CN109825523A

CN109825523A - 多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法

Info

Publication number: CN109825523A
Application number: CN201910011756.9A
Authority: CN
Inventors: 梁伟凡; 周玉岩; 逯佩凤; 丁小云
Original assignee: Guangdong Hinabiotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Hinabiotech Co Ltd
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明公开一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法，所述方法利用rDNA非转录间隔区的基因片段作为整合位点，把菌丝霉素NZ2114表达盒整合至毕赤酵母基因组得到的毕赤酵母菌株菌丝霉素表达量高、菌株稳定性好，解决了现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。

Description

多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法。

背景技术

菌丝霉素对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用，尤其是对肺炎链球菌的杀菌效果与万古霉素和青霉素的杀菌效果相当，并且具有良好的盐离子耐受能力、pH稳定性和热稳定性。同时，菌丝霉素无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，是治疗革兰氏阳性细菌引起的疾病的潜在药物。而毕赤酵母表达系统作为最常用的蛋白表达系统之一，具有遗传背景清晰、基因操作简便、发酵工艺成熟、蛋白表达水平高、具有翻译后修饰等优点，适合菌丝霉素的大规模生产。

近年来，人们对利用毕赤酵母表达重组菌丝霉素开展了大量研究和应用，例如：中国专利授权号CN102191255B提供了一种毕赤酵母表达重组菌丝霉素的方法，但该方法存在以下问题：单拷贝整合，表达量低，筛选工作量大。中国专利授权号CN102409003B提供了一种毕赤酵母多拷贝表达重组菌丝霉素的方法，该方法通过构建四串联子载体表达菌丝霉素，能提高菌丝霉素的表达量，但也存在以下问题：载体构建过程繁琐，耗费时间，四串联子载体分子量增大，降低载体整合效率，筛选工作量大。而且上述两种方法都是以表达载体上AOX1启动子为整合位点，而在毕赤酵母基因组中只存在一个AOX1启动子序列，因此表达载体在基因组AOX1启动子序列上发生多次整合的概率极低，导致筛选菌株的基因拷贝数不高。同时，以毕赤酵母常用的几个整合位点（AOX1启动子、GAP启动子序列或His4片段）作为整合位点获得的多拷贝菌株，由于这些整合位点在基因组都只有一个拷贝，因此这些多拷贝菌株的载体整合片段都是相互邻近的，会由于同源重组的原因导致在传代过程中基因拷贝数逐渐减少，引起菌株不稳定。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法，旨在解决现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。

本发明的技术方案如下：

一种多拷贝表达载体，其中，包括：rDNA非转录间隔区基因片段(SEQ ID No.1)和菌丝霉素NZ2114表达盒。

一种多拷贝表达载体，其中，所述菌丝霉素NZ2114表达盒由菌丝霉素基因序列插入pPICzαA表达载体的α-因子信号肽C端形成。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述毕赤酵母的基因组整合有所述多拷贝表达载体。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其中，包括步骤：

A、对菌丝霉素NZ2114基因5’端进行Xho酶切处理，并对NZ2114基因3’端进行Xba酶切处理，同时对pPICzαA载体进行Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理，然后将经Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理的菌丝霉素基因片段连接至同样被Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理的pPICzαA载体，构建单拷贝表达载体；

B、以毕赤酵母X33菌株基因组为模板，利用扩增引物扩增rDNA非转录间隔区基因片段（NTS片段），并通过扩增引物在rDNA非转录间隔区基因片段的5’端添加BamH酶切位点，并在3’端添加Bgl酶切位点，得到扩增产物；

C、Bgl限制性内切酶单酶切所述单拷贝表达载体，小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化处理酶切产物，得到的线性化单拷贝表达载体，并利用BamH限制性内切酶和Bgl限制性内切酶双酶切处理的步骤B中的扩增产物，然后与所述线性化单拷贝表达载体连接，构建多拷贝整合载体；

D、将多拷贝整合载体进行Spe限制性内切酶单酶切处理，电泳回收酶切产物，电转至X33感受态细胞，即得到表达菌丝霉素的酵母细胞。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其中，所述电转电压为1.5~2.5kV。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其中，所述步骤D后还包括：

