CN113106095A

CN113106095A - 用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用

Info

Publication number: CN113106095A
Application number: CN202110392656.2A
Authority: CN
Inventors: 王勤; 陈守文; 张曼玉; 蔡东波; 肖军; 宋静
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2041-04-13
Also published as: CN113106095B

Abstract

本发明属于基因工程和微生物工程技术领域，公开了用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用，所述的序列为SEQ ID NO.1所示。本发明通过改造启动子的5’非翻译区，从而促使目的基因从多个翻译起始位点进行翻译。在地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中，绿色荧光蛋白的表达量较原始启动子P43启动子分别提高了约150倍和126倍。在谷氨酸棒杆菌中，绿色荧光蛋白的表达量较原始启动子提高了36倍。同时，该mRNA前导序列也显著提高了地衣芽孢杆菌中角蛋白酶的表达量，证明了该序列对于提高革兰氏阳性菌蛋白表达效率的普适性。

Description

用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物工程技术领域，具体涉及用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用。

背景技术

地衣芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌以及谷氨酸棒杆菌均为公认安全(GRAS)的革兰氏阳性菌。由于其生物安全性，能够产生多种有价值的代谢产物以及易于基因改造等特征，它们是极其重要的工业微生物生产菌株。目前，研究人员已经对这些菌株蛋白表达的各个阶段采取一系列优化措施来提升异源蛋白的表达效率，包括启动子优化，信号肽筛选，蛋白酶敲除等。

原核生物mRNA的5’非翻译区(5’-UTR)通常包含核糖体绑定位点和其它可能存在的翻译增强序列，是决定mRNA翻译效率的关键性因素，同时可以保护mRNA的5’端不受RNA酶的攻击，从而增强mRNA的稳定性。原核生物的核糖体30S小亚基通过mRNA上的SD序列与mRNA分子相结合，使下游的起始密码子定位在核糖体的P点上，从而确定翻译起始的第一个起始密码子。因此，mRNA 5’-非翻译区(UTR)的SD序列强度以及SD序列到起始密码子的距离对于翻译起始起着至关重要的作用。在原核生物中，通常认为基因由SD序列和起始密码子共同确定唯一的翻译起始位点。目前尚未发现在启动子区域构建多拷贝RBS序列可以提高外源蛋白表达量的报道。

在之前的研究中，申请人公开了《一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法》以及SCI文章“Facilitating Protein Expression with Portable 5’-UTR SecondaryStructure in Bacillus licheniformis”，对芽孢杆菌中广泛使用的P43启动子进行改造，在5’-UTR区构建了一个茎环结构，使得核糖体结合位点(RBS)处于暴露状态，这样的结构有效提高了多个蛋白的表达量。在提供本发明技术方案之前，申请人尝试将上述两个公开文件中提供的单拷贝的序列，进行多拷贝串联，发现串联序列可以进一步提高蛋白的表达量，但提高幅度并不显著。因此，针对上述问题，申请人对于如何提高蛋白表达量进行了进一步的探索。

发明内容

本发明的目的在于提供了用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列，所述的序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的的另一个目的在于提供了用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列在提高外源蛋白在革兰氏阳性菌表达效率中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列，所述的序列为SEQ ID NO.1所示用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列在提高外源蛋白在革兰氏阳性菌表达效率中的应用，所述是应用过程包括将N个SEQ ID NO.1所示的串联后连接在外源蛋白翻译的起始密码子前端；所述的N为1-6之间的自然数。

以上所述的应用中，优选的，所述的革兰氏阳性菌为：用于表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2、枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌168、谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌13032。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明将RBS序列进行了改造并串联后，连接到蛋白翻译的起始位点前段，发现在革兰氏阳性菌中，每个RBS都可以成为一个蛋白翻译起始位点，从而蛋白的表达量随串联序列的增加得到了进一步提高，以绿色荧光蛋白表达为例，最终6个RBS序列的串联比单个RBS的绿色荧光蛋白表达量增加了约5倍。

在重要革兰氏阳性菌工业菌株地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中以绿色荧光蛋白(GFP)为对其蛋白表达的效果进行测试。在地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中，绿色荧光蛋白的表达量较原始启动子P43启动子分别提高了约150倍和126倍。在谷氨酸棒杆菌中，绿色荧光蛋白的表达量较原始启动子提高了36倍。

