CN108004239A - 一种高效表达蛋白酶的新型启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达蛋白酶的新型启动子，新型启动子来源于一种地衣芽孢杆菌基因组，通过蛋白电泳及质谱检测方法获得。在新型启动子pChi调控转录下，两种不同来源的碱性蛋白酶(克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶与地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶)表达活性达到8000U/mL和3500U/mL，比两种已知强组成型启动子pShuttle‑09和pyxiE的表达活性分别提高了125％和200％。从而为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达奠定基础，并推动蛋白酶的高效表达及工业化。

Description

一种高效表达蛋白酶的新型启动子

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及芽孢杆菌启动子序列及其应用。

背景技术

蛋白酶是一类能够催化水解肽键的酶，作为最重要的工业酶之一，在食品、环境、造纸、化工以及医药等各类领域中具有重要的应用价值。蛋白酶主导全球工业酶市场，占据全球销售总额的65％以上，其中微生物产蛋白酶占据世界工业酶总量的40％。蛋白酶来源十分广泛，主要存在于动物、植物及微生物中，相比于动、植物来源的蛋白酶，微生物蛋白酶不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，而且由于大多数为胞外酶，还具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、产量高、菌体易于培养、高产菌株选育简单、快速、适于大规模工业化生产等优点。由于蛋白酶的广泛用途以及产酶效率不高等原因，一直以来市场都处于供不应求的现状，因此通过生物技术手段提高蛋白酶的产量具有十分重要的研究价值和意义。

枯草芽孢杆菌作为一种重要的工业微生物，其遗传学和生理学已得到深入研究，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌。枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目：(一)无致病性、安全；(二)无明显的密码子偏嗜性；(三)可直接将表达蛋白分泌到培养基中(目前，大约60％的市售酶由芽孢杆菌表达生产)，表达产物可溶，表达产物与胞内蛋白分离，无需破碎细胞，有利于分离纯化；(四)对枯草芽孢杆菌的转录、翻译、蛋白质折叠、分泌等机制背景清楚，有利于遗传操作和大规模发酵。本发明所选用的宿主菌为胞外蛋白酶活性较低的枯草芽孢杆菌WB600。

启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性，这是基因表达的最关键阶段。启动子决定了基因的表达程度和表达时间，是基因表达最重要的调控元件。因此，筛选获取强启动子介导蛋白酶基因的表达是提高蛋白酶产量非常有效的方法。

目前，国内外由基因组中筛选获取新型启动子的方法主要为广谱启动子筛选技术，即对基因组使用限制性内切酶切割后，通过琼脂糖凝胶电泳回收300bp-500bp的DNA片段，然后连接到提前构建好的基因表达载体上，通过检测报告基因的表达强度从而筛选获得新型的强启动子。

发明内容

本发明的第一个目的是，提供一种来源于地衣芽孢杆菌基因组的高效新型启动子。

本发明的第二个目的是提供一种新的芽孢杆菌启动子筛选方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述新型启动子的质粒载体。

本发明的第四个目的是提供该启动子在枯草芽抱杆菌WB600中高效表达两种不同来源的蛋白酶的方法。

本发明的第五个目的是提供含有该启动子及所述表达载体的基因工程菌。

本发明的第六个目的是对该新型启动子进行结构分析，说明其表达活性高于另外两个强启动子的原因。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的有益效果：

本发明采用蛋白电泳及质谱检测的方法，由地衣芽孢杆菌基因组中筛选获得一种新型强组成型启动子。该新型启动子可以在枯草芽抱杆菌WB600中高效表达两种来源不同的蛋白酶基因。新型启动子的启动强度是pShuttle-09的1.25倍，pyxiE的2倍。本发明的新型启动子，用于提高其它外源蛋白基因在枯草芽抱杆菌中的表达也具有较好的效果。

本发明通过蛋白电泳及质谱检测的方法进行启动子筛选，获得的新型启动子pChi对两种不同来源的碱性蛋白酶(克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶与地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶)表达活性分别达到8000U/mL和3500U/mL，比两种已知强组成型启动子pShuttle-09和pyxiE的表达活性分别提高了125％和200％。

