MXPA02003456A - Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a un metodo para regular la transcripcion de transgen en organismos modificados geneticamente. Mas especificamente, la invencion se relaciona al uso de vectores de expresion que alojan la secuencia de codificacion de un gen de interes bajo el control de transcripcion de secuencias promotoras para las cuales se regula la actividad por la presencia de nitrogeno.

Description

o / " -*" MÉTODO PARA REGULAR LA TRANSCRIPCIÓN DE GENES FOR NEOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a un método para regular la transcripción del transgen en organismos modificados 5 genéticamente. Más específicamente, la invención se relaciona al uso de vectores que expresión que albergan la secuencia de codificación de un gen de interés bajo el control transcripcional de secuencias promotoras por las cuales se regula la actividad por la presencia de nitrógeno. 10 Preferentemente, estas construcciones se usan en plantas leguminosas transgénicas (por ejemplo fríjol de soya, alfalfa, clavo, trébol de alimento de pájaros, fríjoles, chícharos, cacahuates) donde no se daña el crecimiento por la carencia de nitrógeno mineral, y en las cuales la inducción de expresión puede ser realizada en cualquier tiempo dado durante el desarrollo, a través de la adición de una fuente de nitrógeno adecuada, con la condición de que el organismo pueda crecer adecuadamente en la ausencia de este inductor de nitrógeno; como un ejemplo dentro del reino vegetal, la lenteja de agua (Lemna minor) puede adaptarse a crecer tanto en nitrato o amonio como la fuente de nitrógeno; la lenteja de agua transgénica puede por lo tanto ser crecida en nitrato como una fuente única de nitrógeno y se acciona la expresión del transgen por la adición de amonio, con la condición de que el cásete contenga un promotor a partir de un gen nativo por el cual se cambia la expresión por la adición de amonio. La invención por lo tanto proporciona un medio para regular la expresión de un rasgo transgénico en cualquier organismo a través de la adición de varios inductores de nitrógeno. El nitrógeno es una molécula esencial para la vida. Todos los organismos vivos necesitan nitrógeno con el fin de sintetizar los aminoácidos, los bloques de construcción de las proteínas y nucleótidos, los bloques de construcción de ácidos nucleicos. El nitrato de amonio es la forma preferida de nitrógeno mineral proporcionado para cultivos en la forma de fertilizante. El nitrógeno de nitrato se reduce primero a nitrito y después a amonio a través de la actividad de una trayectoria metabólica común para la mayoría de las plantas herbáceas. Dependiendo de las especies, parte o todo el nitrato absorbido se moverá a las células de las hojas a través del xilema antes de que se reduzca a amonio. El amonio, u otras formas reducidas de nitrógeno son absorbidas también (aunque usualmente en relaciones inferiores) por el sistema de raíz pero su asimilación no requiere reducción. Estas moléculas que contienen amonio o amonio recientemente absorbidas se unen a las reservas endógenas en las células las cuales se forman por la ciclización de amonio a través de aminoácidos y otras moléculas con nitrógeno. Algunas especies no metalizan el nitrógeno de nitrato fácilmente y por lo tanto no confían en el nitrato como la única fuente de nitrógeno; muchas especies de coniferas fallan en esta última categoría. Las leguminosas y otras especies de plantas simbióticas forman una tercer clase de usuario de nitrógeno dentro de reino vegetal; estos forman una alianza metabólica con un organismo microbiano a través del cual pueden fijar el nitrógeno gaseoso. Este nitrógeno reducido es usado eficientemente por la planta para el crecimiento, y por lo tanto, estos cultivos pueden desarrollarse independientemente de la disponibilidad de nitróngeo mineral en la tierra. Muchos microbios y especies de plantas silvestres se adaptaran extensivamente para disponibilidad de fuentes de nitrógeno y puedan por lo tanto completar su ciclo de vida en la ausencia de una forma molecular de nitrógeno, lo cual pueden usar exclusiva y eficientemente si están en otro ambiente de crecimiento. Como para la mayoría de las trayectorias asimilatorias, la asimilación de nitrógeno está altamente regulada en las células. Como un ejemplo, la expresión de los genes que codifican la nitrato reductasa (NaR) y la nitrito reductasa (NiR) , las cuales son las responsables para la reducción de nitrato a amonio, se ha descrito ampliamente en varias especies microbianas y vegetales (para investigación, véase Miflin and Lea, Books 5 and 12, in The Biochemistry of plants) . Aunque el nitrato no es la única molécula regulatoria implicada en el control de expresión de NaR y NiR, su presencia es esencial para ini~ciar la cascada de transducción que eventualmente lleva a la transcripción y traducción sostenida de estos genes. Se ha mostrado que la expresión de los genes NaR y NiR se reprime en las plantas leguminosas cuando se hacen crecer en la ausencia de nitrógeno mineral. Se han caracterizado los promotores de NiR en algunas especies de plantas (Back et al., 1991, Plant Molecular Biology 17:9-18; Sander et al., 1995, Plant Molecular