附图说明

图1为5’-UTR区带有单拷贝和六拷贝RBS(核糖体结合位点)的绿色荧光蛋白基因示意图。

图2为带有不同拷贝数RBS的重组绿色荧光蛋白地衣芽孢杆菌工程菌株的荧光蛋白的相对表达量。

图3为带有不同拷贝数RBS的重组绿色荧光蛋白枯草芽孢杆菌工程菌株的荧光蛋白的相对表达量。

图4为带有不同拷贝数RBS的重组绿色荧光蛋白谷氨酸棒状杆菌工程菌株的荧光蛋白的相对表达量。

图5为SDS-PAGE检测角蛋白酶表达量示意图；

其中：Line 1～3：DW2/pHY300PLK、Line 4～6：DW2/A1-ker、Line 7～9：DW2/repeat6-ker。

图6为载体A1-repeatN(N为2-10的自然数)-GFP的构建流程示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明以两种蛋白(绿色荧光蛋白和角蛋白酶)为例，说明本发明技术方案的优越性；但在实际操作过程中，并不局限于这两种蛋白。

本发明所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2(Wang等，Appl,Biochem.Biotechn ol.2017)，其余地衣芽胞杆菌也能完成本发明；枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168为本领域的模式微生物，基因组序列为NZ_CP010052.1，其余枯草芽孢杆菌也能完成本发明。谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，本发明或简称为谷氨酸棒状杆菌13032，其余谷氨酸棒状杆菌也能完成本发明。所述的地衣芽胞杆菌WX-02的保藏编号为CCTCC NO：M208065，已在申请号为200910272770.0的申请中公开。

本发明实施例中，在进行基因片段及线性质粒等需要高保真的的PCR产物扩增时，采用全式金高保真的

FastPfu DNA Polymerase，依次向PCR体系中加入以下各成分，加入各成分按照体积从大到小、最后加酶的原则进行添加，各成分的添加量依次为模板1μl、上游引物F 1μl、下游引物R 1μl、5×Buffer 10μl、2.5mM dNTP 5μl、加ddH₂O至总体系50μl；

在扩增大于5000bp长度的PCR的产物时，在上述体系中加入1μl 50mM MgSO₄以提高PCR反应的效率；

当对多个片段进行SOE-PCR反应进行连接时，采用高保真的北京擎科公司的金牌Mix，向PCR反应体系依次加入一下成分:模板1μl、上游引物F1μl、下游引物R1μl、金牌Mix补至50μl；

注：#退火温度根据引物Tm值上下浮动，PCR延伸时间根据PCR产物片段大小进行变动，换算关系则为5～10s延伸1kb，最长延伸时间不超过3min；

对大肠杆菌和芽胞杆菌以及棒状杆菌转化子进行菌落PCR验证时，采用2×TaqMaster Mix，各成分的添加量依次为模板8μl、上游引物F1μl、下游引物R1μl、2×TaqMaster Mix 10μl。

注：#退火温度根据引物Tm值上下浮动，PCR延伸时间根据PCR产物片段大小进行变动，使用

FastPfu DNA Polymerase换算关系则为1min延伸3kb，使用2×TaqMaster Mix换算关系则为1min延伸1kb，但是所有DNA聚合酶每次最长延伸时间不超过3min。

实施例1：

适用于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的5’-UTR单拷贝RBS的表达绿色荧光蛋白(GFP)载体的构建：

对于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌，基因表达载体是以pHY300PLK为基础表达载体进行设计的：

1、根据NCBI数据库发布的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43，其5‘-UTR原始序列为GTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC；设计引物如下：

P43-F：GCGGAATTTCCAATTTCA

P43-R：GTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA

2、以步骤1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43-repeat-R，将P43启动子的5’-UTR区域由原始的GTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC变为GTGATAGCAGATCTAGAAAGGAGGAAGGATCA(SEQ ID NO.1所示)，通过PCR扩增出启动子A1；设计引物如下；

P43-F：TGGAAAAACGCTTTGCCCGCGGAATTTCCAATTTCA

P43-repeat-R：TGATCCTTCCTCCTTTCTAGATCTGCTATCACTTTATATTTTACATAATCGC

3、设计报告蛋白绿色荧光蛋白(GFP)的扩增引物，利用Primer Primier 5软件设计引物GFP-F和GFP-R，扩增出来源于带有进行了密码子优化的绿色荧光蛋白(GFP)基因，模板为pBI-SS(Tom)(TP)101-eGFP质粒(质粒购买自武汉擎科伟业生物科技有限公司)；

设计引物如下：

GFP-F：CTAGAAAGGAGGAAGGATCAATGGTCAGCAAAGGCGAAGA

GFP-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTG；

4、设计淀粉酶终止子TamyL的扩增引物，利用Primer Primier 5软件设计引物Tamy-F/R，以地衣芽胞杆菌WX-02为模板扩增淀粉酶终止子TamyL；