附图说明

图1：重组表达载体的构建过程；

图2：重组载体各片段回收验证；其中，M：核酸分子量标准；1：pChi-dBli0338；2：pShuttle-09-dBli0338；3：pyxiE-dBli0338；4：alk；5：apr；6：pUBA110；

图3：三种启动子对alk基因的表达活性；

图4：三种启动子对apr基因的表达活性；

图5：启动子pChi结构；

图6：启动子pShuttle-09结构；

图7：启动子pyxiE结构。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

本发明对该地衣芽孢杆菌在三角瓶中发酵培养，每隔8h进行取样，离心收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，切取最亮的条带进行蛋白质谱检测；

对蛋白质谱结果进行分析，通过NCBI数据库获得该胞外表达量最高的酶的结构基因序列，并通过在线分析软件Promoter2.0PredictionServer预测其启动子，设计PCR引物；

提取该地衣芽孢杆菌基因组，并以此为模板PCR扩增启动子；

使用枯草芽孢杆菌表达载体pUBA110，分别以三种启动子pChi，pShuttle-09和pyxiE为表达调控元件，构建蛋白酶基因表达载体；

将构建好的重组表达载体转化进入枯草芽孢杆菌WB600，获得重组基因工程菌，并发酵检测其酶活性；

通过在线软件BPROM对该启动子进行结构分析，与启动子pShuttle-09和pyxiE进行结构对比，分析表达活性提高的原因。

培养基和酶活测定方法

种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

SP-A Salts Solution：(NH₄)₂SO₄4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 28g/L，KH₂PO₄ 12g/L，Trisodium Citrate Dihydrate 2g/L；

SP-B Salts Solution：MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；

100×CAYE Solution：Casamino acid 20g/L，Yeast Extract 100g/L；

SPI Medium(200mL)：SP-A Salts Solution 98mL，SP-B Salts Solution 98mL，50％ Glucose 2mL，100×CAYE 2mL；

SPII Medium(600mL)：SPI Medium 588mL，50mmol/L CaCl₂ 6mL，250mmol/L MgCl₂6mL；

100×EGTA Solution：10mmol/L EGTA溶液。

本发明所用碱性蛋白酶酶活测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

实施例1

地衣芽孢杆菌启动子筛选

接种地衣芽孢杆菌11965(天津科技大学应用微生物与酶工程研究室菌种保藏库)于无抗LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落于种子培养基中，220rpm过夜培养，按2％接种量分别接种于100mL发酵培养基，37℃，220rpm振荡培养，每隔8h进行取样，离心收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，切取最亮的条带进行蛋白质谱检测。

实施例2

地衣芽孢杆菌基因组提取

⑴收集过夜培养于LB培养基中的菌液，13000rpm离心3min，弃上清，重悬菌体于200μL无菌水中；

⑵加15μL(50mg/mL)溶菌酶，37℃水浴1h；

⑶加20μL蛋白酶K和60μL 10％ SDS，65℃水浴2-3h至澄清；

⑷加等体积的酚仿，振荡混匀，12000rpm离心5min，取上清；

⑸加等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min，取上清；

⑹加60％-80％的异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃放置5min，12000rpm离心5min，弃上清；

⑺加500μL70％的乙醇洗两次，12000rpm离心2min，弃上清，晾干5-10min；

⑻加50μL无菌水溶解获得的基因组。

实施例3

启动子及信号肽片段、两种蛋白酶基因的克隆

由蛋白质谱检测结果可知，该酶为地衣芽孢杆菌几丁质酶(Chitinase)，由NCBI数据库获得该酶全基因组序列，并通过在线分析软件Promoter 2.0Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测该酶基因的启动子和信号肽序列。通过引物pChi-F和SP-R，以该地衣芽孢杆菌基因组为模板，获得大小为399bp的启动子–信号肽片段。

