CN108410789A

CN108410789A - 产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN108410789A
Application number: CN201810426359.3A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 莫非; 蔡冬波; 何鹏辉; 陈耀中; 王世依; 马昕
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: CN108410789B

Abstract

本发明涉及产聚γ‑谷氨酸的微生物及其构建方法与应用。本发明公开的产聚γ‑谷氨酸的微生物为过表达磷脂酶C的微生物，所述过表达为引入一个或多个拷贝的磷脂酶C编码基因和/或将磷脂酶C的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。本发明通过提高磷酯酶C的表达获得的微生物，其发酵生产聚γ‑谷氨酸产量得到显著提高。本发明为提高微生物发酵生产聚γ‑谷氨酸的产量、降低生产成本提供了新的策略。

Description

产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体涉及产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用。

背景技术

聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一类天然的阴离子型生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成。γ-PGA分子上带有大量游离的带负电荷的羧基，使其具有与大量金属阳离子结合的能力和亲水的性能。这些结构特点使得γ-PGA具备良好的水溶性、较强的吸附能力、可生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在医药、食品、化妆品、环境保护及农业等领域具有广泛的应用。

作为γ-PGA的合成前体的L-谷氨酸的来源主要有两种，一种是是通过外源培养基的添加；另一种则是通过微生物细胞代谢途径中的三羧酸循环(TCA)的重要中间产物α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶催化生成。γ-PGA合成的另一个前体D-谷氨酸则通过L-谷氨酸经谷氨酸异构(消旋酶)消旋而来。目前，提高菌株γ-PGA产量的研究报道一般集中在针对合成、分解途径的改造和优化。细胞代谢产物的膜转运过程是代谢产物胞外积累的关键步骤，胞内合成的代谢产物需要被高效地转运到胞外，以便于产物的分离提取，同时避免胞内产物大量积累导致的代谢抑制。然而，目前尚没有对于γ-PGA的跨膜转运过程的研究及其在促进γ-PGA高效合成方面的应用。

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞中，能专一性水解磷脂甘油sn-3位上甘油磷酸酯键的脂类水解酶。PLC作用底物为甘油磷脂和鞘磷脂两大类，其中甘油磷脂又包括磷脂胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸等。磷脂特别是磷脂酰胆碱和鞘磷脂是生物膜的重要组成部分，PLC通过催化细胞的膜磷脂的水解影响细胞膜的通透性、细胞代谢和信息传递。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供产聚γ-谷氨酸的微生物，所述微生物为过表达磷脂酶C的微生物，所述过表达为引入一个或多个拷贝的磷脂酶C编码基因和/或将磷脂酶C的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。

所述磷脂酶C具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换、缺失、或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

具体地，所述磷脂酶C为由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码或由具有特异性序列且能够表达与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同功能蛋白的核苷酸序列编码。

所述磷脂酶C来源于细菌，优选来源于芽胞杆菌属细菌，更优选来源于苏云金芽胞杆菌。

所用术语“产聚γ-谷氨酸的微生物”指能够通过发酵产生聚γ-谷氨酸的微生物。本领域技术人员应当理解，产生聚γ-谷氨酸的微生物包括但不限于通过基因工程构建的菌株、通过诱变筛选获得的菌株，通过自然环境直接分离获得的菌株，或是结合以上两种或以上方式获得的微生物。所述微生物包括但不限于芽胞杆菌属的细菌，优选为地衣芽胞杆菌。

进一步地，本发明还提供了产聚γ-谷氨酸的微生物的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建plC基因表达盒，所述表达盒包括启动子、plC基因和终止子；

(2)将plC基因表达盒连接至载体，构建含有plC基因表达盒的载体；

(3)将含有plC基因表达盒的载体转化至出发菌株中，筛选获得阳性转化子。

其中，所述步骤1)中的plC基因的序列优选为如SEQ ID NO.2所示序列，所述启动子和终止子包括但不限于本发明实施例中使用的枯草芽胞杆菌的P43启动子和地衣芽胞杆菌的终止子TamyL，本领域技术人员可以根据需要选择常用的操纵基因转录起始和终止的启动子和终止子不同程度地调控plC基因的表达。

所述步骤2)中的载体，包括但是不限于本发明实施例中使用的pHY300PLK载体，本领域技术人员可以根据增强表达plC基因的方式选择任意一种在基因工程改造中使用的载体。

此外，本发明还提供所述任一微生物在发酵生产聚γ-谷氨酸或提高聚γ-谷氨酸中的应用。

更进一步地，本发明提供一种聚γ-谷氨酸的生产方法，为发酵所述的微生物，得到聚γ-谷氨酸。

所述发酵使用的培养基具体包括但不限于以下任意一种发酵培养基：葡萄糖0～150g/L和/或甘油0～100g/L，以及谷氨酸钠0～80g/L，柠檬酸钠0～20g/L，NaNO₃ 0～20g/L，NH₄Cl 0～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0～5g/L，ZnSO₄·7H₂O 0～5g/L，MnSO₄·H₂O 0～1g/L，CaCl₂ 0～5g/L；所述发酵的pH为6.5～7.2。

