CN112375774A - 一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，包括如下步骤，选择大肠杆菌基因组上的硫氧还原蛋白和谷胱甘肽还原酶编码基因(trxB和gor)为靶标，利用CRISPR技术定点敲入含非天然氨基酸技术元件的同源重组片段，实现在无筛选标记下的基因插入，得到重组蛋白表达用工程菌株，通过上述设置，本发明得到的菌株具备在重组蛋白表达时定点插入非天然氨基酸的能力，且消除了质粒不稳定的问题，因此无需向发酵培养基中添加抗生素，在药物的工业化发酵生产中可应用。

Description

一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白质药物生产发酵技术领域，特别涉及一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法。

背景技术

生物体细胞内蛋白质翻译的过程中，通常核糖体通过识别mRNA上的三联密码子，从起始密码子AUG开始，将与之互补的具备反义密码子的携带氨基酸的酰化tRNA进行一一配对，从而将mRNA转化为多肽。由四种碱基可以组成64个不同的三联密码子，其中的61个密码子都有对应的天然氨基酸，剩余的3个通常不编码氨基酸，而是作为终止翻译的信号，能够通过募集肽链释放因子，导致正在合成的多肽的终止延伸，被释放出。这3个终止密码子分别是赭色密码子(ochre)UAA、蛋白石密码子(opal)UGA和琥珀密码子(amber)UAG。因为琥珀密码子在大肠杆菌中的使用频率最低，大约7％，当被改造成编码某种非天然氨基酸时能够影响的内源蛋白质最少，所以是最常被用于建立基因密码子扩展技术的一种密码子。

基于基因密码子扩展的非天然氨基酸技术早在20世纪八九十年代就有美国斯克利普斯研究所的Schultz等人研究尝试在蛋白质中引入非天然氨基酸。为了能够建立基因密码子的扩展技术，需要有一对与天然氨基酸互不干扰的aaRS/tRNA对。

大肠杆菌是用于生产重组蛋白的最主要宿主，因为大肠杆菌有着其他宿主细胞无可比拟的优势，包括生长速度快，大规模生产工艺成熟，控制简单且成本低产量高。有些药物蛋白质的翻译后修饰会引起免疫原性，无法在酵母细胞或者哺乳动物细胞中生产，这样的蛋白质分子就特别适合原核表达。表达载体pEVOL是目前学术研究中使用的最多的辅助结构，能够实现模式蛋白GroE产量最高达到了100mg/L。辅助质粒pULtra能够与辅助质粒pEVOL互相配合使用，从而实现多种非天然氨基酸的插入。

但是现有的菌株都是通过转入辅助质粒实现非天然氨基酸插入的功能。而由于非天然氨基酸技术的辅助质粒使得非天然氨基酸会有部分被插入到非目标蛋白质中，从而对菌株产生一定的毒性，造成辅助质粒在发酵过程中容易丢失，因此必须始终在发酵培养基中添加抗生素等筛选压力。在科学研究中由于发酵产物不应用于人体，可以在发酵过程中添加抗生素，但是在药物蛋白质生产过程中要求在发酵培养基中不得添加抗生素，因此该技术使用辅助质粒的方法在药物的工业化发酵生产中难以应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其具有发酵过程中不添加抗生素也能稳定地在重组蛋白质中插入非天然氨基酸，能够在药物的工业化发酵生产的优点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

引物设计：选择gor基因开放阅读框内任意一个连续三碱基(5-NGG-3’)组成的PAM序列，则该PAM序列前的20个碱基组成的序列A就是引导RNA(gRNA)的靶标，将A序列的3’端添加序列5’-GTTTTAGAGCTAGAAATA-3’，得到引物gor-tgF；在A序列的反向互补序列的3’端添加序列5’-ACTAGTATTATACCTAG-3’，得到引物gor-tgR；gor-tgF/gor-tgR引物对用于构建切断gor基因为靶标的CRISPR技术质粒；同样的以trxB基因的编码框中任意一个PAM序列设计引物对trxB-tgF/trxB-tgR即可用于构建切断trxB基因为靶标的CRISPR技术质粒；

使用gor-tgF/gor-tgR和trxB-tgF/trxB-tgR两对引物对，以质粒pTargetF为PCR模板，扩增DNA片段，将两段PCR产物分别纯化后，进行限制性内切酶DpnI酶切并纯化回收，然后转化Top10感受态细胞，再筛选重组转化子，并提取质粒后经测序获得质粒pTarget-gor及pTarget-trxB；

二、同源重组模板的获取

同源重组模板获取的引物设计：以gor基因的开放阅读框及其5’端和3’端各5kb序列作为设计引物的模板。以步骤一中选定的PAM序列作为中心点，在其5’端选择一段50bp-3000bp的序列作为5’端同源臂，选择5’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-5HF，5’端同源臂3’端的12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列后得到最终反向引物gor-5HR；在中心点的3’端选择一段50bp-3000bp的序列作为3’端同源臂，选择3’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-3HF，3’端同源臂3’端12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列(用于重叠PCR)后得到最终反向引物gor-3HR；类似的以步骤一总选定的trxB基因PAM序列为中心点设计两个同源臂引物对trxB-5HF/trxB-5HR及trxB-3HF/trxB-3HR；

以起始大肠杆菌菌株的基因组DNA作为模板，分别使用引物对gor-5HF/gor-5HR，通过PCR扩增出gor基因的5’端同源臂gor-5HA；使用引物对gor-3HF/gor-3HR，通过PCR扩增出gor基因的3’端同源臂gor-3HA；

使用引物对trxB-5HF/trxB-5HR，通过PCR扩增出trxB基因的5’端同源臂trxB-5HA；使用引物对trxB-3HF/trxB-3HR，通过PCR扩增出trxB基因的3’端同源臂trxB-3HA；

通过全基因合成的方式合成aaRS-tRNA序列，并使作为PCR模板，使用引物aaRS-tRNA-F/aaRS-tRNA-R进行PCR扩增，得到产物aaRS-tRNA，并将PCR产物分别纯化回收；

混合PCR产物gor-5HA、gor-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物gor-5HF和gor-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物gorHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

混合trxB-5HA、trxB-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物trxB-5HF和trxB-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物trxBHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

三、转化与菌株构建

制备起始菌株的感受态细胞，转入质粒pCas，筛选获得含pCas质粒的单克隆菌株；

将上述单克隆菌株制备感受态细胞，并使用质粒pTarget-gor和同源重组片段gorHA-aaRS-tRNA进行共转化，然后筛选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达，降解pTarget-gor质粒；

将诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

再将上述完成pTarget-gor质粒消除的菌株制备感受态细胞，使用质粒pTarget-trxB和同源重组片段trxBHA-aaRS-tRNA进行共转化，筛选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并使用1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达，降解pTarget-trxB质粒；

将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；最后通过将目标菌培养温度调高到37℃消除温度敏感型的pCas质粒，24h的培养后，在不含的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个添加100ug/mL壮观霉素固体培养基上，30℃培养,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

最终得到重组蛋白表达用工程菌株，其gor基因和trxB基因位置各被插入了一个拷贝aaRS-tRNA的菌株。

进一步设置：包括如下步骤：

一、CRISPR技术质粒构建

使用gor-tgF/gor-tgR和trxB-tgF/trxB-tgR两对引物对，以质粒pTargetF为PCR模板，扩增DNA片段，将两段PCR产物分别纯化后，进行限制性内切酶DpnI酶切并纯化回收，然后转化Top10感受态细胞，再筛选重组转化子，并提取质粒后经测序获得质粒pTarget-gor及pTarget-trxB；

以大肠杆菌作为改造起始菌株则各引物的序列如下：

gor-tgF：TGCCGATGGTAGCCTGACGCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

gor-tgR：GCGTCAGGCTACCATCGGCAACTAGTATTATACCTAG；

trxB-F：GAGATAGCGTGCAGAAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

trxB-R：GAGCTTCTGCACGCTATCTCACTAGTATTATACCTAG；

二、同源重组模板的获取

同源重组模板获取的引物设计：以gor基因的开放阅读框及其5’端和3’端各5kb序列作为设计引物的模板。以步骤一中选定的PAM序列作为中心点，在其5’端选择一段50bp-3000bp的序列作为5’端同源臂，选择5’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-5HF，5’端同源臂3’端的12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列后得到最终反向引物gor-5HR；在中心点的3’端选择一段50bp-3000bp的序列作为3’端同源臂，选择3’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-3HF，3’端同源臂3’端12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列(用于重叠PCR)后得到最终反向引物gor-3HR；类似的以步骤一总选定的trxB基因PAM序列为中心点设计两个同源臂引物对trxB-5HF/trxB-5HR及trxB-3HF/trxB-3HR。起始菌株为大肠杆菌,以起始大肠杆菌菌株的基因组DNA作为模板，分别使用引物对gor-5HF/gor-5HR，通过PCR扩增出gor基因的5’端同源臂gor-5HA；使用引物对gor-3HF/gor-3HR，通过PCR扩增出gor基因的3’端同源臂gor-3HA；

使用引物对trxB-5HF/trxB-5HR，通过PCR扩增出trxB基因的5’端同源臂trxB-5HA；使用引物对trxB-3HF/trxB-3HR，通过PCR扩增出trxB基因的3’端同源臂trxB-3HA；