启动子pShuttle-09和pyxiE分别通过引物pS-F/pS-R和pY-F/pY-R(表1)经PCR扩增获得，并与引物SP-F/SP-R扩增得到的信号肽dBli00338片段通过重叠PCR技术进行连接，获得大小分别为314bp的pShuttle09-dBli00338和248bp的pyxiE-dBli00338 DNA片段。

两种蛋白酶基因分别为克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk(GenBank SequenceID:FJ940727.1)和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apr(GenBank Sequence ID:AY590140.1)。根据编码基因序列，运用在线分析软件SignalP 4.1Server分析得到两种蛋白酶基因的成熟肽序列(大小分别为1062bp和1053bp)，并使用引物alk-F/alk-R和apr-F/apr-R通过PCR扩增获得。

表1本发明中用到的引物

实施例4

重组表达载体的构建

PCR产物切胶回收后获得的启动子–信号肽片段与两种蛋白酶基因成熟肽片段分别使用BamH Ⅰ酶切后连接，连接产物纯化后使用Sac Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切并切胶回收，通过连接酶克隆到pUBA110表达载体上，连接产物通过如下方法转入枯草芽孢杆菌WB600细胞中：

(1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm，过夜培养；

(2)取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220rpm培养至对数生长末期OD₆₀₀＝1.2(约3–4h)；

(3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100rpm培养1.5h；

(4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL 10mmol/L EGTA，37℃，100rpm培养10min；

(5)加入连接产物，37℃，100rpm培养30min；

(6)调节转速至220rpm，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

重组蛋白酶表达载体pCalk110，pCapr110，pSalk110，pSapr110，pYalk110，pYapr110以及所对应的重组基因工程菌pCalk110/WB600，pCapr110/WB600，pSalk110/WB600，pSapr110/WB600，pYalk110/WB600，pYapr110/WB600构建成功。

实施例5

重组蛋白酶基因工程菌的表达及分析

将新鲜平板上的6株重组基因工程菌的单菌落分别接入50mL卡那霉素抗性种子培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h，以相同的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵培养，每隔6h收集发酵液，4℃、12000rpm离心取上清。

分别取六株重组基因工程菌48h的发酵上清液，经超滤柱浓缩后进行蛋白电泳检测，结果表明在三种启动子的调控下，两种碱性蛋白酶基因均成功表达。

测定不同时间发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，发酵培养48h时，各重组菌发酵上清液中碱性蛋白酶活性达到最高。此时，三种启动子pChi、pShuttle-09、pyxiE表达克劳氏碱性蛋白酶的活性分别为8000U/mL、7000U/mL、5200U/mL，表达地衣碱性蛋白酶的活性分别为3500U/mL、2600U/mL、1500U/mL，说明pChi的启动强度明显高于pShuttle-09和pyxiE，即pShuttle-09的1.25倍，pyxiE的2倍。

实施例6

三种启动子结果分析及对比

通过在线分析软件BPROM对启动子进行结构预测和分析。pChi、pShuttle-09、pyxiE三种启动子的保守序列均被σ_A因子识别，pChi和pShuttle-09两保守区之间间隔为16bp和18bp，但pyxiE为20bp，这可能是造成pyxiE的启动活性远低于其它两种启动子的主要原因。而pChi和pShuttle-09中SD与起始密码子分别相距8bp、4bp，这可能是pChi表达活性高于pShuttle-09的原因之一。

序列表

1、启动子pChi核苷酸序列

2、启动子pShuttle-09核苷酸序列

3、启动子pyxiE核苷酸序列

4、本发明所用信号肽dBli0338核苷酸序列

5、表达载体pUBA110核苷酸序列

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种高效表达蛋白酶的新型启动子

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

tccccgcgga aatttgtcat aacaaattta tgcattc 37

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gtgttgatca acaaaagcaa aaag 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

cgggatccat cggcttttgc aacttccc 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

tccccgcggg tcacaatgcg ccatcaaac 29

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ctttttgctt ttgttgatca acacgtttcc tctctcccct ctaatcg 47

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

tccccgcggc aactggtatc agcaggttat cg 32

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

ctttttgctt ttgttgatca acacgctctt cccgcctttc ggact 45

<210> 8

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<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

cgggatccgc tgaagaagca aaagaaaaat atttaat 37

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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ccgctcgagt attgattagc gtgttgccgc 30

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<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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cgggatccgc tcaaccggcg aaaaatg 27

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<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

ccgctcgagg ttattgagcg gcagcttcg 29

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<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

atgcattctt cacccattgg aaagtcttct tttacactta aatgtataga cgtctatacg 60

tgtttcaccc tctgcagaac cagcttttca aacgccaaaa ttttaatgaa accatgctgt 120

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atagcttgcc aaaaaattgc ttgtaaagga gatgaaaatc 280

<210> 13

<211> 215

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

gtcacaatgc gccatcaaac cgttgacaag cgtccccgtc agatggccgg gagccggatg 60

aaccaccatt ccgcgcggct tgttgacgac aagaacgtcc tgatcttatt ataatataag 120

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atacaaaaag accgattaga ggggagagag gaaac 215

<210> 14

<211> 148

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

caactggtat cagcaggtta tcgccacaaa cggagagagt ctctgacaat tttttgaaaa 60

ctcatgcgct tcaattgaca ataacgaaat gcaggcggac aataaaagag aaagatgaac 120

cacccacagt ccgaaaggcg ggaagagc 148

<210> 15

<211> 99

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

gtgttgatca acaaaagcaa aaagtttttc gttttttctt tcatttttgt tatgatgctg 60

agcctctcat ttgtgaatgg ggaagttgca aaagccgat 99

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<211> 4463

<212> DNA

<213> 基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 16

cttaaggaac gtacagacgg cttaaaagcc tttaaaaacg tttttaaggg gtttgtagac 60

aaggtaaagg ataaaacagc acaattccaa gaaaaacacg atttagaacc taaaaagaac 120

gaatttgaac taactcataa ccgagaggta aaaaaagaac gaagtcgaga tcagggaatg 180

agtttataaa ataaaaaaag cacctgaaaa ggtgtctttt tttgatggtt ttgaacttgt 240

tctttcttat cttgatacat atagaaataa cgtcattttt attttagttg ctgaaaggtg 300

cgttgaagtg ttggtatgta tgtgttttaa agtattgaaa acccttaaaa ttggttgcac 360

agaaaaaccc catctgttaa agttataagt gactaaacaa ataactaaat agatgggggt 420

ttcttttaat attatgtgtc ctaatagtag catttattca gatgaaaaat caagggtttt 480

agtggacaag acaaaaagtg gaaaagtgag accatggaga gaaaagaaaa tcgctaatgt 540

tgattacttt gaacttctgc atattcttga atttaaaaag gctgaaagag taaaagattg 600

tgctgaaata ttagagtata aacaaaatcg tgaaacaggc gaaagaaagt tgtatcgagt 660

gtggttttgt aaatccaggc tttgtccaat gtgcaactgg aggagagcaa tgaaacatgg 720

cattcagtca caaaaggttg ttgctgaagt tattaaacaa aagccaacag ttcgttggtt 780

gtttctcaca ttaacagtta aaaatgttta tgatggcgaa gaattaaata agagtttgtc 840

agatatggct caaggatttc gccgaatgat gcaatataaa aaaattaata aaaatcttgt 900

tggttttatg cgtgcaacgg aagtgacaat aaataataaa gataattctt ataatcagca 960

catgcatgta ttggtatgtg tggaaccaac ttattttaag aatacagaaa actacgtgaa 1020

tcaaaaacaa tggattcaat tttggaaaaa ggcaatgaaa ttagactatg atccaaatgt 1080

aaaagttcaa atgattcgac cgaaaaataa atataaatcg gatatacaat cggcaattga 1140

cgaaactgca aaatatcctg taaaggatac ggattttatg accgatgatg aagaaaagaa 1200

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gattcataca gatgatgacg aaaaagccga tgaagatgga ttttctatta ttgcaatgtg 1380

gaattgggaa cggaaaaatt attttattaa agagtagttc aacaaacggg ccagtttgtt 1440

gaagattaga tgctataatt gttattaaaa ggattgaagg atgcttagga agacgagtta 1500

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attatctgaa aagggaatga gaatagtgaa tggaccaata ataatgacta gagaagaaag 1620

