CN115160417B - 盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白及其在制备诱导柑橘果实抗病性的保鲜剂中的应用，研究结果证实，农杆菌介导的遗传转化在柑橘果实上瞬时表达Glyco_hydro类分泌蛋白，能一定程度抑制柑橘果实绿霉病的发病和病斑直径的增长；本发明从盔形毕赤酵母中挖掘出具有诱导柑橘果实抗病性的Glyco_hydro类分泌蛋白，不仅丰富了盔形毕赤酵母诱导柑橘果实抗病性的机理，拓宽了拮抗酵母在果实保鲜领域的应用方式，也为柑橘果实采后绿霉病的防治提供了新的解决方法。

Description

盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术和果实采后病害生物防治技术领域，涉及盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)Glyco_hydro类分泌蛋白及其应用。

背景技术

拮抗酵母是果实采后病害防治中常用的生物防治拮抗菌。已有大量文献报道拮抗酵母能诱导果实抗病性，涉及果实多种抗病基因的表达、激素合成和信号转导途径、抗病相关物质的合成等。然而，拮抗酵母分泌蛋白对果实抗病性的作用还不清楚。

柑橘是芸香科柑橘亚科柑橘属植物，是世界和中国产量最多的水果。新鲜柑橘果实在采后运输、贮藏等过程中极易受微生物侵染，损失可达总产量的30％以上。由真菌指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病是柑橘果实贮藏过程中主要的侵染性病害。目前产业上主要采用咪鲜胺等化学杀菌剂控制果实采后病害，但存在杀菌剂残留、微生物产生耐药性等问题。

发明内容

本发明的目的在于探究和明确拮抗酵母分泌蛋白在诱导果实抗病性中的作用，以期为果实采后病害的防治提供新的解决方案。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所示。

2.盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白的编码基因。

进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。

3.含有盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白编码基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQID No.6所示的盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白编码基因克隆入植物表达载体pCAMBIA2300的多克隆位点KpnI和PstI之间而得到。

4.含有上述重组表达载体的工程菌。

进一步，所述工程菌是将含有盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白编码基因的重组表达载体转入农杆菌GV3101中而得到。

5.盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白在制备诱导柑橘果实抗病性的保鲜剂中的应用。

进一步，所述诱导柑橘果实抗病性为诱导柑橘果实绿霉病抗病性。

6.所述工程菌在制备诱导柑橘果实抗病性的保鲜剂中的应用。

进一步，所述诱导柑橘果实抗病性为诱导柑橘果实绿霉病抗病性。

本发明的有益效果在于：本发明提供了盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白及其在制备诱导柑橘果实抗病性的保鲜剂中的应用，研究结果证实，农杆菌介导的遗传转化在柑橘果实上瞬时表达Glyco_hydro类分泌蛋白，能一定程度抑制柑橘果实绿霉病的发病和病斑直径的增长。本发明从盔形毕赤酵母中挖掘出具有诱导柑橘果实抗病性的Glyco_hydro类分泌蛋白，不仅丰富了盔形毕赤酵母诱导柑橘果实抗病性的机理，拓宽了拮抗酵母在果实保鲜领域的应用方式，也为柑橘果实采后绿霉病的防治提供了新的解决方法。

附图说明

图1为盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3编码基因的电泳图，其中M为DNA分子量标准。

图2为重组载体pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro1、pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro2、pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro3的电泳图，其中M为DNA分子量标准。

图3为含有PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2或PgGlyco_hydro3编码基因的农杆菌工程菌的电泳图，其中M为DNA分子量标准。

图4为盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3对柑橘果实采后绿霉病的诱导效果；A和C为发病率，B和D为病斑直径，*表示与对照组(Control)相比差异显著(P<0.05)；E为柑橘果实在接种指状青霉后于25℃贮藏6天后的绿霉病发病症状。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本实施例所用盔形毕赤酵母分离于柑橘果园的柠檬果实表面。

1.引物设计

根据盔形毕赤酵母的基因序列和pCAMBIA2300载体上的多克隆位点KpnI和PstI，设计以下引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

PgGlyco_hydro1-F:caatttactattctagggtaccATGCTTTTCAACAAATTCACTCCTT(SEQID No.7)

