CN113957072A

CN113957072A - 适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子及其在高效表达目的产物中的应用

Info

Publication number: CN113957072A
Application number: CN202111174896.1A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 饶忆; 杨晶尧; 王佳琪; 杨新愿; 蔡冬波; 马昕
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2021-10-09
Filing date: 2021-10-09
Publication date: 2022-01-21
Anticipated expiration: 2041-10-09
Also published as: CN113957072B

Abstract

本发明属于基因工程和微生物代谢工程领域，公开了适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子及其在高效表达目的产物中的应用。本发明提供了3个适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子（T1、T2、T3）。接着，以绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP和α‑淀粉酶为目的蛋白为例，进行蛋白表达，与终止子TamyL相比，发现终止子T1均可有效提高蛋白产量，其分别使GFP、RFP和α‑淀粉酶产量提高43.6%、48.0%和34.5%。最后，将终止子T1应用于代谢工程中，与对照菌株相比，通过将其应用于代谢途径强化使聚γ‑谷氨酸产量提高了33.8%。

Description

适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子及其在高效表达目的产物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物代谢工程领域，具体涉及适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子及其在高效表达目的产物中的应用。

背景技术

终止子通常位于基因或操纵子末端的下游，其是基因终止转录的信号，影响着RNA聚合酶的释放速率和编码基因mRNA的稳定性，因此它除了像启动子那样决定mRNA起始丰富度，还决定mRNA的半衰期，从而它成为影响基因表达的调控元件的成员之一。

在原核生物中，终止子终止基因转录有两种不同的机制，分别为：1)Rho依赖性终止子，2)Rho非依赖性终止子。Rho依赖性终止子终止基因转录需要依靠Rho蛋白作用，多见于薄壁菌门，比如大肠杆菌等；而Rho非依赖性终止子终止基因转录是靠自身富含G、C序列所形成的茎环或发夹结构，以及含U的基序，其常见于厚壁菌门(如芽孢杆菌等)(DOI:10.1371/journal.pcbi.0010025)。

终止子虽然作为基因表达调控元件之一，但大多数终止子研究工作往往仅集中于预测和鉴定。随着合成生物学的发展，近些年，人们才意识到终止子不仅对于防止转录物通读是重要的，而且其对上游mRNA转录物的稳定起着重要的作用。如Chen等人建立了一共582个由天然和合成终止子组成的库。经过计算和比较，发现强终止基因转录效率的终止子通常在发夹茎的底部具有较高的GC含量(DOI:10.1038/nmeth.2515)。然而，将终止子作为蛋白表达和目的物高产的调控元件相关研究少有报道。

地衣芽孢杆菌是一个重要的工业生产模式菌株，具有分泌蛋白能力强的特征，且被美国FDA认定为生物安全性菌株，从而其可作为蛋白和目标代谢物生产的优良宿主。然而，目前地衣芽孢杆菌在表达多数外源蛋白时，存在表达难或表达效率低的问题，而终止子在地衣芽孢杆菌目的物高效表达体系的构建中尚无应用。因此，提供一组适用于地衣芽孢杆菌高效表达目的产物的终止子具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供了适用于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的简短终止子，所述的终止子序列为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4中的任意一个。

适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子在高效表达地衣芽孢杆菌的目的产物中的应用，将本发明的终止子导入地衣芽孢杆菌中，可提高地衣芽孢杆菌生产目的产物的能力。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子，所述的终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.3所示；或SEQ ID NO.4所示。

适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子在提高地衣芽孢杆菌目的产物产量中的应用，将本发明提供的简短终止子，替换地衣芽孢杆菌中所需表达的目标物质的终止子，可提高目标物质的表达量。所述的目标物质为：外源蛋白或地衣芽孢杆菌代谢产物。

以上所述的应用中，优选的，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或α-淀粉酶；

以上所述的应用中，优选的，所述代谢产物为γ-PGA；

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌DW2或地衣芽孢杆菌WX-02。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明人首次提供了一组适用于地衣芽孢杆菌高效表达目的产物的简短终止子。

