CN110564704B - 百合花青素苷转运LhGST基因的克隆及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种百合花青素苷转运LhGST基因的克隆及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明首先获得百合基因LhGST的克隆，利用同源重组的方法将克隆得到的LhGST基因的CDS区和pCAMBIA3301载体进行重组，再通过农杆菌介导蘸花法侵染拟南芥tt19突变体，并筛选纯合的转基因植株，获得LhGST转化拟南芥的异源互补植株，恢复拟南芥突变体胚轴积累花青素苷的表型；并通过VIGS技术诱导亚洲百合‘Tiny Padhye’花被片内源LhGST基因沉默，证明百合LhGST基因参与花被片中花青素苷转运的功能。利用本发明所述的LhGST基因来培育百合丰富的花色品种，在百合花色分子育种中将会有广阔前景。

Description

百合花青素苷转运LhGST基因的克隆及其应用
技术领域
本发明涉及植物工程技术领域，具体涉及百合花青素苷转运基因LhGST的克隆及其应用。
背景技术
百合(Lilium)是重要的园艺观赏植物之一，其栽培品种多样，色彩丰富，其花色是一种重要的观赏性状。粉色、红色和紫色花被片的呈色物质主要为类黄酮类物质花青素苷(Anthocyanin)，花青素苷广泛存在于植物的花瓣及果实中，是亚洲百合花被片主要的呈色物质[曹雨薇，徐雷锋，杨盼盼，徐华，何国仁，唐玉超，任君芳，明军.百合花青素苷呈色类型中3种R2R3-MYBs基因的差异表达.园艺学报，2019，46(5)：955-963.；孔滢，窦晓莹，包放，郎利新，白锦荣.百合花色机理研究进展.园艺学报，2015，42(9)：1747-1759.；Xu L，Yang P，Feng Y，Xu H，Cao Y，Tang Y，Yuan S，Liu X，Ming J.Spatiotemporal transcriptomeanalysis provides insights into bicolor tepal development in Lilium‘TinyPadhye’.Frontiers in Plant Science，2017，8：398.]
百合花青素苷主要集中在合成途径中结构基因和调控基因的研究上[YamagishiM，Shimoyamada Y，Nakatsuka T，Masuda K.Two R2R3-MYB genes，homologs of PetuniaAN2，regulate anthocyanin biosyntheses in flower tepals，tepal spots and leavesof Asiatic hybrid lily.Plant and Cell Physiology，2010，51：463-474.]。花青素苷在结构基因催化的酶作用下，受三大转录因子R2R3-MYB、bHLH和WD40形成的复合体MBW调控，在细胞质中合成花青素苷，但细胞质中合成的花青素苷在转运体谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases，GST)作用下，转运到液泡中积累，才能呈现颜色[Lai Y S，Shimoyamada Y，Nakayama M，Yamagishi M.Pigment accumulation and transcriptionof LhMYB12 and anthocyanin biosynthesis genes during flower development inthe Asiatic hybrid lily(Lilium spp.).Plant Science，2012，193：136-147.；王璐，戴思兰，金雪花，黄河，洪艳.植物花青素苷转运机制的研究进展.生物工程学报，2014，30(6)：848–863；Yamagishi M，Yoshida Y，Nakayama M.2012.The transcription factorLhMYB12 determines anthocyanin pigmentation in the tepals of Asiatic hybridlilies(Lilium spp.)and regulates pigment quantity.Molecular Breeding，30：913-925.]。因此花青素苷转运对其花色积累和呈色具有重要作用[庄维兵，刘天宇，束晓春，渠慎春，翟恒华，王涛，张凤娇，王忠.植物生理学报.2018，54(11)：1630-1644.]。在百合中，由谷胱甘肽S-转移酶介导的花青素苷转运和积累呈色，推测LhGST参与百合花青素苷从细胞质转运到液泡的过程。从百合中分离花青素苷转运基因并阐明其功能，是研究百合花被片呈色机理的关键环节，必将为开展百合花色调控和花色分子育种奠定理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种百合花青素苷转运LhGST基因。
本发明还提供了上述基因的克隆方法，利用上述基因构建的植物表达载体。
本发明还提供了上述基因的沉默方法。
本发明还提供了上述基因的用途。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
百合花被片LhGST基因蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
编码上述蛋白的百合花被片LhGST基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