设计引物如下：

Tamy-F：CACCACCACCACCACTAAAAGAGCAGAGAGGACGGA

Tamy-R：AGGAATTCCCGGGGATCCCGCAATAATGCCGTCGCA

5、将纯化后的启动子P43、报告基因GFP、淀粉酶终止子TamyL片段进行SOE-PCR，将SOE-PCR产物进行回收纯化。

6、设计引物pHY-T5-F/R通过PCR对载体pHY300PLK进行线性化，将PCR产物进行回收纯化；

pHY-T5-F：GGATCCCCGGGAATTCCT

pHY-T5-R：GGGCAAAGCGTTTTTCCA

7、然后使用诺唯赞公司重组酶Exnase II在体外将线性载体pHY300PLK和线性SOE-PCR片段进行环化，将环化的载体通过氯化钙转化法转化到大肠杆菌DH5α。在37℃的条件下经含有四环抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子；

8、通过引物pHY-F/R对转化子进行菌落PCR筛选，对阳性转化子抽质粒并进行DNA测序验证，验证结果正确表明基因表达载体构建成功，将该载体命名为A1-repeat1-GFP。

设计引物如下：

pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC

pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC。

实施例2：

适用于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的表达绿色荧光蛋白(GFP)载体的构建：

多拷贝RBS表达载体是以A1-repeat1-GFP进行设计的：

1、以A1-repeat1-GFP作为模板，在5’-UTR位置设计引物。其中正向引物GFP-repeat-F包含单拷贝质粒5’-UTR的末端18nt碱基及GFP基因5’-端18nt碱基，反向引物GFP-repeat-R为两拷贝的5’-UTR反向序列；

设计引物如下：

GFP-repeat-F：AGAAAGGAGGAAGGATCAATGGTCAGCAAAGGCGAA

GFP-repeat-R：TGATCCTTCCTCCTTTCTAGATCTGCTCACTGATCCTTCCTCCTTTCT

2、通过设计的引物对单拷贝质粒A1-repeat1-GFP进行PCR反应，多拷贝扩增原理是因为GFP-repeat-R引物为双拷贝可以首尾搭桥，不断延伸，从而使反向引物端5’-UTR序列具有多个拷贝数；然后再利用T5外切酶(诺唯赞，南京，中国)将PCR产物的两端切出互补的粘性末端并转入大肠杆菌DH5α中进行连接，并利用菌落PCR对连接载体中重复序列的个数进行验证，得到带有一系列不同拷贝数的串联重复序列。载体A1-repeatN(N为2-10的自然数)-GFP的构建流程如图6所示。

3、对PCR得到的线性载体进行回收和纯化；

4、然后使用诺唯赞公司重组酶Exnase II在体外将线性载体进行环化，将环化的载体通过氯化钙转化法转化到大肠杆菌DH5α。在37℃的条件下经含有四环抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子；

5、设计引物repeat-YF/YR对转化子进行筛选，根据菌落PCR产物长度初步判断5’-UTR的拷贝数，对阳性转化子抽质粒并进行DNA测序验证，从而获得一系列不同拷贝数的RBS的5’-UTR表达载体；

设计引物如下：

Repeat-YF:TTTAGAAATGGGCGTGAA

Repeat-YR:CAGTTCTTCGCCTTTGCT。

本发明将适用于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌含有不同RBS拷贝数的表达绿色荧光蛋白(GFP)载体依次命名为：A1-repeat1-GFP(图1中上图)、A1-repeat2-GFP、A1-repeat3-GFP、A1-repeat4-GFP、A1-repeat5-GFP、A1-repeat6-GFP(图1中下图，该质粒含有SEQ ID NO.2所示的多拷贝序列)、A1-repeat8-GFP、A1-repeat10-GFP

实施例3：

适用于谷氨酸棒状杆菌13032的5’-UTR单拷贝RBS的表达绿色荧光蛋白(GFP)载体的构建：

对于谷氨酸棒状杆菌13032，基因表达载体是以商业化载体pEC-XK99E为基础进行设计的：1、利用pEC-XK99E载体上自身的启动子P_trc(除去UTR序列区域)以及终止子rrnB T1terminator区域作为本实施的启动子以及终止子序列，设计引物pEC-T5-F/R通过PCR对载体pEC-XK99E进行线性化，将PCR产物进行回收纯化；

