CN111850063A - 去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用 - Google Patents

去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和发酵领域，公开了去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ‑谷氨酸产量中的应用。本发明以质粒pHY300PLK为基础，通过构建去饱和酶过表达载体pHY‑des，成功在芽胞杆菌中（地衣芽胞杆菌WX‑02，解淀粉芽胞杆菌HZ‑12，枯草芽胞杆菌Bs168等）过表达基因des，得到了芽胞杆菌工程菌WX‑02/pHY‑des，HZ‑12/pHY‑des，Bs168/pHY‑des。与对照菌相比，工程菌株WX‑02/pHY‑des的γ‑PGA产量至少提高了103%以上，HZ‑12/pHY‑des的γ‑PGA产量至少提高了92%以上，Bs168/pHY‑des的γ‑PGA产量至少提高了82%以上，为γ‑PGA高产提供一种新的策略。

Description

去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和发酵领域，具体涉及去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用。
背景技术
聚γ-谷氨酸(Poly glutamic acid,γ-PGA)是一种由D-谷氨酸、L-谷氨酸或D，L-谷氨酸组成的阴离子型谷氨酸聚合物，相对分子量在10KD-3000KD。根据谷氨酸单体间酰胺键连接方式可分为聚α-谷氨酸和聚γ-谷氨酸，γ-PGA分子链存在着游离羧基，分子与分子之间作用的氢键由游离羧基提供，因此γ-PGA有着诸多特点：易溶于水；良好的保水能力；吸附金属离子；主链由肽键构成，在酶降解下可以降解成短肽或单体氨基酸，因此具有可生物降解性；耐热，耐紫外线。γ-PGA还可以作为药物载体、组织工程材料、化妆品添加剂和食品添加剂等。
不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，其中单不饱和脂肪酸只含一个双键，而多不饱和脂肪酸含二个及以上的双键或三键。与饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)相比，UFA的相变温度较低，故UFA在细胞磷脂中的含量直接会影响细胞膜的物理性质，UFA对调节细胞膜的流动有着重要作用。在一定范围内，细胞膜的流动性大有利于分子侧向扩散和旋转运动来实现对代谢物的高产。
目前对于γ-PGA高产策略一般集中在途径改造和转录调控，本发明首次通过在芽胞杆菌中过表达去饱和酶来提高γ-PGA产量，为γ-PGA高产提供一种新的策略。
发明内容
本发明的目的在于提供去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquef aciens)或枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)；所述的去饱和酶Des为上述芽胞杆菌中对应的去饱和酶Des。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸的产量中的应用，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)；所述的去饱和酶Des为上述芽胞杆菌中对应的去饱和酶Des。
应用过程包括按照本领域的常规方式，利用表达载体将上述芽胞杆菌中对应的des基因在芽胞杆菌中过表达，将得到的重组菌株用于发酵生产聚γ-谷氨酸。
以上所述的应用中，优选的，所述的芽胞杆菌为能生产γ-PGA的芽胞杆菌。
以上所述的应用中，优选的，所述的芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HZ-12，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)BS168，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；
以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
以上所述的应用中，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：40～90g/L葡萄糖，4-10g/L柠檬酸钠，4-10g/L NaNO3，4～10g/L NH4Cl，0.4～1g/L K2HPO4·3H2O，0.4～1g/L MgSO4·7H2O，0.4～1g/L ZnSO4·7H2O，0.075～0.15g/L MnSO4·H2O，0～1g/LCaCl2，pH6.5～7.2；
以上所述的应用中，优选的，所述的表达载体为pHY300PLK。
以上所述的方法中，具体的，包括下述步骤：
(1)PCR扩增出芽胞杆菌的des基因；
(2)通过重叠延伸PCR将des基因与RBS6启动子和淀粉酶终止子连接到一起，构建完整的des表达元件；
(3)采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；
(4)将步骤(3)得到的酶切目的片段和线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到过表达质粒pHY-des；
(5)将过表达质粒pHY-des转入芽胞杆菌中筛选得到阳性转化子，即得。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本申请首次通过过表达去饱和酶，来提高γ-PGA的产量，为提高γ-PGA产量提供了一种新策略。与对照菌相比，工程菌株WX-02/pHY-des的γ-PGA产量至少提高了103％以上，HZ-12/pHY-des的γ-PGA产量至少提高了92％以上，Bs168/pHY-des的γ-PGA产量至少提高了85％以上。本发明的研究结果表明：通过过表达去饱和酶des来提高γ-PGA产量是一个十分有效的方法。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
过表达去饱和酶Des的重组芽胞杆菌的构建方法，包括下述步骤：
本实施例分别针对地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168构建了3种过表达去饱和酶Des的重组芽胞杆菌。