本发明的有益效果在于，通过提高磷脂酶C的表达水平构建了产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌，其聚γ-谷氨酸产量与出发菌株相比显著提高。本发明首次通过增强磷脂酶C的表达，提高了聚γ-谷氨酸的产量，在摇瓶发酵水平，不同发酵培养基中发酵的聚γ-谷氨酸的产量提高均在14％以上，从而在实践上证明增强磷脂酶C的表达，提高细胞膜的通透性，能够有效促进胞内聚γ-谷氨酸的外排，为产聚γ-谷氨酸菌株的代谢工程改造和聚γ-谷氨酸的发酵生产提供了一种新策略。

附图说明

图1为plC基因的琼脂糖凝胶电泳图：其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为plC基因片段；

图2为plC表达盒的琼脂糖凝胶电泳图：其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为P43启动子，泳道3为淀粉酶终止子TamyL，泳道4为plC表达元件；

图3为游离表达质粒pHY-plC菌落PCR验证图：其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为游离表达质粒pHY-plC进行菌落PCR验证的条带；

图4为pHY-plC转化地衣芽胞杆菌WX-02得到的转化子菌落PCR验证图：其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为阳性转化子WX-02/pHY-plC进行菌落PCR验证的条带；

上述DNA Marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 pHY-plC表达质粒的构建

根据苏云金芽胞杆菌BM171的基因组DNA序列中的plC基因的基因序列，设计plC基因的上游引物(plC-F)和下游引物(plC-R)；并以苏云金芽胞杆菌BM171的基因组DNA为模板，分别以plC基因的上游引物(plC-F)和下游引物(plC-R)进行PCR扩增得到plC基因片段，其长度为852bp(如SEQ ID NO.2所示)。引物plC-F和plC-R的序列如下。

SEQ ID NO.3:plC-F:TAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAGAAAGTACTTGCTT

SEQ ID NO.4:plC-R:TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAACGATTTCCGTACGTATCA

以枯草芽胞杆菌168的基因组DNA为模板，P43-F和P43-R为引物，PCR扩增得到P43启动子；以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，TamyL-F和TamyL-R为引物，PCR扩增得淀粉酶终止子TamyL。以上述PCR产物为模板，P43-F和TamyL-R为引物将启动子、目的基因和终止子通过SOE-PCR连到一起，构成完整的plC表达盒(1652bp)；

其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：

SEQ ID NO.5:P43-F:GCGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCT

SEQ ID NO.6:P43-R:GAAATGAACCATAGGGTGTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTA

SEQ ID NO.7:TamyL-F:CTCAGGGAAACTAATACACTAAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTC

SEQ ID NO.8:TamyL-R:GGTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTGG

采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对plC表达盒片段进行双酶切得到酶切基因片段(1646bp)，准备质粒pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段(4870bp)。将得到的酶切基因片段和线性质粒片段经T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物。通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α。在37℃的条件下经含有氨苄青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为pHY-F和pHY-R)。阳性转化子的PCR验证结果为在1934bp处出现电泳条带，进一步结合序列测定结果证明游离表达载体pHY-plC构建成功。其中引物pHY-F和pHY-R的序列如下。

SEQ ID NO.9:pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC

SEQ ID NO.10:pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC

实施例2 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-plC的构建

将游离表达载体pHY-plC转化至转入地衣芽胞杆菌WX-02中(该菌种已在中国专利CN106497857A中公开)，在37℃的条件下、含有四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子提取质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。阳性转化子的PCR验证结果为在1934bp处出现电泳条带，结合序列测定结果，证明游离表达载体pHY-plC成功转入地衣芽胞杆菌WX-02中，地衣芽胞杆菌工程菌WX-02/pHY-plC构建成功，对照菌株WX-02/pHY300为将质粒pHY300转化至WX-02中，其操作步骤同WX-02/pHY-plC的构建。

实施例3 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-plC发酵生产γ-PGA试验

1.种子培养

将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-plC和WX-02/pHY300活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于LB培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液。

2.发酵生产γ-PGA

为更好地分析plC的表达对于地衣芽胞杆菌发酵生产γ-PGA的作用，分别采用如表1所示的培养基进行发酵试验。

表1 发酵培养基配方

以上培养基成分单位均为g/L。

向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速180～300r/min，温度37℃。发酵培养36小时，得到生产发酵的菌液。