Biology 27:165-177). La capacidad de inducción de estos promotores ha sido también caracterizada usando genes marcadores en las plantas transgénicas, donde se muestra que la disponibilidad de nitrato es requerida para activación total de transcripción. Las trayectorias de asimilación para otras fuentes de nitrógeno han sido también descritas, y se han caracterizado también los promotores para genes implicados en algunas de estas trayectorias. Se ha usado la transformación genética de los microbios por más de 15 años para producir moléculas recombinantes útiles, y se están explotando actualmente aplicaciones en las industrias farmacéuticas, cosmacéuticas y dermacéuticas. Se ha expandido esta tecnología a partir de microbios a plantas y animales en los últimos diez años con el desarrollo de técnicas requeridas para adaptar este concepto general a organismos eucarióticos complejos. Básicamente un gen que codifica una proteína de interés o un gen que codifica una enzima responsable para una modificación de una trayectoria metabólica que lleva a una molécula de interés, se enlaza en una forma apropiada a las secuencias regulatorias de actuación cis y trans, y se transfiere a una célula objetivo donde se incorpora en la maquinaria molecular (en una forma temporal o estable) . La célula transgénica, o un tejido u organismos regenerados a partir de la célula transgénica realizarán entonces la transcripción y traducción del transgen y por lo tanto permiten acumular la proteína de interés o realizar la reacción metabólica nueva a través de la actividad de la enzima de interés. La industria emergente de labranza molecular (producción de moléculas recombinantes en animales o cultivos) es una de las industrias más prometedoras del siglo nuevo. Es prometedor proporcionar industrias moleculares seguras y renovables para la industria. Entre las aplicaciones que están actualmente desarrolladas están la producción de anticuerpos monoclonales de bajo costo para usos terapéuticos y de diagnóstico, la producción de cantidades no limitadas de hormonas, citosinas y otras moléculas bioactivas para el tratamiento de enfermedades crónicas o letales, la producción de substitutos bioseguros para varios componentes de la sangre, la producción de cantidades ilimitadas de enzimas de procesamiento para la industria de alimentos y de pulpa, la producción de enzimas de bajo costo para tratamientos de desecho, y la producción de moléculas bioactivas seguras para la industria de cosméticos . Las limitaciones para la aplicación de esta tecnología han llegado con frecuencia a partir de la incapacidad de los organismos transgénicos para acumular cantidades adecuadas del producto recombinante, como un resultado de bajas relaciones de transcripción, inadecuado empalme del mensajero, inestabilidad del ARNm extraño, deficientes relaciones de traducción, hipersusceptibilidad de la proteína recombinante a la acción de proteasas endógenas o hipersusceptibilidad del organismo recombinante a la proteína extraña lo cual resulta en un crecimiento inapropiado y limitado o en los peores casos, en fuertes efectos dañinos para el organismo huésped. El nivel de producción inadecuado tiene un impacto directo en el desarrollo de aplicaciones cuando los márgenes de perfil son estrechos, o cuando el tratamiento y/o disposición de materia residual provoca los problemas de bioseguridad o ambientales. La mejora del nivel de acumulación del producto recombinante deseado parece de esta forma ser un factor crítico que garantiza la comercialización de muchas aplicaciones de la labranza molecular. Se ha propuesto el uso de promotores inducibles, y en algunos casos usados exitosamente, para contrarrestar el efecto combinado de todos los factores mencionados anteriormente. Los promotores inducibles fuertes . pueden tener éxito en generar las relaciones de transcripción efímera altas lo cual resulta en alta acumulación temporal de ARNm extraño y el producto de traducción. Como un resultado, cuando la inducibilidad de expresión está dañada con procedimientos de recuperación de proteína sincronizados adecuados, el rendimiento por unidad obtenido es superior de aquel con el uso de la expresión constitutiva. Varios casetes de expresión que alojan promotores inducibles han sido desarrollados para sistemas de producción microbiana, y algunos están actualmente disponibles para propósitos de investigación. Algunos promotores inducibles son actualmente usados en sistemas de plantas (inducibilidad de herida) o animales (especificidad a células de las glándulas mamarias, PPL) , aunque ninguno reporte está usando inductores químicos de bajo costo, bioseguros tales como las sales de nitrato. Puede ser altamente deseable proporcionar un método para regular la transcripción del transgen en organismos modificados genéticamente. Una' meta de la presente invención es proporcionar un método para regular la transcripción del transgen en organismos modificados genéticamente. Otra meta de la presente invención es proporcionar el uso de vectores de expresión que alojan la secuencia de codificación de un gen de interés bajo el control transcripcional de secuencias promotoras por las cuales se regula la actividad por la presencia de nitrógeno. La