CN113005045B - 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113005045B
CN113005045B CN202110269600.8A CN202110269600A CN113005045B CN 113005045 B CN113005045 B CN 113005045B CN 202110269600 A CN202110269600 A CN 202110269600A CN 113005045 B CN113005045 B CN 113005045B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nkt
nattokinase
mutant
gene
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110269600.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113005045A (zh
Inventor
刘宏生
李佳增
赵鹏燕
朱俊丰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning University
Original Assignee
Liaoning University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning University filed Critical Liaoning University
Priority to CN202110269600.8A priority Critical patent/CN113005045B/zh
Publication of CN113005045A publication Critical patent/CN113005045A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113005045B publication Critical patent/CN113005045B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用。以枯草芽孢杆菌基因为模板，PCR扩增得纳豆激酶前导肽‑成熟肽基因片段NKt；以NKt基因片段为模板，扩增NKt194突变片段；将NKt194突变片段按毕赤酵母X33密码子偏好性进行优化和合成得NKt2；构建PGAPZα‑A‑NKt2，将PGAPZα‑A‑NKt2转化毕赤酵母X33构建真核表达系统的纳豆激酶重组基因工程菌株；培养纳豆激酶重组基因工程菌株，诱导纳豆激酶表达。本发明成功构建一株突变纳豆激酶重组基因工程菌LNF012及在真核系统中表达，使原核生物的纳豆激酶基因在真核生物体系中成功表达，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定了基础。

Description

一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域。具体涉及一株含突变的纳豆激酶重组基因的工程菌的构建及在真核系统中表达。
本发明中所称的一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为Komagataellaphaffii LNF012，已于2020年08月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.20498。
背景技术
纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis varnatto)产生的碱性丝氨酸蛋白酶，经研究发现，纳豆激酶具有很好的溶解纤维蛋白(血栓的主要成分)能力。它的溶栓效果高于同类溶栓药物，且溶栓活性是纤溶酶的4倍。纳豆激酶包含三个部分，共381个氨基酸，从N端开始第1至第29个氨基酸构成信号肽，主要作用为介导蛋白质胞外分泌；第30至第106个氨基酸构成前导肽，主要起到帮助蛋白质折叠成正确的空间构象；剩余的275个氨基酸折叠构成具有活性的成熟肽。纳豆激酶具有催化三联体即Asp32、His64、Ser221，底物结合部位在Serl25、Leul26和Glyl27。近年来，研究人员对纳豆激酶的溶栓作用机理有了进一步的了解：优球蛋白是一种难以溶解的血浆蛋白质，纳豆激酶能够结合到优球蛋白的表面，发挥催化作用，促进其溶解，间接的促进了纤维蛋白原的降解；内源纤溶酶原激活剂t-PA是一种血管内壁细胞所分泌出的能够激发纤溶酶活性的生理性激动剂，纳豆激酶能够与血管内壁细胞作用，诱导t-PA的产生，加强纤维蛋白的降解效果；纳豆激酶可激活尿激酶原生成尿激酶，激活后的尿激酶可以溶解血栓，和纳豆激酶共同作用于血栓溶解；纤溶酶原激活剂的抑制剂(PAI-1)能够使t-PA失去活性并抑制其产生，纳豆激酶能够直接作用于PAI-1使其降解，保持t-PA的活性，使血栓溶解。目前市面纳豆激酶多用于保健类产品。纳豆激酶与其他同类的溶栓药物产品相比，如尿激酶、链激酶等产品同样具有安全性高、生产成本低等的优势，因而在市场上具有强大的竞争力和市场前景。鉴于纳豆激酶功效及发展前景，急需构建一株全新的纳豆激酶工程表达菌。
发明内容
本发明的目的是构建一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌Komagataellaphaffii LNF012及在真核系统中表达。
本发明采用的技术方案是：一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，所述含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为Komagataella phaffii LNF012，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.20498。
一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段NKt：以枯草芽孢杆菌DNA为模板，以Primer1和Primer 2为引物，通过PCR方法扩增出NKt基因片段；
NKt基因片段引物序列为：
Primer1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3
2)获得NKt194突变片段：以NKt基因片段为模板，Primer 1和Primer 3为引物通过重叠延伸PCR扩增突变的上游片段NKt194F；以NKt基因片段为模板，Primer 4和Primer 2为引物通过重叠延伸PCR扩增下游片段NKt194R，通过T4连接酶，16℃过夜连接，将NKt194F和NKt194R连接合成NKt194突变片段；
