne sürülen nükleik asit dizilisine sahip ve SEQ ID NO:28'de öne sürülen amino asit dizilisine sahip bir proteini sifreleyen erisim P42212) ile degistirilmistir` ve bu bir 'vakuol hedefli GFP'ye yol açar (SEQ ID NO:30, amino asit dizilisi; SEQ ID NO:31, nükleik asit dizilisi, Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimi ile hazirlanmistir), ve bu, SEQ ID NO:31'de öne sürülen nükleik asit dizilisi ve SEQ ID NO:30'da öne sürülen amino asit dizilisine sahip olarak, 527 ile belirtilen yapi ile sonuçlanir.

Vakuol-fGH-MTS-HA yapimi Fibroblast büyüme faktöründen bir zar yer degistirme dizilisi (MTS), Biomatik (SEQ ID No:7) ile Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimina göre sentezlenmistir. Yer degistirme dizilisi, SEQ ID NO:8'de öne sürülen amino asit dizilisine sahip vakuol-fGH-MTS-HA sifreleyen yapiyi üretmek için BglII kullanarak fGH'nin 3' ünde vakuol-fGH-HA'ya baglanmistir.

Vakuol-GFP-MTS yapimi Fibroblast büyüme faktöründen bir zar yer degistirme dizilisi (MTS), Biomatik ile Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimina göre sentezlenmistir. Yer degistirme dizilisi, vakuol-GFP-MTS yapiyi (nükleik asit dizilisi: SEQ ID NO:33; amino asit dizilisi SEQ ID NO:32) üretmek için HindIII kullanarak GFP'nin 3' ünde vakuol-GFP'ye baglanmistir.

Vakuol-fGH-TAT-HA yapimi Insan Immun Yetmezligi Virüsünden 1 bir trans-aktiflesen transkripsiyonel aktiflestirici (TAT), Biomatik (SEQ ID No:9) ile Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimina göre sentezlenmistir. Alan, vakuol-fGH-TAT-HA yapisini (SEQ ID NO:10) üretmek için fGH'nin 3' ünde vakuol-fGH-HA'ya iki tekrarin tandeminde BglII ile kaynastirilmistir.

Vakuol-GFP-TAT yapimi Insan Immun Yetmezligi Virüsünden 1 bir trans-aktiflesen transkripsiyonel aktiflestirici (TAT), Biomatik ile Phaeodactylum tricornutum dizgi kullanimina göre sentezlenmistir. Gen, SEQ ID NO:35'te öne sürülen nükleik asit dizilisine sahip, SEQ ID NO:34'te öne sürülen amino asit dizilisine sahip vakuol-GFP-TAT proteinin sifreleyen vakuol- GFP-TAT yapisini üretmek için HindIII kullanarak GFP'nin 3' ünde vakuol-GFP'ye baglanmistir.

Bir alg ifade vektörü içine yapilari klonlama Çesitli polinükleotidler ve yapilar, Apt ve ark. 1996. Mol.

Gen Genet. 252:572-579)'e göre plazmid pPHATl (erisim numarasi AF içinde fcpA etkinlestirici ve fcpA sonlandirici kontrolü altinda ayrica klonlanmistir.

Sadece FcpA etkinlestiricinin, Phaeodactylum tricornutum içinde çalisir oldugu mevcut durumda bilinmektedir. Bununla birlikte, diger etkinlestiricilerin, diger alglerde oldugu gibi Phaeodactylum tricornutum'da da kullanilabilir oldugu açik bir sekilde anlasilmalidir.

Vektör sunlari içerir: - Altinda ilgili genin klonlandigi bir fcpA (fukozantin klorofil protein A) etkinlestirici.

- MCP Çoklu klonlama alani - Sh ble genini Streptoalloteichus hindustanus'tan kontrol eden, zeosin ve fileomisin rezistansi sunan bir proteini sifreleyen bir fch (fukozantin klorofil protein B) etkinlestirici. - ilgili genden sonra ve zeosin rezistans geninden sonra ortaya çikan fcpA sonlandiricilar.

- Ampisilin rezistans geni - Escherichia coli'den replikasyon kaynagi.

Sekil 1, tam pPhaTl ifade vektörünü gösterir. fGH sifreleme polinükleotidi (SEQ ID No:1), fcpA etkinlestirici ve fcpA sonlandirici altinda klonlanmistir.

Plazmid, fch etkinlestirici ve fch sonlandiricinin kontrolü altinda seçilebilir isaretleyici, Bleomisin, içermistir.

Klonlama ve moleküler teknikler PCR reaksiyonlari, Füzyon Polimeraz Cat.# FZ-F-53OS Finnzymes (Zotal) ya da REDTaq hazir karisim PCR reaksiyon karisimi Cat.# R2523-100RXN Sigma kullanilarak yapilmistir. PCR reaksiyonlari, Wizard® SV jel ve PCR Temizleme Sistemi (Cat.

No. A9281, Promega) kullanilarak temizlenmistir.

Baglar, DNA baglama kiti (Mighty Mix)-Takara Cat. No. kullanilarak gerçeklestirilmistir. 5' ya da 13' kirisin baskilanmasi T4 DNA polimeraz ile yapilmistir: (Fermentas #EP0061).

DNA midi prepler, "Pure YieldTM Plasmid Midiprep System A2492" kullanilarak yapilmistir. PROMEGA ve DNA miniprepler, AccuPrep Plazmid Mini Ekstraksiyon KitBIONEER K-3030 kullanilarak yapilmistir. DNA genomik izolasyonlari, Fawley & Fawley'e (Fawley M W ve Fawley K P. 2004. J Phycol 40: 223- 225) göre gerçeklestirilmistir. Tüm kitler ve enzimlere, imalatçinin talimatlarina göre muamele edilmistir.