通过全基因合成的方式合成aaRS-tRNA序列，并使作为PCR模板，使用引物aaRS-tRNA-F/aaRS-tRNA-R进行PCR扩增，得到产物aaRS-tRNA，并将PCR产物分别纯化回收；

混合PCR产物gor-5HA、gor-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物gor-5HF和gor-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物gorHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

混合trxB-5HA、trxB-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物trxB-5HF和trxB-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物trxBHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

各引物的序列如下：

gor-5HF：ATATGTACGGCCCGGATTAT

gor-5HR：ACAGCTCCCTAATGCAGGCACTACCGCTTTCGGGAT

gor-3HF：GCAGGCTTTTTTGCATCTAAGATGGTCGCAGTGAAA

gor-3HR：GTCCATACCAAAGCCAAT

trxB-5HF：CCAGTAACGTAAAGGGAA

trxB-5HR：ACAGCTCCCTAATGCAGGCATCAAAGTACAGTCGGG

trxB-3HF：GCAGGCTTTTTTGCATCTTGGGCAGGATTGTAGGGA

trxB-3HR：CCTGGGTCTACGGTGAGA

aaRS-tRNA-F：CCTGCATTAGGGAGCTGT

aaRS-tRNA-R：AGATGCAAAAAAGCCTGC；

各同源臂的序列如下：

gor-5HA：

ATATGTACGGCCCGGATTATGGTTTTGATACCACTATCAATAAATTCAACTGGGAAACGTTGATCGCCAGCCGTACCGCCTATATCGACCGTATTCATACTTCCTATGAAAACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTCGTTGATGCCAAAACGCTGGAGGTAAACGGCGAAACCATCACGGCCGATCATATTCTGATCGCCACAGGCGGTCGTCCGAGCCACCCGGATATTCCGGGCGTGGAATACGGTATTGATTCTGATGGCTTCTTCGCCCTTCCTGCTTTGCCAGAGCGCGTGGCGGTTGTTGGAGCGGGTTACATCGCCGTTGAGCTGGCGGGCGTGATTAACGGCCTCGGCGCGAAAACGCATCTGTTTGTGCGTAAACATGCGCCGCTGCGCAGCTTCGACCCGATGATTTCCGAAACGCTGGTCGAAGTGATGAACGCCGAAGGCCCGCAGCTGCACACCAACGCCATCCCGAAAGCGGTAGTG

gor-3HA：

AAGATGGTCGCAGTGAAACGGTGGATTGCCTGATTTGGGCGATTGGTCGCGAGCCTGCCAATGACAACATCAACCTGGAAGCCGCTGGCGTTAAAACTAACGAAAAAGGCTATATCGTCGTCGATAAATATCAAAACACCAATATTGAAGGTATTTACGCGGTGGGCGATAACACGGGTGCAGTGGAGCTGACACCGGTGGCAGTTGCAGCGGGTCGCCGTCTCTCTGAACGCCTGTTTAATAACAAGCCGGATGAGCATCTGGATTACAGCAACATTCCGACCGTGGTCTTCAGCCATCCGCCGATTGGTACTGTTGGTTTAACGGAACCGCAGGCGCGCGAGCAGTATGGCGACGATCAGGTGAAAGTGTATAAATCCTCTTTCACCGCGATGTATACCGCCGTCACCACTCACCGCCAGCCGTGCCGCATGAAGCTGGTGTGCGTTGGATCGGAAGAGAAGATTGTCGGTATTCACGGCATTGGCTTTGGTATGGAC

trxB-5HA：

ATATGTACGGCCCGGATTATGGTTTTGATACCACTATCAATAAATTCAACTGGGAAACGTTGATCGCCAGCCGTACCGCCTATATCGACCGTATTCATACTTCCTATGAAAACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTCGTTGATGCCAAAACGCTGGAGGTAAACGGCGAAACCATCACGGCCGATCATATTCTGATCGCCACAGGCGGTCGTCCGAGCCACCCGGATATTCCGGGCGTGGAATACGGTATTGATTCTGATGGCTTCTTCGCCCTTCCTGCTTTGCCAGAGCGCGTGGCGGTTGTTGGAGCGGGTTACATCGCCGTTGAGCTGGCGGGCGTGATTAACGGCCTCGGCGCGAAAACGCATCTGTTTGTGCGTAAACATGCGCCGCTGCGCAGCTTCGACCCGATGATTTCCGAAACGCTGGTCGAAGTGATGAACGCCGAAGGCCCGCAGCTGCACACCAACGCCATCCCGAAAGCGGTAGTG

trxB-3HA：

AAGATGGTCGCAGTGAAACGGTGGATTGCCTGATTTGGGCGATTGGTCGCGAGCCTGCCAATGACAACATCAACCTGGAAGCCGCTGGCGTTAAAACTAACGAAAAAGGCTATATCGTCGTCGATAAATATCAAAACACCAATATTGAAGGTATTTACGCGGTGGGCGATAACACGGGTGCAGTGGAGCTGACACCGGTGGCAGTTGCAGCGGGTCGCCGTCTCTCTGAACGCCTGTTTAATAACAAGCCGGATGAGCATCTGGATTACAGCAACATTCCGACCGTGGTCTTCAGCCATCCGCCGATTGGTACTGTTGGTTTAACGGAACCGCAGGCGCGCGAGCAGTATGGCGACGATCAGGTGAAAGTGTATAAATCCTCTTTCACCGCGATGTATACCGCCGTCACCACTCACCGCCAGCCGTGCCGCATGAAGCTGGTGTGCGTTGGATCGGAAGAGAAGATTGTCGGTATTCACGGCATTGGCTTTGGTATGGAC；

三、转化与菌株构建

制备BL21(DE3)的感受态细胞，转入质粒pCas，筛选获得含pCas质粒的BL21(DE3)感受态细胞单克隆菌株；

将上述单克隆菌株制备感受态细胞，并使用质粒pTarget-gor和同源重组片段gorHA-aaRS-tRNA进行共转化，然后筛选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并使用1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达，降解pTarget-gor质粒；

将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

再将上述完成pTarget-gor质粒消除的菌株制备感受态细胞，使用质粒pTarget-trxB和同源重组片段trxBHA-aaRS-tRNA进行共转化，筛选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并使用1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达，降解pTarget-trxB质粒；

将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；最后通过将目标菌培养温度调高到37℃消除温度敏感型的pCas质粒，24h的培养后，在不含的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个添加100ug/mL壮观霉素固体培养基上，30℃培养,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

最终得到重组蛋白表达用工程菌株，其gor基因和trxB基因位置各被插入了一个拷贝aaRS-tRNA的菌株。

进一步设置：步骤二中全基因合成的非天然氨基酸aaRS-tRNA序列，以吡咯赖氨酸系统合成，插入基因组的aaRS-tRNA序列如下：

CCTGCATTAGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAAGGAGGTATGGATAAAAAGCCTCTGAACACTCTGATTTCTGCGACCGGTCTGTGGATGTCCCGCACCGGCACCATCCACAAAATCAAACACCATGAAGTTAGCCGTTCCAAAATCTACATTGAAATGGCTTGCGGCGATCACCTGGTTGTCAACAACTCGCGTTCTTCTCGTACCGCTCGCGCACTGCGCCACCACAAATATCGCAAAACCTGCAAACGTTGCCGTGTTAGCGATGAAGATCTGAACAAATTCCTGACCAAAGCTAACGAGGATCAGACCTCCGTAAAAGTGAAGGTAGTAAGCGCTCCGACCCGTACTAAAAAGGCTATGCCAAAAAGCGTGGCCCGTGCCCCGAAACCTCTGGAAAACACCGAGGCGGCTCAGGCTCAACCATCCGGTTCTAAATTTTCTCCGGCGATCCCAGTGTCCACCCAAGAATCTGTTTCCGTACCAGCAAGCGTGTCTACCAGCATTAGCAGCATTTCTACCGGTGCTACCGCTTCAGCGCTGGTAAAAGGTAACACTAACCCGATTACTAGCATGTCTGCACCGGTACAGGCAAGCGCCCCAGCTCTGACTAAATCCCAGACGGACCGTCTGGAGGTGCTGCTGAACCCAAAGGATGAAATCTCTCTGAACAGCGGCAAGCCTTTCCGTGAGCTCGAAAGCGAGCTGCTGTCTCGTCGTAAAAAGGATCTGCAACAGATCTACGCTGAGGAACGCGAGAACTATCTGGGTAAGCTAGAGCGCGAAATTACTCGCTTCTTCGTGGATCGCGGTTTCCTGGAGATCAAATCTCCGATTCTGATTCCGCTGGAATACATTGAACGTATGGGCATCGATAATGATACCGAACTGTCTAAACAGATCTTCCGTGTGGATAAAAACTTCTGTCTGCGTCCGATGCTGGCCCCGAACCTGTACAACTATCTGCGTAAACTGGACCGTGCCCTGCCGGACCCGATCAAAATTTTCGAGATCGGTCCTTGCTACCGTAAAGAGTCCGACGGTAAAGAGCACCTGGAAGAATTCACCATGCTGAACTTTTGCCAGATGGGTAGCGGTTGCACGCGTGAAAACCTGGAATCGATTATCACCGACTTCCTGAATCACCTGGGTATCGATTTCAAAATTGTTGGTGACAGCTGTATGGTGTACGGCGATACGCTGGATGTTATGCACGGCGATCTGGAGCTGTCTTCCGCAGTAGTGGGCCCAATCCCGCTGGATCGTGAGTGGGGTATCGACAAACCTTGGATCGGTGCGGGTTTTGGTCTGGAGCGTCTGCTGAAAGTAAAACACGACTTCAAGAACATCAAACGTGCTGCACGTTCCGAGTCCTATTACAATGGTATTTCTACTAACCTGTAACTGCAGTTTCAAACGCTAAATTGCCTGATGCGCTACGCTTATCAGGCCTACATGATCTCTGCAATATATTGAGTTTGCGTGCTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCAAGAAACAGCAAACAATCCAAAACGCCGCGTTCAGCGGCGTTTTTTCTGCTTTTCTTCGCGAATTAATTCCGCTTCGCAACGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTGGAAACCTGATCATGTAGATCGAACGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGCATCT。

