CN114645049B - 一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和分子生物技术领域，公开了一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法和应用。本发明的方法，其适用于地衣芽孢杆菌不同启动子活性的改善。本发明以芽孢杆菌常用的组成型启动子P43、PbacA和人工设计的强组成型启动子R5为研究对象，得到新的启动子P43D、PbacAD和R5D。然后，以绿色荧光蛋白GFP为目的蛋白，研究发现，在地衣芽孢杆菌DW2中，与启动子P43相比，启动子P43D使提高了GFP表达水平提高了6.20倍；与启动子PbacA相比，启动子PbacAD使提高了GFP表达水平提高了2.50倍；而与启动子R5相比，启动子R5D使提高了GFP表达水平提高了0.76倍。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和分子生物技术领域，具体涉及一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法和应用。
背景技术
启动子是位于编码基因上游的一段特殊DNA序列，具有开启基因转录的功能，并在调控基因转录水平中发挥着重要的作用。随着合成生物学和蛋白表达平台的蓬勃发展，人们逐渐发现，为了实现生物系统对目标产物的高产，强化靶蛋白基因表达水平是至关重要的。由于启动子是基因转录的开关，并被认定为是建立基因高效表达工具的首选表达元件，从而启动子优化是开发能强化靶蛋白基因表达水平技术的主选策略。目前，启动子改造策略主要围绕着σ因子识别和结合的启动子核心区(-35区、核心间隔区、-10区)做改良工作。如王等人对T7启动子核心区(-35区和-10区)进行组合，得到的最佳启动子P21285提高了L-天冬酰胺酶和酸性脲酶在大肠杆菌中的产量(DOI:10.1002/biot.201800298)。
地衣芽孢杆菌是一个蛋白表达的平台模式菌株，具有分泌蛋白能力强、生物安全性等特征，从而其可作为蛋白生产的优良宿主。目前，其已经实现多种蛋白高效生产，如α-淀粉酶、碱性蛋白酶，角蛋白酶等。然而，地衣芽孢杆菌在表达多数外源蛋白时，存在表达难或表达效率低的问题，而启动子被认定为是建立基因高效表达工具的主要表达元件，且启动子改造是开发能优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径技术的首选策略。
目前，地衣芽孢杆菌启动子的改造主要是围绕着核心区和5’-UTR做优化工作。比如，饶等人通过对不同σ因子识别的序列进行组合，以提高与RNA聚合酶结合效率，得到最优启动子R2,发现其能有效提高绿色荧光蛋白GFP和角蛋白酶KER的表达量(ZL202010829306.3)。另外，肖等人通过优化P43的5’-UTR提高与RNA聚合酶结合效率，得到的最佳启动子PUTR12能大幅度提高绿色荧光蛋白的表达水平(DOI:10.1021/acssynbio.9b00355)。
然而，目前并没有人报道通过理性设计核心区二级结构来提高与RNA聚合酶的结合效率。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法。
本发明的另一个目的在于提供了一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法，包括下述步骤：
1)对待改造的启动子区域序列的二级结构进行预测；
2)基于步骤1)中所得的二级结构，分别替换和/或增添碱基以改变启动子核心区的-35区和-10区的位置，使启动子核心区的-35区和-10区在茎环结构的环上或是远离茎环结构的核酸链上以利于和RNA聚合酶结合，既得新的核心区序列。
上述方法在提高启动子活性中的应用，包括将调整后的启动子，与待表达蛋白连接后转入地衣芽胞杆菌中表达。
以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽孢杆菌DW2；
以上所述的应用中，优选的，所述的调整后的启动子，是将P43启动子中的核心区序列：gtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaat替换为P43D核心区序列：ttgacaaaaagcgcgcgattatgtaaaat；
或将R5启动子中的核心区序列：ttctcaccttgacaaagcgcgctaaaatttataatgtaaaaagccattgacattctcatattatatatttataattaaaat替换为R5D核心区序列：ttctcaccttgacaaagcgcgctaaaatttataatccccccccccgtaaaaagccattgacattctcatattatatatttataattaaaat；
或将PbacA启动子中的核心区序列：gtaaaagagcaactacagaccaatattat替换为PbacAD核心区序列：gtaaaagagcaactgcagaccaatattat。
与现有技术相比，本发明方法具有以下优点：
传统启动子核心区优化，均采用定点突变或是随机突变的方法，存在大量的筛选工作，耗时耗力。而本发明中，基于核心区二级结构，再理性设计，能方便、快速和有效地获得活性增强的启动子，适用于地衣芽孢杆菌不同启动子活性的改善，特别适用于地衣芽胞杆菌的蛋白表达。
附图说明