编码上述蛋白的百合花被片LhGST基因，全基因序列如SEQ ID NO.2。
上述基因的克隆方法，包括以下步骤：
(1)提取百合花被片RNA，反转录获得cDNA；
(2)根据转录组数据设计引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得CDS序列，扩增CDS序列引物如下：
5’端引物：5’-CCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’
3’端引物：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’
扩增出来的5’端和3’端序列经测序验证后与转录组序列对比，最终获得LhGST基因全长709bp的cDNA序列，如SEQ ID NO.1所示；
(3)根据获得的LhGST基因的CDS序列，设计了扩增DNA序列的引物，引物如下：
5’端引物：5’-ATGACACAAATGAAGACGGT-3’
3’端引物：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’
该基因的DNA序列全长为959bp，由3个外显子和2个内含子构成，如SEQ ID NO.2所示。
一种重组载体，其特征是含有上述克隆LhGST基因的cDNA序列。
所述重组载体命名为pCAMBIA3301-LhGST，其骨架载体为pCAMBIA3301。
上述重组载体的构建方法，为根据获得的LhGST基因的CDS序列，设计在5’端和3’端引物分别加上16-25bp的接头序列，引物如下：
5’端引物：5’-CACGGGGGACTCTTGACCATGGCCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’
3’端引物：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’
通过PCR扩增，获得带接头的CDS序列，利用同源重组的方法，将Nco I和BstE II双酶切载体pCAMBIA3301获得的线性载体片段与带接头的CDS序列进行重组，最终获得重组载体。
百合花被片LhGST基因沉默的方法，通过同源重组，将带有接头的LhGST基因167bp-487bp目的片段与被酶切后TRV2线性载体连接，得到TRV2-LhGST载体；将构建好TRV2-LhGST载体转入农杆菌GV3101中，利用真空渗透法侵染百合花枝；培养7天后观察，被沉默花枝的花被片基部未观察到花青素苷斑点。
百合花被片LhGST基因在百合花色分子育种中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的百合LhGST基因是百合植株中未知的，参与百合花被片花青素苷转运。本发明成功克隆了LhGST基因，提供了该基因的核苷酸序列和编码蛋白质氨基酸序列，为百合花色分子育种的种质创制提供理论基础和应用参考价值。
附图说明
图1为LhGST基因CDS区扩增电泳图。M：DNA Marker，泳道1为LhGST基因CDS区PCR扩增片段；
图2为LhGST基因DNA全长扩增电泳图。M：DNA Marker，泳道1为LhGST基因DNA全长PCR扩增片段；
图3为LhGST与其他GSTs蛋白氨基酸序列对比图；
图4为LhGST与其他GSTs系统进化树分析图；
图5为LhGST表达载体pCAMBIA3301-LhGST构建示意图；
图6为LhGST表达载体pCAMBIA3301-LhGST的PCR检测图。M：DNA Marker，泳道1-2为pCAMBIA3301重组表达载体，泳道3为ddH2O；
图7为T3代转基因拟南芥表型及分子检测图。A：目的基因分子PCR检测，B：拟南芥T3代植株表型检测，C：拟南芥T3代种子表型检测，D：拟南芥植株胚轴总花青素苷含量；Col-0：拟南芥哥伦比亚野生型，tt19：拟南芥tt19突变体，L1-L2：野生型转基因植株，L3-L4：突变体转基因植株，*代表该株系与拟南芥tt19突变体花青素苷含量在统计学上具有显著差异，**代表该株系与拟南芥tt19突变体花青素苷含量在统计学上具有极显著差异。
图8为TRV2-LhGST诱导百合花被片LhGST基因沉默图。A：表型检测。B：RT-PCR检测烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)。C：侵染百合花被片总花青素苷含量检测。D：侵染百合花被片LhGST基因表达量检测。
具体实施方式
为了详细阐释本发明过程、发明专利用途，下述内容结合图表对发明实施例进行进一步阐述。应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明研究材料百合‘TinyPadhye’为中国农业科学院蔬菜花卉研究所玻璃温室种植，可以对公众发放。实验中所涉及试剂，RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、氨苄青霉素钠盐(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、无RNA酶水、β-半乳糖苷酶(X-GAL)、IPTG购自天根生化科技(北京)有限公司，头孢霉素(Cefalothin)、利福平(Rifampicin)购自Bio-topped，TransScript IIOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒、
Figure GDA0002227505270000041