进一步设置：步骤二中全基因合成的非天然氨基酸aaRS-tRNA序列，以对乙酰苯丙氨酸系统合成时，则插入基因组的aaRS-tRNA序列如下：

CCTGCATTAGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAAGGAGGTATGGACGAGTTCGAAATGATTAAACGCAACACCAGCGAAATTATCTCTGAAGAAGAGCTGCGCGAGGTGCTGAAGAAAGACGAGAAGAGCGCGCTGATTGGCTTTGAGCCGTCCGGTAAAATTCACCTAGGTCACTACCTGCAAATCAAGAAGATGATTGATCTGCAAAACGCTGGTTTTGACATCATTATCCTGCTGGCGGACCTGCACGCCTACCTGAATCAAAAGGGCGAGCTGGATGAGATTCGCAAGATCGGCGACTACAATAAGAAAGTCTTCGAAGCCATGGGTTTGAAGGCTAAATACGTCTACGGTAGCGAATTTCAGCTGGATAAGGATTACACGTTGAATGTGTACCGTCTGGCGCTAAAAACCACGCTGAAACGCGCCCGTCGTTCCATGGAGCTGATTGCGCGCGAGGATGAGAATCCAAAAGTTGCTGAGGTTATTTACCCTATTATGCAAGTTAATGGCTGCCACTACCGCGGTGTTGATGTTGCCGTCGGTGGTATGGAGCAACGCAAAATTCACATGCTGGCACGTGAACTGCTGCCGAAAAAGGTTGTCTGTATTCATAATCCGGTCCTGACCGGCCTGGATGGCGAGGGTAAAATGAGCAGCAGCAAGGGTAACTTTATTGCAGTTGACGATAGCCCGGAAGAAATCCGTGCGAAGATCAAGAAAGCGTACTGCCCGGCAGGCGTGGTTGAGGGTAACCCGATCATGGAAATCGCCAAGTATTTTCTGGAATACCCACTGACGATTAAGCGCCCGGAGAAATTTGGCGGCGACCTGACCGTCAACAGCTACGAGGAGCTGGAAAGCTTGTTTAAGAACAAAGAACTGCATCCGATGCGCCTGAAAAACGCCGTGGCGGAAGAGCTGATTAAGATTCTGGAACCAATTCGCAAACGTCTGTAAGTTTGCGTGCTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCAAGAAACAGCAAACAATCCAAAACGCCGCGTTCAGCGGCGTTTTTTCTGCTTTTCTTCGCGAATTAATTCCGCTTCGCAACGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCAGGGGTTCAAATCCCCTCCGCCGGACCACCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGCATCT。

进一步设置：转化与菌株构建步骤中，通过钙离子介导的转化或电转化，将pCas转入起始菌株的感受态细胞。

进一步设置：转化与菌株构建步骤中，筛选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落时，采用卡那霉素和壮观霉素共筛选。

进一步设置：转化与菌株构建步骤中，在30℃条件下，通过IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达。

进一步设置：转化与菌株构建步骤中，筛选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落时，采用卡那霉素和壮观霉素共筛选。

进一步设置：转化与菌株构建步骤中，在30℃条件下，通过IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达。

进一步设置：转化与菌株构建步骤中，使用温度敏感型的pCAS质粒，在菌株构建的最后阶段使用升温培养，消除pCAS质粒。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、trxB和gor基因因为被插入的非天然氨基酸元件打断而失去功能，有利于可溶表达含二硫键的重组蛋白(类似于大肠杆菌菌株OrigamiB)。

2、使用CRISPR技术，进行基因敲入，无需在敲入的DNA片段上添加筛选标记，实现无筛选标记插入，因此避免了OrigamiB菌株自带卡那霉素和四环素抗性的缺点，可以在后续应用NCBB菌株时使用卡那霉素和四环素作为筛选标记。

3、由于定点插入的两个拷贝非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和对应的tRNA，使得菌株获得了能够稳定表达定点插入非天然氨基酸的重组蛋白的能力。

4、由于两个拷贝非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和对应的tRNA为基因组插入，不需要考虑质粒相容性的障碍。而传统的方式引入辅助质粒，需要和重组蛋白表达质粒具备相容的复制起始位点。

5、由于非天然氨基酸插入的对菌株有一定的毒性，造成重组蛋白表达过程中容易质粒丢失，因此发酵过程中需要始终添加抗生素，本发明的结果菌株不存在质粒不稳定的问题，发酵培养基中无需添加抗生素。

附图说明

图1是实施例1的重组蛋白表达用工程菌株的构建方法示意图；

图2是实施例1的质粒pTarget-gor的图谱；

图3是实施例1的质粒pTarget-trxB的图谱；

图4是实施例1的同源重组双交换构建NCBB菌株的原理图；

图5是实施例1的NCBB菌株用于表达定点插入非天然氨基酸NAEK的重组人生长激素的SDS-PAGE凝胶电泳图谱；

图6是实施例2的NCBB菌株用于表达定点插入非天然氨基酸pAF的重组人生长激素的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

1、CRISPR技术质粒构建：

引物设计：选择gor基因开放阅读框内任意一个连续三碱基(5’-NGG-3’)组成的PAM序列，则该PAM序列前的20个碱基组成的序列A就是引导RNA(gRNA)的靶标，将A序列的3’端添加序列5’-GTTTTAGAGCTAGAAATA-3’，得到引物gor-tgF。在A序列的反向互补序列的3’端添加序列5’-ACTAGTATTATACCTAG-3’，得到引物gor-tgR。gor-tgF/gor-tgR引物对可以用于构建切断gor基因为靶标的CRISPR技术质粒。同样的以trxB基因的编码框中任意一个PAM序列设计引物对trxB-tgF/trxB-tgR即可用于构建切断trxB基因为靶标的CRISPR技术质粒

以大肠杆菌作为改造对象可使用的如下的引物序列：

gor-tgF：TGCCGATGGTAGCCTGACGCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

gor-tgR：GCGTCAGGCTACCATCGGCAACTAGTATTATACCTAG；

trxB-F：GAGATAGCGTGCAGAAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

trxB-R：GAGCTTCTGCACGCTATCTCACTAGTATTATACCTAG。首先使用gor-tgF/gor-tgR和trxB-tgF/trxB-tgR两对引物对，分别以质粒pTargetF(ADDGENE#62226)为PCR模板，扩增出全长约2.5kb的DNA片段。将PCR产物分别纯化后，分别使用DpnI限制性内切酶切模板DNA，再将酶切产物进行分别纯化回收，然后转化Top10感受态细胞。以壮观霉素筛选重组转化子。并通过挑选重组转化子提取质粒后经测序获得质粒如图2和图3所示的pTarget-gor及pTarget-trxB。

其中质粒pTarget-gor可以表达靶向起始菌株的gor基因的gRNA，本实施例使用大肠杆菌的BL21(DE3)作为起始菌株，可以引导Cas9蛋白将基因组上的gor基因靶标位置双链DNA切断。

与此类似的质粒pTarget-trxB可以表达靶向起始菌株的trxB基因的gRNA，可以引导Cas9蛋白将基因组上的trxB基因靶标位置双链DNA切断。

各引物的序列如下：

gor-tgF：TGCCGATGGTAGCCTGACGCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

gor-tgR：GCGTCAGGCTACCATCGGCAACTAGTATTATACCTAG；

trxB-F：GAGATAGCGTGCAGAAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

trxB-R：GAGCTTCTGCACGCTATCTCACTAGTATTATACCTAG。

2、同源重组模板的获取：

同源重组模板获取的引物设计：以gor基因的开放阅读框及其5’端和3’端各5kb序列作为设计引物的模板。以步骤一中选定的PAM序列作为中心点，在其5’端选择一段50bp-3000bp的序列作为5’端同源臂，选择5’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-5HF，5’端同源臂3’端的12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列后得到最终反向引物gor-5HR；在中心点的3’端选择一段50bp-3000bp的序列作为3’端同源臂，选择3’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-3HF，3’端同源臂3’端12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列(用于重叠PCR)后得到最终反向引物gor-3HR；类似的以步骤一总选定的trxB基因PAM序列为中心点设计两个同源臂引物对trxB-5HF/trxB-5HR及trxB-3HF/trxB-3HR。

使用引物对trxB-5HF/trxB-5HR，通过PCR扩增出gor基因的5’端同源臂trxB-5HA；使用引物对trxB-3HF/trxB3HR，通过PCR扩增出gor基因的3’端同源臂trxB-3HA；