突变的上游片段NKt194F引物序列为：
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 3：5’-AGCCATTACATCAAGCTCTGGTCCTACGCTGGAGAATG-3’
下游片段NKt194R引物序列为：
Primer 4：5’-CATTCTCCAGCGTAGGTCCAGAGCTTGATGTAATGGCT-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’
3)密码子优化：根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt194突变片段进行优化和合成，获得优化的基因片段NKt2；
4)将优化的基因片段NKt2与表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt2；
5)将重组载体PGAPZα-A-NKt2转化到毕赤酵母X33中，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，命名为Komagataella phaffii LNF012。
进一步的，上述的构建方法，步骤1)中，PCR方法扩增的条件为：
PCR反应体系：Primer 1 2μl，Primer 2 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl；枯草芽孢杆菌DNA1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
进一步的，上述的构建方法，步骤2)中，重叠延伸PCR扩增的条件为：
PCR反应体系：Primer 1(或Primer 4)2μl，Primer 3(或Primer2)2μl，2×Es taqMaster Mix 25μl，NKt基因片段1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
进一步的，上述的构建方法，步骤3)中，所述优化是：保持NKt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt194突变片段基因进行密码子优化。
进一步的，上述的构建方法，步骤5)中，将重组载体PGAPZα-A-NKt2进行线性化后，再通过电转化法转化到毕赤酵母X33中。
更进一步的，上述的构建方法，线性化体系为：PGAPZα-A-NKt2 1μg，10×QuickCutBuffer2μL，QuickCut Enzyme AvrⅡ1μL，ddH2O补至总体系20μL；反应条件为温度37℃，酶切时间为10min-15min。
本发明提供的含突变纳豆激酶重组基因的工程菌在表达纳豆激酶中的应用。
进一步的，方法如下：筛选含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的阳性菌落，划线YPD固体培养基，28℃培养3-4d，挑取单菌落接种于100mL含Zeocin的BMGY培养基中，在温度28℃，摇床转速220rmp/min下摇床培养，每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液，培养4d后冷冻离心收集蛋白上清液，所得蛋白命名为纳豆激酶蛋白RNKT2。
进一步的，所述纳豆激酶蛋白RNKT2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的有益效果是：
1、本发明中，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR方法扩增出NKt基因片段，然后以NKt基因片段为模板，通过重叠延伸PCR扩增并连接成NKt194突变片段，其大小为1050bp，符合纳豆激酶前导肽+成熟肽的DNA片段大小。根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对纳豆激酶基因片段进行优化，优化后合成以及重组载体。
2、本发明构建了一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌LNF012及成功在真核系统中表达。采用基因工程技术，通过重叠延伸PCR扩增出NKt194突变片段，其大小为1050bp。根据毕赤酵母X33密码子偏爱性优化合成NKt2基因片段，并将其连接到真核表达载体构建重组载体PGAPZα-A-NKt2，重组载体转化毕赤酵母X33得到重组菌株。使得原核表达蛋白纳豆激酶能够在真核体系中进行高效表达，表达出的纳豆激酶具有一定的热稳定性。
3、本发明构建的纳豆激酶高效表达菌株，纳豆激酶表达量达到4.33μg/μL，活性达到223.75IU/mL(按照尿激酶活性检测方法测定)与同期的原核表达纳豆激酶相比，更高产、高效。能够为今后纳豆激酶大规模的应用奠定基础。为探究纳豆激酶在心血管疾病中的作用机制提供了工具，并为开发预防心血管疾病药物奠定基础。
附图说明
Komagataella phaffii LNF012，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2020年08月06日，保藏编号为CGMCC NO.20498。
图1是NKt片段PCR结果。
其中，M：Marker；0：阴性对照；1：NKt PCR产物。
图2是重叠延伸PCR扩增获得NKt194突变片段。
其中，M：Marker；3：NKt194F片段；4：NKt194R片段。
图3是NKt194突变片段与blast比对结果。
图4是重组载体PGAPZα-A-NKt2的电泳图。
其中，M：Marker；1：重组载体PGAPZα-A-NKt2；2：双酶切NKt2和质粒剩余片段。
图5是重组载体PGAPZα-A-NKt2线性化图谱。
其中，M：marker；1：重组载体pGAPZα-A-NKt2线性化条带；2：完整重组载体pGAPZα-A-NKt2。
图6是RNKT2的SDS-PAGE分析图谱。
其中，M：marker；1：空白对照；2：RNKT2。(RNKT2表达包括α-factor signalsequence，NKt2，myc epitope以及polyhistidine tag，RNKT2大小为50KD)
图7是RNKT2活性图谱。
其中，1：阳性对照；2：RNKT2水解纤维蛋白原形成透明圈。
具体实施方式
实施例
构建一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及在真核系统中表达，步骤如下：
1、反复冻融法提取枯草芽孢杆菌DNA：
将枯草芽孢杆菌在LB平板培养基上划线过夜培养。挑取单菌落，接种于10ml LB液体培养基，180rpm 37℃过夜培养。取1ml菌体，100℃水浴10min，之后置于-80℃冰箱10min。重复两次。6000rpm离心5min，取上清液，得到枯草芽孢杆菌DNA。