3.γ-PGA产量和菌体生物量的测定

采用干重法测量γ-PGA产量和菌体生物量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，菌体沉淀80℃烘箱烘干，测菌体干重。取上清，用6mol/L NaOH将上清液pH调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀γ-PGA，离心收集γ-PGA絮状沉淀，将沉淀在80℃烘箱烘干，测干重。根据干重法计算生产发酵的菌液中γ-PGA的产量(见表2)。

表2 发酵试验γ-PGA的产量

发酵结果表明，在相同的发酵的条件下，表达plC的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-plC的γ-PGA产量较对照菌WX-02/pHY300显著提高，证明通过表达plC，增加细胞膜的通透性，有利于γ-PGA的发酵生产。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 产聚 γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用

<130> KHP181111960.8

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Lys Lys Val Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ile Thr Leu Val Ala

1 5 10 15

Pro Leu Gln Ser Val Ala Phe Ala His Glu Asn Asp Gly Gly Gln Arg

20 25 30

Phe Gly Val Ile Pro Arg Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly

35 40 45

Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser

50 55 60

Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Leu Leu Asn Glu

65 70 75 80

Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Glu Asn

85 90 95

Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp

100 105 110

Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Tyr Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly

115 120 125

Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met

130 135 140

Lys Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp

145 150 155 160

Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Pro

165 170 175

Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp

180 185 190

Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr

195 200 205

Asn Pro Glu Asp Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp

210 215 220

Tyr Ala Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Arg Ala

225 230 235 240

Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro

245 250 255

Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr

260 265 270

Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asn Arg

275 280

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaaaga aagtacttgc tttagcggca gctattacat tagttgctcc attacaaagt 60

gttgcatttg ctcatgaaaa tgatggggga cagagatttg gagttattcc acgctggtct 120

gctgaagata aacataaaga aggcgtgaat tctcatttat ggattgtaaa ccgtgcaatt 180

gatattatgt ctcgtaatac aacacttgta aaacaagatc gagttgcact attaaatgaa 240

tggcgtactg agttagagaa cggtatttat gctgctgact atgaaaatcc ttattatgat 300

aatagcacat ttgcttcaca tttctatgac cctgacaatg ggaaaactta tattccgtat 360

gcaaagcagg caaaggaaac tggagctaaa tattttaaat tagctggtga gtcttacaaa 420

aataaagata tgaaacaagc attcttctat ttaggcttat ctcttcatta tttaggggat 480

gtaaaccaac cgatgcatgc ggcaaacttt acgaaccttt cgtatccaca aggattccat 540

tctaaatatg aaaactttgt agatacgata aaagataatt ataaagtaac ggatggaaat 600

ggatattgga actggaaagg tacgaatcca gaagattgga ttcatggagc ggcagtagtt 660

gcgaaacaag attacgctgg cattgtaaat gataatacga aagattggtt cgtaagagca 720

gctgtatcac aagaatatgc agataaatgg cgcgctgaag ttacaccaat gacaggtaag 780

cgtttaatgg atgcacaacg tgttactgct ggatacattc agctttggtt tgatacgtac 840

ggaaatcgtt aa 852

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taagagagga atgtacacat gaaaaagaaa gtacttgctt 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgtcctct ctgctctttt aacgatttcc gtacgtatca 40

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgaattctg ataggtggta tgttttcgct 30

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaatgaacc atagggtgtc atgtgtacat tcctctctta ccta 44

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcagggaaa ctaatacact aaaagagcag agaggacgga tttc 44

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctagacg caataatgcc gtcgcactgg 30

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttattatc cataccctta c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagatttcgt gatgcttgtc 20

Claims

1.产聚γ-谷氨酸的微生物，其特征在于，所述微生物为过表达磷脂酶C的微生物，所述过表达为引入一个或多个拷贝的磷脂酶C编码基因和/或将磷脂酶C的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。

2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述磷脂酶C具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换、缺失、或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，所述磷脂酶C为由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码或由具有特异性序列且能够表达与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同功能蛋白的核苷酸序列编码。

4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述磷脂酶C来源于细菌，优选来源于芽胞杆菌属细菌，更优选来源于苏云金芽胞杆菌。

5.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物为选自芽胞杆菌属的细菌，优选为地衣芽胞杆菌。

6.权利要求1-5任意一项所述微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.权利要求1-5任意一项所述微生物在发酵生产聚γ-谷氨酸或提高聚γ-谷氨酸中的应用。

8.一种聚γ-谷氨酸的生产方法，其特征在于，发酵权利要求1-5任意一项所述的微生物，得到聚γ-谷氨酸。

9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述发酵采用如下发酵培养基：葡萄糖0～150g/L和/或甘油0～100g/L，以及谷氨酸钠0～80g/L，柠檬酸钠0～20g/L，NaNO₃ 0～20g/L，NH₄Cl 0～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0～5g/L，ZnSO₄·7H₂O 0～5g/L，MnSO₄·H₂O 0～1g/L，CaCl₂ 0～5g/L；所述发酵的pH为6.5～7.2。