presente invención se relaciona al uso de casetes de expresión inducibles con nitrógeno para la expresión controlada de genes extraños en plantas. Se mostrará a partir de la siguiente descripción que aislar tales secuencias regulatorias puede ser realizado de tal forma que cuando las secuencias de actuación cis están apropiadamente asociadas a la estructura de lectura abierta de un gen de interés, su transcripción puede ser controlada por la adición de fuentes de nitrógeno específicas. En un aspecto de esta invención, el sistema objetivo usa las especies de plantas leguminosas, de tal forma que las construcciones que contienen el promotor inducible con nitrato serán mantenidas transcripcionalmente bajas en todo el periodo de crecimiento si la planta transgénica se mantiene en un medio libre de nitrato, lo cual permite de esta forma el desarrollo de la biomasa de la planta sin interferencia a partir del rasgo transgénico. Ante la adición del nitrato al medio de crecimiento, la transcripción será inducida en una proporción relativamente grande de la biomasa sobre los siguientes días. La optimización del tiempo de inducción y la acumulación de proteína será entonces realizada con el fin de maximizar la recuperación del producto recombinante deseado. Aunque la siguiente descripción hará más claro que esta invención puede ser adaptada fácilmente a la inducción de nitrato en plantas leguminosas transgénicas privadas de nitrato, debe recordarse que este concepto general puede también ser aplicado al desarrollo de otros sistemas de producción, haciéndola útil a la amplia variedad de sistemas de asimilación de nitrógeno en los reinos microbianos, vegetal y animal. En otro aspecto de esta invención, la inducibilidad de nitrógeno puede también ser usada para maximizar la producción de proteínas en organismos los cuales no realizan la fijación de nitrógeno a través de la asociación simbiótica, pero que pueden usar fuentes variables de nitrógeno (reducidas u oxidadas) para crecimiento, y de esta forma poseen la capacidad de desarrollarse adecuadamente mientras está inactiva una de sus trayectorias de asimilación de nitrógeno debido a la carencia de un substrato con nitrógeno en el ambiente de crecimiento. Usar casetes de expresión que controlan la transcripción de cualquier gen en esta trayectoria inactiva con el fin de accionar la expresión de un gen de interés en tal organismo, permitirá la expresión inducíble del rasgo transgénico ante la adición del compuesto de nitrógeno del que carece previamente. Como un ejemplo, la lenteja de agua es una especie vegetal que puede crecer alternativamente en nitrato o amonio; esta invención puede ser usada para desarrollar un cásete de expresión que alberga un promotor inducible con amonio enlazado apropiadamente a un gen de interés de tal forma que la inducción puede ser realizada en plantas de lenteja de agua transgénicas crecidas en nitrato. De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para regular la transcripción de un gen extraño en organismos transgénicos, el cual comprende las etapas de: a) preparar un organismo transgénico usando una construcción de expresión que consiste de por lo menos un promotor inducible con nitrógeno que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:l a 13 y fragmentos funcionales y derivados de las mismas, y una ORF de un gen, en donde el promotor se ubica operacionalmente con respecto al gen para expresión del gen. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método puede además comprender la etapa de regular la expresión transcripcional del gen por la adición o eliminación de un inductor de nitrógeno. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un método para regular la transcripción de un gen extraño en organismos transgénicos el cual comprende: a) preparar una construcción de expresión que consiste de por lo menos un promotor inducible con nitrógeno con o sin la secuencia de actuación cis, una ORF de un gen, y un sitio de extremo de señal de poliadenilación en el extremo 3' de la construcción, en donde el promotor se localiza operacionalmente con respecto al gen para expresión del gen y se modula para expresión transcripcional del gen por la adición o eliminación de un inductor de nitrógeno, b) subclonar la construcción de la etapa a) en un vector de transfección adecuado para el organismo; c) transferir el vector en el ADN del organismo o una célula del mismo; y d) seleccionar para capacidad de transgénico en un medio adecuado. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método puede además comprender las etapas de: e) introducir el vector . en una cepa adecuada de Agrobacterium tumefaciens; f) usar la cepa de Agrobacterium de la etapa a) para transferir el T-DNA en una célula vegetal; g) seleccionar para capacidad de transgénico de la célula vegetal en un medio adecuado; h) regenerar embriones o plantillas a partir de las células transgénicas; y i) hacer crecer a plantas maduras a partir de los embriones regenerados. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la secuencia de actuación cis puede ser aislada de la región corriente arriba 5' de un gen Nir expresado en alfalfa. De acuerdo con una modalidad preferida del método de la presente invención, el promotor tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 1 a 13 y fragmentos funcionales y derivados de las mismas. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el organismo es una planta, más preferentemente una planta dicotiledónea. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el organismo es alfalfa o tabaco. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el inductor de nitrógeno es nitrato.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el método de transferencia de ADN es cualquier método de transferencia adecuado el cual incluye el bombardeo de ADN, electroporación, transferencia de ADN mediada por PEG y batidores, entre otros. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la construcción de expresión comprende por lo menos un promotor inducible con nitrógeno, y por lo menos uno de los elementos de actuación cis o trans. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el organismo es una planta, un hongo, una bacteria, una levadura o un animal. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el promotor o secuencia de actuación se aisla de la región corriente arriba 5' de cualquier gen implicado en una trayectoria de asimilación de nitrógeno. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el promotor o secuencia de actuación cis se aisla a partir de la región corriente arriba 5' de cualquier gen para el cual se modula la transcripción por la disponibilidad de una fuente dada de nitrógeno. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el promotor o secuencia de actuación cis es cualquier secuencia para la cual se regula la actividad transcripcional por la adición o eliminación de cualquier fuente de nitrógeno en o a partir de cualquier ambiente de organismo vivo. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el organismo a partir del cual se aisla el promotor o secuencia de actuación cis es cualquier planta, hongo, levadura, bacteria o animal. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un promotor para promover la transcripción de un gen extraño en organismos transgénicos, lo cual comprende un. promotor inducible con nitrógeno con o sin una secuencia de actuación cis para expresión del gen y adaptado para ser modulado para expresión transcripcional del gen por la adición o eliminación de un inductor de nitrógeno. Preferentemente, el promotor tiene una secuencia selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1 a 13 y fragmentos funcionales y derivados de las mismas. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un terminador el cual permite la expresión de un gen extraño en organismos transgénicos que se usa en combinación con un promotor, lo cual comprende un sitio de extremo de señal de poliadenilación para inserción en el extremo 3 ' del gen, en donde el terminador está ubicado operacionalmente con respecto al gen y al promotor y por lo mismo permite la expresión del gen. Preferentemente, el terminador tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 14 a 16 y fragmentos funcionales y derivados de las mismas. Para el propósito de la presente invención se definen posteriormente los siguientes términos. La expresión "fragmentos funcionales o derivados de las mismas" se propone para significar cualquier derivado o fragmento de las secuencias SEQ ID No: 1-16 las cuales permiten un nivel equivalente de expresión de un gen extraño como el promotor de la presente invención indicado en la SEQ ID NO: 1-13 o como el terminador de la presente invención indicado en la SEQ ID NO: 14-16. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra el ' nivel de expresión GUS usando el promotor Nir (SEQ ID NO: 2-13) y el terminador COS en las hojas de plantas de tabaco transgénicas antes (columnas vacías) y después (columnas rellenas) de la fertilización con nitrato de las plantas. Las plantas de tabaco son transformadas con longitud total y eliminaciones del promotor Nir de alíala y terminador NOS funcionalmente colocados para controlar la transcripción y terminación del gen reportador GUS, como se describe en los métodos. Se mide la actividad GUS de acuerdo a Jefferson et al. (1987, EMBO J. 13:3901-3907) antes y después de la inducción por nitrato. La Figura 2 ilustra el nivel de expresión GUS usando el promotor Nir (SEQ ID NO: 2, 3, 5-6) y terminador Nir (SEQ ID NO: 15-16) en las hojas de plantas de tabaco transgénicas antes (columnas vacías) y después (columnas rellenas) de la fertilización con nitrato de las plantas. Las plantas de tabaco se transforman con longitud completa y eliminaciones del promotor NiR de alfalfa y el terminador NiR funcionalmente colocados para controlar la transcripción y terminación del gen reportador GUS, como se describe en Materiales y Métodos posteriores. Se, mide la actividad GUS de acuerdo a Jefferson et al (1987, EMBO, J. 13:3901-3907) antes y después de la inducción por nitrato. La Figura 3 ilustra el nivel de expresión de Gus usando el promotor NiR y el terminador NOS en las hojas de plantas de alfalfa transgénicas noduladas antes (columnas vacías) y después (columnas rellenas) de la fertilización con nitrato. Se transforma el genotipo de alfalfa 11.9 con las construcciones GC2-E, GC2-B, DC1-D y 35S