2、获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段NKt：
通过对纳豆激酶NKt基因序列比对，分别设计引入酶切位点EcoRI(GAATTC)的Primer1以及引入酶切位点XhoI(CTCGAG)的Primer 2。以枯草芽孢杆菌DNA为模板，以Primer1和Primer 2为引物，通过PCR方法扩增出NKt基因片段。
NKt基因片段引物：
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3
PCR反应体系(50μL)：
Figure GDA0003071213300000051
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
将PCR产物按照上海生工股份有限公司生产的PCR产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物于-20℃保存或直接用于后续实验。
将PCR产物经电泳检测，结果如图1所示，由图1可见，通过PCR方法获得的NKt基因片段，大小为1050bp，符合纳豆激酶前导肽-成熟肽NKt基因序列，并以其为模板获得突变片段NKt194。
3、获得NKt194突变片段：
以NKt基因片段为模板，通过重叠延伸PCR扩增和连接合成NKt194突变片段。根据纳豆激酶NKt基因序列分别设计引物，并分别引入酶切位点EcoRI(GAATTC)和XhoI(CTCGAG)。分别扩增突变的上游片段NKt194F和下游片段NKt194R。
以NKt基因片段为模板，Primer 1和Primer 3为引物通过重叠延伸PCR扩增突变的上游片段NKt194F；以NKt基因片段为模板，Primer 4和Primer 2为引物通过重叠延伸PCR扩增下游片段NKt194R，通过T4连接酶，16℃过夜连接，将NKt194F和NKt194R连接合成NKt194突变片段。
突变的上游片段NKt194F引物：
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 3：5’-AGCCATTACATCAAGCTCTGGTCCTACGCTGGAGAATG-3’
下游片段NKt194R引物：
Primer 4：5’-CATTCTCCAGCGTAGGTCCAGAGCTTGATGTAATGGCT-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’
PCR反应体系(50μL)：
Figure GDA0003071213300000052
Figure GDA0003071213300000061
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。
将PCR产物按照上海生工股份有限公司生产的PCR产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物与-20℃保存或直接用于后续实验。
将PCR产物分别经电泳检测，结果如图2所示，由图2可见，分别获得NKt194上游和下游突变片段，大小分别为810bp和240bp。确定PCR结果成功。
通过T4连接酶过夜连接，获得NKt194突变片段。将所获得的NKt194突变片段的基因序列与blast比对，结果如图3所示，在846位由T突变为A。证明成功获得NKt194突变片段。
4、密码子优化
将NKt194突变片段和表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt194。将重组载体PGAPZα-A-NKt194送到武汉金开瑞生物工程有限公司，在保持NKt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，将NKt194根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt194突变片段基因进行密码子优化和合成，获得优化的基因片段，命名为NKt2。
经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，优化合成后的NKt2基因序列如SEQ IDNO.1所示。
5、构建重组载体PGAPZα-A-NKt2
将NKt2和表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt2。
经电泳检测，结果如图4所示，由图4可见，经过酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切后，切下的片段大小为1070bp与NKt2片段大小一致。证明重组载体PGAPZα-A-NKt2构建成功。
6、转化
将重组载体PGAPZα-A-NKt2进行线性化，再电转化到毕赤酵母X33中，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，具体为：
将重组载体PGAPZα-A-NKt2进行线性化：
线性化体系为(20μL)：
Figure GDA0003071213300000071
反应条件为：温度37℃，酶切时间为10min-15min。
取3-5μg线性化完成的重组载体PGAPZα-A-NKt2，加入到80μL毕赤酵母X33感受态细胞中，在冰上将二者混匀；然后将混合物加到转化电极杯的底部，将电击杯放到冰上冰置大约5min，之后进行电转；电击完成产物加入1mL 1M山梨醇溶液重悬混合物，将电击杯中混合物转移至灭菌的EP管中，随后加入500μL灭菌的YPD液体培养基；将EP管放入摇床震荡培养，培养后6000rpm/min离心5min，吸取上清液，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，命名为Komagataella phaffii LNF012。剩余上清液用移液枪将菌体吹打混匀后涂布在含Zeocin的YPD固体培养基，直至平板上无明显肉眼可见水迹。
图5是重组载体PGAPZα-A-NKt2线性化图谱。为了将重组质粒转入毕赤酵母X33中，需将重组质粒进行线性化。由图5可见，重组质粒线性化成功。
7、含突变纳豆激酶重组基因的工程菌表达纳豆激酶：
将PCR验证成功的阳性菌落重新划线YPD固体培养基，28℃培养3-4d。挑取平板上的单菌落接种于100mL含Zeocin的BMGY培养基中，在温度为28℃，摇床转速220rmp/min下摇床培养；每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液。培养4d后冷冻离心，收集蛋白上清液，即为纳豆激酶蛋白，命名为纳豆激酶RNKT2。
