CN111893115B - 一种低温和qs双重诱导型启动子及其应用 - Google Patents

一种低温和qs双重诱导型启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低温和QS双重诱导型启动子及其应用，本发明提供的启动子来源于荧光假单胞菌PF08，该启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明所述的启动子能够在低温和/或信号分子诱导下启动低细胞密度的宿主细胞表达大量外源目的蛋白。本发明提供的的低温和QS双重诱导型启动子，使蛋白表达可控化，不仅可以应用于食品、医学等领域相关蛋白的生产，还为研究特定蛋白的生物学功能提供新方法。

Description

一种低温和QS双重诱导型启动子及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种低温和QS双重诱导型启动子及应用。
技术背景
启动子(Promoters)是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA进行准确结合并具有转录起始的特异性，控制基因表达的起始时间和表达强度。启动子一般是含有顺式作用元件的一段DNA序列，其在基因的表达调控中起着关键作用：决定下游基因转录的特异性、方向和效率。此外，启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因表达的时空顺序、表达强度、转录效率和基因的表达水平。所以，研究启动子的功能对于基因表达调控机制和日渐成熟的基因工程具有非常重要的科学意义。
通过对多种基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式，一般由启动子核心元件和上游元件组成。比如在某些植物功能启动子中，位于转录起始位点上游-20～-30bp处的TATA box为启动子的核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA(脱氧核糖核酸)双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATA box上游的保守序列称为启动子上游元件，包括-75bp处的CAAT box和-80～-110bp附近的GC box等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸类物质应答元件(JRE)、乙烯响应元件(ERE)等元件(张春晓,王文棋,蒋湘宁,等.植物基因启动子研究进展[J].遗传学报,2004,31(12):1455-1464；路静,赵华燕,何奕昆,等.高等植物启动子及其应用研究进展[J].自然科学进展,2004,8:002.)。其中，CAAT box是比较保守的序列，与RNA(核糖核酸)聚合酶的识别和结合有关，对基因转录具有较强的激活作用。只要具有了这些保守的结构框，那么就可以具有响应的启动下游基因表达的功能。
诱导型启动子(Inducible Promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以显著地提高基因的转录水平。目前，针对诱导性启动子的研究虽然有一些涉及，但是还不是非常成熟，在一些物种和微生物中的相关研究也不是非常多，仍有进一步开发的空间。
低温诱导型(Low-Temperature-Inducible)启动子，是指在低温刺激下，可以大幅度提高基因转录水平的一种启动子。低温表达体系能大大降低蛋白包涵体的形成，还能够显著提高异源蛋白的稳定性，尤其是一些热敏蛋白。群体感应(Quorum Sensing)是细菌细胞间信息传递的普遍机制，细菌通过合成、分泌信号分子(又称自诱导分子)来控制整个细菌群体行为，当信号分子浓度随着细菌群体密度达到一定阈值时，即可启动某些特定基因的大量表达，以调节细菌群体适应功能。现有技术中已经有从丁香假单胞菌MB03中克隆得到了冰核基因inaQ启动子，通过转录活性进行相对定量分析,通过分别在16℃和28℃培养条件下其生长阶段的基因转录活性水平的比较,结果显示该启动子在16℃培养下冰核基因的转录水平明显高于丁香假单胞菌的正常培养温度28℃下的水平,在对数生长中后期前者是后者的将近两倍,而到稳定期中期则达到接近6倍,并且在16℃下有利于冰核基因的持续转录表达(孟姗，丁香假单胞菌MB03冰核蛋白基因低温依赖型启动子转录活性的研究)，这充分的体现了低温启动子具有较好的低温表达的优势。
尽管许多原核生物和真核生物都能表达外源基因，但大多数重组DNA技术生产的具有商业价值的蛋白质都是在大肠杆菌中合成的。大肠杆菌的最适生长温度是37℃，但其在低温环境下(4℃)生长缓慢，因此在最适温度(37℃)下才能高效表达的载体在低温诱导下表达就不能满足人们对表达量的要求。此外，XW Yang等人构建的低温诱导基因表达质粒虽然可以在低温下诱导表达蛋白(XW Yang,2015,Applied&Environmental Microbiology,5519)，但是要产生大量满足需求的外源蛋白，需要将宿主菌培养至对数后期，耗时长。
荧光假单胞菌属于适冷微生物，是一种环境污染菌，也是冷藏条件下食物的主要腐败菌之一(郭全友，2009，食品与机械，87-90)。研究表明，荧光假单胞菌具有群体感应现象，当群体密度升高时，腐败能力加强(马晨晨，2013，微生物学通报，2005-2013)。因此，利用荧光假单胞菌适冷和受QS调控的特性，筛选出受低温和/或QS双重诱导的启动子PFF，基于此构建的质粒仅在低温低细胞密度条件下，通过加入不同浓度的信号分子就能准确迅速且可控化地表达大量目的蛋白，满足对多种表达的需求。虽然荧光假单胞菌的基因组已经公开，具体如Pseudomonas fluorescens strain PF08 chromosome,complete genome，Sequence ID:CP032618.1所示，但是针对PF08的启动子研究，特别是涉及低温的启动子研究目前还没有涉及。