(1)分别根据地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168的基因组DNA为模板，设计des基因的上游引物(des-F)和下游引物(des-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168的基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到des基因片段(1029bp、1050bp、1059bp，SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，编码的氨基酸分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示)；
扩增地衣芽胞杆菌WX-02中des基因的引物为：
des-F(B.L):CTAAAGGAGGAAGGATCAATGAATGACCAAAATCTA
des-R:(B.L)：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAATCCGTTCTTAGTTG；
扩增解淀粉芽胞杆菌HZ-12中des基因的引物为：
des-F(B.a)：CTAAAGGAGGAAGGATCAATGACCAATCACGCCGCA
des-F(B.a)：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTCAGGCATTTTTCTTTAA；
扩增枯草芽胞杆菌BS168中des基因的引物为：
des-F(B.s)：CTAAAGGAGGAAGGATCAATGACTGAACAAACCATT
des-F(B.s)：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTCAGGCATTCTTCCGCAGC；
以带有RBS6启动子(枯草芽胞杆菌P43启动子优化得到)的质粒为模板，PCR扩增得到RBS6启动子(所用引物为RBS6-F和RBS6-R)；以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增得淀粉酶终止子(所用引物为TamyL-F和TamyL-R)，随后将启动子、目的基因和终止子通过SOE-PCR连到一起(所用引物为RBS6-F和TamyL-R)，构成三种针对不同菌株地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168的完整的des表达元件(分别为1820bp，1841bp，1850bp，其序列分别为SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9所示)；
其中，RBS6-F、RBS6-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：
RBS6-F:CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTT
RBS6-R:TAGATTTTGGTCATTCATTGATCCTTCCTCCTTTAG
TamyL-F:CAACTAAGAACGGATTAAAAGAGCAGAGAGGACGGA
TamyL-R:GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCA
(2)采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段des(1823bp，1844bp，1853bp)，同时，采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段(4870)；其中，所述的限制性内切酶EcoRI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
(3)将酶切基因片段和线性质粒片段经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果分别为：在2130bp、2151bp、2160bp，处出现电泳条带，说明过表达构建成功，上述转化子为阳性转化子；
pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC
pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC；
(5)将上述阳性转化子中的过表达载体通过电击转化的方法分别转入地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168中，在37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。转化子的PCR验证结果分别为：在2130bp、2151bp、2160bp处出现电泳条带，证明：过表达载体成功转入地衣芽胞杆菌WX-02，HZ-12，BS168中，此时，该转化子为阳性转化子，即转入了过表达载体pHY-des的地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168，本发明命名为地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-des，解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY-des，枯草芽胞杆菌BS168/pHY-des。
实施例2：
地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-des，解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY-des，枯草芽胞杆菌BS168/pHY-des在γ-PGA生产中的应用，包括下述步骤：
1)种子液获得的具体步骤为：先分别将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-des，解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY-des，枯草芽胞杆菌BS168/pHY-des活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子培养基后于230r/min、37℃中培养12小时，得到种子培养的菌液；
所述的种子培养基的配方是LB(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，pH7.2)
2)向250mL三角瓶中装入50mL的不同配方的发酵培养基(具体配方见表1，pH7.20)，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种，转速230r/min，温度37℃，发酵培养28小时，即得。
表1中的1-24为适用于芽胞杆菌的发酵培养基，其中1～8用于地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-des发酵培养，9～16用于解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY-des发酵培养，17～24用于枯草芽胞杆菌BS168/pHY-des发酵培养。
以转入空载的pHY300PLK的地衣芽胞杆菌WX-02，解淀粉芽胞杆菌HZ-12，枯草芽胞杆菌BS168(本发明命名为地衣芽胞杆菌WX-02/pHY300，解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY300，枯草芽胞杆菌BS168/pHY300)以相同方法发酵生产γ-PGA为对照。
本发明人采用测干重的方法对上述生产发酵的菌液中γ-PGA的产量进行测定。
测定条件具体为：取一定体积的发酵液样品，用6mol/L盐酸调pH值至2-3；12000rpm离心5min，沉淀(菌体)于80℃烘箱烘干，测干重；将上清转移至50mL离心管中；用6mol/L氢氧化钠调pH值至7.0；加三倍体积的无水乙醇，充分震荡，析出成团，12000rpm离心5min；将上清液倒掉，沉淀(γ-PGA)于80℃烘箱烘干；称干重。根据干重法计算出生产发酵的菌液中γ-PGA的产量，不同发酵培养基配方获得的γ-PGA的产量见表2，3，4。
表1
Figure BDA0002628151920000061
Figure BDA0002628151920000071
Figure BDA0002628151920000081
表2
Figure BDA0002628151920000082
表3
Figure BDA0002628151920000083
Figure BDA0002628151920000091
表4
Figure BDA0002628151920000092
Figure BDA0002628151920000101
从表2，3，4可看出，在相同的种子发酵和生产发酵条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY300，解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY300，枯草芽胞杆菌BS168/pHY300来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-des，解淀粉芽胞杆菌HZ-12/pHY-des，枯草芽胞杆菌BS168/pHY-des的生产发酵的菌液中γ-PGA产量有了大幅提升(至少提高101％，92％,82％)，本发明的技术方案在提高芽胞杆菌γ-PGA产量方面具有重大应用价值。本发明的提供的思路对于今后γ-PGA的产量具有重大意义。
序列表
<110> 去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用
<120> 湖北大学
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn Asp Gln Asn Leu Lys Thr Leu Arg Lys Leu Val Thr Pro Tyr
1 5 10 15
Glu Lys Ser Asp Leu Gln Lys Ser Ile Tyr Gln Ile Ile Asn Thr Leu
20 25 30
Ile Pro Phe Phe Leu Leu Trp Cys Leu Ala Tyr Lys Ser Leu Ser Ile
35 40 45
Ser Tyr Phe Leu Thr Leu Ala Ile Ser Ile Val Ala Ala Gly Phe Leu
50 55 60
Val Arg Thr Phe Ile Ile Phe His Asp Cys Cys His Tyr Ser Phe Phe
65 70 75 80
Lys Asn Lys Lys Ala Asn Arg Ile Leu Gly Thr Ile Thr Gly Ile Leu
85 90 95
Thr Leu His Pro Phe Asp His Trp Gly Arg Asp His Ser Ile His His
100 105 110
Ala Thr Ser Ser Asn Leu Asp Lys Arg Gly Thr Gly Asp Ile Trp Leu
115 120 125
Leu Thr Val Glu Glu Tyr Lys Glu Ala Ser Thr Lys Thr Lys Ile Met
130 135 140
Tyr Arg Leu Tyr Arg Asn Pro Phe Val Met Phe Met Ile Gly Pro Ile
145 150 155 160
Tyr Val Phe Gly Ile Thr Asn Arg Phe Asn Arg Lys Gly Ala Lys Arg
165 170 175
Lys Glu Arg Met Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu Gly Ile Ala Ala Leu
180 185 190
Thr Ala Leu Leu Cys Trp Ala Ile Gly Trp Gln Asn Phe Leu Leu Val
195 200 205
Gln Ala Pro Ile Phe Met Ile Ser Gly Ser Leu Gly Ile Trp Met Phe
210 215 220
Tyr Ile Gln His Thr Phe Glu Asp Ser Tyr Phe Glu Glu Asp Glu His
225 230 235 240
Trp Glu Tyr Val Lys Ala Ala Val Glu Gly Ser Ser Phe Tyr Lys Leu
245 250 255
Pro Lys Val Met Gln Trp Leu Thr Gly Asn Ile Gly Phe His His Val
260 265 270
His His Leu Ser Pro Arg Val Pro Asn Tyr Lys Leu Glu Glu Val His
275 280 285
Asn Asn Ile Glu Pro Leu Gln Asn Val Pro Thr Ile Thr Leu Ala Thr
290 295 300
Ser Leu Lys Ser Leu Lys Phe Arg Leu Trp Asp Glu Glu Ser Lys Lys
305 310 315 320
Phe Val Gly Phe Ser His Leu Lys Lys Ala Ser Lys Ser Gln Val Ser
325 330 335
Ala Gln Leu Arg Thr Asp
340
<210> 2
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ser Leu Asn Val Ser Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Phe Thr Val Ile Ala