经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，纳豆激酶RNKT2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
图6是RNKT2的SDS-PAGE分析图谱。重组质粒PGAPZα-A-NKt2在真核宿主毕赤酵母X33中表达，由图6可见，表达出的蛋白大小为50KD。
8、测定RNKT2表达量及活性：
RNKT2为可溶性蛋白。
利用BCA蛋白试剂盒测定RNKT2表达量，纳豆激酶RNKT2表达量达到4.33μg/μL。
利用纤维蛋白平板法测定RNKT2活性，结果如图7所示，由图7可见，纳豆激酶RNKT2活性达到223.75IU/mL(按照尿激酶活性检测方法测定)。
<110> 辽宁大学
<120> 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1068
<212> DNA
<213> NKt2
<400> 1
gaattcgctg gtaagtcctc caccgagaag aagtacatcg ttggtttcaa gcagactatg 60
tccgctatgt cctccgctaa gaagaaggac gttatctccg agaaaggtgg taaggtccag 120
aagcagttca agtacgttaa cgctgctgct gctactttgg acgagaaggc tgtcaaagag 180
ttgaagaagg atccatccgt tgcctacgtt gaagaggacc atattgctca cgaatacgct 240
cagtctgtcc catacggtat ttcccagatt aaggctccag ccttgcactc ccaaggttac 300
actggttcta acgttaaggt tgccgttatc gactccggta tcgattcttc tcacccagac 360
ttgaacgtta gaggtggtgc ttctttcgtt ccatccgaga ctaacccata ccaagatggt 420
tcttcccacg gtactcatgt tgctggtact atcgctgctc tgaacaactc cattggtgtt 480
ttgggtgttg ctccttccgc ttccttgtac gctgttaagg ttttggactc tactggttcc 540
ggtcagtact cctggattat caacggtatt gagtgggcca tctccaacaa catggacgtc 600
attaacatgt cccttggtgg tccaactggt tccactgctc ttaagactgt tgttgacaag 660
gctgtctcct ccggtattgt cgttgctgct gcagctggta acgaaggttc ttctggttct 720
acttccaccg ttggttaccc agctaagtac ccatccacta ttgctgttgg tgctgtcaac 780
tcttccaacc agagagcttc tttctcttcc gtcggttccg aattggatgt tatggctcca 840
ggtgtttcca tccagtctac tttgccaggt ggtacttacg gtgcttacaa cggtacttct 900
atggctactc cacacgttgc tggtgctgct gccttgattt tgtctaagca cccaacttgg 960
actaacgccc aggttagaga cagattggaa tccactgcaa cctacctggg taactccttc 1020
tactacggta agggtttgat caacgttcag gctgctgctc aatctaga 1068
<210> 2
<211> 466
<212> PRT
<213> RNKT2
<400> 2
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu
35 40 45
Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn
50 55 60
Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala
65 70 75
Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu
80 85 90
Phe Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe
95 100 105
Lys Gln Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val
110 115 120
Ile Ser Glu Lys Gly Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val
125 130 135
Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu
140 145 150
Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Ile Ala
155 160 165
His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys
170 175 180
Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys
185 190 195
Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu
200 205 210
Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro
215 220 225
Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile
230 235 240
Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser
245 250 255
Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly
260 265 270
Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn
275 280 285
Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser
290 295 300
Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile
305 310 315
Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr
320 325 330
Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val
335 340 345
Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
350 355 360
Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser
365 370 375
Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met
380 385 390
Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys
395 400 405
His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser
410 415 420
Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu
425 430 435
Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln Ser Arg Glu Gln Lys Leu Ile
440 445 450
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His
455 460 465
His
466

Claims (8)

1.一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，其特征在于，所述含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为Komagataella phaffiiLNF012，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.20498。
2.一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段NKt：以枯草芽孢杆菌DNA为模板，以Primer 1和Primer 2为引物，通过PCR方法扩增出NKt基因片段；
NKt基因片段引物序列为：
Primer1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3
2）获得NKt194突变片段：以NKt基因片段为模板，Primer 1和Primer 3为引物通过重叠延伸PCR扩增突变的上游片段NKt194F；以NKt基因片段为模板，Primer 4和Primer 2为引物通过重叠延伸PCR扩增下游片段NKt194R，通过T4连接酶，16℃过夜连接，将NKt194F和NKt194R连接合成NKt194突变片段；
突变的上游片段NKt194F引物序列为：
Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’
Primer 3：5’-AGCCATTACATCAAGCTCTGGTCCTACGCTGGAGAATG-3’
下游片段NKt194R引物序列为：
Primer 4：5’-CATTCTCCAGCGTAGGTCCAGAGCTTGATGTAATGGCT-3’
Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’
3）密码子优化：根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt194突变片段进行优化和合成，获得优化的基因片段NKt2；优化的基因片段NKt2基因序列如SEQ ID NO.1所示；
4）将优化的基因片段NKt2与表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt2；
5）将重组载体PGAPZα-A-NKt2转化到毕赤酵母X33中，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中，PCR方法扩增的条件为：
PCR反应体系：Primer 1 2μl，Primer 2 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl；枯草芽孢杆菌DNA 1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃ 30s；53℃ 30s；72℃ 30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃ 10min。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2）中，重叠延伸PCR扩增的条件为：
PCR反应体系：Primer 1或Primer 4 2μl，Primer 3或Primer2 2μl，2×Es taq MasterMix 25μl，NKt基因片段 1μl，ddH2O补至总体系50μL；
PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃ 30s；53℃ 30s； 72℃ 30s；30cycles；72℃延伸7 min；4℃ 10min。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3）中，所述优化是：保持NKt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，根据毕赤酵母密码子X33偏爱性对NKt194突变片段基因进行密码子优化。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤5）中，将重组载体PGAPZα-A-NKt2进行线性化后，再通过电转化法转化到毕赤酵母X33中。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，线性化体系为：PGAPZα-A-NKt2 1μg，10×QuickCut Buffer 2μL，QuickCut Enzyme Avr Ⅱ 1μL，ddH2O补至总体系20μL；反应条件为温度37℃，酶切时间为10min-15 min。
8.权利要求1所述的含突变纳豆激酶重组基因的工程菌在表达纳豆激酶中的应用。