Alg kültürleme ve hasat etme Alg kültürleme ve hasat etme, mevcut bulusun Basvuru dokümaninda tarif edildigi gibi yapilmistir. Kisaca algler, diatomlari büyütmek için F/2 besinleri ile zenginlestirilmis filtrelenmis deniz suyunda kültüre edilmistir (Andersen R. ve ark. 2005'ten modifiye edilmistir. Tatli su ve tuzlu su ortamlari için tarifler. 429-538. Elsevier, Amsterdam) F/2, her 72 saatte bir nihai kültür hacmine lleOO'lik bir dozda eklenmistir. Sabit bir sicaklik düzeni, 21°C'de korunmustur. Isik: karanlik m28l basina 100 umol fotonluk bir isik yogunlugunda l6:8 saatlerinde ayarlanmistir. CO2, hava ile karistirildi ve havalandirma sistemleri araciligiyla kontrollü bir oranda kültürlere gönderildi. Algler, maksimal kültür yogunluklari yakininda deney için toplanmistir. Alglerin flokulasyonuna yardi etmek için kalsiyum hidroksit, kültüre 0.15 g/ml Ca(OH)2 ihtiva eden su içindeki partiküllerin bir ince süspansiyonu olarak eklenmistir ve daha sonra filtrelenip santrifrüjlenmistir. Ortaya çikan alg çökeltisi liyofilize edilmistir.

Alg dönüstürümü LPartikül Bombardiman ile Dönüstürme Taze algal kültür, orta üssel faza (2-5*lO6 hücre/ml) yukarida açiklandigi gibi yapay deniz suyu (ASW) F/2 ortaminda yetistirilmistir. Bombardiman hücrelerinin toplanmasindan 24 saat öncesinde, tatli ASW+F/2 ile iki kez yikanmistir ve ASW+F/2'de orijinal hücre hacminin 1/10'unda yeniden askiya alinmistir. hücre süspansiyonunun 0.5 ml'si, katilastirilmis ASW+F/2 ortami içeren bir 55 mm Petri kabinin merkezine saptanmistir. Tabaklar, normal büyüme kosullari altinda kurumaya birakilir. Bombardiman, çapi 2 mikrondan büyük olan hücreler için Ml7 tungsten tozu (BioRad Laboratories Inc.), daha küçük hücreler için 0.6 mikrondan daha küçük partiküllerden (FWO6, Canada Fujian Jinxin Powder Metallurgy Co., Markham, ON, Kanada) olusan tungsten tozu kullanilarak, imalatçinin talimatlarina (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA ABD) göre bir PDS lOOO/He biyolistik dönüstürme sistemi kullanilarak gerçeklestirilir. Tungsten lineer DNA ile kaplanmistir. 1100 ya da 1350 psi patlama diskleri kullanildi. Tüm atilabilir olanlar BioRad Laboratories Inc.'den satin alinmistir. Bombardimandan sonra tabaklar, 24 saat boyunca normal büyüme kosullari altinda inkübe edildi ve bundan sonra hücreler selektif kati ortam üzerine kaplandi ve tekli koloniler ortaya çikana kadar normal büyüme kosullari altinda inkübe edildi.

Algal kültürler, yukarida açiklandigi üzere orta üssel faza yapay deniz suyu (ASW)+F/2 ortaminda yetistirilmistir.

Hücreler daha sonra toplandi ve tatli su ortaminda iki kez yikandi. Hücreleri, orijinal hacimin l/50'sinde yeniden askiya aldiktan sonra, protoplastlar ASW'de esit hacimlerde eklenmesi ile hazirlandi ve 4 saat boyunca 37°C'de inkübe edildi. Protoplast olusumu, Kalkofloe beyaz leke birakmayan ile test edildi. Protoplastlar, 0.6M D-mannitol ve 0.6M D- sorbital içeren ASW ile iki kez yikandi ve ayni ortam içinde yeniden askiya alindi ve bundan sonra DNA eklendi (her bir lOOul protoplast için loug lineer DNA).

Protoplastlar, soguk elektroporasyon küvetlerine aktarildi ve 7 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi ve daha sonra bir ECM83O elektroporasyon aparatinda pals edildi (BTX, Harvard. Apparatus, Holliston, MA, ABD). Genellikle çesitli palslar, 1000 ila 1500 volt araliginda pals basina -20ms uygulanir. Her bir küvet 5-10 kez pals edildi.

Küvetlerin pals edilmesinden hemen sonra 5 dakika boyunca buz üzerine konuldu ve daha sonra protoplast, 250ul taze büyüme ortami içine eklendi (seçmesiz). Protoplastlari 24 saat boyunca 25°C'de kisik isikta inkübe ettikten sonra, hücreler selektif kati ortam üzerine kaplandi ve tekli koloniler ortaya çikana kadar normal büyüme kosullari altinda inkübe edildi.

HLMikroporasyon ile Dönüstürme Bir taze algal kültür, (ASW)+F/2 ortaminda orta üssel faza büyütülmüstür. Kültürün bir lOml'lik numunesi toplandi, Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS, Gibco, tampon R (mikroporasyon aparati ve kitinin üreticisi olan Digital Bio, NanoEnTek Inc., Seul, Kore tarafindan temin edilmistir) içinde yeniden askiya alindi. Her bir lOOul hücreye 8ug Lineer DNA ekledikten sonra hücreler pals edildi. 700 ila 1700 volt araliginda lO-40ms pals uzunlugunda, hücrelerin tipine bagli olarak tipik sekilde çesitli palslere ihtiyaç duyulur; her bir numune 1-5 kez pals edildi. Pals ettikten hemen sonra, hücreler ZOOul taze kültür ortamina aktarildi (seçmesiz). 24 saat boyunca °C'de kisik isikta inkübe ettikten sonra, hücreler selektif kati ortam üzerine kaplandi ve tekli koloniler ortaya çikana kadar normal kültür kosullari altinda inkübe Protein ekstraksiyonu 5xlO6 hücre/ml'de 10 ml hücreler toplandi ve 500ul ekstraksiyon tamponunda yeniden askiya alindi (SOmM Tris pH=7.0; lmM EDTA; lOOmM NaCl; O.5% NP-40; ve proteaz inhibitörü (Sigma cat# P9599). Daha sonra 100 ul cam kürecikler (425-600 unl, Sigma) eklendi ve hücreler 20 saniye boyunca bir kürecik dövücü (MP FastPrep-24, MP Biomedicals, Solon, OH, ABD) içinde hücreler yok edildi. Boru içerigi 4°C.'de 15 dakika boyunca, l3000xg, satrifrüjlendi. Üstte kalan sivi miktar ölçümü ve Western blot analizi için yeni bir flakon içine kaldirildi.