将表达菌丝霉素的酵母细胞复苏后涂布于YPDZ平板，培养至长出单菌落，挑取单菌落划线于高浓度博来霉素抗生素的YPDZ平板，培养2-3天，筛选出阳性多拷贝转化子。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其中，所述扩增引物为：5’-CCCGGATCCCCTAAGATTCGAAAA-3’ (SEQ ID No.2)和5’-CCCAGATCTAACGCCTCTAAGTCA-3’(SEQ ID No.3)。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其中，所述培养温度为30℃。

一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其中，所述YPDZ平板中的博来霉素浓度为0.25-4mg/mL。

有益效果：本发明通过利用rDNA非转录间隔区基因片段（NTS片段）作为整合位点，把菌丝霉素表达盒整合至毕赤酵母基因组，可快速获得稳定的高拷贝菌株。NTS片段在毕赤酵母基因组中存在100-200个重复单元，一次载体转化可同时发生多次基因组整合，提高了获得多拷贝整合菌株的概率。同时，这些重复的NTS片段在毕赤酵母基因组中是分散的，因此筛选得到的多拷贝菌株不会因为同源重组而减少基因拷贝数，多拷贝菌株的稳定性大幅提高，解决了现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。

附图说明

图1为单拷贝表达载体示意图。

图2为Top10/pPICzαA-NZ2114单拷贝表达载体菌落PCR电泳图。

图2中，泳道M：1kb plus DNA marker；泳道C+：空质粒对照，pPICzαA，扩增条带约0.6kb；泳道C-：空菌株对照，E.coliTop10，无条带；泳道1-6: 单个Top10/pPICzαA-NZ2114转化菌株，扩增条带约0.7kb。

图3为多拷贝整合载体示意图。

图4为Top10/pPICzαA- NTS-NZ2114多拷贝整合载体菌落PCR电泳图。

图4中，泳道M：1kb plus DNA marker；泳道1-4: 单个Top10/pPICzαA- NTS-NZ2114转化菌株，扩增条带约3kb。

图5为菌丝霉素发酵上清液蛋白电泳图。

图5中，泳道M：1kb plus DNA marker；泳道24h：流加甲醇诱导菌丝霉素24h所表达的发酵液；泳道48h：流加甲醇诱导菌丝霉素48h所表达的发酵液；泳道72h：流加甲醇诱导菌丝霉素72h所表达的发酵液；

图6 为菌丝霉素发酵上清液抑菌圈检测图。

具体实施方式

本发明提供一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

单拷贝表达载体构建

将菌丝霉素NZ2114基因序列插入pPICzαA表达载体的α-因子信号肽C端，以构建单拷贝表达载体，该单拷贝表达载体包含甲醇脱氢酶AOX1启动子、α-因子信号肽、菌丝霉素NZ2114基因和AOX1（TT）终止子等菌丝霉素表达盒。具体构建方法如下：

在菌丝霉素NZ2114基因5’端添加Xho酶切位点和Kex2切割位点（CTCGAGAAAAGA），保证分泌的菌丝霉素能被正确切割信号肽。在NZ2114基因3’端添加Xba酶切位点（TCTAGA）。Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理的菌丝霉素基因片段连接至同样被Xho和Xba限制性内切酶双酶切处理的pPICzαA载体，构建单拷贝表达载体pPICzαA-NZ2114，如图1所示。

连接产物热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于LB平板（含25ug/mL博来霉素），37℃过夜培养至长出单菌落。利用验证引物：5’AOX：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，3’AOX：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，挑单菌落PCR电泳验证阳性转化子，结果如图2所示，由图2可知泳道1~6中扩增条带越0.7kb，说明单拷贝整合载体pPICzαA- NZ2114已成功构建，并转入大肠杆菌Top10感受态细胞。