50 55 60
Ala Gly Phe Leu Thr Arg Ile Phe Ile Ile Phe His Asp Cys Cys His
65 70 75 80
Gln Ser Phe Phe Lys Gln Lys Lys Leu Asn Arg Leu Phe Gly Phe Ile
85 90 95
Ser Gly Val Leu Thr Leu Phe Pro Phe Leu Gln Trp Gln Arg Ser His
100 105 110
Ser Ile His His Ala Thr Ser Ser Asn Leu Asp Lys Arg Gly Thr Gly
115 120 125
Asp Ile Trp Met Met Thr Val Lys Glu Tyr Asn Glu Ala Ser Ala Trp
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Gly Pro Ile Tyr Val Phe Leu Ile Gln Asn Arg Phe Asn Val Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20 25 30
Leu Asn Thr Phe Ile Pro Phe Phe Gly Leu Trp Phe Leu Ala Tyr Leu
35 40 45
Ser Leu Asp Val Ser Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Leu Thr Val Ile Ala
50 55 60
Ala Gly Phe Leu Thr Arg Ile Phe Ile Ile Phe His Asp Cys Cys His
65 70 75 80
Gln Ser Phe Phe Lys Gln Lys Arg Tyr Asn His Ile Leu Gly Phe Leu
85 90 95
Thr Gly Val Leu Thr Leu Phe Pro Tyr Leu Gln Trp Gln His Ser His
100 105 110
Ser Ile His His Ala Thr Ser Ser Asn Leu Asp Lys Arg Gly Thr Gly
115 120 125
Asp Ile Trp Met Leu Thr Val Asn Glu Tyr Lys Ala Ala Ser Arg Arg
130 135 140
Thr Lys Leu Ala Tyr Arg Leu Tyr Arg Asn Pro Phe Ile Met Phe Ile
145 150 155 160
Leu Gly Pro Ile Tyr Val Phe Leu Ile Thr Asn Arg Phe Asn Lys Lys
165 170 175
Gly Ala Arg Arg Lys Glu Arg Val Asn Thr Tyr Leu Thr Asn Leu Ala
180 185 190
Ile Val Ala Leu Ala Ala Ala Cys Cys Leu Ile Phe Gly Trp Gln Ser
195 200 205
Phe Leu Leu Val Gln Gly Pro Ile Phe Leu Ile Ser Gly Ser Ile Gly
210 215 220
Val Trp Leu Phe Tyr Val Gln His Thr Phe Glu Asp Ser Tyr Phe Glu
225 230 235 240
Ala Asp Glu Asn Trp Ser Tyr Val Gln Ala Ala Val Glu Gly Ser Ser
245 250 255
Phe Tyr Lys Leu Pro Lys Leu Leu Gln Trp Leu Thr Gly Asn Ile Gly
260 265 270
Tyr His His Val His His Leu Ser Pro Lys Val Pro Asn Tyr Lys Leu
275 280 285
Glu Val Ala His Glu His His Glu Pro Leu Lys Asn Val Pro Thr Ile
290 295 300
Thr Leu Lys Thr Ser Leu Gln Ser Leu Ala Phe Arg Leu Trp Asp Glu
305 310 315 320
Asp Asn Lys Gln Phe Val Ser Phe Arg Ala Ile Lys His Ile Pro Val
325 330 335
Ser Leu Pro Pro Asp Ser Pro Glu Lys Gln Lys Leu Arg Lys Asn Ala
340 345 350
<210> 4
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaatgacc aaaatctaaa gactttgaga aaactagtta caccttatga aaagtccgat 60
ttacaaaaaa gcatttacca aatcattaac acattgatac catttttcct gttatggtgt 120
ttagcatata agagcttgtc gatttcttat ttccttacat tagcgatttc tatcgttgcg 180
gcaggttttt tagtgagaac cttcatcatc tttcatgatt gctgccacta ttcctttttt 240
aagaacaaaa aggcgaatcg aatccttgga acaatcacag gaattctaac tttgcatcct 300
tttgatcatt ggggacgcga ccattctatc caccatgcga caagcagcaa cctggacaaa 360
cgaggtacag gcgatatttg gttgctgacc gttgaagaat ataaggaagc ctcaactaag 420
acaaaaataa tgtaccgttt atacagaaat ccgtttgtta tgtttatgat tgggccgatt 480
tacgtcttcg ggattaccaa tcgttttaat cgtaaagggg caaaacgcaa agaacggatg 540
aatacgtatg taacgaactt gggaatcgcc gctttgacag cacttttatg ctgggctatt 600
ggctggcaaa acttcctgct ggttcaggcg ccaattttta tgatatcggg atctctcgga 660
atttggatgt tttatattca gcatacgttt gaggattctt attttgaaga agatgagcat 720
