CN111394381A

CN111394381A - mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法

Info

Publication number: CN111394381A
Application number: CN202010222429.0A
Authority: CN
Inventors: 贾睿; 徐杨; 彭稳; 何培民
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2020-07-10

Abstract

本发明提供了一种mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法，包括步骤：根据检索到的mOrange和vp28的基因通过序列组合、设计得到mOrange和vp28融合基因，进行密码子优化为优化后的mOrange和vp28融合基因；再和pRL489质粒连接，构建mOrange和vp28穿梭载体并转入大肠杆菌，大肠杆菌在含0.5wt％甲醛的磷酸盐溶液内灭活，最后将含有pRL489‑vp28‑mOrange质粒的大肠杆菌喂食到卤虫无节幼体内；本发明充分利用mOrange基因荧光特性，使得融合载体基因的表达易于检测分析，并通过荧光标记物这一特性减少了繁琐的分子、蛋白检测，从而节约时间与成本。

Description

mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法。

背景技术

Gomez-Gil B将恩氟沙星和土霉素两种抗菌剂单独通过生物包封至卤虫无节幼体，通过富集1h、2h、3h、4h、8h和24h确定生物包封的最短时间，结果表明卤虫无节幼体可以在大约1-8h的时间段内生物包封最大浓度的颗粒，这取决于摄取的物质种类与浓度，且在此之后，由于生物体在摄取物质和废物排泄之间达到平衡，因此可能不再生物包封物质。Matthew C证明了甲硝唑通过生物包封后的卤虫无节幼体，可用于治疗易感染传染病水生动物，有效避免了直接投放甲硝唑对啮齿动物的致癌性、藻类细胞以及对水环境潜在药物的毒性作用。

卤虫作为非选择性过滤的动物，并提供一种理想的可溶性转运药品机制，通过生物包封可以进一步丰富卤虫的营养价值。前人的研究中富集的大多为抗生素等药物，并未利用大肠杆菌等载体进行富集工作。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法。本发明构建的荧光蛋白表达系统，能够实现外源蛋白的长效、稳定表达，并且易于检测。利用构建的荧光蛋白表达功能的重组质粒激活其下游荧光蛋白的表达，发出荧光，在卤虫无节幼体体内富集，从而可根据荧光蛋白表达的结果来观察、确定药物的传递位置及水平，进而为后续卤虫作为水产养殖饵料富集药物的疗效水平提供依据。

具体地，为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法，其包括如下步骤：

(1)、根据GenBank上检索到的mOrange和vp28的基因，经过序列组合、设计得到mOrange和vp28融合基因，其碱基序列为SEQ ID.NO.3，再进行密码子优化，得到优化后的mOrange和vp28融合基因，其碱基序列为SEQ ID.NO.4；

(2)、步骤(1)的优化后的mOrange和vp28融合基因和pRL489质粒连接，构建mOrange和vp28穿梭载体并转入大肠杆菌，得到含有pRL489-vp28-mOrange质粒的大肠杆菌；

(3)、将步骤(2)的含有pRL489-vp28-mOrange质粒的大肠杆菌喂食到卤虫无节幼体内。

其中，在步骤(1)中，本发明通过检索GenBank中的已有数据，将mOrange荧光蛋白基因与vp28基因进行融合，再对两端序列进行密码子优化设计，从而保证其稳定的表达。

在步骤(2)中，大肠杆菌在含0.5wt％甲醛的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液内灭活，无菌PBS反复冲洗后保证卤虫富集时存活。

作为本发明的一种优选实施例，步骤(1)中，mOrange的氨基酸序列为SEQID.NO.1。

作为本发明的一种优选实施例，步骤(1)中，vp28的氨基酸序列为SEQ ID.NO.2。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明根据mOrange在荧光显微镜下受橙色或红色光激发后具有橙红色荧光特性，通过构建vp28基因和mOrange基因的融合表达，优化对两端序列进行密码子后，得到载体pRL489-vp28-mOrange，本发明充分利用mOrange基因荧光的这一特性，使得融合载体基因的表达易于检测分析。