Cloning Kit克隆试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，预混热启动高保真酶KAPAHiFi HotStart ReadyMix购自KAPA，Ncol I、BstE II购自Thermo(热电)。Silwet L-77购自Phytotechnology，Basta除草剂购自Coolaber。Xba I，Xma I购自NEB。TRV2载体、TRV2载体为市售。引物合成、测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1 LhGST基因的克隆
1、百合总RNA的提取(试剂盒法)
取百合花被片上下部位，利用天根生化科技(北京)有限公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取植物总RNA。
(1)取0.2g百合花被片在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μL SL，立即涡旋剧烈震荡混匀。
(2)12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
(3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(5)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(6)向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I(DNase I工作液的配制：取10μL DNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀)工作液，室温放置15min。
(7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(9)重复步骤8。
(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl无RNA酶水，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到百合RNA溶液，保存-80℃备用。
2、反转录
采用北京全式金生物技术有限公司
Figure GDA0002227505270000053
II One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(第一链cDNA合成和gDNA去除)
(1)加入
Figure GDA0002227505270000051
(2)轻轻混匀：产物用于PCR：50℃孵育30分钟。
(3)85℃加热5秒钟失活
Figure GDA0002227505270000054
II RT/RI与gDNA去除试剂。
3、利用预混热启动高保真酶进行PCR扩增
根据转录组数据用Primer Premier 6.0设计LhGST基因cDNA序列引物，GST-F/R，正向引物序列为：5’-CCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’，反向引物序列为：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，以百合‘TinyPadhye’内被片cDNA为模板进行扩增。
(1)加入
Figure GDA0002227505270000052
Figure GDA0002227505270000061
(2)95℃预变性3min；98℃加热变性20sec，61℃退火15sec，72℃延伸60sec，35个循环；72℃充分延伸2min。
(3)将获得的PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果显示PCR产物在700bp左右，如图1。利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行扩增产物片段回收。纯化后的产物于pEASY-Blunt载体(市售)连接，转化大肠杆菌，进行PCR检测，送测序公司测序，结果显示该基因的cDNA为709bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1，通过NCBI预测开放阅读框(ORF)为684bp，编码227个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，理论分子量为25.78kD，理论等电点为5.36。
(4)通过DNAMAN软件将扩增得到LhGST的cDNA序列编码的227个氨基酸与其他GSTs蛋白氨基酸序列对比，LhGST氨基酸与其它转运花青素苷的GSTs蛋白氨基酸序列同源性为51.54％-52.86％，N-端具有还原谷胱甘肽GSH结合位点，C-端为φ家族GST的α-螺旋结构域(图3)。
(5)将LhGST氨基酸与其他GSTs蛋白氨基酸序列对比，通过MEGA 7.0软件构建系统发育树，可得LhGST氨基酸与花青素苷转运相关GSTs蛋白氨基酸聚类在一起，同源性高，聚类在φ(phi,F)家族中，属于φ家族GST蛋白。如图4所示，黑色方框代表花青素苷转运相关GSTs蛋白氨基酸。
4、DNA的提取
(1)称取0.2g幼嫩的百合‘TinyPadhye’叶片于液氮中冷冻研磨。
(2)迅速加入含500μL 65℃预热的CTAB裂解液(用前加入2％巯基乙醇)，混匀后置于65℃温浴60min，其间每隔15min混匀，以使裂解充分。
(3)室温冷却后，加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V＝1:1)，颠倒混匀后静置5min，12000rpm室温离心10min。