设计引物如下：

pEC-T5-F：ACACATTATACGAGCCGGAT

pEC-T5-R：CTGCAGGTCGACTCTAGATTATTTATACAGTTCATCCA

2、设计报告蛋白绿色荧光蛋白(GFP)的扩增引物，利用Primer Primier 5软件设计引物GFP-F和GFP-R，扩增出来源于A1-repeat1-GFP的5’-UTR单拷贝RBS绿色荧光蛋白(GFP)基因；

设计引物如下：

GFP-F：GAGGAATGTACACATGAAATGGTCAGCAAAGGCGAA

GFP-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTG

3、然后使用诺唯赞公司重组酶Exnase II在体外将线性载体pEC-XK99E和线性PCR片段进行环化，将环化的载体通过氯化钙转化法转化到大肠杆菌DH5α。在37℃的条件下经含有卡那抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子；

4、通过引物pEC-F/R对转化子进行菌落PCR筛选，对阳性转化子抽质粒并进行DNA测序验证，验证结果正确表明基因表达载体构建成功，将该载体命名为C1-repeat1-GFP；设计引物如下：

pEC-F：TAACGGTTCTGGCAAATA

pEC-R：GACCGCTTCTGCGTTCTG。

实施例4：

适用于谷氨酸棒状杆菌13032的5’-UTR多拷贝RBS的绿色荧光蛋白(GFP)载体的构建：

多拷贝表达载体是以5’-UTR单拷贝RBS的表达绿色荧光蛋白(GFP)载体为基础表达载体进行设计的：

1、以C1-repeat1-GFP作为模板，在5’-UTR位置设计引物。其中正向引物GFP-repeat-F包含单拷贝质粒5’-UTR的末端18nt碱基及GFP基因5’-端18nt碱基，反向引物GFP-repeat-R为两拷贝的5’-UTR反向序列，反向引物的3’-端可根据实验需求相应缩短；

设计引物如下：

GFP-repeat-F：AGAAAGGAGGAAGGATCAATGGTCAGCAAAGGCGAA

GFP-repeat-R：TGATCCTTCCTCCTTTCTAGATCTGCTCACTGATCCTTCCTCCTTTCT

2、通过设计的引物对单拷贝质粒C1-repeat1-GFP进行PCR反应，因为GFP-repeat-R引物为双拷贝可以首尾搭桥，不断延伸，从而使反向引物端5’-UTR序列具有多个拷贝数；

3、对PCR得到的线性载体进行回收和纯化；

4、然后使用诺唯赞公司重组酶Exnase II在体外将线性载体进行环化，将环化的载体通过氯化钙转化法转化到大肠杆菌DH5α。在37℃的条件下经含有卡那抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子；

设计引物如下：

Repeat-YF:TTTAGAAATGGGCGTGAA

Repeat-YR:CAGTTCTTCGCCTTTGCT。

本发明将适用于谷氨酸棒状杆菌的含有不同RBS拷贝数的表达绿色荧光蛋白(GFP)载体依次命名为：C1-repeat1-GFP、C1-repeat2-GFP、C1-repeat3-GFP、C1-repeat4-GFP、C1-repeat5-GFP、C1-repeat6-GFP。

实施例5：

适用于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的5’-UTR单拷贝RBS的表达角蛋白酶载体的构建：基因表达载体是以pHY300PLK为基础表达载体进行设计的：

1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；

设计引物如下：

P43-F：GCGGAATTTCCAATTTCA

P43-R：TTCGCCTTTGCTGACCATTTCATGTGTACATTCCTC

2、设计报告蛋白角蛋白酶(Ker)的扩增引物，利用Primer Primier 5软件设计引物Ker-F和Ker-R，以地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA为模板扩增出角蛋白酶(Ker)；

设计引物如下：

Ker-F：TAAGAGAGGAATGTACACATGAGAGGCAAAAAGGTA

Ker-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTACTGAGCTGCCGCCTG

3、设计淀粉酶终止子TamyL的扩增引物，利用Primer Primier 5软件设计引物Tamy-F/R，以地衣芽胞杆菌WX-02为模板扩增淀粉酶终止子TamyL；

设计引物如下：

Tamy-F：CACCACCACCACCACTAAAAGAGCAGAGAGGACGGA

Tamy-R：AGGAATTCCCGGGGATCCCGCAATAATGCCGTCGCA

4、将纯化后的启动子P43、角蛋白酶(Ker)、淀粉酶终止子TamyL片段进行SOE-PCR，将SOE-PCR产物进行回收纯化；

5、设计引物pHY-T5-F/R通过PCR对载体pHY300PLK进行线性化，将PCR产物进行回收纯化；

6、然后使用诺唯赞公司重组酶Exnase II在体外将线性载体pHY300PLK和线性SOE-PCR片段进行环化，将环化的载体通过氯化钙转化法转化到大肠杆菌DH5α。在37℃的条件下经含有四环抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子；