PgGlyco_hydro1-R:gtatgggtatctagactgcagTTACATCAAGAGAGCTGCGACAA(SEQ IDNo.8)

PgGlyco_hydro2-F:caatttactattctagggtaccATGAAACTCAGCTCATACGC(SEQ IDNo.9)

PgGlyco_hydro2-R:gtatgggtatctagactgcagTTAGGCAGTATAGAACTGTTCAATA(SEQID No.10)

PgGlyco_hydro3-F:caatttactattctagggtaccATGTTGTTTCGATTTGTCAGTT(SEQ IDNo.11)

PgGlyco_hydro3-R:gtatgggtatctagactgcagCTAAAACTTTATTTCCCAATCTTTC(SEQID No.12)

2.盔形毕赤酵母总RNA提取及cDNA合成

用北京酷来搏科技有限公司的真菌RNA提取试剂盒(RE781-50T)提取盔形毕赤酵母总RNA，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

所得盔形毕赤酵母总RNA用PrimeScript^TM RT regent Kit试剂盒(Takara)反转录合成cDNA，具体步骤按照试剂盒说明书进行，用酶标仪Take3检测所得cDNA的浓度和质量，-20℃保存备用。

3.盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白编码基因序列克隆

以反转录合成的cDNA为模板，使用引物PgGlyco_hydro1-F和PgGlyco_hydro1-R，使用诺唯赞高保真酶P505试剂盒，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的PgGlyco_hydro1编码基因序列，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

以反转录合成的cDNA为模板，使用引物PgGlyco_hydro2-F和PgGlyco_hydro2-R，使用诺唯赞高保真酶P505试剂盒，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的PgGlyco_hydro2编码基因序列，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

以反转录合成的cDNA为模板，使用引物PgGlyco_hydro3-F和PgGlyco_hydro3-R，使用诺唯赞高保真酶P505试剂盒，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的PgGlyco_hydro3编码基因序列，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150V，30min)，结果如图1所示，用无菌刀片切下目的条带，用胶回收试剂盒进行回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行，回收产物-20℃保存备用。

4.质粒pCAMBIA2300的KpnI和PstI双酶切

将质粒pCAMBIA2300进行KpnI和PstI双酶切，酶切反应液置37℃金属浴中30min。

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用无菌刀片切下目的条带，用胶回收试剂盒进行回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行，回收产物-20℃保存备用。

5.重组载体的构建

将回收的线性化质粒pCAMBIA2300与PgGlyco_hydro1编码基因序列使用诺唯赞同源重组酶进行连接，具体步骤按照试剂说明书进行，连接反应液置37℃金属浴中30min。同样的方法将PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3编码基因序列分别与线性化质粒pCAMBIA2300连接。

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。用质粒测序引物对转化子进行菌液PCR验证。验证结果为阳性的转化子委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果比对正确的重组质粒即为成功构建的重组载体pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro1、pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro2、pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro3。

6.农杆菌工程菌的构建

提取重组载体pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro1、pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro2、pCAMBIA2300-PgGlyco_hydro3(电泳结果如图2所示，以质粒pCAMBIA2300为对照)，分别加入农杆菌GV3101感受态细胞中，轻弹混匀，置冰上5min，液氮5min，37℃5min，冰上5min；加无抗LB液体培养基600μL，28℃、200rpm培育2～3h，4000rpm离心2min，弃上清，将余液均匀涂布于LB平板(含有25μg/L利福平和50μg/L卡那霉素)；挑取单菌落至500μL LB液体培养基(含有25μg/L利福平和50μg/L卡那霉素)中，28℃、200rpm摇菌培养16h后检测目的片段。结果如图3所示，含有PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3编码基因的农杆菌即为成功构建的PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3农杆菌工程菌。