SDS-PAGE ve Western analizi ile protein ayirimi Ekstrakte edilen proteinler, l saat boyunca lOOV'de bir %4-20 gradyan SDS-PAGE'de (Geba jelleri ayristirildi. Bloklama tamponunda (%5 yagsiz süt, Difco) 1 saatlik inkübasyonu takiben, proteinler ya koomassie (Sigma) ile boyandi ya da aktarim tamponunuda (25 mM Tris, 192 mM glisin ve %20 metanol) lOO voltta 1 saat boyunca PVDF (Millipore, Billerica, MA, ABD) membranlari üzerine lekelendi. Proteinler, bir anti HA (Biotest MMSlOlP-SOO) ya da bloklama tamponunda 1:1000'lik bir oranda seyreltilen somon büyüme hormonu (GroPep: PANl) antikorlari ile saptandi.

Bloklama tamponunda 1:10000 seyreltide, fare (HA antikoru için) ya da tavsan (somon büyüme hormonu için) yabanturpu peroksidazlar ikincil antikorlari (Millipore, Billerica, MA, ABD) kullanildi. Saptama, imalatçinin talimatlarina göre EZ- ECL kit (Bio Ind. Promega: 20-500-120) kullanilarak yürütüldü.

ELISA Analizi ELISA tabagi (microlon, Greiner) 4°C'de bir gece boyunca monoklonal HA Antikoru (Sigma Aldrich) ile karbonat/bikarbonat pH 9.6 ile kaplandi. Daha sonra tabak, PBST (%0.05 Tween) ile yikandi ve oda sicakliginda (RT) 4 saat boyunca PBS'de %1 BSA. (Sigma Aldrich) ile bloklandi.

Serum numuneleri, ELISA kaplama tamponunda seri olarak seyreltildi ve tabak üzerine yüklendi. Serum numuneleri ile bir gecelik inkübasyondan sonra tabak PBST ile yikandi ve oda sicakliginda anti HA-biotin (Roche) ile 1 saat inkübe edildi.

Ilave yikama adimlarindan sonra, yabanturpu peroksidazi (HRP) konjuge streptavidin eklendi ve tabak oda sicakliginda (RT) 1 saat boyunca inkübe edildi. Tabak PBST ile yikandi ve tetrametil-benzidin (TMB) substrati tabaga eklendi. Yeterli renk bir kez gelistiginde reaksiyon 0.16M sülfirik asit ile durduruldu. Her haznedeki emilim, Enspire 2300 multilabel okuyucu (PerkinElmer) kullanilarak 450nm'de ölçülmüstür.

Balik bakimi ve besleme 70-100 gram. agirligindaki 10 Tilapia baligi gruplari 26- 28°C'lik bir sicaklikta 100 litrelik havalandirmali tanklarda tutuldu. Fotoperiyodu 12 saat isik: 12 saat karanlik.

Baliklarin hepsi uygulamadan önce tanklarda bir hafta boyunca ortama alistirildi. Alg süspansiyonlari ile oral uygulama, 100 ppm'lik. clove bud ekstrakti (Roth) ile hafifçe uyusturulmus baliklar üzerinde yürütüldü. Bir enjekte Siringasina eklenen Polietilen boru (uzunlugu 6-8 cm, i.d. 3mm), farkli algal süspansiyonlarin oral uygulamasi (gavaj besleme) için kullanildi.

Besleme denemeleri Somon büyüme hormonunu ifade eden Liyofilize transgenik algler, normal balik yemine %1-4'lük. bir nihai konsantrasyonda eklendi. Baliklara toplam Vücut agirliklarinin %lO-%15'i kadar yem verildi. Transgenik algler ve normal balik yemi, 6 hafta boyunca süs baliklarini, Koi, Scalare ve japon baligi Shubunkin beslemek için kullanildi.

Her deneme, sicaklik, pH, amonyak, nitrit vb. için izlendi.

Her deneyden sonra baliklarin toplam büyümesi, morfolojik bozukluklari ve hayatta kalma oranlari analiz edildi. Örnek 1: Alg ifade Eden Balik (Somon) Büyüme Hormonu ER'ye (yapi 356 olarak belirtilmistir) ya da vakuole (yapi 398 olarak belirtilmistir) hedeflenen polinükleotidi sifreleyen somon büyüme hormonunu barindiran Phaeodactylum tricornutum türlerinin transgenik algleri, transgenik proteinin ifadesi için kültüre edildi ve analiz edildi.

Toplam çözünebilir proteininin (20 pg) bir esit miktari Western blot analizi için transgenik alglerde ektstrakte edildi. Saptama, Sekil 2'de gösterildigi üzere anti somon büyüme hormonu antikoru kullanilarak yapildi.

ER-hedefli somon büyüme hormonu ifade eden alg hatti, vakuol- hedefli büyüme hormonu ifade eden alg hattina kiyasla daha yüksek transgenik protein ifade seviyeleri göstermistir. Örnek 2: Melek Baligi Besleme Denemesi Süs amaçli Melek Baligi (Scalare), ER'e ya da vakuole (yapilar 356, 398, sirasiyla) hedeflenen balik büyüme hormonunu daha fazla ifade eden transgenik Phaeodactylüm tricornutum ile ya da normal, transgenik olmayan balik yemi (kontrol) ile takviye edilen balik besini ile 6 hafta boyunca beslendi. Normal balik yemine %4 oraninda alg takviyesi eklendi. Balik büyümesi, her biri 20 balik içeren bagimsiz tekrarlar (n:5) tanklarin içinde takip edildi. Sekil 3, normal balik yemi ile beslene baliklara kiyasla transgenik algler (balik besini ile karisik) ile beslenen Melek baliginin toplam büyüme performansini göstermektedir.

Yapi 398'i barindiran transgenik algleri içeren besin ile beslenen baliklar (büyüme hormonunun vakuole hedeflendigi), normale besini (kontrol) ile beslenenr baliklarar kiyaslar daha yüksek toplam balik biyokütlesi (~%15) vermistir, buna karsin yapi 356'yi barindiran transgenik algleri içeren besin ile beslenen baliklar (büyüme hormonunun ER'ye hedeflendigi) kontrole kiyasla önemli Ölçüde daha iyi büyümedi.

