CN102220362B

CN102220362B - 一种高效表达抗菌肽饵料藻的构建技术与应用方法

Info

Publication number: CN102220362B
Application number: CN201010148813.7A
Authority: CN
Inventors: 胡章立; 穆菲芸
Original assignee: SHENZHEN SHENBOTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Shenzhen University
Current assignee: SHENZHEN SHENBOTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Shenzhen University
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2030-04-16
Also published as: CN102220362A

Abstract

本发明申请公开了一种高效表达抗菌肽的基因工程饵料微藻的构建技术与应用方法。根据藻类偏爱的密码子，设计改造并人工合成含连接肽序列的串联抗菌肽基因，将串联抗菌肽基因克隆到含藻类高效启动子和终止子的载体上，再与携带筛选基因的表达框架连接，构建重组表达载体。采用玻璃珠转化法、基因抢法或电击转化法将重组表达载体转入微藻中，并筛选得到转基因藻。本发明生产的转基因藻具有高效表达抗菌肽的能力，其藻细胞或提取物均具有抗菌特性，可以作为活体饵料，也可以应用于动物饲料添加剂、生物制药、保健品研制等领域。

Description

一种高效表达抗菌肽饵料藻的构建技术与应用方法

技术领域

本发明申请涉及一种能够高效表达抗菌肽基因的载体的构建方法，以及由此方法得到的表达载体、转化体以及能够高效表达抗菌肽的转基因藻及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptide)最初是从免疫后的昆虫血淋巴细胞中发现的一类活性多肽，是一类由20～60个氨基酸组成的活性肽类物质，通常含有2～3个带正电荷的氨基酸，如精氨酸或赖氨酸，因此又称阳性抗菌肽。抗菌肽是一种具有双亲性质结构的物质，分子中的疏水部分一般位于C端，而阳离子氨基酸部分位于N端，而且所有抗菌肽的C末端都是酰胺化的。它的分子量一般在几千个道尔顿(Da)之间，具有水溶性好，不易被酶水解，热稳定性高等特点。一般的抗菌肽都具有广谱的抗菌性，对真菌、原生生物也能起一定的抵抗作用，有一些特殊的抗菌肽还能杀死病毒和肿瘤细胞。抗菌肽杀菌具有高效性，在浓度很低的情况下就可以发挥作用，其最小抑菌浓度一般为0.25～4μg/ml。

1975年瑞典科学家G.Boman等将蜡状芽孢杆菌诱导惜古比天蚕(Hylophoracecropia)产生一种新的肽类物质，命名为天蚕素(cecropins)，这是第一个被发现的抗菌肽。此后，人们又在细菌、真菌、两栖类、哺乳动物、植物和人类中相继发现并分离得到了多种抗菌肽，迄今为止，已经在自然界中发现了1700多种抗菌肽。近年来的研究表明，抗菌肽具有不同于一般抗生素的特殊作用机制，使细菌不容易产生耐药性，有望成为新一代抗菌药物。天蚕素Cecropin B是一种从家蚕中分离得到的昆虫抗菌肽，具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、广谱抗菌等优点，更为重要的是Cecropin B对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)属于绿藻门、团藻目、衣藻科，是一种单细胞真核鞭毛藻类，是研究多种生命活动(如光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律等)的模式生物，与酵母细胞有许多共同的特征，素有“光合酵母”之称。它的遗传背景清楚，其基因组学研究已近完成，是目前唯一建立细胞核、叶绿体和线粒体三套遗传转化系统的生物材料。由于其生长速度快、光合效率高、可进行基因定点整合，是最适合构建转基因光合生物反应器的单细胞真核生物，具有非常广阔的应用前景。

目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性、靶菌株不易产生抗性突变和对动植物无毒副作用等特点，其作为理想的抗生素替代品，正受到人们越来越多的重视，在养殖业、医药工业上有着广阔的应用前景。抗菌肽的表达在大肠杆菌和酵母细胞中已经存在，特别是在酵母细胞中有较好的表达效果，但还未有在莱茵衣藻中表达抗菌肽的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种能够在莱茵衣藻内高效表达天蚕素B基因的表达载体，以及经过该表达载体转化得到的转化子，由于经转化得到的转基因莱茵衣藻能够高效表达天蚕素B，所以可以作为活体饵料，也可以应用于动物饲料添加剂、生物制药、保健品研制等领域。