7.农杆菌工程菌在柑橘果实上瞬时表达分泌蛋白诱导柑橘果实绿霉病抗病性的效果

分别将PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3的农杆菌工程菌在LB培养基(含有25μg/L利福平和50μg/L卡那霉素)中培养过夜，当菌液OD₆₀₀约为1时，4000rpm离心5min，将菌体用孵育液(1L孵育液含有5g葡萄糖，1.0663g MES(使用浓度5mM)，0.760gNa₃PO₄·12H₂O(使用浓度2mM)，0.785mL 127.4mM AS母液(使用浓度0.1mM))重悬并调整OD600＝0.8，等量混合基因沉默抑制子P19，28℃避光孵育2～3h，得农杆菌工程菌液；挑选大小均匀一致、色泽均匀、无机械伤和疤痕的柑橘果实，用2％次氯酸钠浸泡2min后用清水冲洗干净，自然风干，用75％酒精擦果实赤道部位，待酒精风干后，用1mL无菌枪头在果实赤道部位对立面各打一个孔，用1mL注射器(去掉针头)向孔中注射约0.5mL农杆菌工程菌液，以含有pCAMBIA2300质粒的农杆菌为对照(control)；接种农杆菌工程菌1d后，在每个孔的右方1cm处再打一个孔，用移液枪接种10μL 1×10⁴CFU/mL的指状青霉(Penicilliumdigitatum)孢子悬浮液，待菌液吸收后，单果套袋，避光放置于25℃的环境中，从第3天开始统计发病率和病斑直径。

结果如图4所示，含有PgGlyco_hydro1、PgGlyco_hydro2、PgGlyco_hydro3编码基因的农杆菌工程菌在柑橘果实上瞬时表达分泌蛋白PgGlyco_hydro1(氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示)、PgGlyco_hydro2(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)、PgGlyco_hydro3(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)，能一定程度抑制柑橘果实绿霉病的发病和病斑直径的增长。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 564

<212> PRT

<213> 盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)

<400> 1

Met Leu Phe Asn Lys Phe Thr Pro Leu Ala Val Ser Val Leu Ser Cys

1 5 10 15

Leu Ser Lys Ala Thr Ala Ser Ser Ser Ser Asp Asp Phe Pro Thr Ile

20 25 30

Glu Val Val Gly Asn Lys Phe Phe Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Gln Phe

35 40 45

Tyr Ile Arg Gly Val Ala Tyr Gln Lys Asp Val Thr Gly Ser Asp Asn

50 55 60

Thr Ser Phe Val Asp Pro Leu Ala Asp Glu Glu Thr Cys Lys Arg Asp

65 70 75 80

Ile Pro Tyr Leu Thr Asp Leu Asn Thr Asn Val Val Arg Val Tyr Ala

85 90 95

Leu Asp Ala Asp Ala Asp His Asp Ala Cys Met Asp Leu Leu Lys Glu

100 105 110

Ala Gly Ile Tyr Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Pro Thr Val Ala Ile

115 120 125

Ser Thr Thr Asp Pro Glu Trp Asn Leu Glu Leu Tyr Asp Arg Tyr Thr

130 135 140

Ser Ile Ile Asp Met Met Gln Gly Tyr Asp Asn Val Leu Gly Phe Phe

145 150 155 160

Ala Gly Asn Glu Val Ile Thr Asn Ser Thr Asn Thr Asn Ser Ala Pro

165 170 175

Phe Val Lys Ala Ala Ile Arg Asp Met Lys Thr Tyr Ile Ser Asn Ser

180 185 190

Gly Tyr Arg Asp Ile Pro Val Gly Tyr Ser Ala Asn Asp Asp Ala His

195 200 205

Thr Arg Val Pro Ser Ala Asp Tyr Phe Ala Cys Gly Asp Asn Asp Val

210 215 220

Ser Ala Asp Phe Tyr Gly Ile Asn Met Tyr Glu Trp Cys Gly Thr Ser

225 230 235 240

Thr Phe Ser Thr Ser Gly Tyr Lys Asp Arg Thr Lys Glu Phe Ala Asn

245 250 255

Leu Thr Val Pro Val Phe Phe Ser Glu Tyr Gly Cys Asn Ala Val Gln

260 265 270

Pro Arg Lys Phe Thr Glu Ile Ala Ala Ile Phe Ser Asp Glu Met Thr

275 280 285

Asp Val Trp Ser Gly Gly Ile Val Tyr Met Tyr Tyr Gln Glu Val Asn

290 295 300

Asp Tyr Gly Leu Val Ser Val Val Asp Asn Asp Thr Val Ser Thr Met

305 310 315 320

Asp Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ser Ser Glu Ile Asn Asn Ile Asp Pro Thr