Yine Melek baligi ile yürütülen paralel bir deneyde, baliklari, vakuole (yapi 398) hedeflenen fGH ifade eden algler içeren normal besin ile besleme, normal balik besini ile beslenen baliklara kiyasla, 2 gr üzerine ulasan baliklarin sayisinda artisla sonuçlanmistir (Sekil 4). Bir pazarlama bakis açisindan bu sonuç, vakuole hedeflenen fGH ifade eden algler ile normal balik besinin takviye edilmesinin, popülasyondaki baslangiç baliklarin sayisini artirmadan ya da aksi halde baslangiç balik popülasyonunun herhangi bir yönünü zorunlu sekilde ayarlamadan satis için uygun olan baliklarin sayisini artirdigini ima etmektedir. baligin her biri ile 5 tekrarda Melek baligi ile 8 hafta boyunca yürütülen diger bir deney, normal balik besini ile beslenen baliklara kiyasla fGH (vakuole hedeflenen fGH ifadesi, yapi 398) ifade eden algler ile %4 oraninda takviye edilen besin tüketen baliklarin önemli ölçüde biyokütle artisi saglamasi ile sonuçlandi (Sekil 5).

Bu sonuçlar, fGH'nin alg hücresinin vakuolüne hücre içi hedeflemesinin, ifade seviyesinin, hücre ER'ye hedeflenen fGH'nin ifade seviyesinden daha düsük oldugu gösterilmis olmasina ragmen proteininin daha iyi bir islevsel etkinligi sonuçlandigini ifade etmektedir. Örnek 3: Kbi Baligi Besleme Denemesi Art larva Koi baligi (her biri 600 art larva Koi baligi içeren 4 bagimsiz tekrar), ya normal balik besini ya da vakuole (yapi 398) hedeflenen fGH ifade eden algler ile %4 oraninda takviye edilmis normal balik besini ile beslendi.

Besleme deneyi 8 hafta sürdü. Deney sonunda baliklar Vücut deformasyonu için izlendi (Jha P 4ve ark. 2006. Journal of Applied Ichthyology; 23 (1) 87-92 ile tanimlandigi gibi).

Vücut deformasyonu bunlarla sinirli olmaksizin, herhangi bir morfolojik bozukluk, herhangi bir tipte vücut asimetrisi, bozuk Vücut sekli, bozuk yüzgeç sekli, bozuk kuyruk sekli; bozuk vücut/yüzgeç bölgesi, uzunluk ya da genislik orantilari; bozuk vücut/kuyruk bölgesi, uzunluk ya da genislik orantilari; bozuk kuyruk/yüzgeç bölgesi, uzunluk ya da genislik orantilari; ya da herhangi bir Vücut bölümünde bozukluklari içermektedir. Sekil 6, normal balik besini ile beslenen baliklar ve %4 oraninda vakuole (yapi 398) hedeflenen fGH ifade eden algler içeren normal balik besini ile beslenen baliklarin normal ve deforme olmus seklinin yüzdesini göstermektedir.

Sekil 6'dan anlasilacagi üzere, normal balik besini alan baliklarin popülasyonunun %45 oraninda deforme olmus balik sergilemesine karsin fGH ifade eden algler (yapi 398) ile takviye edilen balik besini alan baliklarin popülasyonunun sadece %38'i deforme olmus balik sergilemistir. Örnek 4: Japon Baligi Besleme Denemesi Art larva süs amaçli japon baligi (Shubunkin) vakuole (yapi 398) hedeflenen balik büyüme hormonunu daha fazla ifade eden transgenik Phaeodactylum tricornutum ile takviye edilen balik besini ya da normal balik besini (kontrol) ile 6 hafta beslendi. Normal balik besinine %4 oraninda alg takviyesi eklendi. Uygulamalar 40 baligin her birinde 6 bagimsiz tekrarda test edildi. Sekil 7, transgenik algler ile beslenen japon baliginin toplam agirliginin, normal besin ile beslenen baliklara kiyasla yaklasik olarak ~%15 daha fazla oldugunu göstermektedir.

Büyüme performansina ek olarak, deney esnasinda yavru baliklarin hayatta kalma orani kontrol tanklarinda yaklasik olarak %64 idi. Hayatta kalma orani, baliklarin fGH ifade eden algler (yapi 398) ile takviye edilen besin ile beslendigi tanklarin içerisinde yaklasik olarak %80' çikti, bu da fGH ifade eden alglerin büyüme iyilestirme etkisinin yani sira baliklarin hayatta kalmalarin da katkida bulundugunu göstermektedir. Örnek 5: Artemia Besleme Denemesi Tuzlu su karidesi (Artemia) yabani tip Phaeodactylum tricornutum, yabani tip Nannochloris ya da balik büyüme hormonu (fGH) ifade eden Phaeodactylum tricornutum (yapi 398) ile 12 gün beslendi. FGH ifade eden Phaeodactylum tricornutum ile beslenen Artemia ciddi ölçüde daha büyüktü (yaklasik %40) ve disiler cinsel olgunluga sirasiyla yabani tip Nannochloris ya da yabani tip Phaeodactylum tricornutum ile beslenen Artemia 'ya kiyasla 3 gün daha önce ulasti (Sekil 8 ve 9).

Spesifik olarak, Sekil 8, tuzlu su karidesi, yabani tip Phaeodactylum tricornutum (Sekil 8A), yabani tip Nannochloris (Sekil 88) ya da balik büyüme hormonu ifade eden Phaeodactylum tricornutum beslendikten sonraki sonuçlari gösterir. Resimler 12 gün sonra çekildi.