图1为P43、P43D启动子核心区二级结构预测示意图。
图2为R5、R5D启动子核心区二级结构理性设计示意图。
图3为PbacA、PbacAD启动子核心区二级结构理性设计示意图。
图4为不同启动子对地衣芽孢杆菌DW2的GFP表达影响的示意图。
图5为不同启动子对枯草芽胞杆菌168的GFP表达影响的示意图。
具体实施方式
本发明所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明以绿色荧光蛋白GFP为例，说明本发明技术方案的优越性。
实施例1：
一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法：
1)首先，利用RNA mfold在线网站(http://www.unafold.org/RNA_form.php)对待改造的启动子区域序列的二级结构进行预测；
2)基于步骤1)中所得的二级结构，分别替换和/或增添碱基以改变启动子核心区的-35区和-10区的位置，使启动子核心区的-35区和-10区在茎环结构的环上或是远离茎环结构的核酸链上以利于和RNA聚合酶结合，从而得到新的核心区序列。
在本实施例中申请人以地衣芽孢杆菌DW2(CN108277191B)的启动子为例进行说明，首先对地衣芽孢杆菌DW2的P43、R5和PbacA所示序列的二级结构进行预测，其结果如图1、2、3所示。在地衣芽孢杆菌DW2中，启动子核心区的为：P43核心区序列：gtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaat；R5核心区序列：ttctcaccttgacaaagcgcgctaaaatttataatgtaaaaagccattgacattctcatattatatatttataattaaaat；PbacA核心区序列：gtaaaagagcaactacagaccaatattat。
经改造后，P43D核心区序列：ttgacaaaaagcgcgcgattatgtaaaat；R5D核心区序列：ttctcaccttgacaaagcgcgctaaaatttataatccccccccccgtaaaaagccattgacattctcatattatatatttataattaaaat；PbacAD核心区序列：gtaaaagagcaactgcagaccaatattat。
实施例2：
一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法在地衣芽孢杆菌DW2和枯草芽胞杆菌168应用：
1)以绿色荧光蛋白GFP为研究对象，分别以本实验早期构建的质粒pHY-P43-GFP(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)、pHY-R5-GFP(将人工合成启动子R5替换质粒pHY-P43-GFP中的启动子P43后所得)和pHY-PbacA-GFP(DOI:10.1021/acssynbio.1c00242)作为模板，通过表1的引物，PCR扩增出包含优化启动子的载体骨架，并进行DNA回收；
表1：核心区二级结构理性设计的启动子表达载体引物设计
2)利用DpnI酶对残留的pHY-P43-GFP、pHY-PbacA-GFP和pHY-R5-GFP模板进行消化；
3)采用Vazyme的同源重组酶(Exnase II)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；随后进行钙转，将其转入大肠杆菌DH5α中；最后通过测序验证后，提取质粒，即得到含有核心区二级结构理性设计优化启动子的重组质粒，分别为pHY-P43D-GFP、pHY-PbacAD-GFP和pHY-R5D-GFP；
4)将步骤3)得到的重组质粒分别转入地衣芽孢杆菌DW2中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落PCR筛选得到阳性转化子，从而获得重组工程菌DW2/P43D-GFP、DW2/PbacAD-GFP和DW2/R5D-GFP。
对照菌株DW2/P43-GFP、DW2/PbacA-GFP和DW2/R5-GFP的制备：直接将pHY-P43-GFP、pHY-PbacA-GFP和pHY-R5-GFP转入地衣芽孢杆菌DW2中获得。
5)工程菌种子活化：从甘油管以体积百分比1％将步骤6得到的工程菌与相应地对照菌株分别接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；
所述的发酵培养基即为LB培养基。
6)工程菌发酵：向500mL三角瓶中装入50mL LB液体发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。
7)GFP荧光强度检测：取0.2mL发酵液于2mL EP管，加入1.8mL PBS缓冲液，用可见光分光光度计测其生物量(OD600)。然后用PBS缓冲液将发酵液相应稀释到终浓度(OD600)为1，终体积2mL，随后7000rpm，2min，接着用2mL PBS缓冲液重悬，重复一次，最后用酶标仪检测其荧光强度，该结果见图4。
由图4可知：对照菌株DW2/P43-GFP、DW2/PbacA-GFP和DW2/R5-GFP表达的GFP荧光强度(RFU/OD600)为1.79×105、3.48×105、170.61×105，而P43D、PbacAD和R5D介导表达的GFP荧光强度依次为12.89×105、12.18×105、300.27×105。从而，与启动子P43相比，启动子P43D使提高了GFP表达水平提高了6.20倍；与启动子PbacA相比，启动子PbacAD使提高了GFP表达水平提高了2.50倍；而与启动子R5相比，启动子R5D使提高了GFP表达水平提高了0.76倍。