(4)小心吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V＝1:1)，颠倒混匀，12000rpm室温离心10min。
(5)吸取上清入新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇，可能会有絮状沉淀，颠倒混匀后置于-20℃沉淀30-60min。
(6)12000rpm离心10min，弃上清。
(7)加入1mL 70％乙醇洗涤2次。
(8)将离心管置于室温晾干15min。
(9)加入60μL的ddH2O，放置4℃溶解1h，-20℃保存备用。
5、LhGST全长基因序列的克隆
根据已经获得的LhGST基因的cDNA序列，通过NCBI的ORFfinder在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框。根据CDS序列(SEQ IDNo.1)设计引物GST-DNA-F/R，上游引物为：5’-ATGACACAAATGAAGACGGT-3’，下游引物为：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，以提取的DNA为模板，PCR扩增LhGST基因DNA全长。
(1)PCR体系
Figure GDA0002227505270000071
(2)95℃预变性3min；98℃加热变性20sec，61℃退火15sec，72℃延伸60sec，35个循环；72℃充分延伸2min。
(3)将获得的PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图2，PCR产物在950bp左右。利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行扩增产物片段回收。纯化后的产物于pEASY-Blunt载体(市售)连接，转化大肠杆菌，进行PCR检测，送测序公司测序，结果显示该基因的DNA序列为959bp，基因序列见SEQ ID NO.2，与LhGST编码区序列对比得知，DNA序列由3个外显子和2个内含子构成。
实施例2 LhGST重组表达载体构建
1、根据已经获得的LhGST基因的CDS序列，设计接头引物，以提取的cDNA为模板，PCR扩增基因全长序列，上游引物GSTjietou-F为：5’-CACGGGGGACTCTTGACCATGGCCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’；下游引物GSTjietou-R为：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’。
(1)目的片段LhGST基因加接头
Figure GDA0002227505270000072
Figure GDA0002227505270000081
(2)95℃预变性3min；98℃加热变性20sec，74℃退火15sec，72℃延伸60sec，35个循环；72℃充分延伸2min。
(3)利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对切割后两端加接头的LhGST序列进行回收，回收产物保存于-20℃。
2、pCAMBIA3301载体酶切
表达载体如图5，用限制性内切酶Ncol I、BstE II进行双酶切，轻轻混匀后，在BIO-RAD T100上进行37℃反应15min后，65℃反应15min进行双酶切。1％琼脂糖凝胶检测双酶切载体片段，利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对切割后的载体线性片段进行回收。
Figure GDA0002227505270000082
3、利用同源重组的方法构建重组载体
将线性载体片段和加接头LhGST序列进行重组，同源重组反应程序为50℃处理30min，重组载体的PCR反应产物保存于-20℃。
Figure GDA0002227505270000083
设计检测引物，上游引物pCAMBIA3301-insert-yz-F为：5’-CATTTGGAGAGAACACGGGG-3’；下游引物pCAMBIA3301-insert-yz-R为：5’-CGGCAACAGGATTCAATCT-3’，以重组载体pCAMBIA3301-LhGST(见图5)菌液为模板进行扩增，检测结果见图6，检测引物中间片段(目的片段+引物间载体序列)为900bp左右，将检测正确的重组载体大肠杆菌菌液，按1：1比例加入50％甘油，保存于-80℃备用。用高纯度质粒小提试剂盒提取菌液中pCAMBIA3301-LhGST重组载体质粒，通过冻融法转入到农杆菌感受态GV3101中，涂布含有利福平(25mg/L)和卡那霉素(50mg/L)YEB培养基平板上，28℃倒置培养36-50h，挑取单克隆于含有利福平(25mg/L)和卡那霉素(50mg/L)YEB液体培养基中，28℃震荡培养24-48h，200rpm进行扩繁。
以重组载体pCAMBIA3301-LhGST菌液为模板进行扩增，上游引物pCAMBIA3301-insert-yz-F为：5’-CATTTGGAGAGAACACGGGG-3’；下游引物pCAMBIA3301-insert-yz-R为：5’-CGGCAACAGGATTCAATCT-3’，检测结果见图6，检测引物中间片段(目的片段+引物间载体序列)为900bp左右，说明农杆菌菌株中重组载体pCAMBIA3301-LhGST构建成功。
实施例3 LhGST基因的互补功能鉴定