colocadas funcionalmente para accionar la expresión del gen reportador GUS, como se describe en Khoudi et al (1997, Gene 197:343-351) . Después de la regeneración, se transfieren las plantas transgénicas a vermiculita estéril y se inoculan con la cepa de Rhizobium Balzac (Nitragin) . Se permite a las plantas crecer por 3 semanas con adiciones repetidas de solución de Hoagland libre de nitrato; se mide entonces la actividad GUS primero en hojas totalmente expandidas como se describe por Jefferson et al. (1987, EMBO J. 13:3901-3907). Se fertilizan entonces las plantas con nitrato 40 mM por dos días. Se mide otra vez la actividad GUS en primero hojas totalmente extendidas. Los datos mostrados en la presente son las relaciones entre las actividades específicas a GUS por inducción post y pre nitrato. Lo siguiente es una descripción detallada del método usado para generar líneas de tabaco y alfalfa transgénicas que pueden ser moduladas en su expresión de un gen reportador. Debe ser recordado que pueden hacerse variaciones al método por el cual pueden ser aislados los promotores inducibles por nitrógeno, por lo cual pueden ser enlazados a las ORF en la construcción usada para expresión en plantas, por lo cual se usan diferentes elementos de actuación cis y trans de las construcciones y están dispuestas espacialmente, por lo cual la inducibilidad por nitrógeno se demuestra y se usa, mientras que permanecen dentro del alcance de esta invención. En esta modalidad, una cadena de ADNc de NiR se aisla primero a partir de la alfalfa usando RT-PCR con cebadores deducidos a partir de la secuencia NiR vegetal consenso. Esta extensión de ADNc .es usada entonces tanto para realizar el caminado de genoma corriente arriba/corriente abajo. La región del promotor de NiR y las eliminaciones, el terminador 5'UTR y NiR son entonces colocados funcionalmente para controlar la transcripción y terminación de un gen reportador GUS. Se insertan estas construcciones en vectores de expresión adecuados para el bombardeo de ADN en hojas de tabaco y alfalfa y para la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium, como se describe por Desgagnés et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140). Estos dos métodos de transferencia de ADN se usan para demostrar que la expresión del gen reportador puede ser modulada por la adición o eliminación del nitrato en el medio de crecimiento. Materiales y métodos Material biológico Se usa la cepa DH5-a de E. coli para realizar todas las etapas de clonación. Se usa el genotipo 11.9 de alfalfa resistente para todos los experimentos los cuales incluyen la transformación estable usando la infección con A. tumefaciens (Desgagnés et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140). Aislamiento de ARN -total Se extrae el ARN total usando un método de fenol caliente esencialmente como se describe por de Vries et al. (1988, B6 página 1, In: Gevin SB and Shilperoot RA editors, Plant Molecular Biology Manual, Dordrecht: Kluwer Academic Pubisher) . RT-PCR Se usa RT-PCR para producir un fragmento de ADN que corresponde a una especie molecular de ARNm de NiR abundante a partir de ARNm total de hoja. Una región conservada es primero identificada a partir de 5 ORF de NiR de planta públicas , es decir las secuencias Genbank #AB006032 (ARNm de NiR de Arabidopsis), #X66145 (ARNm de Nir parcial de tabaco) , #U10419 (cds de Nir completo de fríjol) , #X07568 (ARNm de Nir de espinacas), y #U90429 (cds completa de Nir max de Glicina) . Se deducen los oligonucleótidos degenerados a partir de dos regiones conservadas, es decir Nir5-5' GATATTGATGTTAGACTCAAGTGGC 3' (SEQ ID NO: 17), en el extremo 5' y Nir3- 5' CACYSATTCCACTTCCTWGGC 3' (SEQ ID NO: 18), en el extremo 3' de la cadena de codificación. Una reacción de transcripción inversa es primero realizada con 200 unidades de M-MLV de transcriptasa inversa (RT) por 1 hora en 37 °C usando 1 µg de la ARN de hoja total, dNTP 4 mM (1 mM cada una) , 5 µM de cebadores de hexámero aleatorio en un amortiguador IX M-MLV-RT (Tris-HCl 50 mM pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2) . La reacción de PCR se realiza en un sistema de PCR Perkin Elmer Cetus GenAmp 9600 (EG&G, Wellesley, MA) , usando 2.5 unidades de Taq ADN polimerasa, 2 µM de cebador Nir5, 2 µM de cebador de Nir3, 800 µM de dNTP (200 µM cda uno) en un amortiguador de PCR IX (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl2) . El programa de ciclización usado es: inicial 4 min en 94°C, 30 ciclos de 1 min en 94°C, 30 segundos en 55 °C, y 3 minutos en 72 °C. Un periodo de extensión de 7 min en 72 °C se incluye en el programa. Secuenciación de ADN Se realiza la secuenciación de ADN como se describe por Sanger et al. (1977, P.N.A.S. USA, 74:5643-5647) . Caminado de genoma El caminado corriente arriba del fragmento de ADNc de Nir de alfalfa clonado a partir de la reacción RT-PCr se realiza usando el Universal Genome - Walking Kit de Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) (# de catálogo 1807-1) . Los cebadores tradicionales específicos a NiR usados para amplificar las secuencias corriente arriba de la secuencia de codificación son: Nirll06r- 5' TTGTCACATCAGCACATCCGTCTTTGC 3' (SEQ ID NO: 19) y NirlOdlr- 5 'TCGCCAAGTATCTTGTTTGAGCACTTG 