Sekil 9, tek besin olarak farkli algleri alan baliklarin ölçülen ortalama vücut uzunlugunu gösterir. Vücut uzunlugunun belirlenmesi için, yabani tip Aünnochloris (kontrol), yabani tip Phaeodactylum tricornutum (wt) ya da balik büyüme hormonu ifade eden Phaeodactylum tricornutum (yapi 398) ile beslenen 26 adet rastgele seçilen tuzlu su karidesinin gövde uzunlugu 12 gün sonra ölçüldü. FGH ifade eden algler ile beslenen tuzlu su baliklarinin büyük ölçüde büyük olduklari bulunmustur. Hepsini ele alacak olursak, bu sonuçlar, algal vakuole hedeflenen balik büyüme hormonu ifade eden algleri, Tuzlu su karideslerinde ve kabuklularda besin ya da besin katkisi olarak kullanmanin bunlarin özellikle Vücut uzunluguna ve cinsel olgunlasmasina istinaden büyümelerinin gelistirdigini ortaya koymaktadir. Örnek 6: Mbcrobrachium rosenbergii Besleme Denemesi Tatli su karidesi olan Abcrobrachium rosenbergii, PL 10, alg vakuole (yapi 398) hedeflenen balik. büyüme hormonunu daha fazla ifade eden transgenik Phaeodactylum tricornutum ile takviye edilen balik besini ya da normal balik besini (kontrol) ile 6 hafta beslendi. Normal besine %4 oraninda alg takviyesi eklendi. Sekil 10, transgenik algler verilen Macrobrachium rosenbergii toplam. agirliginin, normal besin ile beslenen karideslere kiyasla yaklasik %21 oraninda büyük ölçüde daha fazla oldugunu göstermistir ve bu da fGH ifade eden algler karideslerin gelismis büyümelerine katkida bulundugunu göstermektedir. Örnek 7: Baliklarin GFP Emilimi 50-100 gram agirliklarinda olan 1 hafta aç birakilmis Tilapia baliklari, yabani tip Phaeodactylum tricornutum ile ya da 111 balik besini-alg oraninda vakuole hedeflenen GFP ifade eden Phaeodactylum tricornutum ile karistirilmis balik besini beslendi. Tilapia mideleri ve bagirsaklari beslendikten 1-4 saat sonra çikarildi ve floresans binoküler altinda analiz edildi. Sekil ll, beslenmesinden 4 saat sonra Tilapia'larin midelerindeki ifade edilen ekzojen GFP'nin floresanini açikça göstermekte ve bu floresan proteinin midenin asidik ortaminda bozunuma ugramadigini göstermektedir. Dahasi, proteinin temiz floresani ayrica bagirsakta, da gözlemlenmistir (Sekil 12). Özetle, bu sonuçlar proteinin, midenin asidik ortaminda bozulmadigini; mikroalgden balik bagirsagina gönderilmekte; ve dahasi proteinin biyolojik islevini bu kosullar altinda korumakta oldugunu göstermektedir. Örnek 8: Karideslerde GFP Emilimi Tuzlu su karidesi Artemia, yumurtlamadan 3 gün sonra, yabani tip algler (Phaeodactylum tricornutum) ile tek basina ya da vakuole (vokuol-GFP ifade eden algler) hedeflenen GFP ifade eden algler ile tek basina beslendi. lx ASW ortaminda yetisen sonra Artemia dikkattlice yikandi ve floresan isigi altinda analiz edildi. Sekil 13, alglerde ifade edilen GFP proteinin, bozulmamis ve biyolojik formunda Artemia sindirim sisteminde konunlandigini göstermektedir (sekil l3B). Bu sonuçlar yine, mevcut bulusta açiklanan mikroalg sisteminin, mikroalglerden alici sindirim sistemine bozulmamis ve biyolojik olarak aktif formlarinda yollanan proteinlerin oral yolla alinmasinin oldukça uygun oldugunu göstermektedir.

Halen ilave deneyde, aç birakilan tatli su karidesleri, Macrobrachium rosenbergii, PLlO, yabani tip alglerin (Phaeodactylum tricornutum) tozu ile ya da l:l besin-alg oranli vakuol-GFP ifade eden alglerin tozu ile karistirilan normal besinden olusan peletler ile beslendi. Karidesler beslenmelerinden 4 saat sonra floresan isigi altinda analiz edildi. Sekil 14, GFP proteininin, karidesin hepatopankreas bezinde konumlandigini göstermektektedir ve bu da GFP proteinin bu hayvanda oral yolla alinmasini belirtmektedir.

Tekrardan protein bozulmamis ve aktif olarak iletildi. Örnek 9: Tavuklarda GFP Emilimi Iki haftalik tavuklarin her biri, 100 mg yabani tip alg (Phaeodactylum tricornutum) tozu ile ya da 5 ml 0.5 X yapay deniz suyunda (ASW) bekletilmis vakuole hedeflenen GFP ifade eden algler ile beslenmeye zorlandilar. Tavuklar beslenmeden 2, 4, 6 ve 24 saat sonra kesildi ve karacigerleri disari çikarildi ve floresan isigi altinda analiz edildi. Sekil 15 göstermistir ki GFP proteini, beslenmeden 6 saat sonra bozulmamis ve islevsel formunda tavugun cigerinde emilmistir ve bu da GFP proteininin asidik sindirim sisteminden geçtigini, kan içerisine bagirsak duvarindan emildigini ve cigerde dolastigini göstermektedir. Sonuç, proteinin tavuklarda oral yolla alinmasinin tam yolunu göstermektedir. Örnek 10: Balik Kanina Proteinlerin Oral Yolla Alimi Tilapia baligi, balik büyüme hormonu ifade eden algler (Phaeodactylum tricornutum) ile ya da GFP ifade eden algler ile (her ikisi de alg vakuole hedeflidir; vakuol-fGH ifade eden ve vakuol-GFP ifade eden algler, sirasiyla) beslendi. 800 mg'lik algal toz 30 nd'lik 0.5x ASW'de bekletildi. Her balik, 2 ml algal süspansiyon ile beslenmeye zorlandi. Steril siringalar ve tüpler kullanilarak kaudal damardan kan örnekleri alindi. Her bir kan örneginin elli mikrolitresi (ul) bir floresan tabak okuyucuda GFP'nin aktivitesi için dogrudan floresan analizi için ayrildi ve örneklerin geri kalani, oda sicakliginda durmasi için 15 dakika birakildi ve 4°C'de bir gece geçtikten sonra, 4°C'de 10 dakika boyunca 250gramda satrifüjleme ile serum. ayrildi ve ELISA analizi için -20°C'de steril tüplerde depolandi.