1、将鉴定正确的重组载体的农杆菌，加入50％甘油，保存于-80℃。取重组载体的农杆菌涂布在含利福平(25mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB平板培养基上，挑取单克隆于含利福平(25mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中进行活化，按菌液：LB液体培养基＝1：100(V/V)的比例，28℃条件下，200rpm震荡扩繁2d，至菌液OD600值＝0.8-1.2，侵染活力最佳。
2、取菌液7000rpm离心5min，配置2×重悬缓冲液Buffer(10％蔗糖溶液：0.1％转化Buffer-Sliwet L-77)，1/2体积的无菌水悬浮农杆菌菌株，转化时再加入1/2体积的2×重悬缓冲液Buffer重悬。
3、侵染时用滴管吸取菌液滴在野生型(col.)拟南芥(胚轴有花青素苷积累着色，如图7中B中col-0)和突变体tt19(拟南芥转运花青素苷GST基因突变，缺失转运花青素苷功能，胚轴无花青素苷积累，如图7中B中tt19-1)的花蕾上，侵染后使被侵染的植株置于避光保湿环境中16-24h。避光后，于正常环境20-22℃中培养，直至种子成熟。
4、转化植株收的种子先干燥1周，4℃春化(打破休眠)处理2-4天后，用75％乙醇消毒5min，无菌水清洗3-5次，在含草铵膦抗性(Basta)的1/2MS平板上进行筛选。直至收获T3代种子，通过表型观察和分子水平鉴定。
实验结果：PCR检测阳性转基因植株(图7中A)发现，突变体转基因植株胚轴和子叶处积累花青素苷(如图7中B中L3-L4)，于野生型(如图7中B中col-0)和野生型转基因植物(如图7中B中L1-L2)表型一致，LhGST基因互补了突变体tt19(缺失转运花青素苷GST基因，如图7中B中tt19-1))转运花青素苷的功能，但突变体转基因植株的种皮没有变化(如图7中C)，可能是由于种皮为原花青素苷积累呈色，而非花青素苷；从图7中D中可以看出，突变体转基因植株花青素苷含量显著高于突变体tt19植株，接近正常野生型拟南芥植株的含量，由此得出，百合LhGST基因具有花青素苷转运的功能。
实施例4 VIGS诱导百合花被片LhGST基因沉默
1、TRV载体构建
(1)设计扩增321bp长度大小的目的片段(LhGST开放阅读框中167bp-487bp的目的片段，因为插入300-400bp目的片段的TRV诱导的基因沉默效果最好)带接头引物，分别在相应酶切位点两端15-25bp大小的载体上序列，上游引物为：5’-TTCTGTGAGTAAGGTTACCGGGCAAGTCCCCTACATCGAG-3’，下游引物为：5’-CCCATGGAGGCCTTCTAGAGCCGCCAGGTACTTGGTCTTT-3’。
(2)以百合花被片cDNA为模板，以上述引物扩增目的序列，目的序列胶回收备用。
(3)TRV2载体质粒采用限制性内切酶EcoR I酶切后胶回收备用。
Figure GDA0002227505270000101
(4)同源重组的方法连接目的片段和载体酶切序列。
Figure GDA0002227505270000102
(5)将构建好的TRV2-LhGST，TRV2载体的连接产物通过热激法转入大肠杆菌DH5α感受态中，PCR和测序检测插入目的片段是否正确，PCR检测上游引物为：5’-TAGATAATGGTTTGGTGGTC-3’，下游引物为：5’-TAGTTTAATGTCTTCGGGAC-3’。
(6)检测正确的阳性菌液提取质粒通过冻融法转入到GV3101农杆菌感受态中。
(7)挑取单菌落到含有卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基中，28℃，200rpm振荡培养12h，菌液PCR检测阳性克隆，PCR检测上游引物为：5’-TAGATAATGGTTTGGTGGTC-3’，下游引物为：5’-TAGTTTAATGTCTTCGGGAC-3’，PCR反应体系为：
Figure GDA0002227505270000111
2、VIGS介导农杆菌侵染
(1)接种前2天，将含有不同质粒的农杆菌GV3101接种于LB液体培养基(含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)中，28℃，200rpm振荡过夜。
(2)按菌液：YEB＝1:50/1:100比例，将培养物加入至YEB(LB)液体培养基(含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)中，过夜扩增至OD值在0.4-1.5之间。
(3)取45ml培养好的菌液转移至50ml无菌离心管中，4000rpm离心8分钟。
(4)弃上清，加入新鲜配置的MMA悬浮液悬浮，MMA悬浮液中加入乙酰丁香酮AS至终浓度200μM/L，2-(N-吗啉)乙磺酸Mes缓冲液10mM/L，至各菌液OD600＝0.8-1.0，室温避光静置1-6h。
(5)接种前将含有TRV1和TRV2载体的农杆菌按照1:1混合。
(6)花枝材料含花苞的花枝浸没花梗真空渗透1min，压力维持0.05MP。真空渗透后，清水清洗基部枝条，将花枝插到新的蒸馏水中，暗培养24h后，放到人工气候箱，20℃培养。
实验结果：培养7天后，以MMA为缓冲液Buffer的阴性对照花被片和以Empty TRV为阳性对照的花被片均开始显色，而插入沉默基因的TRV2-LhGST的花被片未见有花青素苷呈色，说明百合中LhGST基因被沉默(图8中A)。对侵染的花被片提取RNA进行TRV病毒检测发现，阴性对照无TRV病毒，在阳性对照和沉默LhGST花被片检测到TRV病毒，说明阳性对照和沉默LhGST的花被片成功感染TRV病毒，实验体系可实施(图8中B)。通过对侵染的花被片的花青素苷和LhGST基因相对表达量检测，发现被沉默的LhGST花被片花青素苷和基因表达量明显低于阳性对照和阴性对照(图8中C，D)，从以上实验结果中可以得出结论，百合LhGST基因具有转运花青素苷的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和补充完善，这些改进和补充完善也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 百合花青素苷转运LhGST基因的克隆及其应用