第二、本发明成功运用了一种使用卤虫无节幼体富集大肠杆菌的方法，使用0.5wt％甲醛PBS溶液灭活大肠杆菌，有效避免了大肠杆菌自身的毒性对卤虫的影响，降低了卤虫的死亡率，从而保证卤虫正常富集大肠杆菌。

第三、本发明成功利用卤虫无节幼体的肠道进行了荧光物质的富集，经过荧光显微镜可以明显发现卤虫肠道内出现橙红色荧光，与无荧光物质富集的卤虫肠道形成了明显对比，进一步可以避免繁琐的分子、蛋白检测，从而节约了时间与成本。

第四、本发明成功利用卤虫肠道传递了蛋白物质，即利用卤虫进行大肠杆菌的生物包封与重组蛋白在其体内的富集实验，表明重组蛋白可以有效地传递给卤虫的无节幼体并保留其生物活性，进一步表明将卤虫作为承载重组蛋白载体具有可行性与有效性，可为其他物质在卤虫肠道富集提供依据。

总之，本发明提供了一种利用大肠杆菌作为载体的卤虫肠道富集方法，首先灭火大肠杆菌，从而有效避免大肠杆菌自身毒性导致卤虫无节幼体出现死亡；另外，本发明拟通过荧光显微镜观察荧光标记物的表达稳定性，以表明重组蛋白可以有效地传递给卤虫的无节幼体并保留其生物活性；进一步通过荧光标记物这一特性减少了繁琐的分子、蛋白检测，从而节约了时间与成本。

附图说明

图1为本发明的489质粒大致酶切位置示意图。

图2为本发明的pRL489-vp28-mOrange重组载体。

图3为本发明的pRL 489-vp28-mOrange基因酶切产物PCR鉴定示意图。

图4为本发明的pRL489-vp28-mOrange质粒大肠杆菌在明场下形态图。

图5为本发明的pRL489-vp28-mOrange质粒大肠杆菌在荧光显微镜下形态图。

图6为本发明的含pRL489-vp28-mOrange的卤虫在荧光显微镜下形态图。

图7为本发明的不含pRL489-vp28-mOrange的卤虫在荧光显微镜下形态图。

具体实施方式

本发明提供了一种mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法。

(一)、荧光蛋白的构建

对489质粒进行全序列测序，并整理出489质粒中的酶切位点。检索GenBank数据库上登记的对虾白斑综合征病毒蛋白vp28以及荧光蛋白mOrange，vp28碱基序列为KR057961.1，mOrange碱基序列为MF189861.1。以Kpn I(6212)为上游酶切位点，以Xho I(4767)为下游酶切位点，灰色阴影部分是酶切去除部分(图1)，无下划线部分为vp28基因，有下划线部分为mOrange基因。

具体地，vp28碱基序列号为KR057961.1，氨基酸序列为：

MDLSFTLSVVSAILAITAVIAVFIVIFRYHNTVTKTIETHTGNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKIKIRNGKSDAQMKEEDADLVITPVEGRALEVTVGQNLTFEGTFKVWNNTSRKINITGMQMVPKINPSKAFVGSSNTSSFTPVSIDEDEVGTFVCGTTFGAPIAATAGGNLFDMYVHVTYSGTETE。

mOrange碱基序列号为MF189861.1，氨基酸序列为：

MVSKGEENNMAIIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKHPADIPDYFKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPVQLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK。

根据检索GenBank数据库上登记的对虾白斑综合征病毒蛋白vp28以及荧光蛋白mOrange序列，通过使用SnapGene 2.3.2进行组合、设计得到融合表达vp28-mOrange基因序列为：(斜体部分为酶切位点，无下划线部分为vp28基因序列，有下划线部分为mOrange基因序列，粗体部分为Linker序列)vp28-mOrange融合基因的碱基序列：

GGTACCATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCATCACTGCTGTGATTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACACAGGCAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGTCCTTTGACAGCGACACCTTGGGCAAAATCAAGATCCGCAATGGAAAGTCTGATGCACAGATGAAGGAAGAAGATGCGGATCTTGTCATCACTCCCGTGGAGGGCCGAGCACTCGAAGTGACTGTGGGGCAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACACCTCCTCCTTCACCCCCGTCTCTATTGATGAGGATGAAGTTGGCACCTTTGTGTGTGGGGTACCACCTTTGGCGCACCAATTGCAGCTACCGCCGGTGGAAATCTTTTCGACATGTACGTGCACGTCACCTACTCTGGCACTGAGACCGAGTAAGGCGGCGGCGGTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCAT CAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGC GAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGG ACATCCTGTCCCCTCAGTTCACCTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTCAA GCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAG GACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCG TAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGA GATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTCCGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAG CCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACATCGTCGGCATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCG TGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACTCGAG。