然后挑取阳性转化子测序，将正确菌株保存于甘油管中。

实施例2

多拷贝整合载体构建

利用酵母基因组提取试剂盒提取毕赤酵母X33菌株基因组，以X33基因组为模板，利用扩增引物5’- CCCGGATCCCCTAAGATTCGAAAA -3’ (SEQ ID No.2)和5’-CCCAGATCTAACGCCTCTAAGTCA -3’ (SEQ ID No.3)，扩增rDNA非转录间隔区基因片段（NTS片段），如序列SEQ ID No.1所示。通过扩增引物在NTS片段的5’端添加BamH酶切位点（GGATCC），在3’端添加Bgl酶切位点(AGATCT)。Bgl限制性内切酶单酶切单拷贝表达载体pPICzαA-NZ2114，小牛肠碱性磷酸酶（CIP）去磷酸化处理酶切产物，得到的线性化单拷贝表达载体与BamH和Bgl限制性内切酶双酶切处理的NTS片段连接，构建多拷贝整合载体pPICzαA-NTS-NZ2114，如图3所示。

连接产物热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于LB平板（含25ug/mL博来霉素），37℃过夜培养至长出单菌落。利用扩增引物，挑单菌落进行PCR电泳验证阳性转化子，结果如图4所示，由图4可知，泳道1~4中扩增条带约3kb，说明多拷贝整合载体pPICzαA-NTS-NZ2114已成功构建，并转入大肠杆菌Top10感受态细胞。

然后挑取阳性转化子测序，将正确菌株保存于甘油管中。

实施例3

表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞的制备

提取多拷贝整合载体，Spe限制性内切酶单酶切处理，电泳回收酶切产物，电转（1.5KV）至X33感受态细胞，复苏后涂布于YPDZ平板（0.25-4mg/mL博来霉素浓度），30℃培养至长出单菌落，筛选阳性多拷贝转化子，即为表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞。

实施例4

重组菌丝霉素的诱导表达

挑取实施例3中制备的表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞，接种于25mL YPD培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备一级种子液。取20mL一级种子液接种于200mL BSM培养基中制备二级种子液，30℃，220rpm培养24小时。二级种子液全部接种于5L发酵罐（2L BSM培养基），控制温度30℃±0.5℃，溶氧30%±5%，pH=5.0±0.5。基础甘油耗尽后，流加10%甘油，甘油耗尽后直至溶氧上升至100%，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72小时。每24小时收集发酵液，离心（6000Ｘg，5min）取发酵上清液进行蛋白电泳检测，结果如图5所示，由图5可知，发酵液有菌丝霉素NZ2114分泌表达，对应分子量约为4.4KD。随着诱导时间增长，菌丝霉素表达量逐渐增多。所制备的表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞诱导72小时，分泌总蛋白含量为6.7g/L。蛋白电泳结果表明，菌丝霉素含量大于90%，表达量可达6g/L。

实施例5

菌丝霉素抑菌圈检测

将指示菌（金黄色葡萄球菌CMCC26003、金黄色葡萄球菌ATCC25923、耐药金黄色葡萄球菌N14、鸡源产气荚膜梭菌CVCC2027和猪源产气荚膜梭菌CVCC2038）接种于相应的培养基中培养制备指示菌液。用生理盐水稀释至OD₆₀₀=2.3，取100μL 稀释指示菌液至100mL相应的固体培养基（温度50-55℃），混匀，取10.5mL固体培养基至标准培养皿，冷却凝固。利用打孔器打孔，每孔添加5μL发酵上清液，阳性对照样品为5μg氨苄青霉素（Amp），盖上陶瓦盖，置于37℃培养箱培养16小时，结果如图6所示，制备的菌丝霉素发酵液对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌具有很好的抑菌效果，尤其是对耐药金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作用。

实施例6

菌株稳定性评价

通过连续传代培养评价菌株稳定性。挑取实施例3中所制备的表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞菌落接种于3mL YPD培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。取0.5mL种子液接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时。菌液转移到50 mL离心管中，离心（6000 ×g，5 min）弃上清，用25mL甲醇浓度为1%的BMMY培养基重悬菌体，菌液转移到250mL三角瓶中，30℃，220 rpm培养72小时，每24小时添加甲醇至1%浓度。离心（6000 ×g，5 min）取发酵上清液进行菌丝霉素的最低抑菌浓度检测（MIC）。

最低抑菌浓度检测（MIC检测）：接种指示菌金黄色葡萄球菌CMCC26003于50mL LB培养基中，过夜培养。菌液用生理盐水稀释至OD₆₀₀=0.1，再将稀释后的菌液用LB培养基稀释100倍。发酵上清液用0.22μm过滤器过滤，过滤后的发酵上清液用LB培养基稀释50、100、150、200、250、300、350、400倍，分别取1mL上述稀释发酵上清液于试管中，分别添加1mL稀释菌液混合，最终稀释倍数为100、200、300、400、500、600、700、800倍。试管加上活塞密封后置于37℃培养箱培养16小时，观察培养基浑浊情况，判断最低抑菌浓度（MIC值）。

挑取筛选菌株，连续传代培养10代，检测发酵上清液最低抑菌浓度，结果显示每一代菌株的摇瓶发酵上清液的MIC=1/400，说明菌株稳定性良好。

综上所述，本发明通过利用rDNA非转录间隔区基因片段作为整合位点，把菌丝霉素表达盒整合至毕赤酵母基因组，得到的毕赤酵母菌株抑菌效果好，菌株稳定性高，能快速高效获得稳定表达菌丝霉素的菌株，表达载体构建方便，载体整合效率高，筛选工作量少，节约时间成本，提高菌丝霉素产量，降低生产成本，适合菌丝霉素的大规模生产应用，解决了现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。菌丝霉素发酵上清液能有效抑制金黄色葡萄球菌和梭菌。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 广东海纳川生物科技股份有限公司