<141> 2019-08-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 709
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagggcggc ggaatgacac aaatgaagac ggtgaagatc tacggagtcc ccatggccgt 60
ctgtccccaa agggtcatgc tctgccttgt cgagaaggcg gtacccttcg agatcatcta 120
tgtcgacctt gacaagatgg agcaaaagga gcccaaatac atggccaaac agccgtttgg 180
gcaagtcccc tacatcgagg acggagattt cggactctat gaatccaggg ccatcataag 240
atattatgcc gccaagtaca ctgaccaagg tcctgacctc ctgggaggga ctctggaaga 300
gcgtgcccgt gtggatcagt ggctcgacat agaagccatg aactacaacc ccgtcgtatt 360
ccccattgtc ctcaaccttt tcatcatccc aaagatgggt ggtgttggca atcgtgccga 420
agccgagtct tttgttgaga agctcgggaa agtgctcgac gtcctgaacg agcagctggc 480
aaagaccaag tacctggcgg gggacaagta tactctagcc gacattacat tcattccggc 540
cacccagtac cttgtagagt tctgcgggat ggcacacctg attgacgaga ggaagcacgt 600
gaaggtctgg tgggacgaca taaccggccg gccggcgtgg aagacggtgc tcagcattgc 660
tgaggtcaag ggattaagct acttgccttc agcttgaggt aggttgcga 709
<210> 2
<211> 959
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacacaaa tgaagacggt gaagatctac ggagtcccca tggccgtctg tccccaaagg 60
gtcatgctct gccttgtcga gaaggcggta cccttcgaga tcatctatgt cgaccttgac 120
aagatggagc aaaaggagcc caaatacatg gccaaacagg tatgtgttat cacactcgct 180
actctataga ctactggctg attgctaaca tctcttgtgt gtcttcgcca gccgtttggg 240
caagtcccct acatcgagga cggagatttc ggactctatg gtaagtcact attccatcaa 300
tctcagagcc tcccctaaat tggttttgaa tttacccgaa tgttgaataa taaatgtgtc 360
cccatttgtc atctccgtat gaacaactgt cattctttgt aagagactca tttcagctat 420
actcatttta ttaatgtgta atacttacaa agtttatgtt gtcccaacta gaatccaggg 480
ccatcataag atattatgcc gccaagtaca ctgaccaagg tcctgacctc ctgggaggga 540
ctctggaaga gcgtgcccgt gtggatcagt ggctcgacat agaagccatg aactacaacc 600
ccgtcgtatt ccccattgtc ctcaaccttt tcatcatccc aaagatgggt ggtgttggca 660
atcgtgccga agccgagtct tttgttgaga agctcgggaa agtgctcgac gtcctgaacg 720
agcagctggc aaagaccaag tacctggcgg gggacaagta tactctagcc gacattacat 780
tcattccggc cacccagtac cttgtagagt tctgcgggat ggcacacctg attgacgaga 840
ggaagcacgt gaaggtctgg tgggacgaca taaccggccg gccggcgtgg aagacggtgc 900
tcagcattgc tgaggtcaag ggattaagct acttgccttc agcttgaggt aggttgcga 959
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Thr Gln Met Lys Thr Val Lys Ile Tyr Gly Val Pro Met Ala Val
1 5 10 15
