CN113265345B - 一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用。以pGAPZα‑A质粒为模板PCR扩增获得启动子GAP基因片段；将扩增的启动子GAP基因片段通过双酶切后，连接到pGAPZα‑A‑NKt2上，构建pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组载体；将pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组载体通过电转化毕赤酵母X33中，获得双启动子系统重组基因工程菌LNF013。本发明成功构建双启动子毕赤酵母真核体系表达的纳豆激酶重组基因工程菌，纳豆激酶表达量及酶活性显著提高，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定了基础。

Description

一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及 其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域。具体涉及一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013的构建。
本发明中所称的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，komagataella phaffii LNF013，已于2021年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.22081。
背景技术
纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis varnatto)产生的碱性丝氨酸蛋白酶，经研究发现，纳豆激酶具有很好的溶解纤维蛋白(血栓的主要成分)能力。
纳豆激酶比市面上其他治疗血栓的药物，更具有安全、高效、价廉、易得等优点，未来前景十分广阔。然而纳豆激酶在原核表达体系中表达时，表达蛋白不纯且易形成包涵体，不易分离目的蛋白；而在真核体系中表达时，表达量又较低，限制其进一步应用，所以获得纯度高，产量又高的纳豆激酶成为其扩大工业化生产的重中之重。鉴于纳豆激酶功效及发展前景，急需构建一种高效表达纳豆激酶的基因工程菌。
发明内容
本发明的目的是构建一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌。
本发明采用的技术方案是：一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，为komagataella phaffii LNF013，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.22081。
一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的构建方法，方法包括如下步骤：
1)GAP启动子基因片段的获得：
以pGAPZα-A质粒为模板，以Primer5和Primer6为引物，通过PCR反应，获得两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段；
Primer5：GGGGTACCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC
Primer6：ATAAGAATGCGGCCGCATAGTTGTTCAATTGATTGAA
2)pGAPZα-A-NKt2载体质粒的获得：
以pGAPZα-A-NKt2为模板，以Primer7和Primer8为引物，通过环PCR扩增，获得在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα-A-NKt2载体质粒；
Primer7：ATAAGAATGCGGCCGCTTCGAAACGATGAGATTTCCT
Primer8：GGGGTACCATAGTTGTTCAATTGATTGAA
3)构建pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体：
将步骤1)获得的两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段和步骤2)获得的在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα-A-NKt2载体质粒，通过双酶切连接，获得pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体；
4)转化：将pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体转化到毕赤酵母X33中，获得重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013。
优选的，上述的构建方法，步骤1)中，PCR反应的条件为：
PCR反应体系：Primer 5 2μl，Primer 6 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl，pGAPZα-A质粒DNA 1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；55℃30s；72℃30s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
优选的，上述的构建方法，步骤2)中，环PCR扩增的条件为：
PCR反应体系：Primer 7 2μl，Primer 8 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl，pGAPZα-A-NKt2 DNA 1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃30s；56℃30s；72℃50s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min；
优选的，上述的构建方法，步骤4)中，将pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体，先进行线性化后，再使用电转化法转化到毕赤酵母X33中。
优选的，上述的构建方法，线性化体系为：pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2 1μg，10×QuickCut Buffer 2μL，QuickCut Enzyme BglⅡ1μL，ddH2O补至总体系20μL；反应条件为温度37℃，酶切时间为10min-15min。
本发明提供的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌在表达纳豆激酶中的应用。方法如下：筛选纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的阳性菌落，接种于含Zeocin的BMGY培养基中，在温度28℃，摇床转速220rmp/min下摇床培养，每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液。培养4d后，冷冻离心收集蛋白上清液，为纳豆激酶蛋白RNKT2。所述纳豆激酶蛋白RNKT2氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用基因工程技术，构建了一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌LNF013，该重组基因工程菌能够高效表达纳豆激酶。
2、本发明构建的重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013，可高效表达纳豆激酶，纳豆激酶表达量达到4.461±0.254μg/μL，活性达到355.83±0.564FU/mL，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定基础。为探究纳豆激酶在心血管疾病中的作用机制提供了工具，并为开发预防心血管疾病药物奠定基础。