Tilapia baliginda fGH emilimi Tilapia. baliklari, vakuol-fGH (yapi 398) ya da vakuol-GFP ifade eden algler (yapi 527) ile beslenmistir. Kan örnekleri ELISA Analizi için beslenmeden 1 saat sonra alindi. FGH proteininin varligi, anti-HA antikoru kullanilarak fGH'ye kaynastirilanHA. alaninin ifadesini saptayarak onaylandi (bakiniz yukaridaki Malzemeler ve Yöntemler). Vakuol-fGH ifade eden algler ile beslenen baliklardan alinan kan örnekleri, anti-HA antikoru ile pozitif olarak tepki vermesine karsin, algler ifade eden vakuol-GFP ile beslenen baliklardan alinan kan örnekleri önemsiz isaret vermistir (Sekil 16). ELISA sonuçlari, kandaki fGH protein varligi için destek saglar ve alglerde ifade edilen proteinlerin, algleri oral yolla tüketen organizmalarin kanina ulastigini gösterir.

Tilapia baliginda GFP Emilimi ve Aktivitesi Tilapia baliklari (n=5), vakuol-GFP ifade eden algler (yapi 527) ile ya da vakuol-fGH ifade eden algler (yapi 398) ile beslenmeye zorlanmislardir. Kan örnekleri, beslenmeden 1 saat sonra toplandi ve Enspire 2300 multi-label okuyucu kullanilarak floresan isigi altinda analiz edildi (eksitasyon 480nm, emisyon 515nm). Alg ifade eden vakuol-GFP ile beslenen baliklardan toplanan kan örnekleri floresan sergilemistir.

Bunun aksine, alg (yapi 398) ifade eden vakuol-fGH ile beslenen baliklarin kan örnekleri önemli olmayan sinyaller vermistir (Sekil 17). Sonuçlar GFP'nin balik bagirsagindan kanina bozulmamis ve islevsel formunda emildigini göstermektedir. Örnek 11: Vakuol-Hedefli Ekzojen Proteinler Sindirim Yolunda Korunmaktadir Vakuol-GFP ve Vakuol-th ifade eden algler (sirasiyla 527 ve 3978 barindiran) ve vakuol-GFP ifade eden alg hattindan ekstrakte edilen toplam› protein, baliga zorla besleme ile uygulanmasindan önCe GFP floresan için (Sekil 18A) ve uygulamadan 1 sa sonra baliktan alinan kan örneginde (Sekil 18B) ölçülmüstür. Floresan, Enspire 2300 multi-label okuyucu kullanilarak ölçüldü (eksitasyon 480nm, emisyon 515nm).

Görülebildigi üzere sadece, GFP ifade eden algler ile beslenen baliklardan alinan kan örnekleri floresan iken vakuol-GFP ifade eden alglerden ekstrakte edilen izole edilmis proteinler ile beslenen baliklardan alinan kan örnekleri isaret vermedi ya da sadece, vakuol-fGH ifade eden algler ile beslenen baliklardan alinan kan örneklerinde gözlemlendigi gibi bir arka plan sinyali verdi. Sonuçlar çik bir sekilde göstermistir ki alg hücresi GFP proteinini korumakta ve algi tüketen organizmanin kanina bozulmamis ve islevsel formunda gitmesini saglamaktadir. Buna zit olarak, çiplak floresan proteininin (GFP) oral yolla alimi, muhtemelen sindirim sistemindeki bozunuma ugramasindan kaynakli olarak floresaninin yok olmasina neden olur. Örnek 12: Proteinlerin Farelerde Oral Yolla Alimi Fare cigerine fGH iletimi 12 haftalik, balb-C erkek fareler deneyden. önce 12 saat aç birakildi. Fareler, izofloran kullanilarak hafifçe uyusturuldu ve gavaj besleme ile vakuol-fGH ifade eden algler (yapi ile beslendi.

Algal uygulamadan 2 saat sonra fareler yüksek dozda izofloran ile ötenazi edildi. Cigerleri çikarilip sivi nitrojende donduruldu. Toplam protein cigerlerden çikarildi, takibinde HA› tag'a yönelendirilen, ELISA› analizi yapildi ve alglerde ifade edilen rekombinant fGH spesifik olarak fark edildi.

ELISA sonuçlari, Sekil 19'da gösterilen, göstermistir ki rekombinant fGH fare cigerlerinde tespit edilebilir ve bu, farelerin sindirini sisteminden kani ve cigerine oral yolla geçisini isaret etmektedir.

GFP'nin kanda emilimi Farelere yukarida gibi muamele edildi ve kan örnekleri beslemeden 2 saat sonra kalplerinden alindi. Kan örnekleri daha sonra santrifüjlendi ve plazma floresan isik altinda analizi edildi (eksitasyon 480nm, emisyon 515nm). Vakuol-GFP ifade eden algler ile beslenen farelerin kan örnekleri, vakuol-fGH ifade eden algler ile beslenen farelerin kan örneklerine kiyasla büyük ölçüde daha yüksek floresan gösterdi ve bu da GFP'nin sindirim yolundan kan içine bozulmamis ve islevsel formunda geçisini gösterir. Örnek 13: Baliklar ve Farelerde Arttirilmis Protein Emilimi CPPler çesitil moleküler kargolarin hücresel alimini kolaylastiran peptidlerdir. CPPlerin örnekleri, Insan Immun Yetmezligi Virüsünden 1 bir trans-aktiflesen transkripsiyonel aktiflestirici (TAT) ve bir fibroblast büyüme faktöründen zar yer degistirme dizilisini (MTS) içerir. Vakuole hedeflenen gen sifreleyen fGH ya da vakuole hedeflenen gen sifreleyen GFP içeren yapilar ayrica yukaridaki "malzemeler ve yöntemler" bölümünde açiklandigi üzere CPPlerin birini de içermek üzere tasarlanmistir.