Cys Pro Gln Arg Val Met Leu Cys Leu Val Glu Lys Ala Val Pro Phe
20 25 30
Glu Ile Ile Tyr Val Asp Leu Asp Lys Met Glu Gln Lys Glu Pro Lys
35 40 45
Tyr Met Ala Lys Gln Pro Phe Gly Gln Val Pro Tyr Ile Glu Asp Gly
50 55 60
Asp Phe Gly Leu Tyr Glu Ser Arg Ala Ile Ile Arg Tyr Tyr Ala Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Thr Asp Gln Gly Pro Asp Leu Leu Gly Gly Thr Leu Glu Glu
85 90 95
Arg Ala Arg Val Asp Gln Trp Leu Asp Ile Glu Ala Met Asn Tyr Asn
100 105 110
Pro Val Val Phe Pro Ile Val Leu Asn Leu Phe Ile Ile Pro Lys Met
115 120 125
Gly Gly Val Gly Asn Arg Ala Glu Ala Glu Ser Phe Val Glu Lys Leu
130 135 140
Gly Lys Val Leu Asp Val Leu Asn Glu Gln Leu Ala Lys Thr Lys Tyr
145 150 155 160
Leu Ala Gly Asp Lys Tyr Thr Leu Ala Asp Ile Thr Phe Ile Pro Ala
165 170 175
Thr Gln Tyr Leu Val Glu Phe Cys Gly Met Ala His Leu Ile Asp Glu
180 185 190
Arg Lys His Val Lys Val Trp Trp Asp Asp Ile Thr Gly Arg Pro Ala
195 200 205
Trp Lys Thr Val Leu Ser Ile Ala Glu Val Lys Gly Leu Ser Tyr Leu
210 215 220
Pro Ser Ala
225

Claims (9)

1.百合花被片LhGST蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的百合花被片LhGST基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.编码权利要求1所述蛋白的百合花被片LhGST基因，其全基因序列如SEQ ID NO.2。
4.权利要求3所述的百合花被片LhGST基因的克隆方法，包括以下步骤：
(1)提取百合花被片RNA，反转录获得cDNA；
(2)根据转录组数据设计引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得CDS序列，扩增CDS序列引物如下：
5’端引物：5’-CCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’，
3’端引物：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，
扩增出来的5’端和3’端序列经测序验证后与转录组序列对比，最终获得LhGST基因全长709bp的cDNA序列，如SEQ ID NO.1所示；
(3)根据获得的LhGST基因的CDS序列，设计了扩增DNA序列的引物，引物如下：
5’端引物：5’-ATGACACAAATGAAGACGGT-3’，
3’端引物：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，
该基因的DNA序列全长为959bp，由3个外显子和2个内含子构成，如SEQ ID NO.2所示。
5.一种重组载体，其特征是含有权利要求2所述的百合花被片LhGST基因的cDNA序列。
6.根据权利要求5所述重组载体，命名为pCAMBIA3301-LhGST，其骨架载体为pCAMBIA3301。
7.根据权利要求6所述的重组载体的构建方法，为根据获得如SEQ ID NO.1所示的LhGST基因的CDS序列，设计在5’端和3’端引物分别加上16-25bp的接头序列，引物如下：
5’端引物：5’-CACGGGGGACTCTTGACCATGGCCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’，
3’端引物：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，
通过PCR扩增，获得带接头的CDS序列，利用同源重组的方法，将Nco I和BstE II双酶切载体pCAMBIA3301获得的线性载体片段与带接头的CDS序列进行重组，最终获得重组载体。
8.权利要求2所述的百合花被片LhGST基因沉默的方法，通过同源重组，将带有接头的SEQ ID NO.1所示的LhGST基因中167bp-487bp目的片段与被酶切后TRV2线性载体连接，得到TRV2-LhGST载体；将构建好TRV2-LhGST载体转入农杆菌GV3101中，利用真空渗透法侵染百合花枝；培养7天后观察，被沉默花枝的花被片基部未观察到花青素苷斑点。
9.权利要求2所述的百合花被片LhGST基因在百合花色分子育种中的应用。
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