tgggaatatg taaaagcagc agttgaagga agctcttttt ataagcttcc aaaagtcatg 780
caatggctaa caggcaatat cggtttccat catgttcatc atttaagccc gagagtccca 840
aactataagc ttgaagaagt gcataacaac attgaaccat tgcaaaacgt tccaaccatt 900
acactggcaa caagtcttaa gtcgttaaag ttccgactat gggatgaaga aagcaaaaaa 960
tttgttggtt ttagccactt aaaaaaagct tctaaaagcc aagtatcagc gcaactaaga 1020
acggattaa 1029
<210> 5
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaccaatc acgccgcaac tcaaaaacaa gcatctttaa aaaagcaggt tgctgcattt 60
tccggtgccg atacaaagca tagtgtcaat cagcttttca acacgtttgt gccgtttttt 120
gccctttggt ttcttgctta cttcagcctc aatgtctcct atcttctgac cctcgccttt 180
actgttatag cagcgggatt tttgacaaga atctttatta ttttccacga ctgctgccac 240
caatcctttt tcaaacaaaa gaaactgaac cggctgttcg ggtttatttc aggtgtgctg 300
acactgtttc cgttccttca atggcagcgc agccactcca ttcatcatgc gacaagcagc 360
aacttagata aacggggcac cggcgatatt tggatgatga ccgtcaagga atacaacgaa 420
gcgtcagctt ggacaaaagt acgctacaga ctttatcgca atccgtttat tatgtttatt 480
ctcggcccga tttacgtatt tctgattcaa aaccgtttca atgtaaaagg cgcccgccgc 540
aaggagcgct ggaacaccta tttcacgaac gcggcgattg tcttattggc tgctgcgacg 600
tgcctgcttg tcggctggga aaactttttg cttgttcaag gtccgatttt ccttatttcg 660
gggtcaatcg gcgtctggct cttttatgtt cagcacacgt ttgaggattc ttattttgaa 720
gccgatgagc attgggacta tgtgcaggcc gcggtagaag gaagctcctt ttacaagctt 780
ccgaagcttt tgcaatggct gacaggcaat atcggctacc atcatgtcca ccacttaagc 840
ccgaaagtgc cgaactacaa gctggaagcc gctcatgagg ggcacgagcc tttaaaaaac 900
gtaccgacca ttacgcttaa aacaagtctt gaatccatga aattccgtct gtgggatgag 960
gacgaaaagc aatttgtcac ctttcgggag gcgcggaaaa aaccggcgcc ccatccggta 1020
ccgaaagaac ctttaaagaa aaatgcctga 1050
<210> 6
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaccaatc acgccgcaac tcaaaaacaa gcatctttaa aaaagcaggt tgctgcattt 60
tccggtgccg atacaaagca tagtgtcaat cagcttttca acacgtttgt gccgtttttt 120
gccctttggt ttcttgctta cttcagcctc aatgtctcct atcttctgac cctcgccttt 180
actgttatag cagcgggatt tttgacaaga atctttatta ttttccacga ctgctgccac 240
caatcctttt tcaaacaaaa gaaactgaac cggctgttcg ggtttatttc aggtgtgctg 300
acactgtttc cgttccttca atggcagcgc agccactcca ttcatcatgc gacaagcagc 360
aacttagata aacggggcac cggcgatatt tggatgatga ccgtcaagga atacaacgaa 420
gcgtcagctt ggacaaaagt acgctacaga ctttatcgca atccgtttat tatgtttatt 480
ctcggcccga tttacgtatt tctgattcaa aaccgtttca atgtaaaagg cgcccgccgc 540
aaggagcgct ggaacaccta tttcacgaac gcggcgattg tcttattggc tgctgcgacg 600
tgcctgcttg tcggctggga aaactttttg cttgttcaag gtccgatttt ccttatttcg 660
gggtcaatcg gcgtctggct cttttatgtt cagcacacgt ttgaggattc ttattttgaa 720
gccgatgagc attgggacta tgtgcaggcc gcggtagaag gaagctcctt ttacaagctt 780
ccgaagcttt tgcaatggct gacaggcaat atcggctacc atcatgtcca ccacttaagc 840
ccgaaagtgc cgaactacaa gctggaagcc gctcatgagg ggcacgagcc tttaaaaaac 900
gtaccgacca ttacgcttaa aacaagtctt gaatccatga aattccgtct gtgggatgag 960
gacgaaaagc aatttgtcac ctttcgggag gcgcggaaaa aaccggcgcc ccatccggta 1020
ccgaaagaac ctttaaagaa aaatgcctga 1050
<210> 7
<211> 1820
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcag atctaaagga ggaaggatca atgaatgacc 300