7、通过引物pHY-F/R对转化子进行菌落PCR筛选，对阳性转化子抽质粒并进行DNA测序验证，验证结果正确表明基因表达载体构建成功，将该载体命名为A1-repeat1-Ker；设计引物如下：

pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC

pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC

实施例6：

适用于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的5’-UTR多拷贝RBS的表达角蛋白酶载体的构建：

多拷贝表达载体是以5’-UTR单拷贝RBS的表达角蛋白酶载体为基础表达载体进行设计的：

1、以A1-repeat1-Ker作为模板，在5’-UTR位置设计引物。其中正向引物Ker-repeat-F包含单拷贝质粒5’-UTR的末端18nt碱基及Ker基因5’-端18nt碱基，反向引物Ker-repeat-R为两拷贝的5’-UTR反向序列，反向引物的3’-端可根据实验需求相应缩短(同上)；

设计引物如下：

Ker-repeat-F：AGAAAGGAGGAAGGATCAATGAGAGGCAAAAAGGTA

Ker-repeat-R：TGATCCTTCCTCCTTTCTAGATCTGCTCACTGATCCTTCCTCCTTTCT

2、通过设计的引物对单拷贝质粒A1-repeat1-Ker进行PCR反应，因为Ker-repeat-R引物为双拷贝可以首尾搭桥，不断延伸，从而使反向引物端5’-UTR序列具有多个拷贝数；

3、对PCR得到的线性载体进行回收和纯化；

设计引物如下：

Repeat-YF:TTTAGAAATGGGCGTGAA

Repeat-YR:CAGTTCTTCGCCTTTGCT

在本发明中，将适用于衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的含有6个RBS拷贝数的表达角蛋白的载体命名为A1-repeat6-Ker。

实施例7：

地衣芽胞杆菌绿色荧光蛋白工程菌株的构建及荧光强度的检测：

一、将构建好的绿色荧光蛋白表达载体A1-repeat1-GFP、A1-repeat2-GFP、A1-repeat3-GFP、A1-repeat4-GFP、A1-repeat5-GFP、A1-repeat6-GFP、A1-repeat8-GFP、A1-repeat10-GFP分别电转化至地衣芽胞杆菌DW2中。以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以repeat-YF/YR作为验证引物，PCR验证得到阳性转化子，根据菌落PCR产物长度初步判断5’-UTR的拷贝数，对阳性转化子进行DNA测序验证，从而获得5’-UTR具有不同RBS数量拷贝数的绿色荧光蛋白重组表达菌株。

重组菌株分别命名为DW2/A1-repeat1-GFP、DW2/A1-repeat2-GFP、DW2/A1-repeat3-GFP、DW2/A1-repeat4-GFP、DW2/A1-repeat5-GFP、DW2/A1-repeat6-GFP、DW2/A1-repeat8-GFP、DW2/A1-repeat10-GFP；

二、重组载体转化地衣芽胞杆菌DW2菌落PCR验证步骤

待电转化涂抗性平板后，将转化子挑至相同的抗性平板上进行扩大培养，37℃静置培养6h后即可长出，随后将若干转化子分别挑部分至1.5mL EP管(加有30uL的ddH₂O)中，沸水浴煮菌15min，然后12000rpm离心2min，上清液作为菌落PCR验证模板待用；

三、地衣芽胞杆菌工程菌产绿色荧光蛋白(GFP)的发酵实验

种子发酵的具体步骤为：先将步骤一中制备的重组地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入50mL的LB发酵培养基，然后将种子培养的菌液(OD600 4.0-5.0)以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养24小时，得到生产发酵的菌液；

所述液体LB配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，pH7.2-7.4 250mL三角瓶装液量为50mL；

酶标仪测定发酵液中绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达量：

将细菌用LB培养基在37℃、230rpm条件下培养24h后收集菌体，使用等体积磷酸缓冲液PBS将收集菌体重悬，6000g离心3min，重复洗涤2次，然后用PBS缓冲液将菌体的生物量稀释到OD₆₀₀为1。取200μl稀释后的菌液与黑壁透底的康宁酶标板中。使用酶标仪测定样品的相对荧光强度(RFU)和OD₆₀₀的生物量，通过计算RFU/OD₆₀₀数值来表示荧光蛋白的相对表达量。其中测定绿色荧光蛋白时激发光波长为480nm，发射光波长为520nm；

