CN110669784B

CN110669784B - 一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用

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Publication number: CN110669784B
Application number: CN201911046305.5A
Authority: CN
Inventors: 王潮岗; 李安国; 胡章立
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: CN110669784A

Abstract

本发明属于衣藻基因工程技术领域，尤其涉及一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用。本发明将莱茵衣藻碳酸酐酶信号肽和抗菌肽在莱茵衣藻中进行融合表达，获得的转基因衣藻能够胞外分泌抗菌肽，并且分泌的抗菌肽能够有效地抑制海水微生物的生长，减少抗生素的使用，显示其在水产养殖方面具有潜在的应用前景。衣藻构建过程包括：构建质粒载体并提取质粒DNA，所述质粒载体的构建主要为将碳酸酐酶信号肽的编码序列和抗菌肽ALFPm3/ALFPm11基因融合并克隆到载体质粒中；酶切质粒DNA；将酶切后的DNA分子转入基因受体，培养，得到遗传转化子。

Description

一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于微藻基因工程技术领域，尤其涉及一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用。

背景技术

抗菌肽是广泛存在于各种生物中的一类具有抑制或者杀灭病原微生物功能的肽类和小分子蛋白质的总称。研究发现，抗菌肽能够有效地杀灭病原微生物、病毒、致病原生动物等。近年来，抗生素的滥用导致超级细菌的出现，而抗菌肽由于分子量小、抗菌谱广泛、全新的抗菌机制等特点，日益成为新的有望代替抗生素的化合物。其中，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factors，ALFs)是甲壳类动物体内的一种抗菌肽，最早是从两种鲎的血淋巴细胞中鉴定出来的，它一般都是由98-123个氨基酸组成，其中包含一个信号肽序列和一个脂多糖结合结构域，二级结构是由多个α-螺旋和β-折叠组成的。LBD结构域是ALF的功能区，由22个氨基酸残基构成，含有一对保守的半胱氨酸形成二硫键。ALF是一类具有广谱抗病毒、抗细菌、抗真菌活性的抗菌肽，在水产养殖等产业具有重要的应用潜力。然而，自然界的抗菌肽含量较低，提取困难，通过基因工程技术合成是可行的办法。

目前，抗菌肽的异源表达主要有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。

大肠杆菌表达系统是最早建立用于表达异源基因的表达系统，具有表达量高、操作简单、成本低等优点。目前，抗菌肽主要通过原核的大肠杆菌系统进行重组表达而获得。抗菌肽分子量小，将抗菌肽编码基因克隆到表达载体上并转化到大肠杆菌中，就能够异源表达抗菌肽。大肠杆菌不仅生长迅速而且操作简单，只需要添加IPTG诱导即可，因此被广泛用作抗菌肽异源表达的受体细胞。但是，大肠杆菌含有大量能引起免疫反应的内毒素，而内毒素会对抗菌肽的分离纯化造成影响；并且大肠杆菌是原核表达系统，缺乏对真核蛋白的折叠、修饰以及加工的生物过程，也容易形成包涵体；由于抗菌肽可能对大肠杆菌产生抑杀效果，许多抗菌肽没法通过大肠杆菌表达。因此，原核表达系统获得的重组抗菌肽往往活性较低、具有细胞毒性。酵母属于真核微生物，也是人类最早用于生产的微生物之一。它具备了蛋白质翻译后修饰所需要的酶和细胞器，弥补了大肠杆菌表达系统中无法对蛋白质进行修饰的不足。因此，酵母也常常用作抗菌肽异源生产的宿主细胞。研究表明将密码子优化过的真菌防御素基因克隆到相应的表达载体上，电转化到毕赤酵母细胞，能够实现该蛋白在酵母中的胞内表达，分泌表达以及融合表达。通过96孔板抑菌实验证实了表达的抗菌肽具有抗金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌以及副溶血弧菌(革兰氏阴性菌)的能力。然而，酵母表达系统存在一个比较突出的问题，那就是对蛋白过度糖基化，它会对抗菌肽的活性造成较大影响；酵母表达系统需要解决的另一个问题是溶解氧，在高密度发酵时，菌体大量生长会造成溶解氧不足，进而抑制增殖，降低抗菌肽表达量，给分离纯化造成困难，分离的抗菌肽缺乏生物活性；同时，酵母表达量低，且后续分离纯化成本高，不利于工业应用。前期研究结果也告诉我们：无论是大肠杆菌表达系统还是酵母表达系统，都需要进行异养发酵，消耗大量的培养基、氧气和电能，造成环境污染。