<120> 多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2790

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

cctaagattc gaaaagttat tatgaatcac caaaacgaag gttttatcta ataaatacgc 60

ccgagggctg atcaagtatt agctctagaa ttaccacggt tatccttgta gcaacactat 120

caaataaacg ataactgatt taatgagcca ttcgcagttt caccgtataa tgctatactt 180

agacatgcat ggcttaatct ttgagacaag catatgacta ctggcaggat caaccagata 240

actaggtttt gaagctagat aaagtgtttg ttcccccggc tcttttggag ttagtaggct 300

taaggcccta cgattattta tctacgtagt aatccacttt tcccttgtgg gcatgttagg 360

ctggctcgtg tctcccgacc ctttgccagt gttcccatgc cctgcgttct cagagttttc 420

actcttcttt catgtatatc cttccgggtc cttttcgtcg ggtgcaaaac tagactaggt 480

ggatatgcgt tgggtggact agcggagtga attggtcgac tgtttgttag gagtctggtg 540

tgcgcgagac gtccctaaca aatgtgcgat ttcgacttac gatttttcag accgtgagat 600

gggacaagta tccgcgaatt gccttgctgg gcattctggg cgggaagaat gtttcgctgg 660

aaggggaact ttagattaca gggcaaacat gcaaatccca ggcggggaaa gcgctgattt 720

ctgcggttca ggccctgatc cggagtttga gaaccccaac atcagaatac accaaaatgg 780

gttgaggtgg tgaatgctat gtagtgaacg cttatgtaag tgagcactta tgtaagcggt 840

tgaccattat gtaagcttgt ggtttacgta aactgttatg taagctttga ccattatgta 900

agcttgtggt ttacgtaaac tgttatgtaa gctttgacca ttatgtaagc ttgtggttta 960

cgtaaactgt tatgtaagct ttgaccatta tgtaagcttg tggtttacgt aaactgttat 1020

gtaagctttg gccattatgt aagctttaaa cacttatgta agctcgagcc cagtatgtaa 1080

gcagattgac ccattatgta agctttgaac acttatgtaa gctcgaaacc ggttaggtaa 1140

gcagctttgt aagcaatctg gacaattatg taagcgggtt acgtaaacag ttatgtaagc 1200

agaaaaattt caaacgacaa aacttggggt ctacagacac agtagccaga agattgcact 1260

accattcgac tcctcatgac ccactctttc gatccatgta gttaggttac cgtttttcct 1320

aatatttaag gatgttgaaa attcattttc atttttttcg tttttaagat tttctcacaa 1380

ctcttccaaa gattactagt tgacttttca aatatttagg gtatttttct cactttttcc 1440

tagcaaactc caattggtgg gttcagtgca atggagtatc accttgcaac cacaacgtaa 1500

tagctaactt gtggccacca tgtctggttg tagagataat tggattctaa tgtggatcac 1560

atgactactc acgtgtcaaa aacccaacct gacttggccc agcttagcaa gaatatttcg 1620

aatccactct tgtggcctag tggacaactg ggaaagcttg cgacgcagtc gtttttggcg 1680

atccaggcgt agtactaggt tcgagcctgg tcattcagat ggctcagaac ttgaggttga 1740

ctgagttcca ggttcgagtc caggacgggt tggttggtgt cgtcggcttt cggttggtct 1800

ttgatcggca ctcggcatga tgatgttgag actgacgcgt cgactggacg tgtttagtac 1860

acggtccacg cgtaatgtgt ggtcttatct tgttggtgtc ttcttttgtc tggtatctta 1920

tcttatctgg gatgtgtatt atgtaagctg gagaaaactc tgcggcaaga gaaaaaaaca 1980

acaagtccaa ccgcgggaga ctatccggcg ggagatcatc cggcgagcgg agcgcagctg 2040

gggggagtca agatgatggc aagtccaacc gcgggagact atccggcggg agatggtccg 2100

gcgagcggag cgcagctggg gggtgatgct gagggagtca aggtgaggtc aggtgaaggt 2160

ctcaagttcc tatagttttt caagtgcgtg caagtgcaag tgcaagtcca ggtgggacag 2220

ttttttggaa gtggaggtgt cacgtgagga cttctaagga gaatctcaag tccaggacaa 2280

tcctcacaga tccaggtggt caatggaacg gcaggccacg ggagcggagc aggacagggc 2340

cgcctgttgg actcaacaag gagggtctgt cggggtacga cggggcgtgg ttgactggtg 2400

gagatttgcg ttcaccaacc agcgttgttg cggttgcttg gtacgcttgg tgggtagttg 2460

actggtggtt gactgttggt ggaagaatac aagttcacca accagcgtcg ctgcgctcgc 2520

ttggtaccgc ttggttaacc gtcttcggaa cgagccacga ccaccacctt cgctgcgctc 2580

ggtggggtct aggctcgtcc ttcggtatgg aagttccaat cgctcgaccg gggcttaatc 2640

tcagcagatc gtgacggcaa ggccactctt ctgcgtacaa taccctgtcg gggtcaagtc 2700

gtgggcggga gattgtggaa tgctgctatg aaatatatcc ttcttgtaca ctcctcccca 2760

ccccagcaca gattctgact tagaggcgtt 2790

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

cccggatccc ctaagattcg aaaa 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

cccagatcta acgcctctaa gtca 24

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> 菌丝霉素NZ2114(Plectasin NZ2114)

<400> 4

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asn Glu Asp Asp Leu Arg Cys His

1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

35 40

Claims

1.一种多拷贝表达载体，其特征在于，包括：rDNA非转录间隔区基因片段(SEQ IDNo.1)和菌丝霉素NZ2114表达盒。

2.根据权利要求1所述的多拷贝表达载体，其特征在于，所述菌丝霉素NZ2114表达盒由菌丝霉素基因序列插入pPICzαA表达载体的α-因子信号肽C端形成。

3.一种表达菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母的基因组整合有如权利要求1或2任一所述的多拷贝表达载体。

4.一种表达菌丝霉素的毕赤酵母制备方法，其特征在于，包括步骤：

B、以毕赤酵母X33菌株基因组为模板，利用扩增引物扩增rDNA非转录间隔区基因片段，并通过扩增引物在rDNA非转录间隔区基因片段的5’端添加BamH酶切位点，并在3’端添加Bgl酶切位点，得到扩增产物；

5.根据权利要求4所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述电转电压为1.5~2.5kV。

6.根据权利要求4所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤D后还包括：

将表达菌丝霉素的酵母细胞复苏后涂布于YPDZ平板，培养至长出单菌落，挑取单菌落划线于YPDZ平板，培养2-3天，筛选出阳性多拷贝转化子。

7.根据权利要求4所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述扩增引物为：5’- CCCGGATCCCCTAAGATTCGAAAA -3’ (SEQ ID No.2)和5’-CCCAGATCTAACGCCTCTAAGTCA -3’ (SEQ ID No.3)。

8.根据权利要求6所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述培养温度为30℃。

9.根据权利要求6所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述YPDZ平板中的博来霉素浓度为0.25-4mg/mL。