CN202110269600.8A 2021-03-12 2021-03-12 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用 Active CN113005045B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110269600.8A CN113005045B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110269600.8A CN113005045B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113005045A CN113005045A (zh) 2021-06-22
CN113005045B true CN113005045B (zh) 2023-06-16

Family

ID=76406004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110269600.8A Active CN113005045B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113005045B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806990B (zh) * 2022-05-11 2023-05-30 辽宁大学 一种耐热性纳豆激酶重组基因工程菌及其构建方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058204A (zh) * 2017-03-30 2017-08-18 上海诺金科生物科技有限公司 一株可以高效分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌株及高纯纳豆激酶制备工艺

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058204A (zh) * 2017-03-30 2017-08-18 上海诺金科生物科技有限公司 一株可以高效分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌株及高纯纳豆激酶制备工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Improving the activity of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis and molecular dynamics simulation;Weng M Z等;Biochemical and Biophysical Research Communications;第465卷(第3期);580-586 *
纳豆激酶基因工程菌的构建及酶活力分析;崔青等;食品科学;第38卷(第14期);1-8 *
纳豆激酶的高效表达研究进展;赵鹏燕等;辽宁大学学报;第46卷(第4期);289-293 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113005045A (zh) 2021-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110382705B (zh) 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用
CN104630124B (zh) 一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法
CN112522173A (zh) 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法
WO2021139295A1 (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
WO2022134236A1 (zh) 一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用
CN113005045B (zh) 一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用
CN114591935B (zh) 一种热稳定性提高的蛋白酶突变体blapr3及其编码基因和应用
CN114958897B (zh) 可高效表达饲用低温角蛋白酶的枯草芽孢杆菌构建方法
CN113699138B (zh) 碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用
CN106939315B (zh) 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用
CN106085934B (zh) 食品级纳豆激酶表达菌
CN113265345B (zh) 一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用
CN112574977B (zh) 一种低聚半乳糖生产专用酶及其制备与应用
CN111676211B (zh) 一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体
CN112094781A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109679941B (zh) 一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用
CN108410786B (zh) 高效表达纤溶酶的枯草芽孢杆菌工程菌以及制备方法
CN110862974A (zh) 一种有机磷水解酶的突变体、表达载体、重组菌和应用
CN112980753B (zh) 用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统
CN101240284B (zh) 一种重组葡激酶及其高效分泌表达的方法
CN115125247B (zh) 一种组合启动子pα2-α2及其应用
CN114350643B (zh) 一种产氨肽酶的重组菌株及其在高效蛋白水解中的应用
CN115160417B (zh) 盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白及其应用
CN115160418B (zh) 盔形毕赤酵母Peptidase类分泌蛋白及其应用
CN113699091B (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant