JPWO2003004649A1 - 根と茎頂で外来遺伝子を発現するプロモーター - Google Patents
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Abstract
本発明によって根および茎頂の少なくとも１つの部位において特異的に発現を誘導するプロモーターが提供される。このプロモーターを用いて、線虫または土壌病原体に対する抵抗性物質を根で合成させたり、根の発達を促進する物資を根で合成させたり、あるいは遺伝子組換え植物の作成時に、再分化植物体の選抜マーカーの発現を幼植物の根に限定し成熟時の発現を抑制することなどが可能になる。また茎頂の発現能力を利用して、増殖の盛んな細胞の遺伝子発現を制御する技術の開発にも利用し得る。
Description
技 術 分 野
本発明は、植物に外来遺伝子を導入して根および／または茎頂で発現させるプロモーターに関する。さらに詳しくは、イネのカタラーゼ遺伝子Ｂ（以下、ＣａｔＢという）のプロモーター領域の一部を用いて根および／または茎頂で外来遺伝子を発現させる方法に関する。
背 景 技 術
根は植物が倒れないように支える役目のほかに、水および養分の吸収という大きな役目を果たしている。根は分枝することにより表面積を広げて吸収できる面積を大きくしている。物質を吸収しやすいように有機酸を分泌して、リンまたは鉄などと結合させてリンまたは鉄を吸収する機能もある。根の先端が土の中を伸びるのを助けるように潤滑油のような物質を合成して分泌する機能もある。根には植物ホルモンを合成し貯蔵する役目もある。根には光合成で得たエネルギーを蓄えたり、あるいは若いときにリンを蓄えてその後転流させたりするなどの機能がある。動物のように動くことができない植物は、環境から多くのストレスを受けており、多くの対抗策を持っており、特に根も多くの対抗策を備えている。
これらの根の機能に関連して、イネでは、サイクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｙｌｌｉｎ；Ｃｙｐ）遺伝子（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８３７−８４３（１９９４））、リピッドトランスファータンパク質（ＬＴＰ）遺伝子（Ｖｉｇｎｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６：２６５−２７０（１９９４））、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ−ＺＢ８遺伝子（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：５３５−５５０（１９９５））、ヒストンＨ３遺伝子（Ｔｅｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：１７−２６（１９９５））、塩基性キチナーゼ（ＲＣ２４）遺伝子（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：３８７−４０１（１９９６））、カレオシン（ｃａｌｅｏｓｉｎ）遺伝子（Ｎａｅｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：４６３−４７６（２０００））などの遺伝子が根で発現することが既に知られている。
イネ以外では、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の延長因子ｅＥＦ１Ａ遺伝子（Ｔｒｅｍｏｕｓａｙｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ ２０：５５３−５６１（１９９９）、ミロシナーゼ（ｍｙｒｏｓｉｎａｓｅ）遺伝子Ｐｙｋ１０（Ｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６１：３３７−３４６（２００１））、鉄トランスポーター（ＩＲＴ２）遺伝子Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ ２６：１８１−１８９（２００１））など、タバコのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子（Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２：６７９−６８８（２０００））、硝酸還元酵素（ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（Ｈａｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５２：１２５１−１２５８（２００１））など、また亜麻（ｆｌａｘ）のペクチンメチルエステラーゼ（Ｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６０：７１３−７２１（２００１））などが既に根で発現する遺伝子として知られている。
茎頂とは栄養成長期にある茎の先端およびその近傍部を指す。高等植物では、新しく細胞をつくり出す分裂機能を持つ。茎頂で発現する遺伝子としては例えば以下の遺伝子が知られている。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）では、リピッドトランスファータンパク質（Ｉｔｐ１）遺伝子（Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：５１３−５２４（１９９６））、ホメオボックス（ＮＴＨ１５）遺伝子（Ｔａｍａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３８：９１７−９２７（１９９７））、ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ３ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ遺伝子（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２０：１５−２４（１９９９））、アラビドプシスではｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１４：１２１５−１２２４（１９９７））、ＥＲＥＣＴＡ遺伝子（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：３０１−３１０（１９９８））、ＡＴＭＬ１遺伝子（Ｓｅｓｓｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２０：２５９−２６３（１９９９））、ＦＡＤ３遺伝子（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，２１３：８３３−８４０（２００１））である。これらの遺伝子の発現の組織特異性はそのプロモーターによって規定されていることが、これらの研究によって明らかになっている。
最近になって、バイオテクノロジーを利用した方法として、根で発現するプロモーターに根の発達、耐病性または耐ストレス性を助ける機能を持つ遺伝子をつなげて植物に導入する方法が有望視されている。
根で外来遺伝子を発現させるために植物ウイルスの遺伝子のプロモーターを利用する試みもある（例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅ ａｎｄ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６７：２９−３５（２０００）；Ｍａｚｉｔｈｕｌｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５５：２１−２９（２０００））が、ウイルスは感染後に拡散するので、遺伝子発現部位を細胞レベルで限定するには、植物遺伝子由来のプロモーターの方が優れている。
根で発現する遺伝子のプロモーターはトウモロコシなどで数種類が知られている。組換えＤＮＡ技術による耐病性付与の例として、線虫抵抗性付与の例（米国特許６，２８４，９４８：Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）においては、線虫抵抗性の遺伝子を植物ユビキチン遺伝子のプロモーターで発現させているが、このユビキチンプロモーターは器官特異性が低く、恒常的に発現する。
根特異的プロモーターの例としては、米国特許第６，２７１，４３７号：Ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（大豆遺伝子プロモーター）があるが、これは大豆のシスト線虫抵抗性遺伝子のプロモーターを、根での外来遺伝子発現に用いるために使用する方法である。また、根特異的プロモーターの例としては、米国出願２００１／００１６９５４：Ｒｏｏｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（根特異的プロモーター）がある。この例では、アラビドプシス由来のｂ１−チューブリン遺伝子のプロモーター、リボソームタンパク質ＲＰＬ１６Ａ遺伝子のプロモーター、ＡＲＳＫ１遺伝子のプロモーター、およびエンドウ豆のメタロチオネイン様遺伝子のプロモーターが含まれている。これらのプロモーターも利用法として、線虫に対する抵抗性の付与が記載されている。