325 330 335

Ser Ala Lys Thr Ser Asp Ile Ser Thr Ser Gly Lys Val Leu Ser Cys

340 345 350

Pro Thr Gly Phe Ser Tyr Trp Lys Ala Ala Thr Asn Leu Pro Pro Thr

355 360 365

Pro Asp Asp Thr Val Cys Asp Cys Met Ala Lys Ser Leu Thr Cys Val

370 375 380

Val Ser Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Tyr Glu Asp Leu Phe Ser Tyr

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Ile Cys Gly Val Ile Asp Cys Asp Gly Ile Thr Ala Asn Gly Ala Asp

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Gly Ser Tyr Gly Ala Tyr Ser Phe Cys Ser Asn Lys Asp Lys Leu Ser

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Phe Val Leu Asp Leu Tyr Tyr Arg Ala Gln Asp Glu Asn Ser Ser Ala

435 440 445

Cys Asp Phe Ser Gly Ser Ala Ser Leu Val Thr Gly Thr Thr Ala Ser

450 455 460

Thr Cys Lys Ser Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Ser Gly Leu Gly Thr

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Lys Thr Thr Lys Ala Asp Lys Asn Val Ser Thr Asp Val Ser Ser Ser

515 520 525

Ala Ser Ser Thr Val Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Lys Gly Asp Ala

530 535 540

Gly Val Val Arg Ser Ser Ser Phe Met Gly Phe Phe Ala Leu Val Ala

545 550 555 560

Ala Leu Leu Met

<210> 2

<211> 455

<212> PRT

<213> 盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)

<400> 2

Met Lys Leu Ser Ser Tyr Ala Ala Val Pro Leu Leu Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Ser Met Ala Asn Ala Leu Asp Leu Thr Val Gly Asp Lys Glu Ser Val

20 25 30

Cys Asp Ala Ala Thr Glu Ile Ile Asp Gly Ile Met Asp Tyr Tyr Leu

35 40 45

Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Thr Ile Gly Met Phe Gln Gln Pro Tyr Tyr

50 55 60

Trp Trp Glu Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Met Ile Asp Thr Trp Lys

65 70 75 80

Ile Cys Asp Asn Tyr Thr Tyr Val Ser Thr Ile Gln Ser Ala Ile Asn

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Ser Gln Arg Gly Asp Asn Asn Asp Tyr Tyr Gly Val Ala Asn Gln Thr

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Thr Val Glu Ala Asn Asp Asp Gln Val Phe Trp Gly Phe Thr Val Leu

115 120 125

Glu Ala Ala Glu Arg Gly Phe Pro Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Asp Asp

130 135 140

Pro Ser Tyr Ala Asp Leu Ala Leu Asn Val Tyr Asn Ser Met Ala Ala

145 150 155 160

Arg Trp Asp Thr Asp Ser Cys Asn Gly Gly Leu Arg Trp Gln Ile Leu

165 170 175

Ser Asn Met Ser Gly Trp Asp Tyr Lys Ser Thr Ile Ser Asn Ala Gly

180 185 190

Val Phe Ala Leu Gly Ala Arg Leu Ala Arg Tyr Thr Gly Asp Asp Glu

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Leu Val Lys Ser Ser Ser Arg Ile Leu Arg Trp Met Lys Gly Ala Tyr

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Gly Ala Asp Ile Val Asn Gly Ser Cys Pro Val Val Asn Gly Ala Leu

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275 280 285

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Ala Phe Arg Ala Ile Val Ser Arg Thr Leu Gly Glu Val Val Gln Leu

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340 345 350

Glu Gly Ala Ala Lys Ser Cys Ser Gly Gly Thr Asp Gly His Thr Cys

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Gly Leu Ser Trp Ala Ala Gly Glu Trp Asp Gly Tyr Tyr Gly Leu Gly

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Glu Gln Ile Ala Ala Leu Glu Val Ile Gln Asn Thr Val Ile Gly Asp

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Ile Ala Pro Pro Cys Thr Gly Glu Thr Cys Gly Ile Glu Ile Asp Asp