通过全基因合成的方式合成aaRS-tRNA序列，并使作为PCR模板，使用引物aaRS-tRNA-F/aaRS-tRNA-R进行PCR扩增，得到产物aaRS-tRNA，该片段上含有两个基因，分别是由tacI启动子驱动编码识别非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶的基因和对应的tRNA。

将PCR产物分别纯化回收后，混合gor-5HA、gor-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物gor-5HF和gor-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物gorHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

混合trxB-5HA、trxB-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物trxB-5HF和trxB-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物trxBHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA。

以大肠杆菌菌株为起始菌株，可使用如下的同源臂和引物序列：

gor-5HF：ATATGTACGGCCCGGATTAT

gor-5HR：ACAGCTCCCTAATGCAGGCACTACCGCTTTCGGGAT

gor-3HF：GCAGGCTTTTTTGCATCTAAGATGGTCGCAGTGAAA

gor-3HR：GTCCATACCAAAGCCAAT

trxB-5HF：CCAGTAACGTAAAGGGAA

trxB-5HR：ACAGCTCCCTAATGCAGGCATCAAAGTACAGTCGGG

trxB-3HF：GCAGGCTTTTTTGCATCTTGGGCAGGATTGTAGGGA

trxB-3HR：CCTGGGTCTACGGTGAGA

用于扩增aaRS-tRNA序列可以使用如下引物：

aaRS-tRNA-F：CCTGCATTAGGGAGCTGT

aaRS-tRNA-R：AGATGCAAAAAAGCCTGC；

改造大肠杆菌菌株的各同源臂的序列如下：

gor-5HA：

ATATGTACGGCCCGGATTATGGTTTTGATACCACTATCAATAAATTCAACTGGGAAACGTTGATCGCCAGCCGTACCGCCTATATCGACCGTATTCATACTTCCTATGAAAACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTCGTTGATGCCAAAACGCTGGAGGTAAACGGCGAAACCATCACGGCCGATCATATTCTGATCGCCACAGGCGGTCGTCCGAGCCACCCGGATATTCCGGGCGTGGAATACGGTATTGATTCTGATGGCTTCTTCGCCCTTCCTGCTTTGCCAGAGCGCGTGGCGGTTGTTGGAGCGGGTTACATCGCCGTTGAGCTGGCGGGCGTGATTAACGGCCTCGGCGCGAAAACGCATCTGTTTGTGCGTAAACATGCGCCGCTGCGCAGCTTCGACCCGATGATTTCCGAAACGCTGGTCGAAGTGATGAACGCCGAAGGCCCGCAGCTGCACACCAACGCCATCCCGAAAGCGGTAGTG

gor-3HA：

AAGATGGTCGCAGTGAAACGGTGGATTGCCTGATTTGGGCGATTGGTCGCGAGCCTGCCAATGACAACATCAACCTGGAAGCCGCTGGCGTTAAAACTAACGAAAAAGGCTATATCGTCGTCGATAAATATCAAAACACCAATATTGAAGGTATTTACGCGGTGGGCGATAACACGGGTGCAGTGGAGCTGACACCGGTGGCAGTTGCAGCGGGTCGCCGTCTCTCTGAACGCCTGTTTAATAACAAGCCGGATGAGCATCTGGATTACAGCAACATTCCGACCGTGGTCTTCAGCCATCCGCCGATTGGTACTGTTGGTTTAACGGAACCGCAGGCGCGCGAGCAGTATGGCGACGATCAGGTGAAAGTGTATAAATCCTCTTTCACCGCGATGTATACCGCCGTCACCACTCACCGCCAGCCGTGCCGCATGAAGCTGGTGTGCGTTGGATCGGAAGAGAAGATTGTCGGTATTCACGGCATTGGCTTTGGTATGGAC

trxB-5HA：

ATATGTACGGCCCGGATTATGGTTTTGATACCACTATCAATAAATTCAACTGGGAAACGTTGATCGCCAGCCGTACCGCCTATATCGACCGTATTCATACTTCCTATGAAAACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTCGTTGATGCCAAAACGCTGGAGGTAAACGGCGAAACCATCACGGCCGATCATATTCTGATCGCCACAGGCGGTCGTCCGAGCCACCCGGATATTCCGGGCGTGGAATACGGTATTGATTCTGATGGCTTCTTCGCCCTTCCTGCTTTGCCAGAGCGCGTGGCGGTTGTTGGAGCGGGTTACATCGCCGTTGAGCTGGCGGGCGTGATTAACGGCCTCGGCGCGAAAACGCATCTGTTTGTGCGTAAACATGCGCCGCTGCGCAGCTTCGACCCGATGATTTCCGAAACGCTGGTCGAAGTGATGAACGCCGAAGGCCCGCAGCTGCACACCAACGCCATCCCGAAAGCGGTAGTG

trxB-3HA：

AAGATGGTCGCAGTGAAACGGTGGATTGCCTGATTTGGGCGATTGGTCGCGAGCCTGCCAATGACAACATCAACCTGGAAGCCGCTGGCGTTAAAACTAACGAAAAAGGCTATATCGTCGTCGATAAATATCAAAACACCAATATTGAAGGTATTTACGCGGTGGGCGATAACACGGGTGCAGTGGAGCTGACACCGGTGGCAGTTGCAGCGGGTCGCCGTCTCTCTGAACGCCTGTTTAATAACAAGCCGGATGAGCATCTGGATTACAGCAACATTCCGACCGTGGTCTTCAGCCATCCGCCGATTGGTACTGTTGGTTTAACGGAACCGCAGGCGCGCGAGCAGTATGGCGACGATCAGGTGAAAGTGTATAAATCCTCTTTCACCGCGATGTATACCGCCGTCACCACTCACCGCCAGCCGTGCCGCATGAAGCTGGTGTGCGTTGGATCGGAAGAGAAGATTGTCGGTATTCACGGCATTGGCTTTGGTATGGAC。

全基因合成的非天然氨基酸aaRS-tRNA序列，本实施例以吡咯赖氨酸系统为例，则插入基因组的aaRS-tRNA序列如下：

CCTGCATTAGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAAGGAGGTATGGATAAAAAGCCTCTGAACACTCTGATTTCTGCGACCGGTCTGTGGATGTCCCGCACCGGCACCATCCACAAAATCAAACACCATGAAGTTAGCCGTTCCAAAATCTACATTGAAATGGCTTGCGGCGATCACCTGGTTGTCAACAACTCGCGTTCTTCTCGTACCGCTCGCGCACTGCGCCACCACAAATATCGCAAAACCTGCAAACGTTGCCGTGTTAGCGATGAAGATCTGAACAAATTCCTGACCAAAGCTAACGAGGATCAGACCTCCGTAAAAGTGAAGGTAGTAAGCGCTCCGACCCGTACTAAAAAGGCTATGCCAAAAAGCGTGGCCCGTGCCCCGAAACCTCTGGAAAACACCGAGGCGGCTCAGGCTCAACCATCCGGTTCTAAATTTTCTCCGGCGATCCCAGTGTCCACCCAAGAATCTGTTTCCGTACCAGCAAGCGTGTCTACCAGCATTAGCAGCATTTCTACCGGTGCTACCGCTTCAGCGCTGGTAAAAGGTAACACTAACCCGATTACTAGCATGTCTGCACCGGTACAGGCAAGCGCCCCAGCTCTGACTAAATCCCAGACGGACCGTCTGGAGGTGCTGCTGAACCCAAAGGATGAAATCTCTCTGAACAGCGGCAAGCCTTTCCGTGAGCTCGAAAGCGAGCTGCTGTCTCGTCGTAAAAAGGATCTGCAACAGATCTACGCTGAGGAACGCGAGAACTATCTGGGTAAGCTAGAGCGCGAAATTACTCGCTTCTTCGTGGATCGCGGTTTCCTGGAGATCAAATCTCCGATTCTGATTCCGCTGGAATACATTGAACGTATGGGCATCGATAATGATACCGAACTGTCTAAACAGATCTTCCGTGTGGATAAAAACTTCTGTCTGCGTCCGATGCTGGCCCCGAACCTGTACAACTATCTGCGTAAACTGGACCGTGCCCTGCCGGACCCGATCAAAATTTTCGAGATCGGTCCTTGCTACCGTAAAGAGTCCGACGGTAAAGAGCACCTGGAAGAATTCACCATGCTGAACTTTTGCCAGATGGGTAGCGGTTGCACGCGTGAAAACCTGGAATCGATTATCACCGACTTCCTGAATCACCTGGGTATCGATTTCAAAATTGTTGGTGACAGCTGTATGGTGTACGGCGATACGCTGGATGTTATGCACGGCGATCTGGAGCTGTCTTCCGCAGTAGTGGGCCCAATCCCGCTGGATCGTGAGTGGGGTATCGACAAACCTTGGATCGGTGCGGGTTTTGGTCTGGAGCGTCTGCTGAAAGTAAAACACGACTTCAAGAACATCAAACGTGCTGCACGTTCCGAGTCCTATTACAATGGTATTTCTACTAACCTGTAACTGCAGTTTCAAACGCTAAATTGCCTGATGCGCTACGCTTATCAGGCCTACATGATCTCTGCAATATATTGAGTTTGCGTGCTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCAAGAAACAGCAAACAATCCAAAACGCCGCGTTCAGCGGCGTTTTTTCTGCTTTTCTTCGCGAATTAATTCCGCTTCGCAACGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTGGAAACCTGATCATGTAGATCGAACGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGCATCT

上述两个同源重组模板DNA片段的同源重组双交换模式如图4。

3、转化与菌株构建：

首先制备起始菌株的感受态细胞，本实施例以大肠杆菌BL21(DE3)作为例子，并通过钙离子介导或电击介导的转化，转入质粒pCas(ADDGENE,#60847).使用卡那霉素筛选转化子。将获得的含pCas质粒的BL21(DE3)再次制备感受态细胞。并且在制备感受态细胞的过程中培养基添加20mM阿拉伯糖，用于诱导pCas质粒上的λred系统表达。

使用步骤1中制备的质粒pTarget-gor和步骤2中制备的同源重组片段gorHA-aaRS-tRNA进行共转化，并经过卡那霉素和壮观霉素共筛选得到候选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落。

再将得到的阳性菌株进行试管培养，30℃条件下，在培养基中添加1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达，降解pTarget-gor质粒，达到质粒消除的目的。将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为消除了质粒pTarget-gor的菌株。

再将上述消除了质粒pTarget-gor的菌株制备感受态细胞，使用步骤1中制备的质粒pTarget-trxB和步骤2中制备的同源重组片段trxBHA-aaRS-tRNA进行共转化，并经过卡那霉素和壮观霉素共筛选得到候选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落。

再将得到的阳性菌株进行试管培养，30℃条件下，在培养基中添加1Mm IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达，降解pTarget-trxB质粒,达到质粒消除的目标。将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌。

最后通过将培养温度调高到37℃消除温度敏感型的pCas质粒，24h的培养后，在不含的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个添加100ug/mL壮观霉素固体培养基上，30℃培养。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌。

最终得到重组蛋白表达用工程菌株命名为NCBB(DE3)，该菌株gor基因和trxB基因位置各被插入了一个拷贝aaRS-tRNA的菌株。该菌株细胞内不含有质粒，只能在不含抗生素的培养基上生长。

NCBB(DE3)菌株的应用

将质粒pET21a-rhGH-UAC转化NCBB(DE3)的感受态细胞，该质粒为商业化pET21a(Novagen)的多克隆位点插入重组人生长激素rhGH的编码阅读框，且其内部的一个氨基酸的密码子被替换为琥珀密码子UAG(如131位、136位和145位等)。

挑取转化后的单克隆，接种于含氨苄青霉素100mg/L、的LB培养基中，30℃180rpm培养过夜。以1/100的接种量，将活化后的菌液接种于新鲜的不含抗生素的LB培养基中，37℃180r/min振荡培养至0D600约为0.5～0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度1mM，加入非天然氨基酸NAEK至终浓度1mM(阴性对照在诱导表达时不添加非天然氨基酸)，37℃180r/min诱导培养24h。诱导结束后，取1mL菌液12000g离心，弃上清收集菌体，用100μL PBS重悬菌体，并进行SDS-PAGE凝胶电泳验证，结果如图5所示。

实施例2：

本实施例2与实施例1的差别仅在于：全基因合成的非天然氨基酸aaRS-tRNA序列，使用对乙酰苯丙氨酸时，插入基因组的aaRS-tRNA序列如下：

CCTGCATTAGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAAGGAGGTATGGACGAGTTCGAAATGATTAAACGCAACACCAGCGAAATTATCTCTGAAGAAGAGCTGCGCGAGGTGCTGAAGAAAGACGAGAAGAGCGCGCTGATTGGCTTTGAGCCGTCCGGTAAAATTCACCTAGGTCACTACCTGCAAATCAAGAAGATGATTGATCTGCAAAACGCTGGTTTTGACATCATTATCCTGCTGGCGGACCTGCACGCCTACCTGAATCAAAAGGGCGAGCTGGATGAGATTCGCAAGATCGGCGACTACAATAAGAAAGTCTTCGAAGCCATGGGTTTGAAGGCTAAATACGTCTACGGTAGCGAATTTCAGCTGGATAAGGATTACACGTTGAATGTGTACCGTCTGGCGCTAAAAACCACGCTGAAACGCGCCCGTCGTTCCATGGAGCTGATTGCGCGCGAGGATGAGAATCCAAAAGTTGCTGAGGTTATTTACCCTATTATGCAAGTTAATGGCTGCCACTACCGCGGTGTTGATGTTGCCGTCGGTGGTATGGAGCAACGCAAAATTCACATGCTGGCACGTGAACTGCTGCCGAAAAAGGTTGTCTGTATTCATAATCCGGTCCTGACCGGCCTGGATGGCGAGGGTAAAATGAGCAGCAGCAAGGGTAACTTTATTGCAGTTGACGATAGCCCGGAAGAAATCCGTGCGAAGATCAAGAAAGCGTACTGCCCGGCAGGCGTGGTTGAGGGTAACCCGATCATGGAAATCGCCAAGTATTTTCTGGAATACCCACTGACGATTAAGCGCCCGGAGAAATTTGGCGGCGACCTGACCGTCAACAGCTACGAGGAGCTGGAAAGCTTGTTTAAGAACAAAGAACTGCATCCGATGCGCCTGAAAAACGCCGTGGCGGAAGAGCTGATTAAGATTCTGGAACCAATTCGCAAACGTCTGTAAGTTTGCGTGCTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCAAGAAACAGCAAACAATCCAAAACGCCGCGTTCAGCGGCGTTTTTTCTGCTTTTCTTCGCGAATTAATTCCGCTTCGCAACGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCAGGGGTTCAAATCCCCTCCGCCGGACCACCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGCATCT得到的菌株命名未NCBB2并进行凝胶电泳验证，结果如图6所示。

以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江新码生物医药有限公司

<120> 一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法

<130> 1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgccgatggt agcctgacgc gttttagagc tagaaata 38

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcgtcaggct accatcggca actagtatta tacctag 37

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gagatagcgt gcagaagctc gttttagagc tagaaata 38

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gagcttctgc acgctatctc actagtatta tacctag 37

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atatgtacgg cccggattat 20

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acagctccct aatgcaggca ctaccgcttt cgggat 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcaggctttt ttgcatctaa gatggtcgca gtgaaa 36

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gtccatacca aagccaat 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccagtaacgt aaagggaa 18

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

acagctccct aatgcaggca tcaaagtaca gtcggg 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcaggctttt ttgcatcttg ggcaggattg taggga 36

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cctgggtcta cggtgaga 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

cctgcattag ggagctgt 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

agatgcaaaa aagcctgc 18

<210> 15

<211> 515

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

atatgtacgg cccggattat ggttttgata ccactatcaa taaattcaac tgggaaacgt 60

tgatcgccag ccgtaccgcc tatatcgacc gtattcatac ttcctatgaa aacgtgctcg 120

gtaaaaataa cgttgatgta atcaaaggct ttgcccgctt cgttgatgcc aaaacgctgg 180

aggtaaacgg cgaaaccatc acggccgatc atattctgat cgccacaggc ggtcgtccga 240

gccacccgga tattccgggc gtggaatacg gtattgattc tgatggcttc ttcgcccttc 300

ctgctttgcc agagcgcgtg gcggttgttg gagcgggtta catcgccgtt gagctggcgg 360

gcgtgattaa cggcctcggc gcgaaaacgc atctgtttgt gcgtaaacat gcgccgctgc 420

gcagcttcga cccgatgatt tccgaaacgc tggtcgaagt gatgaacgcc gaaggcccgc 480

agctgcacac caacgccatc ccgaaagcgg tagtg 515

<210> 16

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aagatggtcg cagtgaaacg gtggattgcc tgatttgggc gattggtcgc gagcctgcca 60