对两端序列进行密码子优化设计用于融合表达的vp28-mOrange基因序列(序列1，斜体小写部分为内切酶酶切位点，加粗部分为Linker序列，下划线部分为mOrange基因)。根据物种的密码子偏好性进行优化，优化过程通过生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成。然后将产物连接到489质粒构建重组载体pRL489-vp28-mOrange(图2)，转入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，待菌落长出后挑选重组子进行PCR鉴定(图3)。

实际上，根据聚球藻这一物种的密码子偏好性优化基因序列得到优化后的mOrange和vp28融合基因序列：

GGTACCATGGATCTGAGCTTTACCCTGAGCGTGGTGAGCGCCATTCTGGCCATTACCGCCGTGATTGCCGTGTTTATTGTGATTTTTCGCTACCATAATACCGTGACCAAAACCATTGAAACCCATACCGGCAATATTGAAACCAATATGGATGAAAATCTGCGCATTCCCGTGACCGCCGAAGTCGGCAGCGGCTACTTTAAAATGACCGATGTCAGCTTTGATAGCGATACCCTGGGCAAAATCAAAATCCGCAACGGCAAAAGCGATGCCCAAATGAAAGAAGAAGATGCCGATCTGGTGATCACCCCCGTGGAAGGCCGCGCCCTGGAAGTCACCGTGGGCCAGAACCTGACCTTTGAAGGCACCTTCAAAGTCTGGAACAATACGAGCCGAAAAATCAATATCACCGGAATGCAGATGGTTCCCAAAATCAACCCGAGCAAAGCCTTTGTGGGCAGCTCGAACACCAGCAGCTTCACTCCCGTCAGCATCGACGAAGATGAAGTGGGCACGTTTGTTTGCGGCACCACCTTCGGCGCCCCCATCGCGGCGACAGCTGGTGGCAACTTGTTCGATATGTATGTTCACGTCACCTACAGTGGCACCGAAACCGAAGGCGGCGGCGGTAGTATGGTGAGCAAAGGCGAAGAAAATAATATGGCCATTATTAAAG AATTTATGCGCTTTAAAGTGCGCATGGAAGGCAGCGTGAATGGCCATGAATTTGAAATTGAAGGCGAAGGCGAAGG CCGCCCCTACGAAGGCTTTCAAACCGCCAAACTGAAAGTGACCAAAGGCGGCCCCCTGCCCTTTGCCTGGGATATT CTGAGCCCCCAATTTACCTACGGCAGCAAAGCCTACGTGAAACATCCCGCCGATATCCCTGACTATTTTAAATTGA GCTTCCCTGAGGGATTTAAGTGGGAACGAGTGATGAACTTTGAGGATGGTGGGGTCGTGACGGTGACCCAAGATAG TAGCCTACAGGATGGTGAATTTATCTATAAAGTTAAACTGAGAGGCACCAATTTTCCTAGTGATGGGCCCGTGATG CAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAAGCTAGTAGTGAACGTATGTACCCTGAAGATGGCGCCTTGAAGGGTGAAATTA AAATGCGCCTGAAACTGAAAGATGGGGGCCATTACACCAGCGAAGTGAAAACCACCTACAAAGCCAAAAAACCCGT GCAACTACCCGGCGCCTACATTGTCGGCATTAAACTGGATATCACTAGCCATAATGAAGATTACACCATCGTTGAG CAGTATGAACGCGCCGAAGGCCGCCATAGCACCGGCGGCATGGATGAACTGTATAAATAGCTCGAG。

具体地，大肠杆菌转化与筛选：每50μL感受态细胞中加入5μL质粒，轻弹混匀。冰浴30min后，在42℃进行90s热休克，迅速冰浴2min使体系冷却，过程中切忌摇晃离心管。向离心管中加入LB培养液450μL，离心条件为37℃、45min、150rpm。取100μL菌液加入含有相应抗生素的LB平板上，正放约1h使菌液充分吸收，倒置培养12h进行筛选。