aaaatctaaa gactttgaga aaactagtta caccttatga aaagtccgat ttacaaaaaa 360
gcatttacca aatcattaac acattgatac catttttcct gttatggtgt ttagcatata 420
agagcttgtc gatttcttat ttccttacat tagcgatttc tatcgttgcg gcaggttttt 480
tagtgagaac cttcatcatc tttcatgatt gctgccacta ttcctttttt aagaacaaaa 540
aggcgaatcg aatccttgga acaatcacag gaattctaac tttgcatcct tttgatcatt 600
ggggacgcga ccattctatc caccatgcga caagcagcaa cctggacaaa cgaggtacag 660
gcgatatttg gttgctgacc gttgaagaat ataaggaagc ctcaactaag acaaaaataa 720
tgtaccgttt atacagaaat ccgtttgtta tgtttatgat tgggccgatt tacgtcttcg 780
ggattaccaa tcgttttaat cgtaaagggg caaaacgcaa agaacggatg aatacgtatg 840
taacgaactt gggaatcgcc gctttgacag cacttttatg ctgggctatt ggctggcaaa 900
acttcctgct ggttcaggcg ccaattttta tgatatcggg atctctcgga atttggatgt 960
tttatattca gcatacgttt gaggattctt attttgaaga agatgagcat tgggaatatg 1020
taaaagcagc agttgaagga agctcttttt ataagcttcc aaaagtcatg caatggctaa 1080
caggcaatat cggtttccat catgttcatc atttaagccc gagagtccca aactataagc 1140
ttgaagaagt gcataacaac attgaaccat tgcaaaacgt tccaaccatt acactggcaa 1200
caagtcttaa gtcgttaaag ttccgactat gggatgaaga aagcaaaaaa tttgttggtt 1260
ttagccactt aaaaaaagct tctaaaagcc aagtatcagc gcaactaaga acggattaaa 1320
agagcagaga ggacggattt cctgaaggaa atccgttttt ttattttgcc cgtcttataa 1380
atttctttga ttacatttta taattaattt taacaaagtg tcatcagccc tcaggaagga 1440
cttgctgaca gtttgaatcg cataggtaag gcggggatga aatggcaacg ttatctgatg 1500
tagcaaagaa agcaaatgtg tcgaaaatga cggtatcgcg ggtgatcaat catcctgaga 1560
ctgtgacgga tgaattgaaa aagcttgttc attccgcaat gaaggagctc aattatatac 1620
cgaactatgc agcaagagcg ctcgttcaaa acagaacaca ggtcgtcaag ctgctcatac 1680
tggaagaaat ggatacaaca gaaccttatt atatgaatct gttaacggga atcagccgcg 1740
agctggaccg tcatcattat gctttgcagc ttgtcacaag gaaatctctc aatatcggcc 1800
agtgcgacgg cattattgcg 1820
<210> 8
<211> 1841
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcag atctaaagga ggaaggatca atgaccaatc 300
acgccgcaac tcaaaaacaa gcatctttaa aaaagcaggt tgctgcattt tccggtgccg 360
atacaaagca tagtgtcaat cagcttttca acacgtttgt gccgtttttt gccctttggt 420
ttcttgctta cttcagcctc aatgtctcct atcttctgac cctcgccttt actgttatag 480
cagcgggatt tttgacaaga atctttatta ttttccacga ctgctgccac caatcctttt 540
tcaaacaaaa gaaactgaac cggctgttcg ggtttatttc aggtgtgctg acactgtttc 600
cgttccttca atggcagcgc agccactcca ttcatcatgc gacaagcagc aacttagata 660
aacggggcac cggcgatatt tggatgatga ccgtcaagga atacaacgaa gcgtcagctt 720
ggacaaaagt acgctacaga ctttatcgca atccgtttat tatgtttatt ctcggcccga 780
tttacgtatt tctgattcaa aaccgtttca atgtaaaagg cgcccgccgc aaggagcgct 840
ggaacaccta tttcacgaac gcggcgattg tcttattggc tgctgcgacg tgcctgcttg 900
tcggctggga aaactttttg cttgttcaag gtccgatttt ccttatttcg gggtcaatcg 960
gcgtctggct cttttatgtt cagcacacgt ttgaggattc ttattttgaa gccgatgagc 1020
attgggacta tgtgcaggcc gcggtagaag gaagctcctt ttacaagctt ccgaagcttt 1080
tgcaatggct gacaggcaat atcggctacc atcatgtcca ccacttaagc ccgaaagtgc 1140
cgaactacaa gctggaagcc gctcatgagg ggcacgagcc tttaaaaaac gtaccgacca 1200
ttacgcttaa aacaagtctt gaatccatga aattccgtct gtgggatgag gacgaaaagc 1260