atgacaacat caacctggaa gccgctggcg ttaaaactaa cgaaaaaggc tatatcgtcg 120

tcgataaata tcaaaacacc aatattgaag gtatttacgc ggtgggcgat aacacgggtg 180

cagtggagct gacaccggtg gcagttgcag cgggtcgccg tctctctgaa cgcctgttta 240

ataacaagcc ggatgagcat ctggattaca gcaacattcc gaccgtggtc ttcagccatc 300

cgccgattgg tactgttggt ttaacggaac cgcaggcgcg cgagcagtat ggcgacgatc 360

aggtgaaagt gtataaatcc tctttcaccg cgatgtatac cgccgtcacc actcaccgcc 420

agccgtgccg catgaagctg gtgtgcgttg gatcggaaga gaagattgtc ggtattcacg 480

gcattggctt tggtatggac 500

<210> 17

<211> 515

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

atatgtacgg cccggattat ggttttgata ccactatcaa taaattcaac tgggaaacgt 60

tgatcgccag ccgtaccgcc tatatcgacc gtattcatac ttcctatgaa aacgtgctcg 120

gtaaaaataa cgttgatgta atcaaaggct ttgcccgctt cgttgatgcc aaaacgctgg 180

aggtaaacgg cgaaaccatc acggccgatc atattctgat cgccacaggc ggtcgtccga 240

gccacccgga tattccgggc gtggaatacg gtattgattc tgatggcttc ttcgcccttc 300

ctgctttgcc agagcgcgtg gcggttgttg gagcgggtta catcgccgtt gagctggcgg 360

gcgtgattaa cggcctcggc gcgaaaacgc atctgtttgt gcgtaaacat gcgccgctgc 420

gcagcttcga cccgatgatt tccgaaacgc tggtcgaagt gatgaacgcc gaaggcccgc 480

agctgcacac caacgccatc ccgaaagcgg tagtg 515

<210> 18

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

aagatggtcg cagtgaaacg gtggattgcc tgatttgggc gattggtcgc gagcctgcca 60

atgacaacat caacctggaa gccgctggcg ttaaaactaa cgaaaaaggc tatatcgtcg 120

tcgataaata tcaaaacacc aatattgaag gtatttacgc ggtgggcgat aacacgggtg 180

cagtggagct gacaccggtg gcagttgcag cgggtcgccg tctctctgaa cgcctgttta 240

ataacaagcc ggatgagcat ctggattaca gcaacattcc gaccgtggtc ttcagccatc 300

cgccgattgg tactgttggt ttaacggaac cgcaggcgcg cgagcagtat ggcgacgatc 360

aggtgaaagt gtataaatcc tctttcaccg cgatgtatac cgccgtcacc actcaccgcc 420

agccgtgccg catgaagctg gtgtgcgttg gatcggaaga gaagattgtc ggtattcacg 480

gcattggctt tggtatggac 500

<210> 19

<211> 1865

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cctgcattag ggagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag 60

cggataacaa tttcacaaag gaggtatgga taaaaagcct ctgaacactc tgatttctgc 120

gaccggtctg tggatgtccc gcaccggcac catccacaaa atcaaacacc atgaagttag 180

ccgttccaaa atctacattg aaatggcttg cggcgatcac ctggttgtca acaactcgcg 240

ttcttctcgt accgctcgcg cactgcgcca ccacaaatat cgcaaaacct gcaaacgttg 300

ccgtgttagc gatgaagatc tgaacaaatt cctgaccaaa gctaacgagg atcagacctc 360

cgtaaaagtg aaggtagtaa gcgctccgac ccgtactaaa aaggctatgc caaaaagcgt 420

ggcccgtgcc ccgaaacctc tggaaaacac cgaggcggct caggctcaac catccggttc 480

taaattttct ccggcgatcc cagtgtccac ccaagaatct gtttccgtac cagcaagcgt 540

gtctaccagc attagcagca tttctaccgg tgctaccgct tcagcgctgg taaaaggtaa 600

cactaacccg attactagca tgtctgcacc ggtacaggca agcgccccag ctctgactaa 660

atcccagacg gaccgtctgg aggtgctgct gaacccaaag gatgaaatct ctctgaacag 720

cggcaagcct ttccgtgagc tcgaaagcga gctgctgtct cgtcgtaaaa aggatctgca 780

acagatctac gctgaggaac gcgagaacta tctgggtaag ctagagcgcg aaattactcg 840

cttcttcgtg gatcgcggtt tcctggagat caaatctccg attctgattc cgctggaata 900

cattgaacgt atgggcatcg ataatgatac cgaactgtct aaacagatct tccgtgtgga 960

taaaaacttc tgtctgcgtc cgatgctggc cccgaacctg tacaactatc tgcgtaaact 1020

ggaccgtgcc ctgccggacc cgatcaaaat tttcgagatc ggtccttgct accgtaaaga 1080

gtccgacggt aaagagcacc tggaagaatt caccatgctg aacttttgcc agatgggtag 1140

cggttgcacg cgtgaaaacc tggaatcgat tatcaccgac ttcctgaatc acctgggtat 1200

cgatttcaaa attgttggtg acagctgtat ggtgtacggc gatacgctgg atgttatgca 1260

cggcgatctg gagctgtctt ccgcagtagt gggcccaatc ccgctggatc gtgagtgggg 1320

tatcgacaaa ccttggatcg gtgcgggttt tggtctggag cgtctgctga aagtaaaaca 1380

cgacttcaag aacatcaaac gtgctgcacg ttccgagtcc tattacaatg gtatttctac 1440

taacctgtaa ctgcagtttc aaacgctaaa ttgcctgatg cgctacgctt atcaggccta 1500

catgatctct gcaatatatt gagtttgcgt gcttttgtag gccggataag gcgttcacgc 1560

cgcatccggc aagaaacagc aaacaatcca aaacgccgcg ttcagcggcg ttttttctgc 1620

ttttcttcgc gaattaattc cgcttcgcaa cggctaacta agcggcctgc tgactttctc 1680

gccgatcaaa aggcattttg ctattaaggg attgacgagg gcgtatctgc gcagtaagat 1740

gcgccccgca ttggaaacct gatcatgtag atcgaacgga ctctaaatcc gttcagccgg 1800

gttagattcc cggggtttcc gccaaattcg aaaagcctgc tcaacgagca ggcttttttg 1860

catct 1865

<210> 20

<211> 1357

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

cctgcattag ggagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag 60

cggataacaa tttcacaaag gaggtatgga cgagttcgaa atgattaaac gcaacaccag 120

cgaaattatc tctgaagaag agctgcgcga ggtgctgaag aaagacgaga agagcgcgct 180

gattggcttt gagccgtccg gtaaaattca cctaggtcac tacctgcaaa tcaagaagat 240

gattgatctg caaaacgctg gttttgacat cattatcctg ctggcggacc tgcacgccta 300

cctgaatcaa aagggcgagc tggatgagat tcgcaagatc ggcgactaca ataagaaagt 360

cttcgaagcc atgggtttga aggctaaata cgtctacggt agcgaatttc agctggataa 420

ggattacacg ttgaatgtgt accgtctggc gctaaaaacc acgctgaaac gcgcccgtcg 480

ttccatggag ctgattgcgc gcgaggatga gaatccaaaa gttgctgagg ttatttaccc 540

tattatgcaa gttaatggct gccactaccg cggtgttgat gttgccgtcg gtggtatgga 600

gcaacgcaaa attcacatgc tggcacgtga actgctgccg aaaaaggttg tctgtattca 660

taatccggtc ctgaccggcc tggatggcga gggtaaaatg agcagcagca agggtaactt 720

tattgcagtt gacgatagcc cggaagaaat ccgtgcgaag atcaagaaag cgtactgccc 780

ggcaggcgtg gttgagggta acccgatcat ggaaatcgcc aagtattttc tggaataccc 840

actgacgatt aagcgcccgg agaaatttgg cggcgacctg accgtcaaca gctacgagga 900

gctggaaagc ttgtttaaga acaaagaact gcatccgatg cgcctgaaaa acgccgtggc 960

ggaagagctg attaagattc tggaaccaat tcgcaaacgt ctgtaagttt gcgtgctttt 1020

gtaggccgga taaggcgttc acgccgcatc cggcaagaaa cagcaaacaa tccaaaacgc 1080

cgcgttcagc ggcgtttttt ctgcttttct tcgcgaatta attccgcttc gcaacggcta 1140

actaagcggc ctgctgactt tctcgccgat caaaaggcat tttgctatta agggattgac 1200

gagggcgtat ctgcgcagta agatgcgccc cgcattccgg cggtagttca gcagggcaga 1260

acggcggact ctaaatccgc atggcagggg ttcaaatccc ctccgccgga ccaccaaatt 1320

cgaaaagcct gctcaacgag caggcttttt tgcatct 1357

Claims (10)

1.一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、CRISPR技术质粒构建

引物设计：选择gor基因开放阅读框内任意一个连续三碱基(5-NGG-3’)组成的PAM序列，则该PAM序列前的20个碱基组成的序列A就是引导RNA(gRNA)的靶标，将A序列的3’端添加序列5’-GTTTTAGAGCTAGAAATA-3’，得到引物gor-tgF；在A序列的反向互补序列的3’端添加序列5’-ACTAGTATTATACCTAG-3’，得到引物gor-tgR；gor-tgF/gor-tgR引物对用于构建切断gor基因为靶标的CRISPR技术质粒；同样的以trxB基因的编码框中任意一个PAM序列设计引物对trxB-tgF/trxB-tgR即可用于构建切断trxB基因为靶标的CRISPR技术质粒；

使用gor-tgF/gor-tgR和trxB-tgF/trxB-tgR两对引物对，以质粒pTargetF为PCR模板，扩增DNA片段，将两段PCR产物分别纯化后，进行限制性内切酶DpnI酶切并纯化回收，然后转化Top10感受态细胞，再筛选重组转化子，并提取质粒后经测序获得质粒pTarget-gor及pTarget-trxB；

二、同源重组模板的获取

同源重组模板获取的引物设计：以gor基因的开放阅读框及其5’端和3’端各5kb序列作为设计引物的模板。以步骤一中选定的PAM序列作为中心点，在其5’端选择一段50bp-3000bp的序列作为5’端同源臂，选择5’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-5HF，5’端同源臂3’端的12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列后得到最终反向引物gor-5HR；在中心点的3’端选择一段50bp-3000bp的序列作为3’端同源臂，选择3’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-3HF，3’端同源臂3’端12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列(用于重叠PCR)后得到最终反向引物gor-3HR；类似的以步骤一总选定的trxB基因PAM序列为中心点设计两个同源臂引物对trxB-5HF/trxB-5HR及trxB-3HF/trxB-3HR；