Vakuol-fGH-MTS-HA ya da vacuole-fGH-TAT-HA ifade eden Alg hatlari yukarida açiklandigi üzere besleme denemelerinde baliklari beslemek üzere kullanilmaktadir. FGH'nin GFP ile yer degistirildigi yukaridaki yapilar ile dönüstürülmüs alg hatlari (vakuolGFP-MTS ya da vakuol-GFP-TAT-) bir model sistemi olarak kullanilir. Ilave olarak bu alg hatlari fareleri gavaj ile beslemek üzere kullanilir. Besleme denemelerinin sonunda, alg-ifade eden proteinin varligi, HA tag'a dogru yönlendirilen ELISA ya da Western blot analizleri kullanilarak, alg ile beslenen baliklarin ya da farelerin kaninda incelenir. Ilaveten, kan örneklerinin GFP floresani, dogrudan bir floresan tabak okuyucu ile yönlendirilir ya da GFP proteini, bir anti GFP antikoru kullanilarak ELISA ile tespit edilir. yukarida sunulan sonuçlar, alg Phaeodactylum tricornutum'un rekombinant proteinlerin çesitli hedef hayvanlara oral yolla verilmesi için etkili bir araç görevi gördügünü göstermektedir. Herhangi bir belirli teori ya da hareket mekanizmasi tarafindan sinirlandirilmayi istemeksizin, rekombinant proteini asidik midede enzimatik bozunumundan koruyan alg hücre çeperi ile algler bir yerel biyo- kapsüllenme islevi görür. Sonuçlar ayrica, yine herhangi bir belirli teori ya da hareket mekanizmasi tarafindan sinirlandirilmayi istemeksizin, vakuol hedefli proteinin bagirsaktan hedef organele etkili sekilde emilmesini mümkün kildigini ortaya koymaktadir. Özetle, mevcut basvuru, rekombinant proteinlerin hayvanlara bozulmamis ve islevsel formlarinda oral yola uygulanmasini saglayan bir alg bazli platformun ilk kez olusturulmasini göstermektedir.

DIZILIS LISTESI <120> <130> <150> <151> <150> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 1 TransAlage Israel Ltd.

TRANSGENIK MIKROALGLER VE BUNLARIN, ALIMINA YÖNELIK KULLANIMI TRAG/OOS PCT 61/692240 2012-08-23 61/781103 2013-03-14 Patent versiyon 3.5 Yapay Dizilis PROTEINLERIN ORAL Sentetik polinükleotid (Phaeodactylum tricornutum kullaniminda somon büyüme hormonu) .Llîîcîllê 3:5L3-'»IJJ :33':t.-::: :IJJC::.'I: .'Iîîîîîîlê :::LIZIIJC .T-^'Tn.'ii^'Tn,T:' "TT T 1 1 i'i. 'v1' 1“ ' i>'f:°.'1.^*-1T't'i^1 .T.?'.'i^^:*?::°i^^.' :'i^^.°Tq'.°fzr°r^ `î ` <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Peptid retikulum Öncü Dizilis) <400> 2 (Phaeodactylum tricornutum Endoplazmik Met Met Phe Met Arg Ile Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Pro Ser Ile Arg Ala Glu Glu Ala Gly Glu Glu Ala Lys Met Gly Thr 25 30 <210> 3 <211> 221 <212> PRT <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Polipeptid <400> 3 <210> 4 <21l> 22 <212> PRT <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Peptid (Phaeodactylum tricornutum Kisa Vakuol Öncü Dizilis) <400> 4 Met Ser Ile Arg Leu Phe Ser Thr Ala Leu Leu Ala Ala Cys Leu Ala 1 5 10 15 <210> 5 <21l> 32 <212> PRT <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Peptid <400> 5 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro 1 5 10 15 Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln 25 30 <210> 6 <21l> 251 <212> <213> <220> <223> <400> Met Ser Ile Arg Leu Phe Ser Thr Ala Leu Leu Ala Ala Cys Leu Ala Yapay Dizilis Sentetik Polipeptid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Peptid Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro Yapay Dizilis Sentetik Polipeptid (3111 (3111 <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> ..1 ;. :`14: î'L I-_'_\- Yapay Dizilis Sentetik Peptid Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Polipeptid <400> 10 Met Ser Ile Arg Leu Phe Ser Thr Ala Leu Leu Ala Ala Cys Leu Ala 1 5 10 15 Lys Ala Thr Ala Gin Thr Gly Ser Ile Glu Asn Gin Arg Leu Phe Asu 25 30 40 45 <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis alg ifade vektörü) gagtoqtcqg abttqccica qcacgchtq OthgtöqCO cagttcqçtq RW*T:PfnC: <210> 12 <211> 189 <212> PRT <213> <220> <223> <400> 12 Yapay Dizilis Sentetik Polipeptid Lgßch :L' ':gaiiii': Q ;5:::1 ' CÜ'IIIIIÄ: 1'rwi~-;wina 1'Wüfnvfn' (Olgun Somon Büyüme Hormonu) Ve: î e 5 - :er 5 r =": '9. bre ;5~ ' e l a Va Sar Av: Va u ' yili :12::. .11 I .11 i . .i ..i. f'êi r i rii '..i. .su 2!.. I... _ .Lt u - “ii-i' T'T '.~ 4- "'.'i' ?vw .i ' *h* '9. 7 E- T :- :îç-i' :Er' '-:--- Ve; :v: :5' â a :5* G * ' 9 Her u . 'ws 'e- Ser 'ei ' S ' :5' 'e- ü . ü ç :sp u ç :5' ?J ;"3 ="3 AE' 'vr u - 'ez 'e- VP.` :1 y:: I"_.':= far: y:: `-Zi'i' i ' i ` ' P.` .'i w" i '3.' iki . " <210> <211> <212> <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Peptid (Phaeodactyluni tricornutuni Tam `Vakuol Öncü Dizilis) <400> <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Mah 30: Ile Arq Lou Pho Se:: Thr Ala Lou Lou Ala Ala Cys Lou Ala 1 5 10 15 by: Ala Thr Ala Gln Thr Cys Pro 'rhr Leu Ile Trp Ser Asp 2536 Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <2ll> <212> <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Polinükleotid <400> 16 <210> 17 <211> <212> <213> <220> <223> <400> 17 Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid .Tf'":'.7i' m' i' ti'iîi' i_ ..."11 '.. akit! .1 L <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> .1i. cl.: i. "Ü-11"* Yapay Dizilis Sentetik Pept Vv: ü** Hrr 9;- Mar û ~ li iv " a'- tv-'q`r_-,-i ~ .`-'."` -r-,w- 7.17. .. .. 77::: __, Flat g .. .. . 1 'Il' (aguti-baglantili protein parçalanmasi) <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Peptid 4 .'_i_l ', i-'lir: ..3'i 5.-.: :Jliit (y: &gr '.-'..'.~' Arz; ::mr ."Ei" :Kup fu::. Llir 'Iys' ..':w' fu::. <210> 23 <211> 201 <212> DNA <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Polinükleotid <400> 23 1.: 31.' -. I ' ,I ' . [I 'J I' ' I" ::1 K ' ' -'l .2',î|..;i.«,î~.i'i..«.. :îugnu :::L - <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 24 <210> <211> <212> <213> <400> Gln His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly Gallus gallus <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Peptid Met Ser Ile Arg Leu Phe Ser Thr Ala Leu Leu Ala Ala Cys Leu Ala 1 5 10 15 Lys Ala Thr Ala Gln Thr Gln His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly 25 30 <210> 27 <21l> 255 <212> DNA <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Polinükleotid <400> 27 <210> 28 <211> 239 <212> PRT <213> Yapay Dizilis <220> <223> Sentetik Polipeptid <400> 28 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 25 30 <210> 29 <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid i'i TI- i" “ 11"!` 7', I' .". 7', I' fl .° A `fil VE] Yapay Dizilis Sentetik Polipeptid 1.315 14011 <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> .1'i 3 Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> EICC'Zlîüi-'ZIIZ Yapay Dizilis Sentetik Polipeptid .* 7'. .'i.':i'1ri:".'~-' EIIIL :FEEL :Eli: %.: ::If-.dt 1112: <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> 7 9 9. G \ I 5 45 e Ç * i is Pvr* -I F." i i uari i y Hri' ' 'i`.