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435 440 445

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<210> 3

<211> 943

<212> PRT

<213> 盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)

<400> 3

Met Leu Phe Arg Phe Val Ser Cys Phe Leu Trp Leu Leu Val Trp Ser

1 5 10 15

His Pro Ala Leu Ser Val Lys Asp Tyr Leu Phe Lys Lys Cys Glu Gln

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35 40 45

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Glu Asn Ala Lys Asp Ser Val Lys Thr His Trp Met Ser Glu Asn Gly

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Lys Ala Tyr Gly Glu Ile Thr Gly Phe Ser Arg Leu Pro Asn Leu Phe

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Ser Leu Gly Tyr His Gln Cys Arg Trp Asn Tyr Asn Asp Gln Gly Asp

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Val Leu Asp Val His Gln Asn Phe Asp Lys His Glu Ile Pro Tyr Asp

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<210> 4

<211> 1695

<212> DNA

<213> 盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)

<400> 4

atgcttttca acaaattcac tcctttggca gtctctgtct tgagttgctt gagcaaagcc 60

actgcttctt cttcttcgga cgacttccca actatcgaag ttgtcggaaa caagttcttc 120

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gacagataca cttccatcat tgacatgatg caaggttatg acaatgtctt gggtttcttt 480

gcaggtaacg aagttatcac caactccacc aacaccaact ctgcgccatt cgttaaagcg 540

gccatcagag acatgaagac ttacatctcc aacagcggct acagagacat tcctgttggt 600

tactctgcca acgatgatgc ccacactaga gtcccatctg ctgactattt cgcttgtggt 660

gacaacgacg tcagcgccga cttctatggt atcaacatgt acgaatggtg tggtacatct 720

actttctcca cttccggtta caaggacaga acgaaagagt ttgccaactt gaccgttcca 780

gttttcttct ctgaatacgg ttgtaacgct gttcaaccaa gaaaattcac cgaaatcgct 840

gccatcttct ctgatgaaat gaccgacgtc tggtctggtg gtattgttta catgtactac 900

caagaagtca acgactatgg tttagtttct gtggtcgaca acgatactgt ttccaccatg 960

gacgattaca agtactattc ttctgaaatt aacaacattg acccaactag tgccaagact 1020

tccgacatct ccacttctgg taaggtcttg tcttgtccaa ccggtttctc ttactggaaa 1080

gctgcaacga atttgccacc aactccagat gacactgttt gtgactgtat ggccaagtct 1140

cttacttgtg ttgtctcaga cgatgttgac gacgatgatt atgaggatct ctttagctac 1200

atctgcggtg ttattgactg cgatggtatt acggctaacg gtgcagatgg ttcatatggt 1260

gcttactcct tctgttccaa caaggacaag ctttccttcg tcttggactt gtactaccgt 1320

gcacaagatg aaaactcatc tgcttgtgat ttctctggtt ctgctagtct tgtcactggt 1380

accactgcat ccacatgcaa gtccatcatc tctgctgccg gtaagtctgg tcttggaact 1440

gtcactggtg tttctggtgc tacctccaag ggctccacca ctaaggacac gaccaccaac 1500

accaaggaaa ctaccaccag caagacttcc acctccaaga ccacaaaagc agacaagaat 1560

gtctccactg atgtctcatc ttcggcttct tctactgttt cttctatttc ctccaccagt 1620

aaaggtgatg ccggcgttgt ccgctcctcc tctttcatgg gtttctttgc gcttgtcgca 1680

gctctcttga tgtaa 1695

<210> 5

<211> 1368

<212> DNA

<213> 盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)