本发明提供的低温和/或QS诱导的启动子与本领域中已知的现有启动子相比，兼具低温低细胞密度强诱导表达特性和目的蛋白表达量可控性，大幅提高蛋白表达效率，并且为研究特定蛋白的生物学功能提供新方法。
发明内容
本发明的目的是提供能在低温和/或QS诱导时启动目的基因表达的启动子pWFF1028及其应用。
本发明提供的启动子来源于荧光假单胞菌PF08，该启动子位于基因norD的5’-非编码区。核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体的，SEQ ID NO.1的序列为:
CAATCCCCAAGAGGGCGGCCCGGCAGGTTCTGCGGGCCGTTTTACGTCTGGAGCACTTCACATGGCCTTTACCCTTGAGTTGGAAGAGTGGGTCGGCAGTGTCTGGC。
本发明的目的是提供一种低温和/或QS诱导时启动目的基因表达的启动子pWFF1028，所述启动子具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步地，本发明还提供了含有所述启动子的表达载体。其中所述表达载体优选微生物表达载体，更优选如大肠杆菌或荧光假单胞菌的载体。
进一步地，本发明还提供上述表达载体的转化体，其中所述转化体为大肠杆菌。
本发明的另一个目的是提供上述启动子在制备转基因微生物中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述表达载体在制备转基因微生物中的应用，其中所述转基因微生物为大肠杆菌或者荧光假单胞菌。
本发明的又一个目的是提供一种利用所述启动子制备转基因微生物的方法，包括下述步骤：
(1)构建具有如SEQIDNo.1所示序列的启动子；
(2)将所述启动子可操作地插入表达载体中，构建微生物表达载体；
(3)将步骤(2)获得的微生物表达载体转化宿主，获得转基因微生物。
本发明中，采用基因工程方法，将所述启动子插入到适宜的表达载体中即可获得含有该启动子的微生物表达载体。
本发明将上述微生物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。具体的，采用电击法将含有启动子的表达载体转化到靶标微生物中获得转化体。
将本发明的启动子与报告基因构建表达载体，将所述表达载体转化宿主获得含启动子的转化体。所述转基因宿主优选为荧光假单胞菌或大肠杆菌。
优选的表达载体为商业化广宿主表达载体pBBR1MCS-5。
本发明提供了一种使荧光假单胞菌在低温诱导下表达目的基因的方法，其是将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，并将该重组载体导入到荧光假单胞菌中，在低温(4-15摄氏度)条件下诱导目的基因的表达。
本发明提供了一种使荧光假单胞菌在信号分子3-oxo-C8-HSL诱导下表达目的基因的方法，其是将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，并将该重组载体导入到荧光假单胞菌中，在添加一定浓度信号分子条件下诱导目的基因的表达。
本发明还提供了一种含有所述启动子的重组载体在荧光假单胞菌中研究特定蛋白生物学功能的应用。
与现有技术相比，本发明提供的启动子兼具低温低细胞密度强诱导表达特性和诱导表达的可控性，大大降低蛋白包涵体的形成，显著提高蛋白稳定性和蛋白表达效率，并且为研究特定蛋白的生物学功能提供新方法。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1.该启动子可特异性驱动下游目的基因在低温或者信号分子3-oxo-C8-HSL诱导下表达，具有诱导表达特异性。
2.本发明所述的启动子能够在低温和/或信号分子诱导下启动低细胞密度的宿主细胞表达大量外源目的蛋白。本发明提供的的低温和/或QS诱导型启动子，使蛋白表达可控化，不仅可以应用于食品、医学等领域相关蛋白的生产，还为研究特定蛋白的生物学功能提供新方法。
附图说明
图1为低温/QS双重诱导型启动子pWFF1028的PCR电泳检测图；
图2为重组载体图谱；
图3为不同温度条件下的GFP强度结果图；
图4为不同信号分子浓度下GFP强度结果图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明的方法进行详细的描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法所用的试验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：低温和/或QS诱导型启动子pWFF1028序列的确定
1.将荧光假单胞菌PF08接种在LB肉汤里分别在4℃和30℃下培养，用E.Z.N.A.Total RNA Kit(OMEGA)分别提取4℃和30℃下培养到对数前期和对数中后期的荧光假单胞菌PF08总RNA，用Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪对提取的RNA进行纯度检测。经测定，其OD符合建库要求。所述荧光假单胞菌PF08保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号：CCTCC AB 2019272，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2019年07月17日。
2.取步骤1提取的总RNA，
Figure BDA0002367112540000051
II Q RT SuperMix(+gDNA wiper)(Vazyme)试剂盒进行逆转录得到cDNA，采用Illumina Truseq RNA sample prep Kit试剂构建文库，进行原核链特异性转录组测序。