2.本发明人提供了一组能有效终止基因转录的简短终止子。其构建非常方便，以非常低廉的费用直接通过引物设计导入表达载体中，利于合成生物学终止子工具箱的开发。

3.本发明人提供了3个适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子(T1、T2、T3)。接着，以绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP和α-淀粉酶为目的蛋白，与起始终止子TamyL相比，研究发现终止子T1效果最佳，其分别使GFP、RFP和α-淀粉酶产量提高43.6％、48.0％和33.8％。最后，将终止子T1应用于代谢工程中，与对照菌株相比，通过将其应用于代谢途径强化使聚γ-谷氨酸提高了33.8％。从而说明人工筛选的终止子T1不仅性能良好，而且具有一定的普适性。其为构建地衣芽孢杆菌蛋白高效表达体系和目的产物高产的代谢工程育种奠定基础。

附图说明

图1为不同终止子对GFP表达的影响示意图。

图2为简短终止子T1对RFP表达的影响示意图。

图3为简短终止子T1对α-淀粉酶表达的影响示意图。

图4为简短终止子T1对WX-02产γ-PGA的影响示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明以3种外源蛋白(绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP和α-淀粉酶)和1种代谢产物(γ-PGA)为例，说明本发明技术方案的优越性，其他可在地衣芽孢杆菌中表达的外源蛋白、或地衣芽孢杆菌的其他代谢产物，也可用本发明提供的终止子提高其产量。

实施例1：

适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子的获得：

本发明的简短终止子，分别命名为简短终止子T1-T3，具体为：

T1：CCCCCCCCCCAGAGAGGACGGCGCATTTCCTTTGACCCGGAAATGCGCCGTTTTTTTA(SEQ IDNO：2)；

T2：TTTGATTACATTTTATAATTAAT(SEQ ID NO：3)；

T3：GACGGTATCGCGGGTGATCAATCATCCTGAGACTGTG(SEQ ID NO：4)。

实施例2:

不同简短终止子在提高地衣芽孢杆菌外源蛋白表达量中的应用：

在本实施例中，通过引物直接引入了T1、T2、T3终止子，替换了表达载体中的原始终止子TamyL，具体步骤如下：

1、以本实验早期构建的质粒pHY-PylB-GFP(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)作为模板，通过表1的引物，PCR扩增出包含不同简短终止子的载体骨架(YGT1、YGT2、YGT3)，并进行DNA回收；

表1：含有不同简短终止子的表达载体引物设计

注：划线为同源臂区，18-19bp。

2、利用DpnI酶对残留的pHY-PylB-GFP模板进行消化；

3、采用Vazyme的同源重组酶(Exnase II)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；随后进行钙转，将其转入大肠杆菌中；最后通过测序验证后，提取质粒，即得到含有不同简短终止子的重组质粒，分别命名为pHY-YG-T1、pHY-YG-T2、和pHY-YG-T3；

4、将步骤3得到的重组质粒分别转入地衣芽孢杆菌DW2(DOI:CNKI:SUN:ZKSS.0.2009-11-004)中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落PCR筛选得到阳性转化子，从而获得三种工程菌DW2/YG-T1、DW2/YG-T2、DW2/YG-T3。

对照菌株DW2/YG-TamyL的制备：直接将pHY-PylB-GFP转入地衣芽孢杆菌DW2中获得。

5、工程菌种子活化：从甘油管以体积百分比1％将步骤4得到的工程菌分别接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

所述的发酵培养基即为LB培养基。

6、工程菌发酵：向500mL三角瓶中装入50mL LB液体发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。

7、GFP表达水平检测：取0.2mL发酵液于2mL EP管，加入1.8mL PBS缓冲液，用可见光分光光度计测其生物量(OD600)。然后用PBS缓冲液将发酵液相应稀释到终浓度(OD600)为1，终体积2mL，随后7000rpm，2min，接着用2mL PBS缓冲液重悬，重复一次，最后用酶标仪检测其荧光强度(激发光480nm，接受光520nm)，该结果见图1。

由图1可知：对照菌株DW2/YG-TamyL表达的GFP荧光强度为40.37×10⁵，而不同简短终止子T1、T2和T3介导表达的GFP荧光强度依次为57.96×10⁵，32.58×10⁵，29.89×10⁵，其中，简短终止子T1效果最佳，使GFP产量提高43.6％。由于简短终止子T1的提升效果最好，因此本发明以下实施例以简短终止子T1为例，对其在提升地衣芽孢杆菌外源蛋白或代谢产物表达量的效果进行说明。

实施例3:

终止子T1提高地衣芽孢杆菌对红色荧光蛋白RFP的表达：

1、以本实验早期构建的质粒pHY-P43-RFP(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)作为模板，通过表2的引物，PCR扩增出包含简短终止子T1的载体骨架T1R，并进行DNA回收；