<400> 5

atgaaactca gctcatacgc agcggtccct ctgttggcct cggtcctgtc aatggccaac 60

gctcttgatc tcactgttgg agacaaggag tccgtgtgtg acgctgccac agaaatcatc 120

gacggtatca tggactacta cttgggcact aggtacggtg gtaccatcgg tatgttccag 180

cagccctact actggtggga aagcggtctc gtattcggag gaatgattga cacatggaag 240

atctgcgaca actacaccta cgtctccacg atccagagcg caattaacag ccaaaggggt 300

gacaacaatg actactacgg cgtcgccaat cagacgactg tcgaggcaaa cgacgaccag 360

gtcttctggg ggttcaccgt tttggaggct gcagagagag gctttcctgc atactcaaac 420

aactcggacg atccatccta cgcggacttg gctctgaacg tctacaactc aatggcggcc 480

agatgggaca ccgacagctg taacggaggg ttaagatggc agatcctaag caatatgagc 540

ggctgggact acaagagcac aatttccaac gcaggtgtct ttgcattggg ggcaagattg 600

gctcggtaca caggcgacga cgaattggtg aagtcctcaa gcagaatcct cagatggatg 660

aagggcgcct atttcgtcaa ccaaccagac gccaacaagg actactacaa tgtctacgat 720

ggtgcagata ttgtcaatgg gtcgtgccct gtcgtcaacg gcgctctctg gtcctacagc 780

tacgccttga tgaccatggg ttccgcctac ttgtacaatg ccaccggtga cgacgcatgg 840

agttccgaac tcgacaagtt cctcggcggt atcgaacact acttcctcag cccaaacgca 900

acagacgttc tttatgaata ccaatgtcat ctatggggca ggtgcaacaa cgatcaaaga 960

gccttcagag cgattgtctc cagaacattg ggtgaagtcg tccagttggc cccaagcttt 1020

gccgacagag ctttaaagat tctcaacgcc tccgccgaag gcgccgccaa gtcctgttct 1080

ggtggcacag acggccacac ctgtggcctg agctgggctg caggcgaatg ggatggctac 1140

tatggtttgg gtgagcagat tgcagcactc gaggttatcc aaaataccgt tattggcgac 1200

attgcccctc catgcacagg agagacttgt ggtatcgaaa tagacgatgc caacttcacc 1260

actgttccta ttccaaccgt caccagacac ttcactgttg ttgccaccca cgtcgagacg 1320

gaaaccttaa ccgcatctac cgttattgaa cagttctata ctgcctaa 1368

<210> 6

<211> 2832

<212> DNA

<213> 盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis)