本发明是通过以下方法实现的：

一种高效表达抗菌肽饵料藻的构建技术，其特征在于：将人工合成的含连接肽序列的串联抗菌肽基因导入受体藻株中，经筛选得到能高效表达抗菌肽的转基因藻，此方法包括以下步骤：

1)转基因受体藻的筛选与培养：选用饵料藻(如底栖硅藻、小球藻、莱茵衣藻等)作为转基因受体藻株，具有生长迅速、易培养等特点。采用藻类特定培养基(如BBM、BG-11和TAP等)，在光照90～200μE/m².s的条件下通气培养；

2)抗菌肽基因的合成：a、根据抗菌肽基因序列(如Cecropin B等)和受体藻基因组偏爱密码子表，设计适合于藻类表达的抗菌肽序列，并通过人工合成的方法合成抗菌肽基因。b、利用连接肽序列将抗菌肽基因串联组合，形成含连接肽序列的串联抗菌肽基因；

3)藻类抗菌肽表达载体的构建：将串联抗菌肽基因(如串联CecropinB，4个串联)插入藻类表达载体(如莱茵衣藻pH105载体的Nhe I和Pmac I位点)，获得抗菌肽基因表达框架，然后分别将抗菌肽基因表达框架插入带筛选标记表达盒的载体(如莱茵衣藻pSP124的EcoR I位点)，获得带筛选标记的抗菌肽基因衣藻核表达载体；

4)抗菌肽基因表达载体的遗传转化与转基因藻的筛选：分别将抗菌肽基因表达载体，通过“珠磨法”、基因枪法或电击转化法进行遗传转化。通过抗性平板筛选或营养缺陷型筛选，获得阳性藻落，进行分子检测和表达产物分析，确定高效表达抗菌肽的转基因藻。

上述的连接抗菌肽单体成为串联抗菌肽基因的连接肽编码序列，其特征在于藻类细胞中表达产物是6个氨基酸的肽段，且在细胞内能进行自剪切(如莱茵衣藻连接肽序列LWMRFA等)，通过连接肽将抗菌肽单体基因连接起来，形成易于操作的串联抗菌肽基因片段。

上述的转抗菌肽基因受体藻株，其特征在于能够作为饵料或饲料的蓝藻、绿藻、硅藻、甲藻等微藻。

上述的抗菌肽基因，其特征包括能在藻类细胞中有效表达的不同来源和种类的抗菌肽基因，直接或经过藻类优先密码子改造后，转入受体藻株，获得表达具有抗菌活性的转基因藻。

上述的高效表达抗菌肽的转基因藻，其应用方法包括：

1)直接作为水产动物的活体饵料，或饲养动物的活体饲料；

2)大量培养后制成干藻粉，添加到水产动物饵料或家养动物饲料中，其添加比例根据需要可以达到1％-99％；

3)大量培养转基因藻后，从藻细胞中提取具有抗菌活性的重组抗菌肽，应用于医药、水产养殖饵料、动物饲料和保健品等制品。

附图说明

图1：目的基因序列设计图；

图2：莱茵衣藻重组表达载体的构建图；

图3：菌落PCR鉴定图；

图4：衣藻表达载体酶切鉴定图；

图5：衣藻总DNA的PCR鉴定图；

图6：转基因衣藻的RT-PCR鉴定图；

图7：转基因衣藻Western Blot鉴定图；

图8：抑菌圈实验图。

具体实施方式

1.材料与方法

1.1材料

质粒pH105(含衣藻hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子)，质粒pSP124(带有ble基因，使宿主细胞具有腐草霉素和Zeomycin抗性)，大肠杆菌Top10、JM109菌株由本实验室保存，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii CC-849)由美国Duke大学Chlamydomonas遗传中心提供，打孔器、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Nhe I、Sal I和EcoR I购自TaKaRa生物(大连)有限公司，DNAExtraction kit购自晶美生物工程有限公司，E.Z.N.