aatttgtcac ctttcgggag gcgcggaaaa aaccggcgcc ccatccggta ccgaaagaac 1320
ctttaaagaa aaatgcctga aagagcagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt 1380
tttattttgc ccgtcttata aatttctttg attacatttt ataattaatt ttaacaaagt 1440
gtcatcagcc ctcaggaagg acttgctgac agtttgaatc gcataggtaa ggcggggatg 1500
aaatggcaac gttatctgat gtagcaaaga aagcaaatgt gtcgaaaatg acggtatcgc 1560
gggtgatcaa tcatcctgag actgtgacgg atgaattgaa aaagcttgtt cattccgcaa 1620
tgaaggagct caattatata ccgaactatg cagcaagagc gctcgttcaa aacagaacac 1680
aggtcgtcaa gctgctcata ctggaagaaa tggatacaac agaaccttat tatatgaatc 1740
tgttaacggg aatcagccgc gagctggacc gtcatcatta tgctttgcag cttgtcacaa 1800
ggaaatctct caatatcggc cagtgcgacg gcattattgc g 1841
<210> 9
<211> 1850
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcag atctaaagga ggaaggatca atgactgaac 300
aaaccattgc acataaacaa aaacagctga caaagcaagt cgctgcattt gctcagcctg 360
aaacaaaaaa cagcctgatt cagcttttaa acacgtttat cccattcttc ggcctatggt 420
ttcttgctta tctcagcctc gatgtctcct atcttcttac gttagcatta acggtgattg 480
ccgcaggttt tctgacaaga atttttatca tcttccatga ctgctgccat caatcttttt 540
tcaaacaaaa acgctataac cacattctcg gttttctgac aggtgtcctg actttattcc 600
cgtatcttca atggcagcac agccattcga ttcatcatgc aactagcagc aatctggata 660
aacgcggaac aggagacatc tggatgttaa cagtaaacga atataaagct gcatccagac 720
gaacaaagct tgcatacaga ctttatagaa acccgtttat catgtttatt ctcggaccga 780
tttatgtttt tctgatcacg aaccgtttta acaaaaaagg cgcaagacgc aaggaacgtg 840
taaacacata ccttacgaat ctggcaattg tcgcgttggc tgccgcttgc tgtctgatct 900
ttggctggca atcgttttta ctggtgcaag gcccgatatt tctgatttca ggttcaatcg 960
gtgtttggct gttttatgtg cagcatacct ttgaagattc ttattttgaa gcggatgaaa 1020
actggagcta cgttcaggct gctgttgaag gcagctcatt ttataaactc ccgaaactgc 1080
ttcaatggct aacaggcaat attggttacc accacgttca tcatttgagt ccaaaggtgc 1140
ctaactataa gcttgaagtt gctcatgaac atcacgaacc attaaaaaac gtaccgacaa 1200
tcaccttaaa aacaagcctg caatcacttg cgttccgtct atgggatgaa gataacaaac 1260
agtttgtgtc atttcgggct ataaaacata tacctgtaag ccttccgcct gattcaccag 1320
aaaaacagaa gctgcggaag aatgcctgaa agagcagaga ggacggattt cctgaaggaa 1380
atccgttttt ttattttgcc cgtcttataa atttctttga ttacatttta taattaattt 1440
taacaaagtg tcatcagccc tcaggaagga cttgctgaca gtttgaatcg cataggtaag 1500
gcggggatga aatggcaacg ttatctgatg tagcaaagaa agcaaatgtg tcgaaaatga 1560
cggtatcgcg ggtgatcaat catcctgaga ctgtgacgga tgaattgaaa aagcttgttc 1620
attccgcaat gaaggagctc aattatatac cgaactatgc agcaagagcg ctcgttcaaa 1680
acagaacaca ggtcgtcaag ctgctcatac tggaagaaat ggatacaaca gaaccttatt 1740
atatgaatct gttaacggga atcagccgcg agctggaccg tcatcattat gctttgcagc 1800
ttgtcacaag gaaatctctc aatatcggcc agtgcgacgg cattattgcg 1850
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctaaaggagg aaggatcaat gaatgaccaa aatcta 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccgtcctct ctgctctttt aatccgttct tagttg 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctaaaggagg aaggatcaat gaccaatcac gccgca 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tccgtcctct ctgctctttc aggcattttt ctttaa 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctaaaggagg aaggatcaat gactgaacaa accatt 36