根据上述方法测定出的不同多拷贝5’-UTR工程菌株的荧光表达量(如图2)所示，具体如表1所示；

从表1和图2中的数据可以看到，在茎环结构数量≤6时，随着茎环机构数量的增加，荧光蛋白的相对表达量逐渐增高，至6拷贝时的地衣芽胞杆菌绿色荧光蛋白表达菌株的荧光强度达到了2.4×10^7A.U.，是单拷贝的4.9×10^6A.U.的4.9倍，表明提高UTR拷贝数是可以提高5’-UTR的强度。但是实验从6拷贝继续增加拷贝数是，绿色荧光蛋白的强度并没有继续增加，其中8拷贝是的荧光强度为2.2*10^7A.U.，比6拷贝时的荧光强度低，并且10拷贝数时的荧光强度与6拷贝数时一样，数据表明6拷贝数为地衣芽孢杆菌的饱和拷贝数。表1用中的P43为对照组，即原始启动子P43启动子的地衣芽孢杆菌的GFP的表达量。

表1

实施例8：

枯草芽胞杆菌绿色荧光蛋白工程菌株的构建及荧光强度的检测：

一、将构建好的绿色荧光蛋白表达载体A1-repeat1-GFP、A1-repeat2-GFP、A1-repeat3-GFP、A1-repeat4-GFP、A1-repeat5-GFP、A1-repeat6-GFP分别电转化至枯草芽胞杆菌168中。以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以repeat-YF/YR作为验证引物，PCR验证得到阳性转化子，根据菌落PCR产物长度初步判断5’-UTR的拷贝数，对阳性转化子进行DNA测序验证，从而获得5’-UTR具有不同茎环数量拷贝数的绿色荧光蛋白重组表达菌株。

重组菌株分别命名为BS168/A1-repeat1-GFP、BS168/A1-repeat2-GFP、BS168/A1-repeat3-GFP、BS168/A1-repeat4-GFP、BS168/A1-repeat5-GFP、BS168/A1-repeat6-GFP；

二、重组载体转化枯草芽胞杆菌菌落PCR验证步骤

待电转化涂抗性平板后，将转化子挑至相同的抗性平板上进行扩大培养，37℃静置培养6h后即可长出，随后将若干转化子分别挑部分至1.5mL EP管(加有30uL的ddH2O)中，沸水浴煮菌15min，然后12000rpm离心2min，上清液作为菌落PCR验证模板待用。

三、枯草芽胞杆菌工程菌产绿色荧光蛋白(GFP)的发酵实验

种子发酵的具体步骤为：先将重组的枯草芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

酶标仪测定发酵液中绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达量：

将细菌用LB培养基在37℃、230rpm条件下培养24h后收集菌体，使用等体积磷酸缓冲液PBS将收集菌体重悬，6000g离心3min，重复洗涤2次，然后用PBS缓冲液将菌体的生物量稀释到OD₆₀₀为1。取200μl稀释后的菌液与黑壁透底的康宁酶标板中。使用酶标仪测定样品的相对荧光强度(RFU)和OD₆₀₀的生物量，通过计算RFU/OD₆₀₀数值来表示荧光蛋白的相对表达量。其中测定绿色荧光蛋白时激发光波长为480nm，发射光波长为520nm；根据上述方法测定出的不同绿色荧光蛋白重组工程菌株的荧光表达量(如图3)所示；

从表2和图3中的数据可以看到，在茎环结构数量≤5时，随着茎环机构数量的增加，荧光蛋白的相对表达量逐渐增高，至5拷贝时的枯草芽胞杆菌绿色荧光蛋白表达菌株的荧光强度达到了1.7×10^7A.U.，是单拷贝4.8×10^6A.U.的3.4倍，表明提高UTR拷贝数是可以提高5’-UTR的强度从5拷贝继续增加拷贝数量，荧光蛋白的相对表达量并没有继续增加，其中6拷贝时的荧光强度为1.6*10^7A.U.，比5拷贝时的荧光强度低，数据表明5拷贝数为枯草芽孢杆菌的饱和拷贝数。表2用中的P43为对照组，即原始启动子P43启动子的枯草芽孢杆菌的GFP的表达量。