以起始大肠杆菌菌株的基因组DNA作为模板，分别使用引物对gor-5HF/gor-5HR，通过PCR扩增出gor基因的5’端同源臂gor-5HA；使用引物对gor-3HF/gor-3HR，通过PCR扩增出gor基因的3’端同源臂gor-3HA；

使用引物对trxB-5HF/trxB-5HR，通过PCR扩增出trxB基因的5’端同源臂trxB-5HA；使用引物对trxB-3HF/trxB-3HR，通过PCR扩增出trxB基因的3’端同源臂trxB-3HA；

通过全基因合成的方式合成aaRS-tRNA序列，并使作为PCR模板，使用引物aaRS-tRNA-F/aaRS-tRNA-R进行PCR扩增，得到产物aaRS-tRNA，并将PCR产物分别纯化回收；

混合PCR产物gor-5HA、gor-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物gor-5HF和gor-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物gorHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

混合trxB-5HA、trxB-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物trxB-5HF和trxB-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物trxBHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

三、转化与菌株构建

制备起始菌株的感受态细胞，转入质粒pCas，筛选获得含pCas质粒的单克隆菌株；

将上述单克隆菌株制备感受态细胞，并使用质粒pTarget-gor和同源重组片段gorHA-aaRS-tRNA进行共转化，然后筛选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达，降解pTarget-gor质粒；

将诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

再将上述完成pTarget-gor质粒消除的菌株制备感受态细胞，使用质粒pTarget-trxB和同源重组片段trxBHA-aaRS-tRNA进行共转化，筛选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并使用1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达，降解pTarget-trxB质粒；

将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；最后通过将目标菌培养温度调高到37℃消除温度敏感型的pCas质粒，24h的培养后，在不含的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个添加100ug/mL壮观霉素固体培养基上，30℃培养,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

最终得到重组蛋白表达用工程菌株，其gor基因和trxB基因位置各被插入了一个拷贝aaRS-tRNA的菌株。

2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

一、CRISPR技术质粒构建

使用gor-tgF/gor-tgR和trxB-tgF/trxB-tgR两对引物对，以质粒pTargetF为PCR模板，扩增DNA片段，将两段PCR产物分别纯化后，进行限制性内切酶DpnI酶切并纯化回收，然后转化Top10感受态细胞，再筛选重组转化子，并提取质粒后经测序获得质粒pTarget-gor及pTarget-trxB；

以大肠杆菌作为改造起始菌株则各引物的序列如下：

gor-tgF：TGCCGATGGTAGCCTGACGCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

gor-tgR：GCGTCAGGCTACCATCGGCAACTAGTATTATACCTAG；

trxB-F：GAGATAGCGTGCAGAAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATA；

trxB-R：GAGCTTCTGCACGCTATCTCACTAGTATTATACCTAG；

二、同源重组模板的获取

同源重组模板获取的引物设计：以gor基因的开放阅读框及其5’端和3’端各5kb序列作为设计引物的模板。以步骤一中选定的PAM序列作为中心点，在其5’端选择一段50bp-3000bp的序列作为5’端同源臂，选择5’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-5HF，5’端同源臂3’端的12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列后得到最终反向引物gor-5HR；在中心点的3’端选择一段50bp-3000bp的序列作为3’端同源臂，选择3’端同源臂的5’端12-90bp序列作为正向引物命名为gor-3HF，3’端同源臂3’端12-90bp序列的反向互补序列作为反向引物，并添加上aaRS-tRNA序列的重叠序列(用于重叠PCR)后得到最终反向引物gor-3HR；类似的以步骤一总选定的trxB基因PAM序列为中心点设计两个同源臂引物对trxB-5HF/trxB-5HR及trxB-3HF/trxB-3HR。起始菌株为大肠杆菌,以起始大肠杆菌菌株的基因组DNA作为模板，分别使用引物对gor-5HF/gor-5HR，通过PCR扩增出gor基因的5’端同源臂gor-5HA；使用引物对gor-3HF/gor-3HR，通过PCR扩增出gor基因的3’端同源臂gor-3HA；

使用引物对trxB-5HF/trxB-5HR，通过PCR扩增出trxB基因的5’端同源臂trxB-5HA；使用引物对trxB-3HF/trxB-3HR，通过PCR扩增出trxB基因的3’端同源臂trxB-3HA；

通过全基因合成的方式合成aaRS-tRNA序列，并使作为PCR模板，使用引物aaRS-tRNA-F/aaRS-tRNA-R进行PCR扩增，得到产物aaRS-tRNA，并将PCR产物分别纯化回收；

混合PCR产物gor-5HA、gor-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物gor-5HF和gor-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物gorHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

混合trxB-5HA、trxB-3HA和aaRS-tRNA作为PCR模板，使用引物trxB-5HF和trxB-3HR,通过重叠PCR得到三个DNA片段串联的产物trxBHA-aaRS-tRNA，用于作为菌株转化时的同源重组模板DNA；

各引物的序列如下：

gor-5HF：ATATGTACGGCCCGGATTAT

gor-5HR：ACAGCTCCCTAATGCAGGCACTACCGCTTTCGGGAT

gor-3HF：GCAGGCTTTTTTGCATCTAAGATGGTCGCAGTGAAA

gor-3HR：GTCCATACCAAAGCCAAT

trxB-5HF：CCAGTAACGTAAAGGGAA

trxB-5HR：ACAGCTCCCTAATGCAGGCATCAAAGTACAGTCGGG

trxB-3HF：GCAGGCTTTTTTGCATCTTGGGCAGGATTGTAGGGA

trxB-3HR：CCTGGGTCTACGGTGAGA

aaRS-tRNA-F：CCTGCATTAGGGAGCTGT

aaRS-tRNA-R：AGATGCAAAAAAGCCTGC；

各同源臂的序列如下：

gor-5HA：

ATATGTACGGCCCGGATTATGGTTTTGATACCACTATCAATAAATTCAACTGGGAAACGTTGATCGCCAGCCGTACCGCCTATATCGACCGTATTCATACTTCCTATGAAAACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTCGTTGATGCCAAAACGCTGGAGGTAAACGGCGAAACCATCACGGCCGATCATATTCTGATCGCCACAGGCGGTCGTCCGAGCCACCCGGATATTCCGGGCGTGGAATACGGTATTGATTCTGATGGCTTCTTCGCCCTTCCTGCTTTGCCAGAGCGCGTGGCGGTTGTTGGAGCGGGTTACATCGCCGTTGAGCTGGCGGGCGTGATTAACGGCCTCGGCGCGAAAACGCATCTGTTTGTGCGTAAACATGCGCCGCTGCGCAGCTTCGACCCGATGATTTCCGAAACGCTGGTCGAAGTGATGAACGCCGAAGGCCCGCAGCTGCACACCAACGCCATCCCGAAAGCGGTAGTG

gor-3HA：

AAGATGGTCGCAGTGAAACGGTGGATTGCCTGATTTGGGCGATTGGTCGCGAGCCTGCCAATGACAACATCAACCTGGAAGCCGCTGGCGTTAAAACTAACGAAAAAGGCTATATCGTCGTCGATAAATATCAAAACACCAATATTGAAGGTATTTACGCGGTGGGCGATAACACGGGTGCAGTGGAGCTGACACCGGTGGCAGTTGCAGCGGGTCGCCGTCTCTCTGAACGCCTGTTTAATAACAAGCCGGATGAGCATCTGGATTACAGCAACATTCCGACCGTGGTCTTCAGCCATCCGCCGATTGGTACTGTTGGTTTAACGGAACCGCAGGCGCGCGAGCAGTATGGCGACGATCAGGTGAAAGTGTATAAATCCTCTTTCACCGCGATGTATACCGCCGTCACCACTCACCGCCAGCCGTGCCGCATGAAGCTGGTGTGCGTTGGATCGGAAGAGAAGATTGTCGGTATTCACGGCATTGGCTTTGGTATGGAC

trxB-5HA：

ATATGTACGGCCCGGATTATGGTTTTGATACCACTATCAATAAATTCAACTGGGAAACGTTGATCGCCAGCCGTACCGCCTATATCGACCGTATTCATACTTCCTATGAAAACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTCGTTGATGCCAAAACGCTGGAGGTAAACGGCGAAACCATCACGGCCGATCATATTCTGATCGCCACAGGCGGTCGTCCGAGCCACCCGGATATTCCGGGCGTGGAATACGGTATTGATTCTGATGGCTTCTTCGCCCTTCCTGCTTTGCCAGAGCGCGTGGCGGTTGTTGGAGCGGGTTACATCGCCGTTGAGCTGGCGGGCGTGATTAACGGCCTCGGCGCGAAAACGCATCTGTTTGTGCGTAAACATGCGCCGCTGCGCAGCTTCGACCCGATGATTTCCGAAACGCTGGTCGAAGTGATGAACGCCGAAGGCCCGCAGCTGCACACCAACGCCATCCCGAAAGCGGTAGTG

trxB-3HA：

AAGATGGTCGCAGTGAAACGGTGGATTGCCTGATTTGGGCGATTGGTCGCGAGCCTGCCAATGACAACATCAACCTGGAAGCCGCTGGCGTTAAAACTAACGAAAAAGGCTATATCGTCGTCGATAAATATCAAAACACCAATATTGAAGGTATTTACGCGGTGGGCGATAACACGGGTGCAGTGGAGCTGACACCGGTGGCAGTTGCAGCGGGTCGCCGTCTCTCTGAACGCCTGTTTAATAACAAGCCGGATGAGCATCTGGATTACAGCAACATTCCGACCGTGGTCTTCAGCCATCCGCCGATTGGTACTGTTGGTTTAACGGAACCGCAGGCGCGCGAGCAGTATGGCGACGATCAGGTGAAAGTGTATAAATCCTCTTTCACCGCGATGTATACCGCCGTCACCACTCACCGCCAGCCGTGCCGCATGAAGCTGGTGTGCGTTGGATCGGAAGAGAAGATTGTCGGTATTCACGGCATTGGCTTTGGTATGGAC；