同时，该结果证明了我们提供了基于核心区二级结构理性设计提高启动子活性的方法具有可行性，其适用于地衣芽孢杆菌不同启动子活性的改善。
然而，我们以相同的方式，将其应用于枯草芽孢杆菌168中，发现PbacA表达的GFP荧光强度为1.68×105，而PbacAD介导表达的GFP荧光强度为1.51×105(图5)。这一结果与其在地衣芽孢杆菌不一致。由于不同启动子在不同遗传宿主中的背景差异较大，其暗示着这种提高启动子活性的方法不全适用于所有芽孢杆菌属。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (1)
1.一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法在提高地衣芽胞杆菌启动子活性中的应用；应用过程中，提高活性后的启动子，是将P43启动子中的核心区序列：gtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaat替换为P43D核心区序列：ttgacaaaaagcgcgcgattatgtaaaat；
或将R5启动子中的核心区序列：ttctcaccttgacaaagcgcgctaaaatttataatgtaaaaagccattgacattctcatattatatatttataattaaaat替换为R5D核心区序列：ttctcaccttgacaaagcgcgctaaaatttataatccccccccccgtaaaaagccattgacattctcatattatatatttataattaaaat；
或将PbacA启动子中的核心区序列：gtaaaagagcaactacagaccaatattat替换为PbacAD核心区序列：gtaaaagagcaactgcagaccaatattat；
所述的方法，包括下述步骤：
1）对待改造的启动子核心区域序列的二级结构进行预测；
2）基于步骤1）中所得的二级结构，分别替换和/或增添碱基以改变启动子核心区的-35区和-10区的位置，使启动子核心区的-35区和-10区在茎环结构的环上或是远离茎环结构的核酸链上以利于和RNA聚合酶结合，既得新的核心区序列；
所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽孢杆菌DW2。
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| CN202210473176.3A CN114645049B (zh) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | 一种基于核心区二级结构改造提高启动子活性的方法和应用 |
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Citations (7)
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| CN105296486A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-03 | 湖北大学 | 一种启动子文库构建方法和强启动子 |
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| CN112226437A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-01-15 | 湖北大学 | 梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用 |
| CN113106095A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-13 | 湖北大学 | 用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用 |
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| CN114008202A (zh) * | 2019-06-21 | 2022-02-01 | 格礼卡姆股份公司 | 用于体外和体内基因表达的包含5’utr茎环的核酸构建体 |
-
2022
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Patent Citations (7)
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| CN114008202A (zh) * | 2019-06-21 | 2022-02-01 | 格礼卡姆股份公司 | 用于体外和体内基因表达的包含5’utr茎环的核酸构建体 |
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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