3、启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性，起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着RNA聚合酶的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本，一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。本发明通过串联GAP启动子方法提高纳豆激酶在毕赤酵母X33中的表达。
附图说明
komagataella phaffii LNF013，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2021年3月29日，保藏编号为CGMCC NO.22081。
图1是重组载体pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2构建图谱。
图2是GAP启动子基因片段PCR扩增结果。
其中，M:Marker；1：pGAPZα-A质粒(阳性对照)；2：无菌水(空白对照)；3：PCR产物GAP启动子基因片段；4：PCR产物GAP启动子基因片段。
图3是pGAPZα-A-NKt2基因片段环PCR扩增结果。
其中，M：Marker；1：pGAPZα-A-NKt2质粒(阳性对照)；2：无菌水(空白对照)；3：退火温度为55℃下的PCR产物pGAPZα-A-NKt(+Kpn I和Not I酶切位点)；4：退火温度为57℃下的PCR产物pGAPZα-A-NKt(+Kpn I和Not I酶切位点)；5：退火温度为59℃下的PCR产物pGAPZα-A-NKt(+Kpn I和Not I酶切位点)；6：退火温度为61℃下的PCR产物pGAPZα-A-NKt(+Kpn I和Not I酶切位点)。
图4是验证pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组质粒双酶切结果。
其中，M:Marker；1：pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2完整载体；2：pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2双酶切条带pGAPZα-A-NKt2+PGAP(Bgl II和kpn I酶切位点)；3：pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2双酶切条带pGAPZα-A-NKt2+PGAP(kpn I和Not I酶切位点)。
图5是重组载体pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2线性化图谱。
其中，M：Marker；1：未线性化质粒pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2；2：线性化质粒pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2；3：线性化质粒pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2。
图6是RNKT2与对比例的SDS-PAGE分析柱状图谱。
图7是RNKT2与对比例的活性图谱。
其中，1：PGAPZα-A-NKt水解纤维蛋白原形成透明圈；2：RNKT2水解纤维蛋白原形成透明圈；3：构建的pGAPZα-A-FLD1-NKt2重组质粒表达蛋白水解纤维蛋白原形成透明圈；4：构建的pGAPZα-A-GAP-FLD1-NKt2重组质粒表达蛋白水解纤维蛋白原形成透明圈。
具体实施方式
pGAPZα-A-NKt2质粒为本实验室保存的质粒，用于以下试验，其构建方法如下：
1、反复冻融法提取枯草芽孢杆菌DNA：
将枯草芽孢杆菌在LB平板培养基上划线过夜培养。挑取单菌落，接种于10ml LB液体培养基，180rpm 37℃过夜培养。取1ml菌体，100℃水浴10min，之后置于-80℃冰箱10min。重复两次。6000rpm离心5min，取上清液，得到枯草芽孢杆菌DNA。
2、获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段NKt：
通过对纳豆激酶NKt基因序列比对，分别设计引入酶切位点EcoRI(GAATTC)的Primer 1以及引入酶切位点XhoI(CTCGAG)的Primer 2。以枯草芽孢杆菌DNA为模板，以Primer 1和Primer 2为引物，通过PCR方法扩增出NKt基因片段。
NKt基因片段引物：
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
将PCR产物按照上海生工股份有限公司生产的PCR产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物于-20℃保存或直接用于后续实验。
将PCR产物经电泳检测，通过PCR方法获得的NKt基因片段，大小为1050bp，符合纳豆激酶前导肽-成熟肽NKt基因序列，并以其为模板获得突变片段NKt194。
3、获得NKt194突变片段：
以NKt基因片段为模板，通过重叠延伸PCR扩增和连接合成NKt194突变片段。根据纳豆激酶NKt基因序列分别设计引物，并分别引入酶切位点EcoRI(GAATTC)和XhoI(CTCGAG)。分别扩增突变的上游片段NKt194F和下游片段NKt194R。
以NKt基因片段为模板，Primer 1和Primer 3为引物通过重叠延伸PCR扩增突变的上游片段NKt194F；以NKt基因片段为模板，Primer 4和Primer 2为引物通过重叠延伸PCR扩增下游片段NKt194R，通过T4连接酶，16℃过夜连接，将NKt194F和NKt194R连接合成NKt194突变片段。
突变的上游片段NKt194F引物：
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 3：5’-AGCCATTACATCAAGCTCTGGTCCTACGCTGGAGAATG-3’
下游片段NKt194R引物：
Primer 4：5’-CATTCTCCAGCGTAGGTCCAGAGCTTGATGTAATGGCT-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
将PCR产物按照上海生工股份有限公司生产的PCR产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物与-20℃保存或直接用于后续实验。将PCR产物分别经电泳检测，分别获得NKt194上游和下游突变片段，大小分别为810bp和240bp。确定PCR结果成功。通过T4连接酶过夜连接，获得NKt194突变片段。将所获得的NKt194突变片段的基因序列与blast比对，在846位由T突变为A。证明成功获得NKt194突变片段。
4、密码子优化
将NKt194突变片段和表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt194。将重组载体PGAPZα-A-NKt194送到武汉金开瑞生物工程有限公司，在保持NKt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，将NKt194根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt194突变片段基因进行密码子优化和合成，获得优化的基因片段，命名为NKt2。经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，优化合成后的NKt2基因序列如SEQ ID NO.2所示。
5、构建重组载体PGAPZα-A-NKt2
将NKt2和表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt2。经电泳检测，经过酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切后，切下的片段大小为1070bp与NKt2片段大小一致。证明重组载体PGAPZα-A-NKt2构建成功。
实施例1一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌
如图1所示，构建方法，包括如下步骤：
1、GAP启动子基因片段的获得：
以实验室保藏的pGAPZα-A真核表达载体质粒基因组为模板，以Primer5和Primer6为引物，通过重叠延伸PCR反应，获得两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段，其大小为507bp。GAP启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
GAP启动子引物序列如下：
Primer5：GGGGTACCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC
Primer6：ATAAGAATGCGGCCGCATAGTTGTTCAATTGATTGAA
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；55℃30s；72℃30s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
图2是GAP启动子基因片段PCR扩增结果，由图2可见，泳道3和4PCR扩增出含有KpnⅠ、NotⅠ酶切位点的GAP启动子，片段大小为483bp，与GAP启动子大小相同，片段扩增成功。
2、pGAPZα-A-NKt2载体质粒的获得：
以实验室保存的pGAPZα-A-NKt2载体为模板，以Primer7和Primer8为引物，通过环PCR扩增，获得在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα-A-NKt2载体质粒，其大小为4162bp。
Primer7：ATAAGAATGCGGCCGCTTCGAAACGATGAGATTTCC
Primer8：GGGGTACCATAGTTGTTCAATTGATTGAA
PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃30s；56℃30s；72℃50s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
图3是pGAPZα-A-NKt2基因片段环PCR扩增结果，由图3可见，泳道3、4、5、6均以pGAPZα-A-NKt质粒为模板PCR添加KpnⅠ、NotⅠ酶切位点的pGAPZα-A-NKt基因片段，但退火温度不同，分别为55℃、57℃、59℃、61℃。PCR扩增的结果片段大小为4156bp，图片结果与预期的结果相同，说明片段扩增成功。
3、构建pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体：
将步骤1获得的两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段和步骤2获得的在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα-A-NKt2载体质粒，通过双酶切连接，获得pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体。
图4是验证pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组质粒双酶切结果。由图4可见，选用BglⅡ与KpnⅠ酶切位点和KpnⅠ与NotⅠ酶切位点分别进行双酶切。如图4所示，泳道2和3显示中最上方条带为重组载体双酶切后的载体大小，下方条带大小为483bp，其大小与之前设想的GAP启动子片段大小相同，实验结果表明重组载体pGAPZα-GAP-GAP-NKt构建成功。
4、转化：
将pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体，先进行线性化后，再使用电转化法转化到毕赤酵母X33中。
反应条件为：温度37℃，酶切时间为10min-15min。
取3-5μg线性化完成的重组载体加入80μL毕赤酵母X33感受态细胞中，在冰上将二者混匀；将所得混合物加到转化电极杯的底部，将电击杯放到冰上冰置大约5min，之后进行电转；电击完成产物加入1mL 1M山梨醇溶液重悬混合物，将电击杯中混合物转移至灭菌的EP管中，随后加入500μL灭菌完成的YPD液体培养基；将EP管放入摇床震荡培养，培养后6000rpm/min离心5min，吸取上清液，剩余上清液用移液枪将菌体吹打混匀后涂布在含Zeocin的YPD固体培养基，直至平板上无明显肉眼可见水迹。筛选阳性菌落进行PCR验证，获得PCR验证成功的阳性菌落，命名为komagataella phaffii LNF013。
图5是重组载体pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2线性化图谱，由图5可见，为了重组载体中的目的基因整合到真核基因组中，经重组质粒进行双酶切。泳道2、3经过单酶切之后，出现单一线性条带，证明线性化成功。
实施例2纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的应用
1、重组基因工程菌表达纳豆激酶：
将重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013重新划线YPD固体培养基，37℃培养3-4d。挑取平板上的单菌落接种于100mL含Zeocin的BMGY培养基中，摇床培养；表达温度为28℃，摇床转速220rmp/min，每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液。培养4d后，冷冻离心，收集蛋白上清液，即为纳豆激酶蛋白，命名为纳豆激酶RNKT2。
经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，纳豆激酶RNKT2氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
对比例：以本实验室保存的pGAPZα-A-NKt2质粒为模板，按实施例1的方法构建了pGAPZα-A-FLD1-NKt2重组载体、pGAPZα-A-GAP-FLD1-NKt2重组载体，同时以pGAPZα-A-NKt2质粒为空白。将重组载体电转化到毕赤酵母X33感受态细胞中，构建重组工程菌株。按上述同样的方法，同样表达纳豆激酶蛋白。
2、测定RNKT2表达量：
利用BCA蛋白试剂盒测定纳豆激酶蛋白表达量。
图6是本发明重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013表达纳豆激酶蛋白与对比例表达的纳豆激酶蛋白的SDS-PAGE分析柱状图谱。由图6可见，本发明重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013表达的纳豆激酶RNKT2表达量达到4.461±0.254μg/μL，表达量显著提高。
3、测定RNKT2活性：
利用日本纳豆激酶协会活性测量方法改良测定纳豆激酶蛋白的活性。一个酶活力单位(FU)定义为：在特定条件下(37℃，pH8.0)每分钟在275nm处的吸光值变化0.01所需要的酶量。
酶活性，FU/g＝FU/mL×2mL/g
图7是本发明重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013表达的纳豆激酶蛋白与对比例表达的纳豆激酶蛋白的活性图谱。由图7可见，本发明重组基因工程菌表达的纳豆激酶RNKT2的活性达到355.83±0.564FU/mL。PGAPZα-A-NKt表达的纳豆激酶蛋白的酶活性为220.15±3.46FU/mL，pGAPZα-A-FLD1-NKt2表达的纳豆激酶蛋白的酶活性为315.76±5.31FU/mL，pGAPZα-A-GAP-FLD1-NKt2表达的纳豆激酶蛋白的酶活性为280.83±1.89FU/mL。