これらのプロモーターの活性は、一般的に実用に用いられるには低い、イネ等の穀類を含む単子葉植物では機能しない、あるいは器官特異性が低い等の問題点がある。
従って、穀類の各発生段階に機能するプロモーターを多数単離し、それぞれの特徴を明らかにした上で、異なる組織特異性および高い活性を持ったプロモーターカセットを作成すれば、イネ等の作物の品種改良に非常に有用である。
（発明が解決しようとする課題）
本発明の課題は、根および／または茎頂で高い活性を有する植物用プロモーターを提供することにある。より詳細には、本発明は、従来のプロモーターの活性が有する問題点（一般的に実用に用いられるには低い、イネ等の穀類を含む単子葉植物では機能しない、あるいは器官特異性が低い等）を克服し、実用的なプロモーターを提供することを課題とする。
発 明 の 要 旨
（課題を解決するための手段）
上記課題は、本発明は、イネのカタラーゼＢ（ＣａｔＢ）遺伝子のプロモーター領域の一部の塩基配列を用いることによって、外来遺伝子を根で発現させることができることを見いだして完成されたものである。
本発明は、以下を提供する。
１． 配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
２． 項目１に記載のプロモーターであって、該プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
３． 項目１に記載のプロモーターであって、該プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
４．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための組成物であって、該組成物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、組成物。
５． 項目４に記載の組成物であって、前記プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、組成物。
６． 項目４に記載の組成物であって、前記プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、組成物。
７．前記植物は、単子葉植物または双子葉植物である、項目４に記載の組成物。
８．前記植物は、単子葉植物である、項目４に記載の組成物。
９．前記植物は、イネ、アラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、トマト、キュウリ、ナス、ジャガイモ、レタス、ダイコンまたはニンジンである、項目４に記載の組成物。
１０．前記所望の遺伝子は、抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子である、項目４に記載の組成物。
１１．前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、根端部を含む、項目４に記載の組成物。
１２．前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、単子葉植物の幼生植物の分裂組織領域を含む、項目４に記載の組成物。
１３．前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、茎頂部を含む、項目４に記載の組成物。
１４．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための植物発現カセットであって、該カセットは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物発現カセット。
１５．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるためのプラスミドであって、該プラスミドは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含し、ここで、該プロモーターは、該所望の遺伝子に作動可能に連結される、プラスミド。
１６．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物細胞であって、該植物細胞は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物細胞。
１７．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物組織であって、該植物組織は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物組織。
１８．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、トランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、トランスジェニック植物。
１９．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物種子であって、該植物種子は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物種子。
２０．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を該植物に提供する工程；
２）該植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）該植物を該プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する、方法。
２１．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法によって得られる遺伝子産物であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を該植物に提供する工程；
２）該植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）該植物を該プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する、
遺伝子産物。
２２．根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現するように改変された植物を生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターを含むプラスミドを提供する工程；
２）該プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および
３）該形質転換された植物細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
上記項目１４〜２２は、項目５〜１３の特徴事項で特定され得る。
発 明 の 詳 細 な 説 明
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（配列の説明）
配列番号１は、ＣａｔＢのプロモーター領域の核酸配列（１３６４ｂｐ）（ｃＤＮＡの開始点を＋１として−１０６６〜＋２９８；図５を参照）を示す。
配列番号２は、ＣａｔＢ遺伝子の核酸配列（４９８５ｂｐ）を示す。
配列番号３は、ＢΔ３断片（８６６ｂｐ）を示す。
配列番号４は、Ｂ１断片（６２７ｂｐ）を示す。１〜６位は、ＣａｔＢカタラーゼ遺伝子塩基配列中のＡＡＡＡＡＡをＡＡＧＣＴＴに変換し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を作成した。４６０位は、ＴをＣに置換し、ＣａｔＢカタラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンを壊した。
配列番号５は、Ｂ２断片（５２４ｂｐ）を示す。１〜６位は、ＣａｔＢカタラーゼ遺伝子塩基配列中のＡＡＡＡＡＡをＡＡＧＣＴＴに変換し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を作成した。３５７位は、ＴをＣに置換して、ＣａｔＢＣａｔＢカタラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンを壊した。
配列番号６は、ＣａｔＢ ｃＤＮＡの１０２−１３１に相当する配列である。
配列番号７は、ＣａｔＢ ｃＤＮＡの４８４−４５５に相当する配列である。
配列番号８は、本明細書の１実施形態で使用されるプライマー３Ｄ３−Ｆ１である。
配列番号９は、本明細書の１実施形態で使用されるプライマー３Ｄ３−Ｆ２である。
配列番号１０は、本明細書の１実施形態で使用されるプライマーＢＤ３−ＭＲである。
配列番号１１は、ＣａｔＢ遺伝子の−３２９〜＋２９８のプロモーター領域を示す。
配列番号１２は、ＣａｔＢ遺伝子の−３２９〜−２２７のプロモーター領域を示す。
（用語の定義）
本明細書において使用される「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める遺伝エレメントまたは因子をいう。本明細書において、「プロモーター領域」とは、ある構造遺伝子配列付近の領域であって、プロモーター活性を有する領域をいう。プロモーター領域は、遺伝子の転写が開始される際にＲＮＡポリメラーゼが結合する通常遺伝子上流の塩基配列で特定される領域である。本明細書において、ある因子が「プロモーター活性」を有するとは、その因子がＲＮＡポリメラーゼなどに作用し、転写が開始する活性をいう。
本明細書において用いられる「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
本明細書において使用される「根および茎頂の少なくとも１つの部位」は、根および茎頂からなる部位群の少なくとも１つの部位を指す。従って、「根および茎頂の少なくとも１つの部位」には、根の一部または茎頂の一部が包含される。「根および茎頂の少なくとも１つの部位」にはまた、分裂組織も含まれる。
本明細書において使用される「分裂組織（メリステム、ｍｅｒｉｓｔｅｍ）」とは、分化細胞からなる植物の形成組織で，分化して他の分裂細胞または特殊な型の細胞をつくる能力をもつ部位をいう。分裂組織は主に、生長部分にみられる。分裂組織としては、生長点（ｇｒｏｗｔｈ ｐｏｉｎｔ）、茎頂（シュート頂；ｓｈｏｏｔ ａｐｅｘ）、根端（ｒｏｏｔ ａｐｅｘ，ｒｏｏｔ ｔｉｐ）、根端分裂組織（ｒｏｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ）、頂端分裂組織（ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ）などが挙げられる。
本明細書において使用される「根」（ｒｏｏｔ）とは、地下部にあり，体支持と水吸収をする器官をいう。先端は根冠（ｒｏｏｔ ｃａｐ）といい、内部は表皮にかこまれて中心柱という。中心柱の中に導管と篩管が通る。根端の少し後方に表皮細胞の一部が突起した根毛がある。根毛およびその付近の細胞の表皮細胞で水分吸収が盛んであるが、根毛の寿命は数日から数週間で、根は常に伸長するので，その位置は常に前進する。本明細書では、根全体を根系（ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ）ともいう。例えば、イネでは，種子根は１本の鞘葉節以上の節から不定根が各節あたり約５〜２０本出る。節から出る根を冠根という。根は上位節で多く出る。上位節から１次、２次の分枝根が出る。根は、最長１ｍ程度になる。根は分裂組織を含む。
本明細書において使用される「茎頂」とは、シュート頂とも呼ばれ、茎の頂端分裂組織とその周辺の部位をいう。茎頂には、茎および側生的に葉を形成する栄養期茎頂と花序または花を形成する生殖期茎頂とがある。茎頂は分裂組織を含む。茎頂は、栄養成長期にある茎の先端及びその近傍部を指す。高等植物では、新しく細胞をつくり出す分裂機能を持つ。
本明細書において使用される「カタラーゼ」とは、過酸化水素を分解する反応を触媒する酵素をいう（ＥＣ１．１１．１．６）。カタラーゼはまた、Ｈ２Ｏ２，ＣＨ３ＯＯＨ，Ｃ２Ｈ５ＯＯＨの存在で、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＮＯ２などを酸化し得る。動物、植物、微生物を問わず好気的細胞にはすべて存在し、動物では肝臓、腎臓、赤血球に特に多い。ウシの肝臓のカタラーゼは分子量約２３万で，酵素１分子に作用基として４個のプロトヘマチンが含まれている。植物では、本発明者らが単離したカタラーゼＢなどがある。
本明細書において、核酸分子の「断片」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、少なくともプローブまたはプライマーとしての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。ある核酸分子の断片を、それが由来した元の核酸分子に対する選択的プローブまたは選択的プライマーとして使用するためには、特異的にハイブリダイズし得る断片である必要がある。本明細書においてあるＤＮＡが「特異的にハイブリダイズ」するとは、提供された核酸分子を互いに区別して検出または増幅し得ることをいう。選択的プローブには、代表的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも３０、４０または５０ヌクレオチド長であり得、５０を超えるヌクレオチド長も使用され得る。選択的プローブは、選択的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物として入手され得る。１対のプライマーの少なくとも一方に、選択的プライマーをＰＣＲに使用する場合、選択的プライマーは、代表的には少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０または５０ヌクレオチド長であり得る。
本明細書において、核酸分子の「ホモログ」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明のプロモーターについていう場合、「ホモログ」とは、プロモーター配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その発現特性（例えば、部位特異性、時期特異性、ストレス応答性など）が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
従って、本発明のプロモーター配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本発明のプロモーターと同一または類似の活性を有し得る。そのような活性は、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、またはＧＦＰの遺伝子をレポーター遺伝子として使うアッセイ、生化学的あるいは細胞組織学的な検定により確認することができる。そのようなアッセイは、当該分野における周知慣用技術に属することから（Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５：３８７（１９８７）；Ｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６（１９８６）；Ｓｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：７７７−７８４（１９９５））、当業者は何ら困難を伴わずに、本発明の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子が本発明のプロモーターと同一または類似のあるいは実質的に同等以上の活性を有することを確認することができる。本明細書では、上記アッセイにおいて、検出誤差範囲内で同じプロモーター活性を有することが判定されたときに実質的に同等以上のプロモーター活性を有するという。
本発明のプロモーターの長さは、通常１０ヌクレオチド以上であるが、好ましくは、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、６０ヌクレオチド以上、７０ヌクレオチド以上、８０ヌクレオチド以上、９０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、１５０ヌクレオチド以上、２００ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上の長さであり得る。
本発明のプロモーターは、従来のプロモーター（例えば、ミニマムプロモーター（３５Ｓプロモーター由来の約８０塩基対からなるプロモーター（Ｈａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：８５９−８７６（１９９５）；Ｒｏｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：４３５−４４０（１９９８）；Ｗａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：１−１２（１９９９））など）につなげて利用することができる。この場合、従来組織特異性を示さないまたは弱い特異性を示す、あるいは別の特異性を示すプロモーターであっても、本発明のプロモーターまたはその断片を付加することによって、根および／または茎頂に組織特異的に強く機能するプロモーターを作製することができる（Ｈａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：８５９−８７６（１９９５）；Ｒｏｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：４３５−４４０（１９９８）；Ｗａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：１−１２（１９９９））。
本発明のプロモーターは、単子葉植物だけでなく双子葉植物および他の生物の改変にも利用し得る。これは、両植物間で転写調節の基本的な機構が類似していることにより説明される。例えばトウモロコシのｚｅｉｎ遺伝子プロモーターがタバコで同じ組織特性で発現すること（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７：１２４９−１２５５（１９８８））、イネのグルテリン遺伝子プロモーターがタバコで同じ組織特性で発現すること（Ｌｅｉｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：４１−５０（１９８９））が報告されている。特に好ましい対象植物としては、イネのほか、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ソルガム、カンキツ類、白菜、レタス、タバコ、モモ、ジャガイモ、トマト、およびリンゴなどが挙げられる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等が例示される。
ベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、以下を用いた形質転換などが挙げられる：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。
本発明のプロモーターによる発現の「検出または定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンプロット法、ドットプロット法またはＰＣＲ法等が例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等が例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法等が例示される。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、本発明のタンパク質またはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンプロット法、ドットプロット法、ＰＣＲ法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。発現量の絶対量または相対量を観察することにより、あるプロモーターが特異的に作用しているかどうかを検出することができる。
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。
本明細書において発現される「遺伝子」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、遺伝形質を規定する因子をいう。本発明の方法において発現される、所望の遺伝子は特異的に発現させることが所望される遺伝子であればなんでもよいが、例としては、例えば、線虫または土壌病原体などに対する抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーなどが挙げられる。
本明細書において「再分化する」とは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、細胞および葉または根などの組織片から植物体が形成される。
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；＿Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などが挙げられる。従って、当業者は、上記周知方法を目的とするトランスジェニック植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。
再分化した形質転換体が、所望の改変された特性を有することは、当該特性の種類に応じて適切なアッセイを行うことにより確認し得る。例えば、レポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子とプロモーターとを融合し、植物体に導入して形質転換体を作出し、ＧＵＳ活性の組織染色で検出することが可能である。ここでは、蛍光タンパク質であるＧＦＰの遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として使うことも可能である。これらはいずれも各種プロモーターのアッセイに使われている。詳細は下記実施例に記載される。また、ストレス耐性として病原性細菌に対する耐性の付与が意図される場合、再分化した植物体にモデル菌、例えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ）を接種し、コントロールの植物体と比較して接種による変化の有無を観察することで、特性の変化を評価し得る。
本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、およびアラビドプシスの栽培法（丹羽康夫）ｐｐ．３３−４０（監修 島本功、岡田清孝）に例示されており、本明細書では詳述しない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで４０〜５０粒の種子が得られ、播種後２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。種子の休眠期間は短く、完熟種子は１週間程度乾燥させれば吸水後２〜３日で発芽する。ただし、吸水・播種後２〜４日間４℃で低温処理を行うと発芽が斉一化される。
（発明を実施する最良の形態）
１つの局面において、本発明は、配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸配列に関する。この配列は、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。好ましくは、この核酸配列は、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み得る。
より好ましくは、本発明は、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。この核酸分子は、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。この核酸分子は、分裂組織を含む根での発現を特異的に促進させるプロモーター活性を有する。本発明者の知る限りこのようなプロモーター活性を付与する配列は特に、イネでもアラビドプシスでもこれまで見い出されていないことから、本発明は、当該分野において顕著な効果を奏することを達成したといえる。
上述の特定の配列の範囲は、本発明において１つの好ましい配列範囲を示すものであり、本発明はそれらに限定されないことを付言しておく。従って、本発明は、本明細書に記載される方法に従って、当業者が選択した他に適切な領域に特定することも可能である。そのような選択方法は本明細書の他の記載または当該分野において周知慣用技術を参酌することにより過度な実験を要することなく実施することができる。
別の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための組成物を提供する。この組成物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する。上述のように１）のプロモーターは、根および茎頂の少なくとも１つの部位で特異的な発現を促進させることから、このような組成物は根および茎頂の少なくとも１つの部位で特異的に発現する系を提供するという当該分野において顕著な有用性を提供する。
１つの実施形態において、上記プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。
別の実施形態において、上記プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。別の実施形態において、上記植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得るが、生物は、単子葉植物または双子葉植物に限定されることはない。従って、本発明のプロモーターが同様な効果を奏する限り、生物は、動物などの植物以外の生物、または単子葉植物および双子葉植物以外の植物であり得る。好ましい実施形態において、上記植物は、単子葉植物であり得る。より好ましくは、上記植物は、イネ、アラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、トマト、キュウリ、ナス、ジャガイモ、レタス、ダイコンまたはニンジンであり得る。
別の好ましい実施形態において、本発明のプロモーターの長さは、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、６０ヌクレオチド以上、７０ヌクレオチド以上、８０ヌクレオチド以上、９０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、１５０ヌクレオチド以上、２００ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上の長さであり得る。
別の実施形態において、本発明のプロモーターは、他のプロモーターにつなげて提供され得る。この場合、従来組織特異性を示さないまたは弱い特異性を示す、あるいは別の特異性を示すプロモーターであっても、本発明のプロモーターまたはその断片を付加することによって、根および茎頂の少なくとも１つの部位に組織特異的に強く機能するプロモーターを作製することができる
別の実施形態において、上記所望の遺伝子は、例えば、線虫または土壌病原体に対する抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。
別の実施形態において、上記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、根端部を含み得る。別の実施形態において、上記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、茎頂部を含み得る。根および茎頂の少なくとも１つの部位は、単子葉植物（例えば、イネ）の幼生植物の分裂組織を含み得る。幼生植物のみでの発現を促進することによって、作物（例えば、イネ）では導入した遺伝子産物が発現または残留しない植物を作製することができる。
他の局面において、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための植物発現カセットを提供する。このカセットは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含し得る。植物発現カセットは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。そのような作製方法は、本明細書の実施例においても例示されている。
他の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるためのプラスミドを提供する。このプラスミドは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。ここで、上記プロモーターは、上記所望の遺伝子に作動可能に連結される。このようなプラスミド（またはベクター）を作製する方法は当該分野において周知慣用であり、本明細書の実施例にも例示されている。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物細胞を提供する。この植物細胞は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。そのような植物細胞を作製する方法は当該分野で周知であり、例えば、本発明のプラスミドを用いた形質転換、トランスフェクション、形質導入などによって実施することができる。そのような方法は、本明細書においても上記に具体的に記載し、かつ、実施例においても例示されている。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物組織を提供する。この植物組織は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。植物組織は、例えば、本発明の植物細胞から再分化することにより作出することができる。あるいは、植物組織に直接本発明の組成物を注入することによって作製することも可能である。そのような方法は、当該分野において周知である。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、トランスジェニック植物を提供する。このトランスジェニック植物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。トランスジェニック植物は、例えば、本発明の植物細胞を再分化することによって作出することができる。そのような再分化方法は、当該分野において周知であり、例えば、タバコやアラビドプシス等の双子葉植物については、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；＿Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；＿Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；イネについては、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４）；Ｔｏｋｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７）など。）などが挙げられる。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物種子を提供する。この植物種子は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。このような植物種子は、上記トランスジェニック植物を稔性を保つようにして再分化することによって作出することができる。そのような再分化方法は、当該分野において周知であり、例えば、タバコやアラビドプシス等の双子葉植物については、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；イネについては、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４）；Ｔｏｋｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７）など。）などが挙げられる。
他の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法を提供する。この方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を上記植物に提供する工程；
２）上記植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）上記植物を上記プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する。このような方法は、本発明のプロモーターさえ特定されれば、当業者に周知慣用の技術を用いて行うことができる。そのような発現方法は、本明細書において上述した。
他の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法によって得られる遺伝子産物を提供する。ここで、上記方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を上記植物に提供する工程；
２）上記植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）上記植物を上記プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する。根および茎頂の少なくとも１つの部位は、新生の盛んな組織であることから、この方法によって所望の遺伝子が多量に得られる。
他の局面において、本発明は、根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現するように改変された植物を生産する方法を提供する。この方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターを含むプラスミドを提供する工程；
２）上記プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および
３）上記形質転換された植物細胞を培養する工程、
を包含する。プラスミドを提供する方法、形質転換する方法、および培養する方法は当該分野において周知であり、本明細書においてすでに説明した。
既に本発明者らは、イネ・カタラーゼＣａｔＢ遺伝子を単離して構造解析した（ＤＤＢＪ登録番号Ｄ６４０１３）。さらに、その５’上流のプロモーター領域（ｃＤＮＡ開始点を＋１として、−１０６６から＋２９８：本文ではこのＤＮＡ断片をＢΔ０と呼ぶ）をレポーター遺伝子（ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ））と融合し、イネの培養細胞系統（Ｏｃ細胞）から調製したプロトプラストにエレクトロポレーションで導入して一過性遺伝子発現によるＧＵＳ酵素活性を指標にしてプロモーター活性を測定したところ、植物の遺伝子導入によく使用されるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの約２０倍の活性を示すことを見いだした。これにより、本プロモーターが有用遺伝子の発現のためのプロモーターカセットの作出に利用できることを明らかにして発明を完成し、特許出願した（特許第２９５５６４４号「イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター」）。
さらに本発明者らは、ノーザンハイブリダイゼーション分析により、ＣａｔＢはイネ幼植物の根で強く発現しているが、成熟個体の根では発現がしないこと、葉、茎、花では強い発現はないことを明らかにした（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５１：３９−４６（２０００））（表１）。
上記の結果をヒントに、本発明において、ＣａｔＢ遺伝子プロモーター領域（特許登録２９５５６４４）の中の器官特異性を制御する部分の同定を試みた。
具体的には、ＣａｔＢ遺伝子プロモーター領域ＢΔ０を５’側から欠損して作成した各種ＤＮＡ断片にレポーター遺伝子（ＧＵＳ）を融合してベクターに組み込み（図１、２）、イネおよびアラビドプシスに導入して形質転換し、再分化当代あるいは後代の植物の各組織をＧＵＳ組織染色して発現部位を調べた。
その結果、ｃＤＮＡ開始点（＋１）の上流−３２９から＋２９８までの短いプロモーターＤＮＡ断片（Ｂ１）でもイネの幼植物の根（図３、表２、３）、およびアラビドプシスの幼植物の根および茎頂（図４、表４）でのレポーター遺伝子の発現を可能にすることを明らかにした。
形質転換植物では個体間で発現の器官特異性の程度にばらつきがあるが、Ｂ１：：ＧＵＳコンストラクト（図１のＢ１）を導入したイネ再分化当代の約半数でレポーター遺伝子を根で強く発現していた。イネでも同様に茎頂において特異的に発現するものと考えられる。
イネ幼植物の根における発現の特異性はプロモーター領域を５‘側から欠損すると減少し、その順は高い方から、ＢΔ０（７１％）＝ＢΔ３（７５％）＞Ｂ１（４８％）＞Ｂ２（１９％）である（表２）。プロモーター領域は長い方が発現特異性は強いが、Ｂ１でも再分化個体の集団からから望ましい個体を選抜すれば，特異的発現をしている植物体を得ることができるので、目的に応じてＢΔ０、ＢΔ３あるいはＢ１の中から選ぶことができる。
−３２９から−２２７を欠損したプロモーター（Ｂ２）では、イネおよびアラビドプシスの根での発現は大きく減少するので（表２、４）、この−３２９から−２２７の領域は根での発現に必要である。この領域には、根での発現に関与する既知のシスエレメントは存在しないので、新規のシスエレメントがある可能性が高い。
この結果から先に特許出願したイネ・カタラーゼＣａｔＢ遺伝子由来の１，３６４塩基のプロモーター領域のうち、約６３０塩基の長さまでの各配列を用いることによって、イネ等の単子葉およびアラビドプシスなどの双子葉において、幼植物の根および茎頂で外来遺伝子を発現させることを可能にする方法が開発された。
一般的にプロモーター塩基配列は保存度が低く、数百塩基のプロモーター塩基配列を用いてのスクリーニングで類似した活性を持つプロモーターを検出するのは容易ではない。プロモーター領域の中の、転写調節因子（タンパク質）が結合するサイト（シスエレメント）は保存性が高いことから、本発明の特定の配列を参酌し、シスエレメントデータベースを用いて電子計算機によるサーチを行うと、シスエレメント候補はたくさん出てくる。どれが実際に機能しているかの判断は、バイオインフォーマティクス技術により行うことができるものと考えられる。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
実 施 例
（実施例１：イネカタラーゼＣａｔＢ遺伝子の単離）
イネカタラーゼＣａｔＢ遺伝子の単離方法は、「イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター」（平成１１年７月特許登録２９５５６４４）に記載されている。簡潔には以下のとおりである。
（ゲノミックライブラリーからのスクリーニング）
ＣａｔＡｃＤＮＡの一部を、ＣａｔＢ遺伝子のクローニングに用いた。ＣａｔＡｃＤＮＡのクローニングの過程で得られた不完全長ｃＤＮＡ（全長約１．８ｋｂｐのうち、５’非翻訳領域及び若干のコード領域の合計約４５０ｂｐを欠損する３’末端側の１．３５ｋｂｐ）を含むラムダファージ（クローン＃５１）のインサート部分をＰＣＲで増幅した。同ファージよりＤＮＡを調製してこれをテンプレートとし、プライマーとしてλｇｔｌ１−Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ及びλｇｔｌ１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（東洋紡）を用いた。生成物をセントリコン−１００（ａｍｉｃｏｎ）で精製し、濃度を２５ｎｇ／１０μｌにして、マルチプライムラベル法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプローブとした。
米国クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したイネのゲノミックＤＮＡライブラリー（ＲＩＣＥ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ）を用いて、ＣａｔＢ遺伝子をスクリーニングした。ゲノミックライブラリーを構成するファージλＥＭＢＬ−３を常法に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５３８株に感染させ、ファージプラークを形成させた。このファージプラークをナイロンメンブレンに移し、下記の標準的条件で上記プローブとハイブリダイズさせた。なお、プローブは、３２Ｐで標識した。
ハイブリダイズ溶液：６ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：６５℃；ハイブリダイズ時間：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ。
次に、メンブレンを、以下の比較的緩い条件で洗浄した。洗浄条件：２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ室温５分プラス３０分；１ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６８℃、１時間。
洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブリダイズしたクローンを検出した。ハイブリダイズすることが確認されたファージからそれぞれＤＮＡを調製した。
上記ファージのＤＮＡをＳａｌ ＩとＳｃａ Ｉの制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。分離したＤＮＡ断片をナイロンメンブレンに移して、上述のＣａｔＡｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。ハイブリダイズの条件は上記と同じであり、メンブレン洗浄は以下の条件で行った。洗浄条件：２ｘ ＳＳＣ室温５−１０分 ２回；２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６５℃、３０分。
洗浄後、当該分野で周知の常法に従って、ナイロンメンブレンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を検出した。
シグナルの強さとバンドのパターンがほぼ同一の、従って同じ構造を持つと推定される一群のクローンと、バンドのパターンが一部しか一致しないクローンとがある。前者のシグナルの強さとバンドのパターンがほぼ一致するクローンはＣａｔＡ遺伝子に対応すると考えられた。実際、Ｎｏ．７４のクローンは、ＣａｔＡｃＤＮＡに対応する遺伝子であった。他方、後者のバンドのパターンが一部しか一致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の欠損クローン、あるいはＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ遺伝子のクローンである可能性がある。そこで、ＣａｔＡｃＤＮＡをプローブとして用いて、下記のような緩い条件と厳しい条件でのハイブリダイゼーションを行って、パターンを比較した。
緩いハイブリダイズ条件：５０％ フォルムアミドを添加した、６ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：３７℃；ハイブリダイズ時間：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ。
メンブレン洗浄条件は上記と同じであり、２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ室温５分プラス３０分；１ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６８℃、１時間であった。
ストリンジェントハイブリダイズの条件：５０％ フォルムアミドを添加した、６ｘ ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：４２℃；ハイブリダイズ時間：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ。
メンブレン洗浄条件は、２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ室温５分プラス３０分；１ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６８℃、１時間であった。
ストリンジェント条件でのハイブリダイズの結果、標準的ハイブリダイズのパターンと同じ数のバンドが検出された。他方、緩い条件のハイブリダイズでは、厳しい条件のハイブリのパターンよりも多数のバンドを示した。これらの結果から、バンドのパターンが一部しか一致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の欠損クローンではなく、ＣａｔＡに似てはいるが、塩基配列が異なる部分を持つＤＮＡ、すなわちＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ遺伝子である可能性が高いことが判った。
約２０個の、バンドのパターンが一部しか一致しないクローンを、カタラーゼアイソザイム遺伝子候補としてさらに解析した。この内のＮｏ．７クローンは、詳細なサザン分析、部分塩基配列の解析、ＣａｔＡ塩基配列に基づくＰＣＲ分析などから、ＣａｔＡとは異なるカタラーゼ遺伝子であると結論した。また、ＣａｔＢｃＤＮＡとも異なる配列であることがわかり、ＣａｔＣと命名された。ＣａｔＣの塩基配列は、日本農芸化学会誌６８、４０４（１９９４）に記載される。
ＣａｔＡともＮｏ．７クローン（ＣａｔＣ）とも異なるパターンを示すクローンがあり、その中からＮｏ．６クローンをさらに詳細に解析した。Ｎｏ．６クローンのＤＮＡについては、部分的に塩基配列も解析した。この配列は、ＣａｔＢ遺伝子のｃＤＮＡ配列（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９４）１０５：１０１５−１０１６）と一致した。