表2：含有简短终止子T1的表达载体引物设计

注：划线为同源臂区，18-19bp。

2、利用DpnI酶对残留的pHY-P43-RFP模板进行消化；

3、采用Vazyme的同源重组酶(Exnase II)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；随后进行钙转，将其转入大肠杆菌中；最后通过测序验证后，提取质粒，即得到含有T1简短终止子的重组质粒，命名为pHY-P43R-T1；

4、将步骤3得到的重组质粒分别转入地衣芽孢杆菌DW2中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落PCR筛选得到阳性转化子，从而获得工程菌DW2/P43R-T1。

对照菌株DW2/P43R-TamyL的制备：直接将pHY-P43-RFP转入地衣芽孢杆菌DW2中获得。

所述的发酵培养基即为LB培养基。

7、RFP表达水平检测：取0.2mL发酵液于2mL EP管，加入1.8mL PBS缓冲液，用可见光分光光度计测其生物量(OD600)。然后用PBS缓冲液将发酵液相应稀释到终浓度(OD600)为1，终体积2mL，随后7000rpm，2min，接着用2mL PBS缓冲液重悬，重复一次，最后用酶标仪检测其荧光强度(激发光560nm，接受光600nm)，该结果见图2。

由图2可知：对照菌株DW2/P43R-TamyL表达的RFP荧光强度为8.20×10⁵，而简短终止子T1介导表达的RFP荧光强度为12.14×10⁵，说明最佳简短终止子T1使RFP产量提高48.0％。表明简短终止子T1对地衣芽胞杆菌提升红色荧光蛋白表达量也有明显效果。

实施例4:

终止子T1提高地衣芽孢杆菌对α-淀粉酶的表达：

1、以本实验早期构建的质粒pHY-P43-SAT(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)作为模板，淀粉酶基因amyL为SEQ ID NO.5所示，通过表3的引物，PCR扩增出包含简短终止子T1的载体骨架T1S，并进行DNA回收；

表3：含有简短终止子T1的α-淀粉酶表达载体引物设计

注：划线为同源臂区，18-19bp。

2、利用DpnI酶对残留的pHY-P43-SAT模板进行消化；

3、采用Vazyme的同源重组酶(Exnase II)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；随后进行钙转，将其转入大肠杆菌中；最后通过测序验证后，提取质粒，即得到含有T1简短终止子的重组质粒，命名为pHY-P43S-T1；

4、将步骤3得到的重组质粒分别转入地衣芽孢杆菌DW2中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落PCR筛选得到阳性转化子，从而获得工程菌DW2/P43S-T1。

对照菌株DW2/P43S-TamyL的制备：直接将pHY-P43-SAT转入地衣芽孢杆菌DW2中获得。

所述的发酵培养基为α-淀粉酶发酵培养基(g/L)：玉米浆5，酵母粉5，蛋白胨10，柠檬酸钠12，磷酸氢二钾1，七水合硫酸镁0.5，二水合氯化钙0.15，其余为水，pH7.0-7.2。

6、工程菌发酵：向500mL三角瓶中装入30mLα-淀粉酶发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。

7、(1)标准曲线的制作：配制2g/L的可溶性淀粉溶液，依次稀释成0.00g/L，0.10g/L，…2.00g/L。分别加入到装有0.5mL HCl溶液(0.1mol/L)和5.00mL稀碘液的离心管中，振荡混匀，在660nm下，测定其吸光度(A)。以吸光度(A)为横坐标，淀粉浓度为纵坐标，制得标准曲线和斜率K。

(2)α-淀粉酶酶活测定

1)酶液的制备：取1mL发酵液于2mL离心管中，12000rpm离心2min，取上清液，稀释到一定倍数待用；

2)测定：吸取10.0mL可溶性淀粉溶液(2g/L)于50mL离心管中，加入pH为6.0的磷酸缓冲液2.50mL摇匀后置于60℃恒温水浴锅中预热8min；

3)加入0.50mL待测酶液，准确反应10min；立即取1.00mL反应液，加到装有有0.5mLHCl溶液(0.1mol/L)和5.00mL稀碘液的离心管中，并以0.5ml盐酸溶液和5.00稀碘液为对照，在660nm下，测定其吸光度(A)。U定义为1min水解1mg淀粉的酶量。该结果见图3。