CL; En::. ;Izr i'ri:- . Lv: CD," :Kup 'Ilk' i'ri'i 1 .. 1' _ .32. i' Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid Lauug;LLLa cLaguLgpLL <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 7?? f] "ifl Aiiugijr.it:' h! ij:;'i; pii.x ,? Yapay Dizilis Sentetik Polipeptid a.qutrrçnr dü 1..' »I '..-J.1'.\. : . F.. i.. ..i. E i n.. .7 . H ,L I ._. 5 mt. . _ i.. n.. . . hu .ru . ...A Y. ni .7 . F . I..“ lu â_ . .. n: . _1 .i Iir __u .U ». _ . <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> 1 :I.: Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid -1. am.. 2...!.. <210> 36 <211> 27 <212> <213> <220> <223> <400> 36 KL atlus'i› !1.1.5.2 Yapay Dizilis LaLugiLLLa utagutgLLL Sentetik Polinükleotid <210> 37 <21l> 30 <212> DNA 8513527... Zil:: iC-Il-Jâiilîlê :32:: :ia: <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay Dizilis Sentetik Polinükleotid . frsvß- *er-'n' '

Claims (1)

1. ISTEMLER .Bir biyolojik olarak aktif ekzojeni sifreleyen en az bir dönüstürülebilir polinükleotid içeren bir ifade kaseti içeren bir transgenik ökaryotik mikroalg olup, burada ifade edilen biyolojik olarak aktif ekzojen proteini, mikroalg hücrenin hücre vokuolüne hedeflenir. .Istem 1'e göre transgenik mikroalg olup, burada ifade kaseti ayrica, bir vakuol hedefleme peptidini sifreleyen bir polinükleotid içermektedir. .Istem Z'ye göre transgenik mikroalg olup, burada bir vakuol hedefleme peptidini sifreleyen bir polinükleotid, SEQ ID NO:18'de öne sürülen nükleik asit dizilisi, SEQ ID NO:4'de öne sürülen amino asit dizilisini sifrelemeyi içerir. .Istem 1'e göre transgenik mikroalg olup, burada ifade kaseti ayrica, ifade edilmis ekzojen proteinin bir ksenogenik hücre ya da doku tarafindan alinimini arttiran bir protein alanini sifreleyen bir polinükleotid içerir; ya da burada bahsedilen mikroalg bir deniz algidir. .Istem 4'e göre transgenik mikroalg olup, burada bahsedilen mikroalg, Phaeodactylum tricornutum, Dunaliella spp., Nannochloropsis spp., Nannochloris spp., Tetraselmis spp., Chaetoceros muelleri, ve Neochloris oleoabundans' tan olusan bir gruptan seçilir, tercihen mikroalg Phaeodactylum tricornutum'dur. .Istem l'e göre transgenik mikroalg olup, burada biyolojik olarak aktif ekzojen protein, 150 kD'ye kadar bir moleküler agirliga sahiptir, ya da burada biyolojik olarak aktif ekzojen protein, bir 7.Istem 6'ya göre transgenik mikroalg olup, burada biyolojik olarak aktif ekzojen protein bir hormondur. 8.Istem 7'ye göre transgenik mikroalg olup, burada bu hormon, bir* büyüme hormonu, istah artirici hormon ve yumurtlama hormonundan olusan bir gruptan seçilir. 9.Istem 8'e göre transgenik mikroalg olup, burada bu hormon, SEQ ID NO:12'de ortaya konan amino asit dizilisine sahip Somon büyüme hormonudur; ya da burada bu hormon, SEQ ID NO:24'te ortaya konan amino asit dizilisine sahip yumurtlama hormonudur; ya da burada bu hormon, SEQ artirici hormondur. 10. Istemler 1 ila 9'dan herhangi birine göre transgenik mikroalg içeren bir yenilebilir bilesimdir. 11. Istem lO'a göre yenilebilir bilesim olup, bahsedilen bilesim bir hayvan besin bilesimidir ya da insan tüketimi 12. Istem 11'e göre yenilebilir bilesim olup, burada bahsedilen hayvan besin bilesimi su hayvanlarini beslemek için; ya da bahsedilen hayvan besin bilesimi kara hayvanlarini beslemek içindir. 13. Bir proteinin oral yolla _alimina iliskin bir bilesim hazirlanmasi için Istemler 1 ila 9'dan herhangi birine göre transgenik mikroalgin kullanimidir. 14. Bir ilaç olarak kullanim için istemler 1 ila S'ten herhangi birine göre bir transgenik ökaryotik mikroalg 5 olup, burada, ifade edilen ekzojen biyolojik aktif protein bir terapötik proteindir. 10 15. Istem 14'e göre kullanim için transgenik ökaryotik mikroalg olup, burada terapötik protein, bir konunun büyüme orani, büyüme sekilleri, hayatta kalmasi, üreme saglik durumu ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonunu gelistirmek içindir; tercihen burada konu bir su 15 hayvanindan, bir kara çiftlik hayvanindan ve bir insandan seçilir.