3' (SEQ ID NO: 20) . Se subclona el fragmento de 3775 pb amplificado en el vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, Wl) (# de catálogo A1360) para análisis adiconal. El plásmido resultante es nombrado pGNir4c. Se realiza el caminado corriente abajo como el caminado corriente arriba usando los siguientes cebadores específicos a NiR: Nirle - 5' ATGTCTTCCTTCTCAGTACGTTTCCTC 3' (SEQ ID NO:28), y Nirl38c - 5' CAAGTTGATGCATCAAGGTGGGAGCCTAGA 3' (SEQ ID NO: 29) . Se subclona el fragmento de 3508 pb amplificado en el vector p-GEM-T easy (Promega, Madison, Wl) (# de catálogo #A1360) para análisis adicional. El plásmido resultante es nombrado pGN3 ' 1. Construcción de casetes y vectores de expresión. Los casetes para análisis de expresión usando el gen reportador GUS se ensamblan como sigue. Un cásete GUS sin promotor se digiere con pBllOl con HindIII y EcoRI, y se inserta en los sitios HindIII y ?coRI del sitio de policlonación pUC19. El plásmido resultante es nombrado pB1201 y se usa para construcciones adicionales. Las secuencias corriente arriba de Nir se amplifican por PCR usando el cebador AP2 a partir del Universal Genome Walking Kit como el cebador colocado corriente arriba, y tanto uno de los cebadores corriente abajo diseñados tradicionalmente con un sitio de restricción Smal. Los 4 cebadores se colocan tanto en la región 5' UTR del gen (Nir-23r-Sma-5 'AGAGCCCGGGAGAAGAGAGTGTGTTTG3 ' (SEQ ID NO:21)), en el extremo de la secuencia de codificación de péptido temporal (Nir51r-Sma-5'TTCTCCCGGGGGACGAGAGATGGATGGT -3' (SEQ ID NO: 22)), 50 pb después de la secuencia de codificación del péptido temporal (Nirl03r-Sma-5 ' TTCTCCCGGGGTTGAA-ACAGGTGCAACTGA 3' (SEQ ID NO: 23)), y 100 pb después de la secuencia de codificación del péptido temporal (Nirl58r-Sma-5' TTCTCCCGGGTAACCATCTTTTTCCTCA 3' (SEQ ID NO: 24). Se realiza la amplificación bajo condiciones estándar con el plásmido pGNir4c como templado. Se digieren los fragmentos amplificados con enzimas de restricción específicas con el fin de producir eliminaciones 5' del promotor Nir. Se produce pNir3k-23 por digerir el fragmento previamente amplificado por los cebadores AP2 y Nir-23r-Sma con Xmal, e insertando el fragmento resultante en pB1201 previamente digerido con Xmal. Se usa una estrategia similar para producir los plásmidos pNir3k51, pNir3kl03 y pNir3kl58 excepto que los cebadores corriente abajo usados son Nir51r-Sma, Nirl03r-Sma, y Nirl58r-Sma, respectivamente. Se produce pNir2.2k-23 a partir de la digestión con Smal-BglII del fragmento amplificado API - Nir-23-Sma insertado en el pBl201 previamente digerido con Smal y BamHl. Se usa la misma estrategia para producir los plásmidos pNir2.2k51, pNir2.2kl03 y pNir2.2kl58 excepto que los cebadores corriente abajo usados con Nir51r-Sma, Nirl03r-Sma y Nirl58r-Sma, respectivamente. Se verifican la fidelidad y orientación de las inserciones por digestión con las enzimas de restricción. Estos fragmentos de eliminación se ligan a la terminal 5' del gen reportador GUS en pB1201, y se usan para estudios de expresión temporales usando el bombardeo de ADN. Ante la identificación de los fragmentos de eliminación adecuados, se subclonan en un vector de expresión de planta binario tal como pBHOl (Clonetech) . Para la construcción de los casetes que contiene la terminal NiR corriente abajo del gen GUS además del promotor NiR, se usan los siguientes cebadores específicos a NiR: Nir2514c-Sac-5' AGAAGAGCTCAGTATATAGGTATTTGGTGA 3' (SEQ ID NO: 30) Nir2728c-Sac-5 ' AGAAGAGCTCTTGTACATTTGGATAAGTCA 3' (SEQ ID NO: 31) Nir3029r-Eco- 5' AGAAGAATTCGTTTTCCCGATACTTCAACT 3' (SEQ ID NO: 32) Un fragmento terminador de 617 pb es amplificado por PCR usando los cebadores Nir2514c-Sac y Nir3029r-Eco, y un fragmento terminador de 503 pb se amplifica por PCR usando los cebadores Nir2728c-Sac y Nir3029r-Eco. Los fragmentos obtenidos se digieren con Sacl y EcoRI y se insertan en los plásmidos que contiene las construcciones Nir-GUS después de la eliminación del terminador NOS entre los sitios Sacl y EcoRI.

Se usan estos plásmidos recombinantes para integración estable a través de la infección con A. tumefaciens como se describe posteriormente. Transferencia de ADN mediada por Agrobacterium y regeneración de las lineas transgénicas de alfalfa. Se introducen los plásmidos recombinantes en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación como se describe por Khoudi et al (1999, Gene 197:343-351). Se cocultivan entonces las cepas seleccionadas de Agrobacterium con discos de hojas del genotipo C5-1 por 4 días en la ausencia de presión de selección (kanamicina) . Después de este periodo de incubación, se lavan los discos de hojas y se humedecen, y después se permiten formar un callo en el medio B5H. Se transfieren entonces los callos por 21 días en medio SH para inducción de embriones y por 28 días en Boi2Y para el desarrollo embrionario. Se remueven los embriones de forma de torpedo de Boi2Y y se colocan en medio MS para regeneración. La kanamicina está presente en todo el medio de cultivo excepto para el cocultivo y regeneración en MS . Este método está descrito en amplitud en Desgagnés et al (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140). Se hacen