三、转化与菌株构建

制备BL21(DE3)的感受态细胞，转入质粒pCas，筛选获得含pCas质粒的BL21(DE3)感受态细胞单克隆菌株；

将上述单克隆菌株制备感受态细胞，并使用质粒pTarget-gor和同源重组片段gorHA-aaRS-tRNA进行共转化，然后筛选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并使用1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达，降解pTarget-gor质粒；

将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上。挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

再将上述完成pTarget-gor质粒消除的菌株制备感受态细胞，使用质粒pTarget-trxB和同源重组片段trxBHA-aaRS-tRNA进行共转化，筛选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落；

再将得到的阳性菌株进行试管培养，并使用1mM IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达，降解pTarget-trxB质粒；

将IPTG诱导培养得到的菌液在含100ug/mL壮观霉素的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个同时添加100ug/mL壮观霉素和100ug/mL卡那霉素的固体平板上,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；最后通过将目标菌培养温度调高到37℃消除温度敏感型的pCas质粒，24h的培养后，在不含的固体培养基上划线挑选单菌落，并转接种到一个添加100ug/mL壮观霉素固体培养基上，30℃培养,挑选的单菌落中，在转接培养基中无法生长的菌落即为目标菌；

最终得到重组蛋白表达用工程菌株，其gor基因和trxB基因位置各被插入了一个拷贝aaRS-tRNA的菌株。

3.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤二中全基因合成的非天然氨基酸aaRS-tRNA序列，以吡咯赖氨酸系统合成，插入基因组的aaRS-tRNA序列如下：

CCTGCATTAGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAAGGAGGTATGGATAAAAAGCCTCTGAACACTCTGATTTCTGCGACCGGTCTGTGGATGTCCCGCACCGGCACCATCCACAAAATCAAACACCATGAAGTTAGCCGTTCCAAAATCTACATTGAAATGGCTTGCGGCGATCACCTGGTTGTCAACAACTCGCGTTCTTCTCGTACCGCTCGCGCACTGCGCCACCACAAATATCGCAAAACCTGCAAACGTTGCCGTGTTAGCGATGAAGATCTGAACAAATTCCTGACCAAAGCTAACGAGGATCAGACCTCCGTAAAAGTGAAGGTAGTAAGCGCTCCGACCCGTACTAAAAAGGCTATGCCAAAAAGCGTGGCCCGTGCCCCGAAACCTCTGGAAAACACCGAGGCGGCTCAGGCTCAACCATCCGGTTCTAAATTTTCTCCGGCGATCCCAGTGTCCACCCAAGAATCTGTTTCCGTACCAGCAAGCGTGTCTACCAGCATTAGCAGCATTTCTACCGGTGCTACCGCTTCAGCGCTGGTAAAAGGTAACACTAACCCGATTACTAGCATGTCTGCACCGGTACAGGCAAGCGCCCCAGCTCTGACTAAATCCCAGACGGACCGTCTGGAGGTGCTGCTGAACCCAAAGGATGAAATCTCTCTGAACAGCGGCAAGCCTTTCCGTGAGCTCGAAAGCGAGCTGCTGTCTCGTCGTAAAAAGGATCTGCAACAGATCTACGCTGAGGAACGCGAGAACTATCTGGGTAAGCTAGAGCGCGAAATTACTCGCTTCTTCGTGGATCGCGGTTTCCTGGAGATCAAATCTCCGATTCTGATTCCGCTGGAATACATTGAACGTATGGGCATCGATAATGATACCGAACTGTCTAAACAGATCTTCCGTGTGGATAAAAACTTCTGTCTGCGTCCGATGCTGGCCCCGAACCTGTACAACTATCTGCGTAAACTGGACCGTGCCCTGCCGGACCCGATCAAAATTTTCGAGATCGGTCCTTGCTACCGTAAAGAGTCCGACGGTAAAGAGCACCTGGAAGAATTCACCATGCTGAACTTTTGCCAGATGGGTAGCGGTTGCACGCGTGAAAACCTGGAATCGATTATCACCGACTTCCTGAATCACCTGGGTATCGATTTCAAAATTGTTGGTGACAGCTGTATGGTGTACGGCGATACGCTGGATGTTATGCACGGCGATCTGGAGCTGTCTTCCGCAGTAGTGGGCCCAATCCCGCTGGATCGTGAGTGGGGTATCGACAAACCTTGGATCGGTGCGGGTTTTGGTCTGGAGCGTCTGCTGAAAGTAAAACACGACTTCAAGAACATCAAACGTGCTGCACGTTCCGAGTCCTATTACAATGGTATTTCTACTAACCTGTAACTGCAGTTTCAAACGCTAAATTGCCTGATGCGCTACGCTTATCAGGCCTACATGATCTCTGCAATATATTGAGTTTGCGTGCTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCAAGAAACAGCAAACAATCCAAAACGCCGCGTTCAGCGGCGTTTTTTCTGCTTTTCTTCGCGAATTAATTCCGCTTCGCAACGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTGGAAACCTGATCATGTAGATCGAACGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGCATCT。

4.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤二中全基因合成的非天然氨基酸aaRS-tRNA序列，以对乙酰苯丙氨酸系统合成时，则插入基因组的aaRS-tRNA序列如下：

CCTGCATTAGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAAGGAGGTATGGACGAGTTCGAAATGATTAAACGCAACACCAGCGAAATTATCTCTGAAGAAGAGCTGCGCGAGGTGCTGAAGAAAGACGAGAAGAGCGCGCTGATTGGCTTTGAGCCGTCCGGTAAAATTCACCTAGGTCACTACCTGCAAATCAAGAAGATGATTGATCTGCAAAACGCTGGTTTTGACATCATTATCCTGCTGGCGGACCTGCACGCCTACCTGAATCAAAAGGGCGAGCTGGATGAGATTCGCAAGATCGGCGACTACAATAAGAAAGTCTTCGAAGCCATGGGTTTGAAGGCTAAATACGTCTACGGTAGCGAATTTCAGCTGGATAAGGATTACACGTTGAATGTGTACCGTCTGGCGCTAAAAACCACGCTGAAACGCGCCCGTCGTTCCATGGAGCTGATTGCGCGCGAGGATGAGAATCCAAAAGTTGCTGAGGTTATTTACCCTATTATGCAAGTTAATGGCTGCCACTACCGCGGTGTTGATGTTGCCGTCGGTGGTATGGAGCAACGCAAAATTCACATGCTGGCACGTGAACTGCTGCCGAAAAAGGTTGTCTGTATTCATAATCCGGTCCTGACCGGCCTGGATGGCGAGGGTAAAATGAGCAGCAGCAAGGGTAACTTTATTGCAGTTGACGATAGCCCGGAAGAAATCCGTGCGAAGATCAAGAAAGCGTACTGCCCGGCAGGCGTGGTTGAGGGTAACCCGATCATGGAAATCGCCAAGTATTTTCTGGAATACCCACTGACGATTAAGCGCCCGGAGAAATTTGGCGGCGACCTGACCGTCAACAGCTACGAGGAGCTGGAAAGCTTGTTTAAGAACAAAGAACTGCATCCGATGCGCCTGAAAAACGCCGTGGCGGAAGAGCTGATTAAGATTCTGGAACCAATTCGCAAACGTCTGTAAGTTTGCGTGCTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCAAGAAACAGCAAACAATCCAAAACGCCGCGTTCAGCGGCGTTTTTTCTGCTTTTCTTCGCGAATTAATTCCGCTTCGCAACGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCAGGGGTTCAAATCCCCTCCGCCGGACCACCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGCATCT。

5.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，转化与菌株构建步骤中，通过钙离子介导的转化或电转化，将pCas转入起始菌株的感受态细胞。

6.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，转化与菌株构建步骤中，筛选得到gor基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落时，采用卡那霉素和壮观霉素共筛选。

7.根据权利要求6所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，转化与菌株构建步骤中，在30℃条件下，通过IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-gor的gRNA表达。

8.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，转化与菌株构建步骤中，筛选得到trxB基因位置被正确插入aaRS-tRNA的单菌落时，采用卡那霉素和壮观霉素共筛选。

9.根据权利要求8所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，转化与菌株构建步骤中，在30℃条件下，通过IPTG诱导pCas质粒表达靶向pTarget-trxB的gRNA表达。

10.根据权利要求1或2所述的一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法，其特征在于，转化与菌株构建步骤中，使用温度敏感型的pCAS质粒，在菌株构建的最后阶段使用升温培养，消除pCAS质粒。

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