与此同时，莱茵衣藻作为一种单细胞真核绿藻，是唯一可进行细胞核、线粒体和叶绿体转化并表达异源蛋白的真核表达系统。它的三个基因组已完成测序，有数十万个突变株，遗传背景清晰。莱茵衣藻具备真核蛋白质的翻译后加工，可正确表达异源蛋白，它的糖基化与人的接近，没有内毒素。莱茵衣藻生长速度快，能够进行光合作用，吸收CO₂并合成产品，培养成本低且环保。莱茵衣藻也可利用光生物反应器进行发酵培养，培养技术成熟，不占用耕地，成本低。相较于大肠杆菌和酵母表达系统，莱茵衣藻还可作为鱼、虾等水生生物的饵料，也可以培养于密闭的养殖池，在水产养殖行业具有重要的应用潜力。

现今已经实现了对莱茵衣藻叶绿体、线粒体和细胞核进行遗传转化。据文献报道，在衣藻叶绿体中已经成功表达了多种蛋白，其中包括融合抗原、单克隆抗体、细胞因子、疫苗等。线粒体表达系统由于遗传转化株的异质性问题，筛选方法的问题以及表达调控的问题等，尚未有利用线粒体生产药用蛋白的报导。核基因组是衣藻表达系统中使用得最多、技术最成熟的系统。Rouhollah Barahimipour等在衣藻中表达HIVP24基因，重组蛋白的表达量占总蛋白的0.25％。Alke Eichler-Stahlberg等在衣藻核内表达促红细胞生成素，表达量高达100μg/L。李镇芳等将同一抗菌肽基因Bacteriocin LS2的3个拷贝串联起来，在莱茵衣藻中实现了胞内表达，重组的Bacteriocin LS2蛋白占可溶性蛋白的0.29％，通过抑菌活性分析发现其对沙门氏菌以及大肠杆菌(革兰氏阴性菌)，枯草芽孢杆菌和单增李斯特菌(革兰氏阳性菌)表现出较强的抗菌活性。综上所述，莱茵衣藻可解决大肠杆菌表达存在的活性低、有内毒素等问题，避免酵母表达存在的过度糖基化、成本高等问题。但是，莱茵衣藻表达也有其自身的难题，如表达产物分离纯化工艺复杂等。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用。本发明采用分泌式表达系统，将抗菌肽表达到细胞外，可避免产物抑制；采用诱导型启动子，提高产物表达量；通过培养基回收目的蛋白，简单纯化即可用于生产，成本低；通过密闭培养池培养，杀灭致病菌，为水产养殖提供健康环境。

本发明是这样实现的，一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：构建信号肽-抗菌肽衣藻表达载体，将信号肽与抗菌肽序列连接并合成后连接至载体，得到表达载体；

步骤2：将表达载体的质粒DNA转化至转基因受体藻株，得到遗传转化子；

步骤3：对遗传转化子的基因组DNA进行检测，并对抗菌肽的转录活性进行分析，得到能够稳定遗传的转基因藻。

本发明可将细胞内表达的抗菌肽分泌到细胞外，涉及一条胞外分泌表达的信号肽(S-peptide)，其氨基酸序列为：MARTGALLLVALALAGCAQA，见SEQ ID NO.1，在莱茵衣藻中的基因表达序列为：atggcgcgtactggcgctctactcctggtcgcgctggcgcttgcgggctgcgcgcaggct，见SEQ ID NO.2。