大肠杆菌质粒制备：目的基因和pRL489空载体经T4 DNA连接酶连接后16℃过夜，连接产物转入大肠杆菌TOP10感受态细胞。取50μL菌液加入5mL无菌LB培养液，37℃、160rpm过夜培养。将过夜培养的转化后的大肠杆菌用干净的LB培养液清洗两遍，挑取单克隆扩大培养，并采用天根小提质粒试剂盒(货号为DP103-02)提取重组质粒pRL489-vp28-mOrange。通过PCR使对重组质粒pRL489-vp28-mOrange进行验证，用空载体作为对照进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

通过荧光显微镜观察转化后大肠杆菌菌落。可以发现在明场下大肠杆菌菌落不发光(图4)，而在荧光下发出很强的橙色荧光(图5)。

(二)、利用卤虫富集荧光蛋白

购买无棣海吉牌卤虫卵，在盐度30‰、26±1℃、pH 7-8的无菌盐水，1000lux光照下持续通气孵化24h，收集孵化完成的卤虫无节幼体放置于500mL同等条件下的无菌海水中暂养。

为了避免大肠杆菌的毒性对卤虫的致死性，需要将大肠杆菌灭活后再进行富集：通过在卤虫的肠道内富集表达pRL489-vp28-mOrange的大肠杆菌，将大约60OD₆₀₀的细菌细胞重悬于1mL含0.5wt％甲醛的pH为7.4的PBS中，并在室温下孵育30min或在4-8℃持续12-16h。灭活的大肠杆菌在使用前存储在4-8℃下。灭活的大肠杆菌用pH为7.4的PBS洗涤，以除去过量的甲醛，然后用于卤虫富集。

卤虫在30‰、pH为7-8的无菌海水中适应5-10min。通过将1g卤虫孵育30min富集在3mL、pH为8-9、30‰的海水，投喂含有120OD₆₀₀灭活了表达pRL489-vp28-mOrange的大肠杆菌(1OD₆₀₀约为10⁹E.Coli/mL)。富集后，收获卤虫并用50mL 30‰海水洗涤，以从其外表面除去大肠杆菌。

(三)、富集效果验证

将卤虫放置在载玻片上，使用MS-222麻醉5min，将其放置在荧光显微镜下观察(图6和图7)。可以很清楚地发现：在荧光场下，含有pRL489-vp28-mOrange的卤虫肠道发出很强的橙红色荧光(如图6)，而不含pRL489-vp28-mOrange的卤虫肠道则不发光(如图7)。故有效证明了荧光蛋白成功在卤虫的肠道内富集，且在富集条件下能稳定存在。

上述对具体实施方式的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施方式做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施方式中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法

<141> 2020-03-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 236

<212> PRT

<213> mOrange的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asn Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Phe Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Thr Ser Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Gly Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> vp28的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile

1 5 10 15

Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr

20 25 30

Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Gly Asn Ile Glu Thr Asn Met

35 40 45

Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr

50 55 60

Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile

65 70 75 80

Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala

85 90 95

Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val

100 105 110

Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr

115 120 125

Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn

130 135 140

Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro

145 150 155 160

Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr

165 170 175

Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met

180 185 190

Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu

195 200

<210> 3

<211> 1355

<212> DNA

<213> mOrange和vp28融合基因的碱基序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

ggtaccatgg atctttcttt cactctttcg gtcgtgtcgg ccatcctcgc catcactgct 60

gtgattgctg tatttattgt gatttttagg tatcacaaca ctgtgaccaa gaccatcgaa 120

acccacacag gcaatatcga gacaaacatg gatgaaaacc tccgcattcc tgtgactgct 180

gaggttggat caggctactt caagatgact gatgtgtcct ttgacagcga caccttgggc 240

aaaatcaaga tccgcaatgg aaagtctgat gcacagatga aggaagaaga tgcggatctt 300

gtcatcactc ccgtggaggg ccgagcactc gaagtgactg tggggcagaa tctcaccttt 360

gagggaacat tcaaggtgtg gaacaacaca tcaagaaaga tcaacatcac tggtatgcag 420

atggtgccaa agattaaccc atcaaaggcc tttgtcggta gctccaacac ctcctccttc 480

acccccgtct ctattgatga ggatgaagtt ggcacctttg tgtgtggggt accacctttg 540

gcgcaccaat tgcagctacc gccggtggaa atcttttcga catgtacgtg cacgtcacct 600

actctggcac tgagaccgag taaggcggcg gcggtagtat ggtgagcaag ggcgaggaga 660

ataacatggc catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag ggctccgtga 720

acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggctttcaga 780

ccgctaagct gaaggtgacc aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc 840

ctcagttcac ctacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact 900

tcaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg 960

gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga 1020

agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct 1080

gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaaga 1140

tgaggctgaa gctgaaggac ggcggccact acacctccga ggtcaagacc acctacaagg 1200

ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acatcgtcgg catcaagttg gacatcacct 1260

cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca 1320

ccggcggcat ggacgagctg tacaagtaac tcgag 1355

<210> 4

<211> 1350

<212> DNA

<213> 优化后的mOrange和vp28融合基因的碱基序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 4

ggtaccatgg atctgagctt taccctgagc gtggtgagcg ccattctggc cattaccgcc 60

gtgattgccg tgtttattgt gatttttcgc taccataata ccgtgaccaa aaccattgaa 120

acccataccg gcaatattga aaccaatatg gatgaaaatc tgcgcattcc cgtgaccgcc 180

gaagtcggca gcggctactt taaaatgacc gatgtcagct ttgatagcga taccctgggc 240

aaaatcaaaa tccgcaacgg caaaagcgat gcccaaatga aagaagaaga tgccgatctg 300

gtgatcaccc ccgtggaagg ccgcgccctg gaagtcaccg tgggccagaa cctgaccttt 360

gaaggcacct tcaaagtctg gaacaatacg agccgaaaaa tcaatatcac cggaatgcag 420

atggttccca aaatcaaccc gagcaaagcc tttgtgggca gctcgaacac cagcagcttc 480

actcccgtca gcatcgacga agatgaagtg ggcacgtttg tttgcggcac caccttcggc 540

gcccccatcg cggcgacagc tggtggcaac ttgttcgata tgtatgttca cgtcacctac 600

agtggcaccg aaaccgaagg cggcggcggt agtatggtga gcaaaggcga agaaaataat 660

atggccatta ttaaagaatt tatgcgcttt aaagtgcgca tggaaggcag cgtgaatggc 720

catgaatttg aaattgaagg cgaaggcgaa ggccgcccct acgaaggctt tcaaaccgcc 780

aaactgaaag tgaccaaagg cggccccctg ccctttgcct gggatattct gagcccccaa 840

tttacctacg gcagcaaagc ctacgtgaaa catcccgccg atatccctga ctattttaaa 900

ttgagcttcc ctgagggatt taagtgggaa cgagtgatga actttgagga tggtggggtc 960

gtgacggtga cccaagatag tagcctacag gatggtgaat ttatctataa agttaaactg 1020

agaggcacca attttcctag tgatgggccc gtgatgcaga agaagaccat gggctgggaa 1080

gctagtagtg aacgtatgta ccctgaagat ggcgccttga agggtgaaat taaaatgcgc 1140

ctgaaactga aagatggggg ccattacacc agcgaagtga aaaccaccta caaagccaaa 1200

aaacccgtgc aactacccgg cgcctacatt gtcggcatta aactggatat cactagccat 1260

aatgaagatt acaccatcgt tgagcagtat gaacgcgccg aaggccgcca tagcaccggc 1320

ggcatggatg aactgtataa atagctcgag 1350

Claims

1.一种mOrange和vp28穿梭载体富集至卤虫无节幼体的方法，其特征在于：其包括如下步骤：

(3)、将步骤(2)的含有pRL489-vp28-mOrange质粒的大肠杆菌喂食到卤虫无节幼体内；

其中，在步骤(2)中，所述大肠杆菌在含0.5wt％甲醛的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液内灭活，之后反复冲洗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，mOrange的氨基酸序列为SEQID.NO.1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，vp28的氨基酸序列为SEQID.NO.2。