crecer las plantillas de raíz para madurez en el invernadero. Se verifica la integración del transgen por amplificación de PCR de un fragmento NiR-GUS a partir de ADN genómico. Los cebadores usados son: Nir-102c-5' CACACTTCTTCACTCACCTCTCAA 3' (SEQ ID NO: 25) Nir-2016c- 5' ATCTAGGAGGGGCAGACATTG 3' (SEQ ID NO: 26) GUS228r - 5' TCGGTATAAAGACTTCGCGCTGAT 3' (SEQ ID NO: 27) Transferencia de ADN mediada por Agrro-acterium y regeneración de lineas de tabaco transgénicas . Se introducen los plásmidos recombinantes en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación como se describe por Khoudi et al (1999, Gene 197:343-351). Se cocultivan entonces las cepas seleccionadas con discos de hojas por dos días en medio MS sin kanamicina. Después de este periodo, se transfieren las explantas al medio de selección (MS con kanamicina) . Se mantiene las explantas en este medio por 3 semanas para permitir la formación de callos y. raíces a partir de las células transfectadas. Se transfieren las raíces resistentes a kanamicina en el medio MS de enrizamiento. Se hacen crecer para madurez en el invernadero. Se verifica la integración del transgen por amplificación de PCR de un fragmento NiR-GUS a partir de ADN genómico. Los cebadores usados son: Nir-102c- 5' CACACTTCTTCACTCACCTCTCAA 3' (SEQ ID NO: 25) Nir-2016c- 5' ATCTAGGAGGGGCAGACATTG 3' (SEQ ID NO: 26) GUS228r - 5' TCGGTATAAAGACTTCGCGCTGAT 3' (SEQ ID NO: 27) Inducción de nitrato Se hacen crecer las plantas de tabaco y alfalfa no transgénicas y transgénicas en medio de vermiculita sin nitrato. Se mantiene el equilibrio mineral por adiciones repetidas de soluciones de Hoagland libre de nitrato (Goagland and Varnon, 1950, Circular 347, California Agr. Exp. Stat. Berkeley). Se realiza la inducción con nitrato por regar las plantas con fertilizador 20-20-20 en una concentración de 5 gL"1 o como una alternativa con la solución de Hoagland complementada con nitrato 40 mM. Actividad del promotor de NiR en hojas de tabaco Se colocan los promotores derivados de NiR corriente arriba del gen reportador GUS en fusiones transcripcionales y de traducción. Las eliminaciones 5' del promotor NiR analizado aquí consisten en (1) un promotor de longitud completa putativa que comprende 2813 pb corriente arriba del ATG inicial de la región de codificación, (2) una versión de 1905 pb del promotor, y (3) una versión de 1111 pb más corta del promotor. El extremo 3' del promotor se fusiona al extremo 5 ' de la región de codificación GUS para formar las fusiones transcripciones y de traducción. Las fusiones de traducción analizadas permiten la producción de la ß-glucuronidasa que contiene (1) el péptido temporal de cloroplasto de NiR, (2) el péptido temporal de NiR con unos 17 aminoácidos adicionales a partir de NiR, y (3) el péptido temporal de NiR con unos 36 aminoácidos adicionales de NiR. Las doce combinaciones de eliminaciones 5' y 3' del promotor NiR introducido en las plantas de tabaco están presentadas en la Figura 1. Las construcciones del gen se transfieren en plantas de tabaco que usan el método de transfección mediada por Agrobacterium (Khoudi et al., 1997, Gene 197:343-351). Se transfieren las plantas transgénicas a cámaras de crecimiento y se analizan para su contenido de ß-glucuronidasa de hoja antes y después de la fertilización de nitrato. La Figura 1 presenta el nivel mediano de la actividad de ß-glucuronidasa medida en la primera hoja expandida de plantillas. Todos los promotores derivados de NiR muestran reactividad a la inducción de' nitrato. Se observan generalmente entre 5 y 10 veces el incremento de la expresión de ß-glucuronidasa, independientemente del truncamiento del promotor, lo cual indica que los elementos responsivos a nitrato importantes están contenidos dentro de la primera 1.1 kb corriente arriba del ATG inicial. Ambas eliminaciones 5' y 3' del promotor NiR llevan a modificaciones importantes de la actividad de la ß-glucuronidasa. El nivel más alto de expresión GUS se obtiene con el promotor de 2.8 kb, lo cual indica que las regiones corriente arriba lejanas tienen un papel regulatorio para el nivel de expresión de NiR en las hojas. Las fusiones de traducción del promotor a la región de codificación GUS resultan en un nivel de expresión variable dependiendo de la extensión del extremo 5' del promotor. Sin embargo, la fusión más corta (que contiene el péptido temporal NiR de 17 aa fusionado al extremo amino terminal de la ß-glucuronidasa) resulta constantemente en el nivel más alto de actividad para todos los tres truncamientos del extremo 5'. Esta fusión de traducción corta, combinada con la extensión más larga de regiones promotoras corriente arriba da origen al promotor más fuerte (3 kb + 50) . Cuando se induce, esta construcción específica resulta en más de 13 veces el nivel de expresión Gus obtenido con la construcción 35S-GUS-NOS. Cuando se considera la extensión 5' más larga del promotor, la fusión de transcripción para el gen GUS (3 kb-5) es ~7 veces menos efectiva que la fusión de traducción corta (3 kb + 50) . Sin embargo, en su estado inducido, el nivel de expresión GUS en las plantas que alojan la eliminación del promotor 3 kb-5 es más de 1.8 veces aquel observado en las plantas 35S-GUS-NOS.