これらの情報を基に、ＣａｔＢ遺伝子の５’非翻訳領域を得るために二つのＤＮＡオリゴマーを合成した。
他方、イネカルスから、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。このｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡをテンプレートとし、上記二つの合成ＤＮＡをプライマーとして、標準的条件でＰＣＲを行った。約４００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この４００ｂｐ ＤＮＡ断片をプローブとして用い、上記ＣａｔＢ遺伝子と思われるクローン群を再度スクリーニングし、ハイブリダイスする数個のクローンを得た。
この中の、上記Ｎｏ．６クローンは、ＰＣＲ増幅した４００ｂｐの上流に、約１ｋｂｐ以上の５’上流域を持ち、且つ全長が約５ｋｂｐ以上であることがわかった。このクローンをクローンＵ６と命名した。クローンＵ６の制限酵素地図を作製した（示さず）。
クローンＵ６から、５’上流域を約１ｋｂｐ含む断片（Ｓａｌ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ消化断片）とその下流の断片（Ｅｃｏ ＲＩ−Ｅｃｏ ＲＩ消化断片）を切り出し、シーケンス解析用のベクター（ｐＵＣ１８）に挿入し、５’側から及び３’側からの段階的欠損プラスミドを多数作成し、塩基配列決定を行った。そのうち、ＣａｔＢの核酸配列（４９８５ｂｐ）は配列番号２に示される。
（実施例２：ＣａｔＢΔ０（−１０６６〜＋２９８）−ＧＵＳ／ｐＢＩ１２１の構築）
ＣａｔＢΔ０（−１０６６〜＋２９８）−ＧＵＳ／ｐＢＩ１２１の構築は、「イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター」（特許２９５５６４４号）に記載されるように行った。簡潔には以下のとおりである。
得られたＣａｔＢ遺伝子は、４９８５ｂｐであった。そして、配列番号２の１０７３番目から１２１６番目に第１エクソン、１３３３番目から１４２９番目に第２エクソン、２３４１番目から２６１８番目に第３エクソン、２９７０番目から３７４６番目に第４エクソン、３９６８番目から４０５７番目に第５エクソン、４２５２番目から４３１９番目に第６エクソン、４４１０番目から４５０３番目に第７エクソン、および４６１６番目から４８８１番目に第８エクソンが存在すること、および、それぞれのエクソンの間に、第１から第７イントロンが存在することがわかった。上記配列から、プロモーター領域は、１０７３番目より前の配列と推定された。この配列情報に基づいて、プロモーター領域を切り出すことができる。イネＣａｔＢ遺伝子プロモーターを有するプラスミド、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−Δ０の作製は以下のとおりである。
クローンＵ６をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、２．３Ｋｂｐの断片を切り出した。この断片を、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ１８に連結した。得られた組換えプラスミドを、Ｅｃｏ４７Ｉ（東洋紡（株）製）で消化し、約２ｋｂｐの断片を回収した。この断片をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で消化し、ついで、ＰｓｔＩで消化した。クローンＵ６の７番目から１３７０番目までの配列（配列番号２）を有する断片Ａが得られた。この断片Ａには、第１エクソンの上流側の配列、第１エクソン、第１イントロン、および、第２エクソンの一部が含まれていた。断片Ａの５’末端側は、ＰｓｔＩ部位であり、３’末端は平滑末端である。
植物細胞用発現ベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、β−グルクウロナーゼ（ＧＵＳ）コーディング領域およびノパリンシンセターゼのターミネーター（ＮＯＳ・Ｔ）を有している。このｐＢＩ２２１を、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩで消化し、ＰｓｔＩ−ＳｍａＩ大断片Ｂを回収する。この大断片Ｂは、ｐＢＩ２２１から、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター領域が削除されている断片である。この大断片Ｂと、上記クローンＵ６の７番目から１３７０番目までの配列を有する断片Ａとを連結させ、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−Δ０を作製した。
（イネ細胞の形質転換とＧＵＳ遺伝子の発現）
３００ｍｌのフラスコに、以下の組成のＡＡ培地を７０ｍｌ入れ、イネＯｃ細胞を、緩やかに攪拌（９０ｒｐｍ）しながら、２８℃で、懸濁培養した。
ＡＡ培地の組成（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６１：６７−７６（１９７８））
１）無機塩 濃度（ｍｇ／ｌ）
ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ １０
Ｈ３ＢＯ３ ３
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２５
ＣｕＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０２５
ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ０．０２５
Ｋｌ ０．７５
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １５０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５０
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １５０
ＫＣｌ ３，０００
２）鉄分 Ｆｅ−ＥＤＴＡ ４０
３）ビタミン・有機物
蔗糖 ２０，０００
ニコチン酸１塩酸チアミン １０
塩酸ピリドキシン １
ｍｙｏ−イノシトール １００
Ｌ−アルギニン １７７
Ｌ−グリシン ７．５
Ｌ−グルタミン ９００
Ｌ−アスパラギン酸 ３００
４）ホルモン酸
２，４−Ｄ １
カイネチン ０．２
ＧＡ３ ０．１
１週間毎に、１０ｍｌの培養物を７０ｍｌの新鮮な培地に移した。移してから５日目の細胞を用いて、プロトプラストを作製した。プロトプラストの作製は、Ｍｏｌ Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ ２０６：４０８−４１３（１９８７）に記載の方法に従った。継代後５日目のカルス細胞サスペンジョンを直径１０ｃｍプラスチックシャーレに移し、アスピレーターで培地を除いて酵素液（４％ セルラーゼＲＳ（ヤクルト）、１％ マセロザイムＲ１０（ヤクルト）、０．４Ｍ マンニトール、０．５％ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．５％ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）２０ｍｌを加えた。パラフィルムをして２８℃の暗所に静置した。約５時間後にナイロンメッシュで濾過して未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返した。
得られたプロトプラストをＥＰ緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ ＭＥＳ、０．４Ｍ マンニトール、蒸留水を加えてｐＨ５．６とし、フィルターで滅菌する：Ｎａｔｕｒｅ３３８：２７４−２７６（１９８９））に懸濁し、その一部（０．５ｍｌ）をとり、上記プラスミドＤＮＡ２０μｇ／ｍｌおよびキャリアＤＮＡとしてのサケ精子ＤＮＡ３０μｇ／ｍｌと混合した。次に、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）を用いて，電極間距離０．４ｃｍのディスポーサブルキュベット中で、５００μＦのキャパシタンスおよび１００Ωの抵抗で、３００Ｖ／ｃｍでエレクトロポレーションした。氷上で１０分インキュベートした後、プロトプラストに１．５ｍｌのＲ２Ｐ培養液を添加してＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＣＡ）に入れ、これを５ｍｌのＲ２Ｐ培地（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４：１１１３−１１２１（１９７３））を含む６ｃｍプラスチックディシュに入れる。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌの外側にナースセルを添加し、２８℃、暗条件で培養した。なお、ナースセルの有無は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−Δ０、およびＣａｔＣ−ＧＵＳ−Δ０の発現には影響を及ぼさなかった。