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccgtcctct ctgctctttc aggcattctt ccgcagc 37
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggaattctg ataggtggta tgtttt 26
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tagattttgg tcattcattg atccttcctc ctttag 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caactaagaa cggattaaaa gagcagagag gacgga 36
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctctagacg caataatgcc gtcgca 26
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtttattatc cataccctta c 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagatttcgt gatgcttgtc 20

Claims (8)

1.去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸的产量中的应用，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）或枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）；所述的去饱和酶Des为上述芽胞杆菌中对应的去饱和酶Des。
2.根据权利要求1所述的应用，其应用过程是利用表达载体将芽胞杆菌中对应的des基因在芽胞杆菌中过表达，将得到的重组菌株用于发酵生产聚γ-谷氨酸。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的芽胞杆菌为能生产γ-PGA的芽胞杆菌。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HZ-12，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）BS168，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求4所述的应用，编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求2所述的应用，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：40~90g/L葡萄糖，4-10g/L柠檬酸钠，4-10g/L NaNO3，4~10g/L NH4Cl，0.4~1g/L K2HPO4·3H2O，0.4~1g/L MgSO4·7H2O，0.4~1g/L ZnSO4·7H2O，0.075~0.15g/L MnSO4·H2O，0~1g/LCaCl2，pH6.5~7.2。
7.根据权利要求2所述的应用，所述的表达载体为pHY300PLK。
8.根据权利要求2所述的应用，所述的重组菌株的构建过程包括：
（1）PCR扩增出芽胞杆菌的des基因；
（2）通过重叠延伸PCR将des基因与RBS6启动子和淀粉酶终止子连接到一起，构建完整的des表达元件；
（3）采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；
（4）将步骤（3）得到的酶切目的片段和线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到过表达质粒pHY-des；
（5）将过表达质粒pHY-des转入芽胞杆菌中筛选得到阳性转化子，即得。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106095A (zh) * 2021-04-13 2021-07-13 湖北大学 用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101603015B (zh) * 2008-06-13 2010-11-10 河北维尔康制药有限公司 一种地衣芽孢杆菌菌株及用途和用其生产聚γ-谷氨酸的方法
CN108611308A (zh) * 2018-05-02 2018-10-02 湖北大学 一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用
CN109913488A (zh) * 2018-04-28 2019-06-21 湖北大学 一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101603015B (zh) * 2008-06-13 2010-11-10 河北维尔康制药有限公司 一种地衣芽孢杆菌菌株及用途和用其生产聚γ-谷氨酸的方法
CN109913488A (zh) * 2018-04-28 2019-06-21 湖北大学 一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法
CN108611308A (zh) * 2018-05-02 2018-10-02 湖北大学 一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI ZENG等: "Draft Genome Sequence of Bacillus subtilis GXA-28, a Thermophilic Strain with High Productivity of Poly-γ-Glutamic Acid", 《GENOME ANNOUNCEMENTS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106095A (zh) * 2021-04-13 2021-07-13 湖北大学 用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用
CN113106095B (zh) * 2021-04-13 2022-03-18 湖北大学 用于增加革兰氏阳性菌翻译起始位点的序列及其在提高蛋白表达效率中的应用

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