表2

实施例9：

谷氨酸棒状杆菌绿色荧光蛋白工程菌株的构建及荧光强度的检测：

一、将构建好的绿色荧光蛋白表达载体C1-repeat1-GFP、C1-repeat2-GFP、C1-repeat3-GFP、C1-repeat4-GFP、C1-repeat5-GFP、C1-repeat6-GFP分别电转化至谷氨酸棒状杆菌13032中。以卡那素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以repeat-YF/YR作为验证引物，PCR验证得到阳性转化子，根据菌落PCR产物长度初步判断5’-UTR的拷贝数，对阳性转化子进行DNA测序验证，从而获得5’-UTR具有不同茎环数量拷贝数的绿色荧光蛋白重组表达菌株。

重组菌株分别命名为Cog/C1-repeat1-GFP、Cog/C1-repeat2-GFP、Cog/C1-repeat3-GFP、Cog/C1-repeat4-GFP、Cog/C1-repeat5-GFP、Cog/C1-repeat6-GFP。

二、重组载体转化谷氨酸棒状杆菌菌落PCR验证步骤

待电转化涂抗性平板后，将转化子挑至相同的抗性平板上进行扩大培养，30℃静置培养6h后即可长出，随后将若干转化子分别挑部分至1.5mL EP管(加有30uL的ddH₂O)中，沸水浴煮菌15min，然后12000rpm离心2min，上清液作为菌落PCR验证模板待用；

三、谷氨酸棒状杆菌工程菌产绿色荧光蛋白(GFP)的发酵实验

种子发酵的具体步骤为：先将重组的谷氨酸棒状杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，190r/min、温度30℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于190r/min、30℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入50mL的LB发酵培养基，然后将种子培养的菌液(OD600 4.0-5.0)以接种量为2％(体积百分比)，转速190r/min，温度30℃，发酵培养24小时，得到生产发酵的菌液；

所述液体LB配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，pH 7.2-7.4250mL三角瓶装液量为50mL；

酶标仪测定发酵液中绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达量：

将细菌用LB培养基在37℃、230rpm条件下培养24h后收集菌体，使用等体积磷酸缓冲液PBS将收集菌体重悬，6000g离心3min，重复洗涤2次，然后用PBS缓冲液将菌体的生物量稀释到OD₆₀₀为1。取200μl稀释后的菌液与黑壁透底的康宁酶标板中。使用酶标仪测定样品的相对荧光强度(RFU)和OD₆₀₀的生物量，通过计算RFU/OD₆₀₀数值来表示荧光蛋白的相对表达量。其中测定绿色荧光蛋白时激发光波长为480nm，发射光波长为520nm；根据上述方法测定出的不同绿色荧光蛋白重组工程菌株的荧光表达量(如图4)所示；

从表3和图4中的数据可以看到，在茎环结构数量≤6时，随着茎环机构数量的增加，荧光蛋白的相对表达量逐渐增高，至6拷贝时的谷氨酸棒状杆菌绿色荧光蛋白表达菌株的荧光强度达到了3.6×10^6A.U.，是单拷贝1.2×10^6A.U.的3倍。表3用中的Ptrc为对照组，即原始启动子Ptrc启动子的谷氨酸棒状杆菌的GFP的表达量。

表3

实施例10：

地衣芽胞杆菌角蛋白酶工程菌株的构建及荧光强度的检测

一、将构建好的角蛋白酶表达载体A1-repeat6-Ker以及作为对照的空质粒电转化至地衣芽胞杆菌DW2中。以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以repeat-YF/YR作为验证引物，PCR验证得到阳性转化子，根据菌落PCR产物长度初步判断5’-UTR的拷贝数，对阳性转化子进行DNA测序验证，重组菌株命名为DW2/A1-repeat6-Ker；将转入A1-repeat1-Ker至地衣芽胞杆菌DW2中的菌株命名为DW2/A1-repeat1-Ker，将转入空载体pHY300至地衣芽胞杆菌DW2中的菌株命名为DW2/pHY300。

二、重组载体转化地衣芽胞杆菌DW2菌落PCR验证步骤

待电转化涂抗性平板后，将转化子挑至相同的抗性平板上进行扩大培养，37℃静置培养6h后即可长出，随后将若干转化子分别挑部分至1.5mL EP管(加有30uL的ddH2O)中，沸水浴煮菌15min，然后12000rpm离心2min，上清液作为菌落PCR验证模板待用；

三、地衣芽胞杆菌工程菌产角蛋白酶(Ker)的发酵实验

种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入50mL的纳豆激酶发酵培养基，然后将种子培养的菌液(OD600 4.0-5.0)以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液；

纳豆激酶发酵培养基为：5-30g/L葡萄糖；1-15g/L大豆蛋白胨；1-15g/L酵母粉；1-15g/L蛋白胨；1-10g/L玉米浆；0.1-10g/L氯化钠；0.1-6g/L硫酸铵；0.1-3g/L磷酸氢二钾；pH 7.0-7.2；