由图3可知：对照菌株DW2/P43S-TamyL表达的α-淀粉酶酶活为101.21U/mL，而简短终止子T1介导表达的α-淀粉酶酶活为136.09U/mL，说明最佳简短终止子T1使α-淀粉酶产量提高33.8％。综上，表明简短终止子T1对地衣芽孢杆菌提升外源蛋白的表达水平具有普适性。

实施例5：

终止子T1在提高地衣芽孢杆菌的代谢产物产量中应用：

谷氨酸脱氢酶RocG终止子强化工程菌株WX-02-(RocG)T1的制备：

1、早期研究发现：强化谷氨酸脱氢酶RocG的表达水平，可以提高地衣芽孢杆菌WX-02(CN101603015B)产γ-PGA的能力(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)。根据地衣芽孢杆菌WX-02基因组DNA序列中的rocG基因(SEQ ID NO：6)终止子TrocG的序列，设计TrocG的上游同源臂引物(TrocG-F1、TrocG-R1)、下游同源臂引物(TrocG-F2、TrocG-R2)；然后以地衣芽孢杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别PCR扩增扩增以得到TrocG DNA序列的上游同源臂片段、下游同源臂片段(TrocG的上游同源臂片段为598bp；TrocG的下游同源臂片段为608bp)；

其中，TrocG-F1、TrocG-R1、TrocG-F2、TrocG-R2的序列为：

TrocG-F1：GCTCTAGAAAAAGCCGCTCAATTCGGTG、

TrocG-R1：GATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTCTTTAAACGACTCCCTGAGCG、

TrocG-F2：GATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTATTCATTGTCTCTGAATCC、

TrocG-R2：CCGAGCTCTGTCATTCCCGGGAAAGATG；

2、以TrocG序列的上游同源臂、下游同源臂片段为模板，上游同源臂引物TrocG-F1、下游同源臂引物TrocG-R2为引物，通过重叠延伸PCR将TrocG序列的上游同源臂和下游同源臂连接到一起，得到目的片段；

3、采用XbaI和SacI限制性内切酶对步骤2中的目的基因片段进行双酶切得到双酶切基因片段；

4、并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

5、将步骤3的酶切基因片段和步骤4的线性质粒片段经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1406bp处出现电泳条带，说明终止子替换载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：终止子替换载体T2(2)-(rocG)T1)；

6、将终止子替换载体T2(2)-(rocG)T1转入地衣芽孢杆菌WX-02中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1406bp处出现电泳条带，证明：终止子替换载体T2(2)-(rocG)T1成功转入地衣芽孢杆菌WX-02中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了终止子替换载体T2(2)-(rocG)T1的地衣芽孢杆菌WX-02)；

其中，T2-F和T2-R的序列为:

T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA、

T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC；

7、将步骤6得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和TrocG-KR为引物进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1481bp长度的条带，即证明为单交换菌株；

其中，TrocG-KF和TrocG-KR的序列为:

TrocG-KF：ACGGTCTGGTTTATTTCG、

TrocG-KR：TCTAGCACACCTTTCTGTTG；

8、将步骤7得到的单交换成功的菌株接种培养，开始双交换传代。在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为TrocG-KF和TrocG-KR)。若转化子的PCR验证结果为：在1428bp处出现电泳条带时，说明WX-02的基因组上的rocG基因的终止子TrocG成功被替换成T1，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的rocG基因终止子强化菌株(即地衣芽孢杆菌WX-02-(rocG)T1)。

9、构建对照菌株，即地衣芽孢杆菌WX-02-(rocG)TamyL，同理，采取相似的操作构建，用TamyL替代了该菌株中的TrocG，即获得地衣芽孢杆菌WX-02-(rocG)TamyL，作为对照组。谷氨酸脱氢酶RocG终止子强化对WX-02产γ-PGA的影响：

1、γ-PGA生产菌株WX-02、WX-02-(rocG)TamyL和WX-02-(rocG)T1的种子活化和发酵阶段除发酵培养基外，与实施例2中的步骤5和6相同，γ-PGA发酵检测的方法参考申请人已发表的文献(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)。

γ-PGA液体发酵培养基：葡萄糖80g/L，柠檬酸钠10g/L，硝酸钠10g/L，氯化铵8g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，ZnSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 0.15g/L，CaCl₂ 1g/L，pH 7.2。