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gatgatgtgt gtcatgtcaa cagaggaagc agagttcagc catgaatgga caaccggtga 1800

gtggaaggtg gaagtgaatt ttgatagcga agagattcta ctagattatg catctcaggt 1860

ggaatcagat tggccgctta cacatggtca atttttctct attttgccga tttatgattc 1920

aggtggatac ttagagaaag tgtatcaaac tgctaaatcg gtagaagccc aaacgttcca 1980

cgatgcgatt tgtgccctta tcgtagaaga gctgtttgaa tatgcaggca aatggcgtaa 2040

tattcgtgtg caaggaccga caacatttct accatccttg actgtacagg tagcaatggc 2100

aggtgccatg ttgattggtc tgcatcatcg catctgttat acgacgagcg cttcggtctt 2160

aactgaagca gttaagcaat cagatcttcc ttcaggttat gaccatctgt gccagttcgt 2220

aatgtctggt caactttccg actctgagaa acttctggaa tcgctagaga atttctggaa 2280

tgggattcag gagtggacag aacgacacgg atatatagtg gatgtgtcaa aacgcatacc 2340

attttgaacg atgacctcta ataattgtta atcatgttgg ttacgtattt attaacttct 2400

cctagtatta gtaattatca tggctgtcat ggcgcattaa cggaataaag ggtgtgctta 2460

aatcgggcca ttttgcgtaa taagaaaaag gattaattat gagcgaattg aattaataat 2520

aaggtaatag atttacatta gaaaatgaaa ggggatttta tgcgtgagaa tgttacagtc 2580

tatcccggca ttgccagtcg gggatattaa aaagagtata ggtttttatt gcgataaact 2640

aggtttcact ttggttcacc atgaagatgg attcgcagtt ctaatgtgta atgaggttcg 2700

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ttgtacaggt gcggagtcgt ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg 2820

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tcggtaagct agacaaaacg gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt 3180

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ggcgtgaatg ggaaaaataa gagagtaaaa gaaaaagaac aaaaaatctg gtcggagatt 3660

gggatgatag cgggagcatt tgcgctgctt gatgtgatca tccgcggcat tatgtttgaa 3720

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caaaaacggg tgaagcagca gcgaatagaa tcaattgcgg tcgcctttgc ggtagtggtg 3900

cttacgatgt acgacagggg gattccccat acattcttcg cttggctgaa aatgattctt 3960

ctttttatcg tctgcggcgg cgttctgttt ctgcttcggt atgtgattgt gaagctggct 4020

tacagaagag cggtaaaaga agaaataaaa aagaaatcat cttttttgtt tggaaagcga 4080

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gccaagttgt tttgatagag tgattgtgat aattttaaat gtaagcgtta acaaaattct 4200

ccagtcttca catcggtttg aaaggaggaa gcggaagaat gaagtaagag ggatttttga 4260

ctccgaagta agtcttcaaa aaatcaaata aggagtgtca agaatgtttg caaaacgatt 4320

caaaacctct ttactgccgt tattcgctgg atttttattg ctgtttcatt tggttctggc 4380

aggaccggcg gctgcgagtg ctgaaacggc gaacaaatcg aatgagctta caggatccgc 4440

gctcgagccc tgcaggagaa ttc 4463

Claims (6)

1.一种新型启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的新型启动子，其特征在于：所述序列用作表达克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apr的启动子。

3.核苷酸序列为SEQ ID NO：1的作为启动子的应用。

4.含有权利要求1所述新型启动子的质粒。

5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于：其核苷酸序列SEQ ID NO：5所示。

6.含有权利要求5或6所述质粒载体的基因工程菌。