Plasmid Miniprep KitI购自Promega公司，DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0、RNA PCRKit(AMV)ver 3.0购自TaKaRa生物(大连)有限公司。

1.2方法

1.2.1人工合成串联CecropinB基因

根据莱茵衣藻偏好的密码子，由于莱茵衣藻细胞核内基因对于G、C两种碱基有很强的偏爱性，因此我们依据密码子的简并性特点结合莱茵衣藻偏爱密码子表对原始的CecropinB基因进行了改造，改造后的基因序列在不改变原有氨基酸序列的基础上，提高了基因编码序列的GC含量。改造并化学合成CecropinB(Genebank登陆号为AAA29184)。将四段相同的Cecropin B基因依次串联起来，中间加上了莱茵衣藻的自剪切连接肽序列LWMRFA，末尾加上His6标签，两端设计了Nhe I、Sal I限制性内切酶，总基因长度为522bp，由上海生工完成整个外源基因的合成工作。

1.2.2莱茵衣藻重组表达载体的构建

先将外源基因连接到含有hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上，构建载体pCB105，接着将pCB105上的表达框架切下连接到含有ble筛选基因的载体pSP124上构建最终的衣藻表达载体pCB124。载体构建完成后进行PCR、酶切鉴定以及基因测序来验证基因序列的正确性。

1.2.3“玻璃珠法”转化莱茵衣藻并筛选阳性克隆子

对于经Not I酶切的重组质粒pCB124线性化后，采用“玻璃珠法”转化莱茵衣藻细胞，转化后涂布在含10μg/mL的Zeomycin TAP平板上，于22℃光照培养箱里培养，观察绿色单克隆藻落生长情况。

取20ml处于对数生长后期的莱茵衣藻培养液，于4℃ 5000rpm离心5min，去上清，收集藻细胞。提取莱茵衣藻CC-849和转基因衣藻的基因组DNA进行PCR鉴定，检验有无基因整合入莱茵衣藻中。

1.2.4转基因衣藻的RT-PCR分析

提取莱茵衣藻CC-849和转基因衣藻的总RNA，取1μg作为模板，采用TaKaRa生物(大连)有限公司的RNA PCR Kit(AMV)ver 3.0进行反转录，然后以引物P1、P2进行RT-PCR扩增(引物P1序列为：5’-GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTC-3，P2序列为：5’-GTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGT-3’)。

RT-PCR条件：30℃，10min；50℃，40min；99℃，5min；5℃，5min。PCR条件：94℃变性3min，94℃，30s；60℃，1min；72℃，1min，30个循环，72℃延伸10min。

1.2.5转基因衣藻的Western blot分析

由于衣藻表达载体pH105的启动子为HSP70A-RBCS2，串联有热休克蛋白HSP70A的启动子，此启动子具有热激诱导的特性。分别将莱茵衣藻cc-849和转基因衣藻接种于新鲜的TAP培养基中培养，在光照下培养至对数中后期，进行二次热激诱导外源蛋白的表达。先置于40℃培养箱下，光照热激诱导30min，然后放回22℃光照培养箱中，光照培养5h；光照完毕后再次置于40℃培养箱下，进行第二次热激诱导30min，再放回22℃光照培养箱中培养1h。提取衣藻总蛋白，使用His6单克隆抗体作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，进行免疫印记，检测转基因衣藻中目的蛋白CecropinB的表达。

1.2.6抑菌圈法检测蛋白抑菌活性

在LB平板上涂布100ul培养至对数期的JM109细菌，待菌液稍干后用灭菌的打孔器打孔，接着用液体的LB一滴封底，加入100ul藻蛋白提取液，将培养皿放置于培养箱内培养24h观察抑菌圈形成情况。

1.2.7比浊法检测实验方法

在0.5ml的Enppendorf管中按以下比例加样：JM109过夜培养物5μL(OD＝1)，LB培养液50μL，实验组转基因衣藻和野生型衣藻蛋白抽提上清液(蛋白浓度为0.03mg/ml)分别加75μL(对照组用等量LB补加)，混匀，于37℃水浴2.5～3h，其间不断摇匀，然后稀释至3mL的LB液中，同样轻摇温育1h，取出在721分光光度计上测溶液在600nm处的OD值。

2、结果与分析

2.1串联抗菌肽的设计与合成

人工合成的基因序列设计如图1所示，将上海生工合成的串联CecropinB基因送与深圳欣海凌生物公司测序，测序报告显示结果表明，串联CecropinB基因序列与上海生工提供的合成报告单完全相符。