其γ-PGA发酵检测结果见图4。由图4可知：菌株WX-02、WX-02-(rocG)TamyL和WX-02-(rocG)T1生产的γ-PGA产量依次为10.08g/L、11.25g/L、15.05g/L。与野生型菌株相比WX-02，简短终止子T1效果优于出发终止子TamyL，其使γ-PGA产量相比于TamyL提高33.8％。从而，简短终止子T1可用于代谢工程以强化γ-PGA的代谢通量。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 适用于地衣芽孢杆菌的简短终止子及其在高效表达目的产物中的应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagagcagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt tttattttgc ccgtcttata 60

aatttctttg attacatttt ataattaatt ttaacaaagt gtcatcagcc ctcaggaagg 120

acttgctgac agtttgaatc gcataggtaa ggcggggatg aaatggcaac gttatctgat 180

gtagcaaaga aagcaaatgt gtcgaaaatg acggtatcgc gggtgatcaa tcatcctgag 240

actgtgacgg atgaattgaa aaagcttgtt cattccgcaa tgaaggagct caattatata 300

ccgaactatg cagcaagagc gctcgttcaa aacagaacac aggtcgtcaa gctgctcata 360

ctggaagaaa tggatacaac agaaccttat tatatgaatc tgttaacggg aatcagccgc 420

gagctggacc gtcatcatta tgctttgcag cttgtcacaa ggaaatctct caatatcggc 480

cagtgcgacg gcattattgc 500

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccccccccc agagaggacg gcgcatttcc tttgacccgg aaatgcgccg ttttttta 58

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgattaca ttttataatt aat 23

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacggtatcg cgggtgatca atcatcctga gactgtg 37

<210> 5

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgccgc tgttatttgc gctcatcttc 60

ttgctgcctc attctgcagc agcggcggca aatcttaaag ggacgctgat gcagtatttt 120

gaatggtaca tgcccaatga cggccaacat tggaagcgct tgcaaaacga ctcggcatat 180

ttggctgaac acggtattac tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa 240

gcggatgtgg gctacggtgc ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg 300

acggttcgga caaagtacgg cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa aagtcttcat 360

tcccgcgaca ttaacgttta cggggatgtg gtcatcaacc acaaaggcgg cgctgatgcg 420

accgaagatg taaccgcggt tgaagtcgat cccgctgacc gcaaccgcgt aatttcagga 480

gaacaccgaa ttaaagcctg gacacatttt cattttccgg ggcgcggcag cacatacagc 540

gattttaaat ggcattggta ccattttgac ggaaccgatt gggacgagtc ccgaaagctg 600

aaccgcatct ataagtttca aggaaaggct tgggattggg aagtttccaa tgaaaacggc 660

aactatgatt atttgatgta tgccgacatc gattatgacc atcctgatgt cgcagcagaa 720

attaagagat ggggcacttg gtatgccaat gaactgcaat tggacggttt ccgtcttgat 780

gctgtcaaac acattaaatt ttcttttttg cgggattggg ttaatcatgt cagggaaaaa 840

acggggaagg aaatgtttac ggtagctgaa tattggcaga atgacttggg cgcgctggaa 900

aactatttga acaaaacaaa ttttaatcat tcagtgtttg acgtgccgct tcattatcag 960

ttccatgctg catcgacaca gggaggcggc tatgatatga ggaaattgct gaacggtacg 1020

gtcgtttcca agcatccgtt gaaagcggtt acatttgtcg ataaccatga tacacagccg 1080

gggcaatcgc ttgagtcgac tgtccaaaca tggtttaagc cgcttgctta cgcttttatt 1140

ctcacaaggg aatctggata ccctcaggtt ttctacgggg atatgtacgg gacgaaagga 1200

gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt aaaagcgaga 1260

aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc accatgacat tgtcggctgg 1320

acaagggaag gcgacagctc ggttgcaaat tcaggtttgg cggcattaat aacagacgga 1380

cccggtgggg caaagcgaat gtatgtcggc cggcaaaacg ccggtgagac atggcatgac 1440

attaccggaa accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg agagtttcac 1500

gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaagatag 1539

<210> 6

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgcatacgc tagaaaaaat ggagcaaaca aatttccaga cggcgagaga ttatgtgaca 60