Tomados juntos, los resultados presentados en la presente claramente indican que las secuencias corriente arriba del gen NiR de alfalfa tienen la capacidad para accionar expresión deducible alta de un gen exógeno en hojas de tabaco. Eficiencia del terminador NiR Las plantas de tabaco se transforman con construcciones que consisten del promotor NiR y eliminaciones (SEQ ID NO: 2, 3, 5 y 6) y 35S, junto con las secuencias 3'UTR y terminador (SEQ ID NO:15 y 16), funcionalmente colocadas para accionar la transcripción y terminación del gen reportador GUS. Se realizan el crecimiento, inducción de nitrato y mediciones de actividad GUS como por el experimento ilustrado en la Figura 1. Los resultados mostrados en la Figura 2 demuestran que la secuencia terminadora de Nir permite la terminación de transcripción en un ARN mensajero traducible. La actividad del promotor NiR en hojas de alfalfa Se obtiene la planta de alfalfa transgénica que contiene las construcciones de genes presentadas en la Figura 3 usando el método de transfección mediado por Agrobacterium de Desgagnés et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42: 129-140). Las plantas in vitro son transferidas en cámara de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo normal. Se hacen crecer los cultivos a partir de cada línea transgénica en vermiculita y se fertilizan con medio de Hoagland libre de nitrato. Después de dos semanas, se inoculan las raíces con Nitragin (LiphaTech inc., Milwaukee, Wl) . Dos semanas después de la inoculación, se han desarrollado nodulos en las raíces. Las plantas noduladas son permitidas para continuar su crecimiento vegetativo por al menos otra semana antes de que se realice la medición fluorométrica de la actividad de ß-glucuronidasa (antes de la inducción) . Después de la medición, las plantas se riegan con medio de Hoagland que contiene 40 mmoles de KN03. Dos días después de la inducción, se mide la actividad de la ß-glucuronidasa de hoja para evaluar la inducibilidad de nitrato del promotor NiR en hojas de alfalfa. Los resultados son presentados en la Figura 3. Los resultados muestran que el promotor NiR induce la expresión del gen reportador GUS ante la adición del nitrato en plantas de alfalfa noduladas. Tomados juntos, esta última serie de resultados demuestran que la capacidad de inducción del promotor NiR puede ser usada para regular posiblemente la expresión de un gen reportador en plantas de alfalfa cuando se reemplaza la fijación del nitrógeno atmosférico por asimilación del nitrato. Mientras que la invención se ha descrito en conexión con modalidades especificas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta aplicación se propone para cubrir cualesquiera variaciones, usos o t adaptaciones de la invención que sigue, en general, los principios de la invención y que incluyen tales desviaciones de la presente descripción como que están dentro del conocimiento o práctica tradicionales dentro de la técnica a la cual pertenece la invención y como pueden ser aplicados a las características esenciales indicadas anteriormente en la presente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de promotor aislado para promover la transcripción de un gen extraño en organismos transgénicos, caracterizada porque comprende un promotor inducible con nitrógeno con o sin la secuencia de actuación cis para expresión del gen extraño y adaptada para ser modulada para expresión transcripcional del gen extraño por adición o eliminación de un inductor de nitrógeno, el promotor aislado que tiene la secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 1 a 13.
2. 2. El promotor aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo se selecciona del grupo que consiste de una planta, un hongo, una bacteria, una levadura y un animal.
3. 3. El promotor aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la planta es una dicotiledónea .
4. 4. El promotor aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la dicotiledónea es alfalfa o tabaco.
5. 5. El uso de un promotor aislado como se describe de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por regular la transcripción de un gen extraño en organismos transgénicos .
6. 6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende regular la transcripción del gen extraño por la adición o eliminación de un inductor de nitrógeno.
7. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el organismo se selecciona del grupo que consiste de una planta, un hongo, una bacteria, una levadura y un animal.
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la planta es dicotiledónea.
9. 9. El uso conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la dicotiledónea es alfalfa o tabaco.
10. 10. El uso de conformidad, con la reivindicación 1, caracterizado porque el inductor de nitrógeno es nitrato.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el promotor está asociado operativamente a por lo menos un elemento de actuación cis o trans .
12. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el elemento de actuación cis se aisla de la región corriente arriba 5' de cualquier gen implicado en una trayectoria de asimilación de nitrógeno.
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el elemento de actuación cis se aisla de la región corriente arriba 5 ' de cualquier gen para el cual se modula la transcripción por disponibilidad de una fuente de nitrógeno.
14. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el elemento de actuación cis es cualquier secuencia para la cual se modula la actividad de transcripción por adición o eliminación de cualquier fuente de nitrógeno en o de cualquier ambiente de organismo vivo.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque elemento de actuación cis se aisla de cualquier planta, hongo, levadura, bacteria o animal. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el elemento de actuación cis se aisla de la región corriente arriba 5' de un gen Nir expresado en alfalfa. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el promotor se usa en combinación con un terminador el cual comprende un sitio de extremo de señal de poliadenilación para inserción eh el extremo 3' del gen extraño, en donde el terminador se ubica operativamente con respecto al gen extraño y el promotor aislado y por lo mismo permite la expresión del gen extraño. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el terminador tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14 a 16. 19. Un terminador aislado para regular la expresión de un gen en un organismo transgénico, caracterizado porque la secuencia del terminador aislado se selecciona de grupo dé secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 14 a
16. 16.