基因设计序列如下：

GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGT

GAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCA

AGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGC

CCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGT

GTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCG

CGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAG

ATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGG

CGAGGCCAAGGCGCTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGTCGAC

pCB124载体测序序列如下：

GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGT

GAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCA

AGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGC

CCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGT

GTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCG

CGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAG

ATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGG

CGAGGCCAAGGCGCTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGTCGAC

由于莱茵衣藻细胞核内基因对于G、C两种碱基有很强的偏爱性，因此我们依据密码子的简并性特点结合莱茵衣藻偏爱密码子表对原始的CecropinB基因进行了改造，改造后的基因序列在不改变原有氨基酸序列的基础上，提高了基因编码序列的GC含量，经过改造后的串联CecropinB基因全长522bp，其中GC含量为64.2％，极大地满足了莱茵衣藻基因组对于GC碱基的偏爱性，从而使得串联CecropinB基因更易整合入莱茵衣藻基因组中并获得稳定表达。

2.2含串联抗菌肽莱茵衣藻表达载体的构建

如图2所示，将CecropinB基因克隆到含hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上，再与携带ble筛选基因的表达框架连接，构建重组表达载体pCB124。载体构建好后进行菌落PCR以及酶切鉴定。

2.3莱茵衣藻重组表达载体的菌落PCR鉴定

挑取转化子单克隆划线保种后，进行菌落PCR鉴定。从图3可以看到，在重组菌CB-1、CB-2与阳性对照(含有目的基因的质粒)的PCR图谱上分别可看到一条522bp的条带，与目的基因大小相同，据此，我们可以判断目的基因已经连接到了相应的载体上。CB-1菌落PCR结果图出现目的条带，说明目的基因已经连接到了含有hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上，具有了可以顺利表达的表达初步框架，CB-2菌落PCR结果出现目的条带，则说明了最终的表达载体上连接上了ble筛选基因，ble筛选基因的存在是为了便于在转化子平板上筛选出对Zeomycin具有抗性的阳性转化子。

2.4莱茵衣藻重组表达载体pCB124的酶切鉴定

如图4所示，用Nhe I和Sal I限制性内切酶酶切pCB57质粒，切下含有522bp的目的基因CecropinB(泳道1)，将之连接至经Nhe I和Sal I双酶切后的pH105载体上。经酶切鉴定结果显示，获得了插入目的基因的载体pCB105(泳道3)。将pCB105采用EcoR I酶切，得到包含莱茵衣藻hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子以及插入CecropinB基因的表达框架，全长1300bp。再将CecropinB基因表达框架与经EcoR I酶切后的pSP124载体连接，转化大肠杆菌TOP10后经酶切鉴定，筛选出正确的重组质粒pCB124(泳道5，亦可用EcoR I酶切下一条长1300bp的表达框架)。由此结果可以验证，衣藻表达载体pCB124已经构建成功。

为了验证我们所构建的表达载体基因是否有突变以及方向性的正确性，我们将重组载体送与深圳欣海凌生物公司测序，测序结果显示所构建载体pCB124没有发生基因突变，串联CecropinB基因与合成序列同源性为100％，并且各个片段连接方向正确，含有ble基因序列。至此，莱茵衣藻重组表达载体已经完全被验证构建成功。

2.5转基因衣藻的PCR分析.

如图5所示，转化子经Zeomycin TAP平板抗性筛选获得阳性克隆后，划线保种阳性转化子。提取转基因衣藻和野生型莱茵衣藻基因组DNA，以引物P1、P2进行PCR。转基因衣藻PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，显示出522bp大小的基因片段。这表明CecropinB基因已经整合到莱茵衣藻基因组中。由于串联CecropinB基因整合进入莱茵衣藻基因组中的方式是随机进行的，因此，采用相同的外源基因转化莱茵衣藻，可以产生不同的转化子，它们可能都能够在Zeomycin TAP抗性平板上生长，但是却可能整合到莱茵衣藻基因组的不同位置。

2.6转基因衣藻的RT-PCR分析

如图6所示，提取转基因衣藻和野生型莱茵衣藻的总RNA，以TaKaRa PCR(AMV)Kit ver 3.0进行反转录。以转基因衣藻cDNA为模板，引物P1、P2进行PCR扩增，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，显示出522bp大小的基因片段。这表明CecropinB基因在转录水平上已经获得了表达。转录水平上的表达成功，说明了串联CecropinB基因能够成功进行自我复制，并且CecropinB基因在莱茵衣藻的细胞中能够转录获得相应的mRNA。

2.7转基因衣藻的Western Blot分析

如图7所示，HSP70A-RBCS2启动子是一个热激诱导型启动子，在40℃条件下热激一定的时间，能显著的提高外源基因的表达水平。将莱茵衣藻cc-849、转CecropinB基因衣藻置于40℃下，进行二次热激诱导，以提高CecropinB基因在莱茵衣藻中的表达量。使用His6单克隆抗体作为一抗、碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗与提取的衣藻总蛋白进行免疫反应，以检测莱茵衣藻中CecropinB的表达。与对照组相比，在14KD和20KD附近各有一杂交信号带，推测该条带可能为不同数目的抗菌肽蛋白单体的表达产物。一个CecropinB抗菌肽单体含有36个氨基酸，由此可计算出一个抗菌肽单体蛋白的分子量为4.3KD，加上中间2个连接肽序列，一个连接肽含有6个氨基酸，那么两个连接肽序列表达的蛋白分子量应该为1.4KD，因此三个多肽式抗菌肽单体和两个连接肽序列的表达产物总分子量应该为14.3KD，这与我们从图7上看到的蛋白分子量的位置是相吻合的。同理我们可以计算出四个多肽式抗菌肽单体加上三个连接肽序列以及6个His组氨酸标签蛋白的总分子量应该为20.08KD，这与我们图7中反应的条带位置也是相一致的。

此结果说明了串联CecropinB基因在莱茵衣藻中确实可以获得不同程度的表达。从而从蛋白水平上印证了串联CecropinB基因在莱茵衣藻中表达的可行性。

2.8抑菌圈法鉴定蛋白功能结果分析

从图8中我们可以看到，转基因衣藻总蛋白抑菌效果图中出现了明显的抑菌圈，而野生型衣藻总蛋白抑菌效果图中则没有出现抑菌圈，经测量得知转基因衣藻总蛋白抑菌圈半径长为0.2cm。由此我们可以推断，转基因衣藻总蛋白对细菌具有抑制作用，野生型衣藻总蛋白对细菌不具有抑菌作用。这说明，我们的串联CecropinB基因已经成功转入单细胞生物莱茵衣藻CC-849中，并且在莱茵衣藻中获得了成功表达，更重要的是，串联CecropinB基因所表达的目的基因具有蛋白活性即抗菌生物活性。因此当具有抗菌生物活性的转基因衣藻总蛋白提取物加入到孔洞内时，就会在空洞的周围出现显著的抑菌透明圈，相反，野生型衣藻总蛋白则由于没有外源抗菌肽基因的导入，不能表达抗菌活性的蛋白，所以就不能产生抑菌圈。

2.9比浊法测量实验结果及分析

比浊法测量抑菌效果是将细菌培养至对数期后，实验组加入转基因衣藻与野生型衣藻总蛋白提取物，对照组加入LB培养液，培养一段时间后，测量培养液的OD值，将实验组OD值与对照组OD值做比较，用实验组相对于对照组细菌OD值降低的程度来说明其抑菌效果，OD值降低越大，说明加入实验组蛋白后菌数量减少的越多，则该组蛋白具有越强的抑菌效果。

表：比浊法测量抑菌效果数据

上表为比浊法测量抑菌效果数据，本实验对革兰氏染色阴性的大肠杆菌JM109进行了抑菌实验研究，对照组加入LB培养液进行培养，而实验组则分别加入转基因衣藻总蛋白提取物和野生型衣藻总蛋白提取物进行培养实验测量数据标准偏差分别为0.001，说明本实验数据可信度较高。从实验最后的平均值来看，实验组加入野生型衣藻总蛋白提取物的使得JM109的OD值从开始的0.362降至0.251，降幅为31％，而加入转基因衣藻总蛋白提取物的使得JM109的OD值从开始的0.362降至0.123，降幅为66％，这说明实验组的转基因衣藻和野生型衣藻均有一定程度的抑菌活性，但是转基因衣藻的抑菌作用更大一些。

Claims

1.一种在莱茵衣藻中表达抗菌肽Cecropin B基因的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

根据莱茵衣藻基因组偏爱的密码子，设计合成适合于莱茵衣藻表达的GenBank基因登录号为AAA29184天蚕素Cecropin B基因序列；

1)将四段相同的GenBank基因登录号为AAA29184的Cecropin B基因依次串联起来，中间加上了莱茵衣藻的自剪切连接肽序列LWMRFA，末尾加上His6标签，两端设计了Nhe Ⅰ、Sal Ⅰ限制性内切酶，总基因长度为522bp；

2)将上述串联CecropinB基因连接到含有hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上，构建载体pCB105，获得天蚕素CecropinB基因表达框架；

3)用限制性内切酶Nhe Ⅰ、Sal Ⅰ将pCB105上的天蚕素CecropinB基因表达框架切下，连接到含有ble筛选基因的载体pSP124上，构建最终的衣藻表达载体pCB124。

2.一种高效表达抗菌肽Cecropin B的转基因莱茵衣藻的构建方法，其特征在于，采用莱茵衣藻作为受体藻株，构建能表达GenBank基因登录号为AAA29184的天蚕素Cecropin B转基因莱茵衣藻的方法，具体包括以下步骤:

1）转基因受体莱茵衣藻的筛选与培养:选择细胞壁缺陷型莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii cc-849作为转基因的受体藻株，使用TAP培养基作为莱茵衣藻的培养基，莱茵衣藻的培养条件包括：在22-25℃，90μE/m²/s光照条件下连续培养，藻细胞对数生长期浓度达到1-2×10⁶cells/mL时，收集藻细胞进行遗传转化；

2）串联抗菌肽Cecropin B基因的改造与合成:根据莱茵衣藻偏好的密码子，由于莱茵衣藻细胞核内基因对于G、C两种碱基有很强的偏爱性，因此依据密码子的简并性特点结合莱茵衣藻偏爱密码子表，对原始的CecropinB基因进行改造，改造后的基因序列在不改变原有氨基酸序列的基础上，提高了基因编码序列的GC含量；将四段改造后的GenBank基因登录号为AAA29184的Cecropin B基因依次串联起来，中间加上了莱茵衣藻的自剪切连接肽序列LWMRFA，末尾加上His6标签，两端设计了Nhe Ⅰ、Sal Ⅰ限制性内切酶，设计总基因长度为522bp串联CecropinB基因序列；

3）抗菌肽Cecropin B基因莱茵衣藻表达载体的构建:先将上述总长度为522bp串联改造后的CecropinB基因序列连接到含有hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上，构建载体pCB105；接着将pCB105上的抗菌肽基因表达框架切下，连接到含有ble筛选基因的载体pSP124上构建最终的衣藻表达载体pCB124；

4）表达载体的遗传转化:采用

Plasmid Purification Kit分别提取重组质粒pCB124，经Not Ⅰ酶切的重组质粒，使其线性化后进行遗传转化，其遗传转化方法包括“珠磨法”、“基因枪法”或“电击转化法”；

5）能表达Cecropin B转基因莱茵衣藻筛选鉴定，包括以下步骤：

（1）转基因藻PCR检测:人工合成引物P1、P2，引物P1序列为：5’-GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTC-3，P2序列为：5’-GTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGT-3’转化子经Zeomycin TAP平板抗性筛选获得阳性克隆后，划线保种阳性转化子；提取转基因衣藻和野生型莱茵衣藻基因组DNA；利用引物P1、P2进行PCR反应，PCR条件：94℃变性3min，94℃，30s；60℃，1min；72℃，1min，30个循环，72℃延伸10min；转基因衣藻PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，显示出522bp大小的基因片段；这表明CecropinB基因已经整合到莱茵衣藻基因组中；

（2）转基因藻的RT-PCR检测：提取转基因衣藻的总RNA，取1μg作为模板，采用TaKaRa生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)ver3.0进行反转录,然后以引物P1、P2进行RT-PCR扩增，RT-PCR条件：30℃，10min；50℃，40min；99℃，5min；5℃，5min；RT-PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，显示出522bp大小的基因片段，这表明CecropinB基因在转录水平上已经获得了表达，转录水平上的表达成功，说明了串联CecropinB基因能够成功进行自我复制，并且CecropinB基因在莱茵衣藻的细胞中能够转录获得相应的mRNA；

（3）转基因藻的Western-Blot检测：将莱茵衣藻cc-849、转CecropinB基因衣藻置于40℃下，进行热激诱导以提高CecropinB基因在莱茵衣藻中的表达量，使用His6单克隆抗体作为一抗、碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗与提取的衣藻总蛋白进行免疫反应，以检测莱茵衣藻中CecropinB的表达，此结果说明了串联CecropinB基因在莱茵衣藻中确实可以获得不同程度的表达，从而从蛋白水平上印证了串联CecropinB基因在莱茵衣藻中表达的可行性。