caagcatacg agacagtaca gaagcgaaat ttttacgaaa gcgaatttct tcaagctgta 120

aaggaaatat ttgattccct tgtccctgta ttggcaaggc atccaaagta tatcgaacac 180

cgcattcttg agaggatcgc agagccggaa cggatgatca ccttcagggt gccgtgggtc 240

gatgatgaag gcaatatccg ggttaaccga gggttccggg ttcaatttaa cagtgcaatc 300

ggtccgtata aaggcggcat ccgctttcac ccttctgtga acgcgagcat tattaaattt 360

ttgggttttg agcagatttt taaaaattct ttgaccggac tgccgatcgg aggcggaaaa 420

ggcggggctg attttgatcc gaagggcaaa tcggacaggg agattatgag ttttacgcag 480

agcttcatga atgaactgta cagacatatc ggaccggaca cggatatccc tgccggcgat 540

attggtgtcg gagcaaggga agtcgggttt atgttcggac agtataaaaa gattcggggc 600

cgctatgatg caggcgtgtt aacaggcaaa ggccttgaat acgggggcag tttaacgagg 660

aaagaagcga cagggtacgg tctggtttat ttcgtggaag aaatgctgaa ggatcagggg 720

atgcgctttg aaaacagcac cgttgtcgtc tccggttcag ggaatgtggc gctgtacgcg 780

atggaaaaag ccgctcaatt cggtgcgaag gtggtggcct gcagcgattc tgacggctat 840

gtctatgacg aaaaaggcat ctgtcttgag acggtgaagc ggctcaaaga agacgggaac 900

ggaaggattc gcgagtatgt cagcgagcat ccggaagcac actatttcga gggatgtacc 960

ggcatttggt ctattccatg cgatatcgcg cttccgtgcg cgacccagaa cgaaattgac 1020

gaagaggcgg ccgaagtgct catttcaaat ggggtcaaag ctgtcggaga aggagcaaat 1080

atgccgtctg aagagggcgc cgtcaaacgc tttttggatg cgggagttct attcggaccg 1140

gctaaggctg caaatgccgg cggtgtagcc gtttcagcgc tcgaaatggc gcagaacagc 1200

gcacggcttc actggacggc ggaagaaacg gatgcgaagc tcagggcgat catggctgat 1260

attcacaaga gaagcgttga agcggcttca gaatacggac ggcccggaaa tctgctcgac 1320

ggctgcaata tagccggatt tatcaaagtg gcggatgcga tgatcgctca gggagtcgtt 1380

taa 1383

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtcaaagg aaatgcgccg tcctctctgg ggggggggtt acttgtacag ctcgtcc 57

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgcatttcc tttgacccgg aaatgcgccg tttttttatc tagaagcttg ggcaaagcg 59

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aattataaaa tgtaatcaaa ttacttgtac agctcgtc 38

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gattacattt tataattaat ggatccagct tgggcaaa 38

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggatgattga tcacccgcga taccgtctta cttgtacagc tcgtc 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgggtgatca atcatcctga gactgtggga tccagcttgg gcaaa 45

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatttccttc aggaaatccg tcctctcttt atttatatag ttcatccatc c 51

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatttcctga aggaaatccg tttttttagg atccagcttg ggcaaa 46

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatttccttc aggaaatccg tcctctctct atctttgaac atagatcg 48

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatttcctga aggaaatccg tttttttagg atccagcttg ggcaaa 46

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctctagaaa aagccgctca attcggtg 28

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatttccttc aggaaatccg tcctctcttt aaacgactcc ctgagcg 47

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatttcctga aggaaatccg tttttttatt attcattgtc tctgaatcc 49

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccgagctctg tcattcccgg gaaagatg 28

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgtgataac tcggcgta 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcaagcagca gattacgc 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acggtctggt ttatttcg 18

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tctagcacac ctttctgttg 20

Claims

1.适用于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的终止子，所述的终止子的多核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.适用于地衣芽孢杆菌的终止子，所述的终止子的多核苷酸为SEQ ID NO.3所示。

3.适用于地衣芽孢杆菌的终止子，所述的终止子的多核苷酸为SEQ ID NO. 4所示。

4.权利要求1-3中的所述的任一终止子，在提高地衣芽孢杆菌外源蛋白表达量中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，是将所述的终止子替换外源蛋白的原始终止子。

6.权利要求1-3中的所述的任一终止子在提高地衣芽胞杆菌代谢产物的产量中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其是将所述的终止子替换代谢产物的原始终止子。

8.根据权利要求4或6所述的应用，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或α-淀粉酶；所述代谢产物为γ-PGA。

9.根据权利要求4或6所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽孢杆菌DW2或地衣芽孢杆菌WX-02。