<110> 辽宁大学
<120> 一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> GAP promoter region
<400> 1
agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca 50
tctctgaaat atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg 100
taaaattctc cggggtaaaa cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg 150
tctcttccct tctctctcct tccaccgccc gttaccgtcc ctaggaaatt 200
ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc aatgctcttc 250
ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300
ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg 350
Catgtcatga gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac 400
Acctttccca attttggttt ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt 450
atttgtccct atttcaatca attgaacaac tat 483
<210> 2
<211> 1068
<212> DNA
<213> NKt2
<400> 2
gaattcgctg gtaagtcctc caccgagaag aagtacatcg ttggtttcaa gcagactatg 60
tccgctatgt cctccgctaa gaagaaggac gttatctccg agaaaggtgg taaggtccag 120
aagcagttca agtacgttaa cgctgctgct gctactttgg acgagaaggc tgtcaaagag 180
ttgaagaagg atccatccgt tgcctacgtt gaagaggacc atattgctca cgaatacgct 240
cagtctgtcc catacggtat ttcccagatt aaggctccag ccttgcactc ccaaggttac 300
actggttcta acgttaaggt tgccgttatc gactccggta tcgattcttc tcacccagac 360
ttgaacgtta gaggtggtgc ttctttcgtt ccatccgaga ctaacccata ccaagatggt 420
tcttcccacg gtactcatgt tgctggtact atcgctgctc tgaacaactc cattggtgtt 480
ttgggtgttg ctccttccgc ttccttgtac gctgttaagg ttttggactc tactggttcc 540
ggtcagtact cctggattat caacggtatt gagtgggcca tctccaacaa catggacgtc 600
attaacatgt cccttggtgg tccaactggt tccactgctc ttaagactgt tgttgacaag 660
gctgtctcct ccggtattgt cgttgctgct gcagctggta acgaaggttc ttctggttct 720
acttccaccg ttggttaccc agctaagtac ccatccacta ttgctgttgg tgctgtcaac 780
tcttccaacc agagagcttc tttctcttcc gtcggttccg aattggatgt tatggctcca 840
ggtgtttcca tccagtctac tttgccaggt ggtacttacg gtgcttacaa cggtacttct 900
atggctactc cacacgttgc tggtgctgct gccttgattt tgtctaagca cccaacttgg 960
actaacgccc aggttagaga cagattggaa tccactgcaa cctacctggg taactccttc 1020
tactacggta agggtttgat caacgttcag gctgctgctc aatctaga 1068
<210> 3
<211> 466
<212> PRT
<213> RNKT2
<400> 3
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu
35 40 45
Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn
50 55 60
Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala
65 70 75
Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu
80 85 90
Phe Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe
95 100 105
Lys Gln Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val
110 115 120
Ile Ser Glu Lys Gly Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val
125 130 135
Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu
140 145 150
Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Ile Ala
155 160 165
His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys
170 175 180
Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys
185 190 195
Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu
200 205 210
Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro
215 220 225
Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile
230 235 240
Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser
245 250 255
Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly
260 265 270
Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn
275 280 285
Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser
290 295 300
Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile
305 310 315
Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr
320 325 330
Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val
335 340 345
Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
350 355 360
Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser
365 370 375
Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met
380 385 390
Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys
395 400 405
His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser
410 415 420
Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu
425 430 435
Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln Ser Arg Glu Gln Lys Leu Ile
440 445 450
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His
455 460 465
His
466

Claims (7)

1.一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，其特征在于，所述纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌为komagataella phaffii LNF013，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.22081。
2.一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的构建方法，其特征在于，方法包括如下步骤：
1）GAP启动子基因片段的获得：以pGAPZα-A质粒为模板，以Primer5和Primer6为引物，通过PCR反应，获得两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段；
Primer5：GGGGTACCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC
Primer6：ATAAGAATGCGGCCGCATAGTTGTTCAATTGATTGAA
2）pGAPZα-A-NKt2载体质粒的获得：
2.1)以NKt基因片段为模板，Primer 1和Primer 3为引物通过重叠延伸PCR扩增突变的上游片段NKt194F；以NKt基因片段为模板，Primer 4和Primer 2为引物通过重叠延伸PCR扩增下游片段NKt194R，通过T4连接酶，16℃过夜连接，将NKt194F和NKt194R连接合成NKt194突变片段；
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 3：5’-AGCCATTACATCAAGCTCTGGTCCTACGCTGGAGAATG-3’
Primer 4：5’-CATTCTCCAGCGTAGGTCCAGAGCTTGATGTAATGGCT-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’
2.2）根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt194突变片段基因进行密码子优化和合成，获得优化的基因片段NKt2；NKt2基因序列如SEQ ID NO.2所示；
2.3）将NKt2和表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A- NKt2；
2.4）以pGAPZα-A-NKt2为模板，以Primer7和Primer8为引物，通过环PCR扩增，获得在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I 的pGAPZα-A-NKt2载体质粒；
Primer7：ATAAGAATGCGGCCGCTTCGAAACGATGAGATTTCCT
Primer8：GGGGTACCATAGTTGTTCAATTGATTGAA；
3）构建pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体：将步骤1）获得的两端添加酶切位点KpnI和Not I的GAP启动子基因片段和步骤2）获得的在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I 的pGAPZα-A-NKt2载体质粒，通过双酶切连接，获得pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体；
4）转化：将pGAPZα-A-GAP-GAP- NKt2重组表达载体转化到毕赤酵母X33中，获得重组基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中，PCR反应的条件为：
PCR反应体系：Primer 5 2μl，Primer 6 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl，pGAPZα-A质粒DNA 1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 30s；25cycles；72℃延伸7min；4℃ 10min。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2）中，环PCR扩增的条件为：
PCR反应体系：Primer 7 2μl，Primer 8 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl，pGAPZα-A-NKt2 DNA 1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃ 30s；56℃ 30s；72℃ 50s；25cycles；72℃延伸7min；4℃ 10min。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤4）中，将pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体，先进行线性化后，再使用电转化法转化到毕赤酵母X33中。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，线性化体系为：pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2 1μg，10×QuickCut Buffer 2μL，QuickCut Enzyme Bgl Ⅱ 1μL，ddH2O补至总体系20μL；反应条件为温度37℃，酶切时间为10min-15 min。
7.权利要求1所述的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌在表达纳豆激酶中的应用。
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纳豆枯草芽孢杆菌LNUB236所产纳豆激酶的溶栓活性（英文）;朱俊丰;刘帅;赵鹏燕;赵健;李佳增;王天琦;王丽;刘宏生;;食品科学(第13期);157-168 *
纳豆激酶基因工程菌的构建及酶活力分析;崔青;钱炳俊;姚晓敏;季顺利;鲁飞凤;吴静;张建华;;食品科学;38(第14期);1-8 *
纳豆激酶的高效表达研究进展;赵鹏燕;刘宏生;;辽宁大学学报(自然科学版)(第04期);289-293 *

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