四、SDS-PAGE检测发酵液中角蛋白酶的酶活：

取2mL发酵液13400g离心5min，离心后取发酵上清液0.9mL，加入1/9体积的0.1mlTCA溶液，震荡混匀后放置4℃过夜沉淀，13400g离心5min，去上清，加入0.5mL无水乙醇，洗涤残留在沉淀上的TCA，13400g离心5min，去上清，重复洗涤步骤3次。将沉淀室温放置晾干，待管底无明显液体残留，加入45μL的含有8mol/L尿素和2mol/L硫脲的混合溶液溶解，再加入45μL SDS-PAGE loading buffer，100℃沸水浴15min，然后13400g离心1min，上清作为SDS-PAGE上样样品。

按照浓缩胶4％丙烯酰胺、分离胶12％丙烯酰胺配方配置SDS-PAGE凝胶；将胶板置于电泳槽中，加入SDS-PAGE电泳缓冲液浸没胶板点样孔，拔掉制胶的梳子；取10μL上述制备蛋白样品加入点样孔，80V，2-3h；电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染色液将分离胶染色3-4h；最后用蛋白胶脱色液脱色数次，每1h更换一次脱色液，直至条带清晰，使用凝胶成像仪进行成像分析；

根据上述方法测定出的多拷贝5’-UTR工程菌株的角蛋白酶表达量(如图5)所示：

从图5可以看到，以角蛋白酶作为报告蛋白时，6拷贝5’-UTR时的角蛋白酶的量是单拷贝时的角蛋白酶的量多，表明多拷贝5’-UTR也适用于角蛋白酶基因的表达，以上数据说明多拷贝5’-UTR具有良好的应用前景。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgatagcag atctagaaag gaggaaggat ca 32

<210> 2

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgatagcag atctagaaag gaggaaggat cagtgagcag atctagaaag gaggaaggat 60

cagtgagcag atctagaaag gaggaaggat cagtgagcag atctagaaag gaggaaggat 120

cagtgagcag atctagaaag gaggaaggat cagtgagcag atctagaaag gaggaaggat 180

ca 182

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggaatttc caatttca 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgtacattc ctctcttacc tataa 25

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggaaaaacg ctttgcccgc ggaatttcca atttca 36

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgatccttcc tcctttctag atctgctatc actttatatt ttacataatc gc 52

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctagaaagga ggaaggatca atggtcagca aaggcgaaga 40

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccgtcctct ctgctctttt agtggtggtg gtggtg 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccaccacc accactaaaa gagcagagag gacgga 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggaattccc ggggatcccg caataatgcc gtcgca 36

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggatccccgg gaattcct 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggcaaagcg tttttcca 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtttattatc cataccctta c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagatttcgt gatgcttgtc 20

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agaaaggagg aaggatcaat ggtcagcaaa ggcgaa 36

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgatccttcc tcctttctag atctgctcac tgatccttcc tcctttct 48

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tttagaaatg ggcgtgaa 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagttcttcg cctttgct 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acacattata cgagccggat 20

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgcaggtcg actctagatt atttatacag ttcatcca 38

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaggaatgta cacatgaaat ggtcagcaaa ggcgaa 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tccgtcctct ctgctctttt agtggtggtg gtggtg 36

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taacggttct ggcaaata 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaccgcttct gcgttctg 18

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agaaaggagg aaggatcaat ggtcagcaaa ggcgaa 36

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgatccttcc tcctttctag atctgctcac tgatccttcc tcctttct 48

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttcgcctttg ctgaccattt catgtgtaca ttcctc 36

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

taagagagga atgtacacat gagaggcaaa aaggta 36

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tccgtcctct ctgctctttt actgagctgc cgcctg 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caccaccacc accactaaaa gagcagagag gacgga 36

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aggaattccc ggggatcccg caataatgcc gtcgca 36

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agaaaggagg aaggatcaat gagaggcaaa aaggta 36

<210> 33

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgatccttcc tcctttctag atctgctcac tgatccttcc tcctttct 48

Claims

1.用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的多核苷酸，所述的多核苷酸为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的多核苷酸在提高外源蛋白在革兰氏阳性菌表达效率中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的应用过程包括将N个SEQ ID NO.1所示的串联后连接在外源蛋白翻译的起始密码子前端；所述的N为1-6之间的自然数。

4.根据权利要求1所述的应用，所述的革兰氏阳性菌为用于表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2、枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌168、谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌13032。