3.根据步骤2的转录组测序结果得到同时满足低温和高密度下表达水平显著上升的基因norD，根据荧光假单胞菌PF08基因组数据库，得到该基因上游5’-非编码区2000bp序列。利用启动子预测软件得到打分最高的107bp启动子序列pWFF1028。
实施例2：pWFF1028启动子序列的分离及重组表达载体的构建
1.根据选用的载体pBBR1MCS-5特点，设计引物的酶切位点，其中上游引物(5’-CTATAGGGCGAATTGGAGCTCcaatccccaagagggcggc-3’)带有SacI酶切位点：GAGCTC，下游引物(5’-GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGgccagacactgccgac-3’)带有XhoI酶切位点：CTCGAG，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.提取荧光假单胞菌PF08 DNA作为模板，根据步骤1设计的引物进行启动子的PCR扩增，PCR反应体系为：DNA模板1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；dNTP4μL；5×pfu buffer10μL；pfu Enzyme 1μL；ddH2O 32μL。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
3.用1.0％的琼脂糖凝胶电泳验证步骤2的PCR结果，见图1。107bp条带即为目标条带，经测序，其序列如SEQ ID NO：1所示，即为pWFF1028启动子。
4.用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit将步骤3验证PCR成功的启动子片段连接到载体pBBR1MCS-5上，重组载体图谱见图2。反应体系为：5×CE Multis buffer 4μL；克隆载体50～200ng；DNA扩增片段20～200ng；Exnase Multis 2μL；ddH2O加到总体系为20μL。混匀反应液，置于37℃反应30min。反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，储存于-20℃备用。
实施例3：pWFF1028启动子功能验证
1.以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因，用XbaI和SacI核酸内切酶酶切上述重组表达载体，用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit将EGFP片段与重组表达载体的pWFF1028启动子相连，得到重组表达载体pWFF1028::EGFP。反应体系为：5×CEMultis buffer 4μL；克隆载体50～200ng；DNA扩增片段20～200ng；Exnase Multis 2μL；ddH2O加到总体系为20μL。混匀反应液，置于37℃反应30min。反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，储存于-20℃备用。
2.将步骤1构建好的重组载体转化到E.coli WM3064感受态细胞，转化条件如下：取5μL步骤2得到的反应液加入到100μL E.coli WM3064感受态细胞，冰上放置30min，42℃热激45s，冰水浴2min；加入1mL LB培养基，37℃摇菌1h；取100μL菌液涂布到含有庆大霉素的平板上，于37℃培养过夜。
3.将步骤2转化有重组质粒的E.coli WM3064与荧光假单胞菌PF08进行接合，得到重组菌，
4.取步骤3得到的重组菌，接种于含有庆大霉素的LB肉汤中，分别于25℃和4℃摇床培养，待生长到对数中后期，吸取200μL菌液到96孔酶标板中，用SpectraMax i3x进行EGFP荧光检测，其中激发光波长为485nm，吸收波长为535nm。根据荧光强度，与25℃相比，4℃下EGFP的表达量提高了18.74倍(如图3所示)，表明pWFF1028启动子能够在低温胁迫下高度诱导EGFP基因的表达，保证其活性。
5.取步骤3得到的重组菌，接种于含有庆大霉素的LB肉汤中，于4℃下培养至OD600＝0.3，加入终浓度为0，10，50，100μM的3-oxo-C8-HSL，继续培养3h，然后吸取200μL菌液到96孔酶标板中，用SpectraMax i3x进行EGFP检测，其中激发光波长为485nm,吸收波长为535nm。如图4所示，与对照组相比，EGFP的表达量随着信号分子3-oxo-C8-HSL浓度的增加而增加，在100μM3-oxo-C8-HSL的诱导下，EGFP的表达量达到对数中后期水平，大大缩短了培养时间。
从以上结果可以看出，本发明所述的启动子能够在低温和/或信号分子诱导下启动低细胞密度的宿主细胞表达大量外源目的蛋白。本发明提供的的低温和/或QS诱导型启动子，使蛋白表达可控化，不仅可以应用于食品、医学等领域相关蛋白的生产，还为研究特定蛋白的生物学功能提供新方法。
序列表
<110> 浙江工商大学
<120> 一种低温和QS双重诱导型启动子及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> DNA
<213> 荧光假单胞菌(P.fluorescens)
<400> 1
caatccccaa gagggcggcc cggcaggttc tgcgggccgt tttacgtctg gagcacttca 60
catggccttt acccttgagt tggaagagtg ggtcggcagt gtctggc 107

Claims (1)

1.一种低温和QS双重诱导型启动子，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
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