<400> 6

atgttgtttc gatttgtcag ttgtttcctt tggctgcttg tgtggtccca cccagccttg 60

tctgtaaaag actacttgtt caaaaagtgt gaacaaaatg gattctgtca tcgaaacaga 120

cactacgcac aacaaattga atcatacaat ggcaattacg agcctcggta ttccctagat 180

agatctagct tggccattga tgataaaaag ggatttatta aggggaaagt gaacaagcaa 240

ttaggcgatg gttcttacag ggacttggtt tttcacatca ccatagtcga agattacaat 300

ttgcgtttcc aactagatga agagaacaga aaggagtacg ttccttcgga tatcacggtt 360

aaccccaaca ggtactcgga gactgctgat cgagcattca agggagaatt ggaaaacaag 420

ccctttgaat accagattct cgatgatgaa atagtcgtca aatatggaga cgagcaagaa 480

tacacagctc tcatcaaact ttatccattc agaattaaca ttttatacag aggcgtcaag 540

caaattgtac tgaatgatag agattttctg aacctggaac attatagatc taaggaaagt 600

gaggaaaatg cagaatcgat tgatgtgctg cctgaggaat caagatacaa tgcatacaaa 660

gacgatttca aagattcaaa agctgataaa cttttcctag gtcctgagtc tgtggcattg 720

gacctcacat ttgtcaatta tacccacgta tatgggatac ctgaacatgc tgattccctc 780

tccttgaagg acacaactgg aacggagcct tacagactgt acaacgtcga catttttgag 840

tacgaaactc agagcaagct gccaatgtac gggtcaattc cgttgatgat tgctgctaaa 900

ccagatgttt cggcggctat tttttgggtc aactccgcgg acacttacat tgacattgaa 960

aagaacgact ccggtgaaaa catcggtggg gtggaattgg tatggtcgga aaacgccaag 1020

gatagtgtta aaacacattg gatgtcagaa aatggtataa ttgatgtcat tttgatggtc 1080

aagcccactc caaatggaat ctccaaagcg tatggcgaaa tcaccggttt ttcaagattg 1140

cctaacctat tttctctcgg ttatcaccaa tgtagatgga attacaacga tcaaggtgat 1200

gtattagatg tgcatcaaaa ttttgataaa catgaaatcc cgtatgatac tatctggtta 1260

gacattgaat acactgatga aaaaagatat ttcacatgga ataaagagct cttcccaaca 1320

ccggatgaaa tgatggcaaa aatggacgag acgaagcgtc agttagttgt cattgttgac 1380

cctcacatca aagatgacta ttttatggcg gatttaataa aagataatga cataggaatt 1440

aacgatccgt tagtcgctgg cgctttccgt ggtcattgtt ggcctggaaa atctatttgg 1500

attgatacga tgaaccctgg agcccagaaa atttgggact cgcaattcaa gaatggtagc 1560

tccctccttg gtcattcaac taacggacat atctggaatg atatgaatga accatctgtt 1620

ttcgatgggc cagaaacatc aattccaaag gacacagttc attatggcca ttttgaacat 1680

agatcagtcc acaacattta cggcctctcg ttccatgaag caacctatca ttccttgatc 1740

aaaaggaaca gttataagcg tcctttcgtt cttactaggt ctttttttgc aggatcacaa 1800

agaactgcgg ctatgtggac aggtgataac atggccaaat gggaatactt gaaagagtcc 1860

atccctatgg tcctcaccat gaatgctgca ggttttcctt ttgccggtgc agacgtggga 1920

ggattctttg gtaatccatc taaagactta ctggtgaggt ggtatcaaac tggtatatgg 1980

tatccattct tcagagggca tgctcatata gactcgagac ggcgtgaacc atggattgct 2040

ggtggagaat acacggaata tatgaaggat gcgataaaat taaggtacag attgctgcca 2100

ttgctgtata ctgagttttg ggagaacagt gtgtctggac aacctattat caagccactt 2160

ttgtgggaaa atcctcaaga caagaatgga tatgaagtag ataacgaatt ttacctgggc 2220

ggcttactgg tccatcctgt tactgaggag aatgccgagg aggttgagat ctatttccct 2280

tgtgatggcg aagtatacta cgacttcttt gacgtttcaa cgaagttcga gtcttgtcag 2340

aatatcaatg tcaaagcaac cttgggtatg attcctgtct tccttaaagg tggaaatatt 2400

gtaccaacca aggacaggta tagaagatcg gcacaattga tgaaatatga cccttacacc 2460

ttgtatgttg tgataggttc tgatggttcc gcttctggga aactatatgt tgatgatgga 2520

gaaacttttg ggtatgaatc tggagattgg ctccaggtta atattactgc ttctgcatcc 2580

gaaaaaataa taagtgcaag tgttattcac aatgaaaaca agccatttac aaaaagcctc 2640

gaagaaaaga aggtcagcgt gaacaaaatt gtggtggtgg gaactagcaa ttttgacgaa 2700

accgcctctg tttccgttgt acaaaatggc aagcaatgga ttgccgacgt tatcaagagt 2760

aagcttgatc attcgtttac gatccgtaat ccgaacgtgc ttattacgaa agattgggaa 2820

ataaagtttt ag 2832

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caatttacta ttctagggta ccatgctttt caacaaattc actcctt 47

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtatgggtat ctagactgca gttacatcaa gagagctgcg acaa 44

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caatttacta ttctagggta ccatgaaact cagctcatac gc 42

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtatgggtat ctagactgca gttaggcagt atagaactgt tcaata 46

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caatttacta ttctagggta ccatgttgtt tcgatttgtc agtt 44

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtatgggtat ctagactgca gctaaaactt tatttcccaa tctttc 46

Claims (8)

1.盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：是将核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白的编码基因克隆入植物表达载体pCAMBIA2300的多克隆位点KpnI和PstI之间而得到。

6.含有权利要求4所述重组表达载体的工程菌。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，是将所述重组表达载体转入农杆菌GV3101中而得到。

8.权利要求1所述的盔形毕赤酵母Glyco_hydro类分泌蛋白或权利要求6所述的工程菌在制备诱导柑橘果实绿霉病抗病性的保鲜剂中的应用。

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