本发明构建质粒载体，所述质粒载体的构建主要为将信号肽(S-peptide)的编码序列和抗菌肽基因的编码序列融合，通过基因合成技术获得信号肽-抗菌肽的融合序列，然后克隆到载体质粒中。其中，本研究示范的抗菌肽为斑节对虾抗菌肽ALFPm3，其氨基酸序列见SEQ IDNO.3，在衣藻中表达的基因优化序列为SEQ ID NO.4；通过双酶切载体质粒，获得信号肽-抗菌肽融合基因的序列，插入带有光诱导或热激诱导启动子的衣藻表达载体pH124中，成功构建衣藻表达载体；将带有信号肽-抗菌肽融合基因的表达载体导入衣藻基因组中进行表达，通过“珠磨法”进行遗传转化。

进一步，步骤1中所述抗菌肽为抗脂多糖因子。

进一步，步骤1中构建表达载体涉及的载体包括pH105载体和pSP124载体，购买自美国衣藻中心(https://www.chlamycollection.org)。

进一步，步骤2中所述转基因受体藻株为细胞壁缺陷型莱茵衣藻，购买自美国衣藻中心(https://www.chlamycollection.org)。

进一步，步骤3中对遗传转化子的基因组DNA进行PCR扩增检测所用引物分别为CAH-F和All-R，序列分别见SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

一种利用上述的能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法构建的转基因衣藻在抑制海水微生物的生长中的应用。

进一步，所述应用表现为对藻居芽胞杆菌和副溶血弧菌的抑制作用。

进一步，步骤3后面增加：抗菌肽表达的检测，培养转基因藻至对数期，施加强光或热激，增加抗菌肽的表达量，浓缩培养基获得抗菌肽，通过蛋白质杂交鉴定抗菌肽表达量；抗菌肽分泌到培养基中，通过离心和冷冻干燥即可获得。

进一步，利用二次热激诱导法诱导抗菌肽ALFPm3或ALFPm11的表达。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明根据莱茵衣藻的密码子偏好性将碳酸酐酶信号肽的编码序列和ALFPm3或ALFPm11基因融合并克隆到pH124载体上。利用珠磨法转化莱茵衣藻细胞壁缺陷型藻株CC-849，通过Zeocin进行筛选。然后，利用二次热激诱导法诱导表达ALFPm3或ALFPm11蛋白。经过离心分离藻细胞、冷冻干燥就能获得含有ALFPm3或ALFPm11蛋白的粗提物。本发明构建的转基因衣藻能够将抗菌肽分泌到培养基中，即所得到的抗菌肽为胞外分泌的抗菌肽，便于分离纯化，且纯度较高。并且分泌的抗菌肽能够有效地抑制海水微生物的生长，减少抗生素的使用，显示其在水产养殖方面具有潜在的应用前景。

本发明采用衣藻作为宿主细胞生产抗菌肽主要有几点优势：①遗传转化操作方便，已获得各种突变株用于分子生物学研究。②具有能够对抗菌肽进行修饰的酶和细胞器，也能够将抗菌肽分泌到培养基中，简化分离纯化步骤。③衣藻培养方便。既能光合自养，又能化能异养，培养基廉价易得。

附图说明

图1是pH-S-ALF3质粒结构简图；

图2是TAP平板上的CAH转化子；

图3是通过PCR鉴定转化子；

图4是CAH转化子的转录活性分析；

图5是抗菌肽的Western Blot分析，1：阴性对照；2：阳性对照；3：CAH-3；3：CAH-2；3：CAH-1；

图6是抗菌肽ALFPm3对细菌生长的抑制，其中A-SIV：氨苄青霉素杀副溶血弧菌；A-E.coli：氨苄青霉素杀大肠杆菌；A-B.algicola：氨苄青霉素杀藻居芽孢杆菌；Pm3-SIV：ALFPm3杀副溶血弧菌；Pm3-E.coli：ALFPm3杀大肠杆菌；Pm3-B.algicola：ALFPm3杀藻居芽孢杆菌；

图7是抗菌肽ALFPm11对细菌生长的抑制，其中Amp：氨苄青霉素；Pm11：ALFPm11；PBS：磷酸缓冲液。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用，具体如下实施例所示。

实施例1莱茵衣藻的培养

选择细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,CC-849,购自美国衣藻研究中心)作为转基因的受体藻株。使用TAP培养基作为莱茵衣藻的培养基，其配方及成分如下所示：2.42g Tris,25mL 4×Beijerinck salts(16g NH₄Cl,2g CaCl₂·2H₂O,4gMgSO₄·7H₂O溶于水中，定容至1L),1mL 1M(K)PO₄,1mL Trace微量元素混合液(11.4g H₃BO₃,5.6g MnCl₂·4H₂O,22g ZnSO₄·7H₂O,4.99g FeSO₄·7H₂O,1.61g CoCl₂·6H₂O,1.57gCuSO₄·5H₂O,1.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O,50g Na₂EDTA,溶于水中，20％KOH调pH6.5-6.8,定容至1L),溶解到975mL水中，使用冰醋酸调pH6.95-7.05，定容至1L。

莱茵衣藻的培养条件：在22～25℃，90μE/m²·s光照条件下连续培养，藻细胞对数生长期浓度为1～2×10⁶cells/mL。

实施例2信号肽-抗菌肽序列的合成

信号肽(S-peptide)的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，MARTGALLLVALALAGCAQA。信号肽在莱茵衣藻中的基因表达序列为SEQ ID NO.2，atggcgcgtactggcgctctactcctggtcgcgctggcgcttgcgggctgcgcgcaggct。本实施例示范表达斑节对虾抗菌肽-抗脂多糖因子ALF3(ALFPm3)，其他实施例中也可以根据实际需求选择表达其他的抗菌肽。ALFPm3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，QGWEAVAAAVASKIVGLWRNEKTELLGHECKFTVKPYLKRFQVYYKGRMWCPGWT

AIRGEASTRSQSGVAGKTAKDFVRKAFQKGLISQQEANQWLSS。斑节对虾抗菌肽ALF3(ALFPm3)在莱茵衣藻中的基因表达序列为SEQ ID NO.4，caagggtgggaggctgtggcagcggccgtcgccagcaagatcgtggggttgtggaggaacgaaaaaactgaacttctcggccacgagtgcaagttcaccgtcaagccttatttgaagagattccaggtgtactacaaggggaggatgtggtgcccaggctggacggccatcagaggagaagccagcacacgcagtcagtccggggtagctggaaagacagccaaagacttcgttcggaaagctttccagaaaggtctcatctctcaacaggaggccaaccagtggctcagctcatag。

本发明将信号肽和抗菌肽在莱茵衣藻中进行融合表达，获得能够胞外分泌抗菌肽ALFPm3的衣藻。因此，用于在莱茵衣藻中表达分泌抗菌肽的基因序列为，SEQ ID NO.5，atggcgcgtactggcgctctactcctggtcgcgctggcgcttgcgggctgcgcgcaggctcaagggtgggaggctgtggcagcggccgtcgccagcaagatcgtggggttgtggaggaacgaaaaaactgaacttctcggccacgagtgcaagttcaccgtcaagccttatttgaagagattccaggtgtactacaaggggaggatgtggtgcccaggctggacggccatcagaggagaagccagcacacgcagtcagtccggggtagctggaaagacagccaaagacttcgttcggaaagctttccagaaaggtctcatctctcaacaggaggccaaccagtggctcagctcatag。该序列通过三方基因公司合成，序列两端加上NheI和PmaCI限制性内切酶位点，并克隆到T载体上(Takara Bio，CodeNo：3271)。

实施例3信号肽-ALFPm3衣藻表达载体的构建

通过NheI和PmaCI双酶切获得信号肽-ALFPm3序列，连接到pH105载体，具体实验条件见【Wu JX et al.Efficient expression of green fluorescent protein(GFP)mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii.Chinese Journalof Oceanology and Limnology，2008(26):242-247】，通过EcoRI双酶切获得信号肽-ALFpm3基因表达盒(HSP70A-RBCS2∷信号肽-ALFPm3∷RBCS2)，连接到pSP124载体(购自美国衣藻研究中心)，具体实验条件见【Lambreras v,Stevens DR,Purton S.Efficientforeign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by anendogenous intron.Plant J.1998；14(4):441-447】，获得含有信号肽-ALFPm3基因的衣藻表达载体，命名为pH-S-ALF3，原理流程见图1。

实施例4“珠磨法”遗传转化

1：准备转化质粒。

将含有pH-S-ALF3的菌株接种到15mL含有100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养12～16小时。室温下，将培养发酵液8000rpm离心10min，弃上清。运用OMEGAPlasmid Kit试剂盒提取质粒DNA：加入500μL添加了RNase A的Solution I，充分涡旋菌体。加入500μL Solution II，轻柔地混匀，不超过5min。加入700μL Solution III，轻轻地混匀5～10次。室温下，12000×g离心10min，取上清，加到套上了2mL收集管的离心柱上，10000×g离心1min，弃滤液。加入500μL添加了异丙醇的HBC Solution，10000×g离心1min，弃滤液。加入700μL Washing Buffer，10000×g离心1min，弃滤液，重复操作一次。室温下，12000×g空柱离心2min，去掉收集管，套上1.5mL EP管。往离心柱的膜中央滴加80～100μL65℃预热的无菌水，室温放置2min，12000×g离心1min洗脱质粒DNA。最后得到无蛋白杂质的质粒DNA 100μL，浓度为249ng/μL。

2：酶切质粒DNA。

运用NEB的限制性内切酶进行酶切反应体系的配置(New England BioLabs Inc，英国)，反应体系如下：2μg质粒DNA，2μL Kpn I，10μL 3×Cut Smart Buffer，用去离子水补足30μL。37℃反应2小时，85℃热失活30min。取4μL反应液加1μL 5×Loading Buffer，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，结果显示质粒DNA已经酶切完全，条带大小与预期相符，可以用作下一步实验。

3：获取遗传转化子。

将莱茵衣藻细胞壁缺陷型藻株CC-849(购自美国衣藻研究中心)接种到TAP液体培养基中，22℃，90μE×m^-2×s^-1，光照培养。直到OD750至1.0，此时培养液中的藻细胞密度约为1×10⁶cell/mL。

室温下，5000rpm离心5min，收集藻细胞。在超净工作台上，用新鲜的TAP培养基调整细胞密度至2×10⁸cell/mL。将藻液加入到已灭菌的含300mg玻璃珠的EP管中，再加入1μg经限制性内切酶线性化的质粒DNA(pH-S-ALF3)，在涡旋振荡器上以最高转速(2500rpm)涡旋25秒。小心吸取上清藻液，转接到含有10mL TAP培养基的50mL离心管中，25℃，90μE×m^-2×s^-1，100rpm摇床培养22小时。室温下，3000rpm离心5min，收集藻细胞，留约100μL液体重悬藻细胞。将其涂布到含有10μg/mL Zeocin的TAP固体培养基上。22℃，90μE×m^-2×s^-1，倒置培养1～2周，直至出现单克隆。将单克隆藻落转接到新的含有10μg/mLZeocin的TAP平板上，重复转接3次，得到能够稳定遗传的转化子CAH-1，CAH-2，CAH-3，见图2。

实施例5转基因藻的检测

4：提取转化子基因组DNA。

挑取各转化子到10mL TAP液体培养基中，22℃，90μE×m^-2×s^-1，100rpm培养至OD₇₅₀为1.0。

室温下，5000rpm离心5min，舍弃上清。用150μL去离子水重悬藻细胞，加入350μLSDS-EB裂解液(0.5mol/L NaCl；0.05mol/L EDTA；0.125mol/L Tris-HCl；2.5％SDS；0.1μgRNase A)，100mg玻璃珠，室温下以最高转速(2500rpm)涡旋15min。

吸取上清液，加入500μL 1：1(v/v)的酚氯仿溶液，充分混匀后，吸取上清液，重复两次。

取干净的EP管，加入上一步得到的上清液和等体积的无水乙醇，冰浴放置30min。

室温下，10000rpm离心15min，弃上清，加入500μL 75％乙醇，冰浴30min，室温下10000rpm离心15min，重复两次。

用100μL 65℃预热的去离子水溶解，室温放置2～3min，即可得到莱茵衣藻基因组DNA。

5：PCR检测。

用TaKaRa的2×PreMix Taq^TM(Ex Taq^TM Version 2.0plus dye)(TaKaRa，日本)配置PCR反应体系。PCR反应体系为：基因组DNA 2μL，CAH-F(SEQ ID NO.6)0.5μL，All-R(SEQID NO.7)0.5μL，2×Premix 25μL，ddH₂O 22μL。反应流程为：94℃，5min，94℃，30s，56℃，30s，72℃，20s，循环35次，72℃，5min，12℃终止反应。取5μL在1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，PCR后得到349bp的单一条带，PCR产物测序确认，获得转基因藻，电泳结果见图3。

其中用到的PCR引物分别为SEQ ID NO.6，CAH-F为5’GCGTACTGGCGCTCTACTCCTG3’；SEQ ID NO.7，All-R为5’CTGCTCAGCCACTGGTTCGC 3’

实施例6抗菌肽的表达

6：抗菌肽ALFPm3的转录活性分析。

挑取实施例中得到单克隆，接种到10mL TAP液体培养基中，22℃，90μE×m^-2×s^-1，100rpm培养至OD₇₅₀为0.5～0.8。

将培养物转接到新的100mL TAP培养基中，22℃，90μE×m^-2×s^-1，100rpm培养至OD₇₅₀为1.0～1.5。

调整摇床温度至40℃，光照条件不变，藻细胞在此条件下培养20分钟。然后藻细胞恢复到正常培养条件，培养5小时后再次在40℃条件下培养20分钟，再恢复到正常培养条件，培养40min。用RNAfast200试剂盒(飞捷生物，中国上海)提取RNA：取2mL藻液，4℃，5000rpm离心5min收集藻细胞，用100μL无RNase的去离子水重悬。加入500μL RA2，轻柔混匀5到10次，静止1min，加入到含有2mL收集管的离心柱中，12000×g离心1min，弃滤液。加入500μL Wash Buffer，12000×g离心1min，弃滤液，重复操作一次。空柱离心，12000×g，2min。离心柱套上1.5mL EP管，往离心柱加50μL RNase-free水，12000×g离心1min。取4μL样品和1μL 5loading buffer混合后在1％琼脂糖凝胶中电泳分离，分析RNA完整度，2μL在Nanodrop下测定RNA的浓度和纯度。

用TaKaRa的PrimerScrip^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)(TaKaRa，日本)取1μg总RNA，2μL 5×gDNA Eraser buffer，1μL gDNA Eraser，用RNase-free水补足10μL。42℃，2min，4℃结束反应。然后再加入4μL的RNase-free水和4μL 5×PrimerScripBuffer 2(for Real Time)，1μL PrimerScrip RT Enzyme Mix I，1μL RTPrimer Mix，37℃反应15min，85℃，5s，4℃结束反应。cDNA保存于-20℃中。

用TaKaRa的Premix Taq^TM(Ex Taq^TM Version 2.0plus dye)(TaKaRa，日本)配置PCR反应体系：取1μL cDNA，10.5μL去离子水，CAH-F和All-R引物各0.5μL，12.5μL 2×PremixTaq。反应流程为：94℃，5min，94℃，30s，56℃，30s，72℃，20s，循环35次，72℃，5min，12℃终止反应。取5μL在1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，PCR后得到349bp的条带，与预期相符，证明导入的信号肽-ALFpm3在转基因藻中具有转录活性，见图4。

7：抗菌肽ALFPm3的表达。

将培养物转接到新的100mL TAP培养基中，22℃，90μE×m^-2×s^-1，100rpm培养至OD₇₅₀为1.5～2.0。

调整摇床温度至40℃，光照条件不变，藻细胞在此条件下培养20分钟。然后藻细胞恢复到正常培养条件，培养5小时后再次在40℃条件下培养20分钟，再恢复到正常培养条件，培养40min。最后，4℃，5000rpm离心5分钟，所得到的上清即为含有抗菌肽ALFPm3的粗提物。

8：Western Blot分析。

量取400mL ALFPm3的粗提物，分装到10个50mL离心管中，封口膜封紧，放到-80℃中冰冻。翌日，将冰冻的样品取出，放到冷冻干燥仪中冷冻干燥2天。最后用4mL PBS溶液溶解，保存于-20℃中。

取40μL样品，加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，充分混匀，沸水浴中处理5～10min，冷却至室温。

样品各取8μL，GenStar 10-180kDa PreStain Marker取5μL进行SDS-PAGE，将蛋白分离。电泳过程中，裁剪合适大小的PVDF膜，用无水甲醇浸泡PVDF膜1min，再用GenScrip的eBlot试剂盒(Genscrip，美国)中的1×PVDF膜平衡液浸泡1min，备用。

电泳结束，取出凝胶，在去离子水中浸泡凝胶1min。按照GenScrip的eBlot试剂盒说明书堆叠好转膜夹，从负极到正极为，海绵垫-凝胶-PVDF膜-海绵垫，自动转膜6min。

转膜结束后，在去离子水中分离凝胶和PVDF膜，将膜浸泡在3％BSA溶液中，室温封闭2小时。

配置一抗溶液，称取0.3g BSA粉末，溶解于10mL Washing Buffer(8.5g NaCl，1.4gNa2HPO4，0.2g NaH2PO4，加入1000mL去离子水，调节pH为7.4，再加入0.5mL Tween20，4℃储存)里，待充分溶解后，加入2μL HRP conjugated The^TM Anti-His monoclonalantibody(Mouse)(Genscrip，美国)。倒掉3％BSA溶液，倒入一抗溶液，4℃孵育过夜。倒掉一抗溶液，用Washing Buffer洗涤PVDF膜4次，每次10mL，在50rpm下摇10min。

准备化学发光试剂ECL(Biosharp，美国)，试剂A和试剂B按1：1的比例混合，避光保存，现配现用。

将膜取出，放置在干净的方形培养皿中，加入2mL ECL试剂，充分吹打膜表面，使其充分反映，室温反应2min，在显影机上自动曝光10min。结果显示在10-15kDa有特异性条带，表明ALFPm3在莱茵衣藻中成功表达并分泌到培养基中，结果见图5。

实施例7抗菌肽的应用

本发明所涉及的菌种：包括藻居芽孢杆菌和副溶血弧菌(市购)。培养待测菌株，分别进行抑菌实验。细菌在20mL培养基中培养者至对数中期。

莱茵衣藻表达的抗菌肽ALFPm3在超净工作台上用0.22μm的水系滤膜进行过滤除菌并去除色素。取200μL微生物过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃250rpm培养3h，使OD₆₀₀在0.2-0.3左右。取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照，分别加入氨苄青霉素和50μg的总蛋白，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD₆₀₀的吸光值，分析微生物生长情况。结果见图6，结果显示，莱茵衣藻表达的斑节对虾ALFPm3抗菌肽对藻居芽胞杆菌和副溶血弧菌均具有抑菌效果。

实施例8

本实施例中采用同上述的技术，将斑节对虾ALFPm11的氨基酸序列NO.8，FGLKDLFLPAITDQVKDLWRNGDVDLVDHSCSYSVKPDIQGIELYFIGSVTCPGWTTIRGESNTRSKSGVLNAAIKDFIQKALKAGLVTEEEAKPYLV，与信号肽序列融合表达，经过珠磨法转化，筛选获得可表达ALFPm11的基因工程藻，培养后用其培养液进行抑菌实验，结果显示表达产物可显著抑制副溶血弧菌的生长，效果与阳性对照氨苄青霉素一致，结果见图7。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> S-peptide(S-peptide)

<400> 1

Met Ala Arg Thr Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly

1 5 10 15

Cys Ala Gln Ala

20

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> S-peptide(S-peptide)

<400> 2

atggcgcgta ctggcgctct actcctggtc gcgctggcgc ttgcgggctg cgcgcaggct 60

<210> 3

<211> 98

<212> PRT

<213> ALFPm3(ALFPm3)

<400> 3

Gln Gly Trp Glu Ala Val Ala Ala Ala Val Ala Ser Lys Ile Val Gly

1 5 10 15

Leu Trp Arg Asn Glu Lys Thr Glu Leu Leu Gly His Glu Cys Lys Phe

20 25 30

Thr Val Lys Pro Tyr Leu Lys Arg Phe Gln Val Tyr Tyr Lys Gly Arg

35 40 45

Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr Ala Ile Arg Gly Glu Ala Ser Thr Arg

50 55 60

Ser Gln Ser Gly Val Ala Gly Lys Thr Ala Lys Asp Phe Val Arg Lys

65 70 75 80

Ala Phe Gln Lys Gly Leu Ile Ser Gln Gln Glu Ala Asn Gln Trp Leu

85 90 95

Ser Ser

<210> 4

<211> 297

<212> DNA

<213> ALFPm3(ALFPm3)

<400> 4

caagggtggg aggctgtggc agcggccgtc gccagcaaga tcgtggggtt gtggaggaac 60

gaaaaaactg aacttctcgg ccacgagtgc aagttcaccg tcaagcctta tttgaagaga 120

ttccaggtgt actacaaggg gaggatgtgg tgcccaggct ggacggccat cagaggagaa 180

gccagcacac gcagtcagtc cggggtagct ggaaagacag ccaaagactt cgttcggaaa 240

gctttccaga aaggtctcat ctctcaacag gaggccaacc agtggctcag ctcatag 297

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> S-peptide-ALFPm3(S-peptide-ALFPm3)

<400> 5

atggcgcgta ctggcgctct actcctggtc gcgctggcgc ttgcgggctg cgcgcaggct 60

caagggtggg aggctgtggc agcggccgtc gccagcaaga tcgtggggtt gtggaggaac 120

gaaaaaactg aacttctcgg ccacgagtgc aagttcaccg tcaagcctta tttgaagaga 180

ttccaggtgt actacaaggg gaggatgtgg tgcccaggct ggacggccat cagaggagaa 240

gccagcacac gcagtcagtc cggggtagct ggaaagacag ccaaagactt cgttcggaaa 300

gctttccaga aaggtctcat ctctcaacag gaggccaacc agtggctcag ctcatag 357

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(CAH-F)

<400> 6

gcgtactggc gctctactcc tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(All-R)

<400> 7

ctgctcagcc actggttcgc 20

<210> 8

<211> 98

<212> PRT

<213> ALFPm11(ALFPm11)

<400> 8

Phe Gly Leu Lys Asp Leu Phe Leu Pro Ala Ile Thr Asp Gln Val Lys

1 5 10 15

Asp Leu Trp Arg Asn Gly Asp Val Asp Leu Val Asp His Ser Cys Ser

20 25 30

Tyr Ser Val Lys Pro Asp Ile Gln Gly Ile Glu Leu Tyr Phe Ile Gly

35 40 45

Ser Val Thr Cys Pro Gly Trp Thr Thr Ile Arg Gly Glu Ser Asn Thr

50 55 60

Arg Ser Lys Ser Gly Val Leu Asn Ala Ala Ile Lys Asp Phe Ile Gln

65 70 75 80

Lys Ala Leu Lys Ala Gly Leu Val Thr Glu Glu Glu Ala Lys Pro Tyr

85 90 95

Leu Val

Claims

1.一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤3：对遗传转化子的基因组DNA进行检测，并对抗菌肽的转录活性进行分析，得到能够稳定遗传的转基因藻；步骤 1中所述抗菌肽为抗脂多糖因子；

步骤 1中所述信号肽的氨基酸序列见SEQ ID NO .1，所述信号肽在莱茵衣藻中表达的基因序列见 SEQ ID NO .2；

所述抗脂多糖因子的氨基酸序列见SEQ ID NO .3或SEQ ID NO .8。

2.根据权利要求1所述的一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法，其特征在于：步骤1中构建表达载体涉及的载体包括pH105载体和pSP124载体。

3.根据权利要求1所述的一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法，其特征在于：步骤2中所述转基因受体藻株为细胞壁缺陷型莱茵衣藻。

4.根据权利要求1所述的一种能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法，其特征在于：步骤2中采用珠磨法将表达载体的质粒DNA转化至转基因受体藻株。

5.一种利用权利要求1-4任一所述的能胞外分泌抗菌肽的衣藻的构建方法构建的转基因衣藻在抑制海水微生物的生长中的应用，所述应用表现为对藻居芽胞杆菌和/或副溶血弧菌的抑制作用。