Ｒ２Ｐ培地の組成
（１）主要成分（ｍｇ／ｌ）
ＫＮＯ３ ４０００
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３３５
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５０
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １５０
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ２７３
（２）マイナー成分（ｍｇ／ｍｌ）
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ １．６
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１２５
Ｈ３ＢＯ３ ３．０
ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１２５
Ｎａ２ＥＤＴＡ ７．５
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５．５
（３）有機成分（ｍｇ／ｍｌ）
イノシトール １００
ニコチン酸 １．０
ピリドキシン塩酸 １．０
チアミン塩酸 １０
蔗糖（ｇ／ｌ） １３７
２，４−Ｄ（ｍｇ／ｌ） ２．０
ｐＨ５．６
ＧＵＳ活性用のプロトプラストの処理は、基本的には、ラボマニュアル：植物遺伝子の機能解析（岩淵雅樹・志村令郎編、丸善、１９９２）ｐ．５５の記述に従って行った。エレクトロポレーション処理後、４日間、２８℃、暗所にて培養したプロトプラストを、１ｍｌファルコン・ピペット（＃７５２１）で１．５ｍｌマイクロチューブにとり、室温で９，０００ｒｐｍ、３分間遠心し、ペレットを分析まで−８０度の保存した。
ペレットに２００μｌの抽出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｌａｕｒｙｌ Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）を加え、氷水中で５分、凍結したペレットを融解した。超音波処理装置（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ ２５０）を用いて、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ２、Ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ １０％の条件で、１分間処理した。処理後、１５，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離した。上清（プロトプラスト抽出液）をとり、ＧＵＳ活性測定用のサンプルとした。サンプル中のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ ７２：２４８−２５４（１９７６））で決定した。
ＧＵＳ活性は、上記のＪｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法に従った。内在性のＧＵＳ活性は、反応液に２０％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを加えることにより最少にした。実験結果は、少なくとも２回の実験の結果であり、それぞれの実験には、同一試料について３つのサンプル（トリプリケート）が含まれていた。
これらの結果、ＣａｔＢ遺伝子プロモーターは、コントロールであるＣａＭＶ、ＣａｔＡおよびＣａｔＣのプロモーターに比べて、非常に高い活性を示していた（示さず）。
（実施例３：ＰＣＲ法による開始コドンの塩基改変とＣａｔＢの５’上流ＤＮＡ断片（Ｂ１断片、Ｂ２断片）の作成とプラスミド構築）
ＰＣＲ法により開始コドンに点変異を導入させたイネ・カタラーゼ遺伝子ＣａｔＢの５’上流ＤＮＡ断片（Ｂ１断片、Ｂ２断片）を作成した。Ｂ１断片（−３２９〜＋２９８、ｃＤＮＡ開始点を＋１とする）はＣａｔＢΔ０（−１０６６〜＋２９８）−ＧＵＳ／ｐＢＩ１２１をテンプレートとし、プライマー３Ｄ３−Ｆ１（５’−ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＡＧ−３’（配列番号８）、ＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）およびＢＤ３−ＭＲ（５’−ＧＴＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＧＴ ＧＧＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＧ−３’（配列番号９）、ＣａｔＢの開始コドンＡＴＧのＴをＣに置換するプライマー）、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅させた。
Ｂ２断片（−２２６〜＋２９８）は、プライマー３Ｄ３−Ｆ２（５’−ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＴＴＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＧＴ ＧＡＴ ＣＣ−３’（配列番号１０）、ＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）とＢＤ３−ＭＲを用いて増幅させた。
増幅させたＤＮＡ断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理したベクターＣａｔＢΔ０−ＧＵＳ／ｐＢＩ２２１のＧＵＳ遺伝子の上流に組み込み、形質転換用の大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５ａｌｐｈａ（東洋紡績）に導入した。大腸菌から精製したベクターは塩基配列を決定して確認した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理してＢ１断片もしくはＢ２断片とＧＵＳ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）（ＮＯＳ−ｔｅｒ）を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理したバイナリーベクターｐＴＮ２（ＦｕｋｕｏｋａらＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：８１５−８２０（２０００））に組み込んだ。
（実施例５：植物への遺伝子導入）
ｐＴＮ２のイネ（品種；日本晴）への導入は、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４））、Ｔｏｋｉ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７））の方法に従って、アグロバクテリウム（ＥＨＡ１０５）を用いて行った。
ｐＴＮ２のアラビドプシス（品種；Ｃｏｌｕｍｂｉａ）への導入は、「モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；減圧湿潤法による形質転換（荒木崇）ｐｐ．１０９−１１３（監修 島本功、岡田清孝）に記載の方法をもとに、一部改変した方法で行った。
（実施例６：植物のＧＵＳ組織染色法）
ＧＵＳ活性の観察は、「植物の細胞を観る実験プロトコール：遺伝子発現から細胞内構造・機能まで」；細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ６２−３；細胞レベルでＧＵＳ活性を観る方法（高橋美佐、森川弘道）ｐｐ．７１−７９（監修 福田裕穂、西村幹夫、中村研三）に記載の方法をもとに一部改変した方法で行った。
▲１▼Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液［１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ，０．３ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．３ｍＭ フェロシアン化カリウム、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００］を調製する。
▲２▼Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液５００μＬを２４穴タイタープレートの各ウエルに分注する。
▲３▼イネおよびアラビドプシスの各組織あるいは切片をウエルに入れ、２８℃、１６時間処理する。
▲４▼Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液を除去し、７０％エタノールを加えて脱色する。
▲５▼７０％エタノールを除去し、組織・切片を５０％グリセロール溶液に浸す。
▲６▼顕微鏡あるいは実体顕微鏡で観察する。
（結果）
形質転換植物では個体間で発現の器官特異性の程度にばらつきがあるが、Ｂ１：：ＧＵＳコンストラクト（図１のＢ１）を導入したイネ再分化当代の約半数でレポーター遺伝子が根で強く発現していた。一方形質転換アラビドプシスでは、Ｂ１：：ＧＵＳコンストラクト（図１のＢ１）を導入したアラビドプシスＴ２世代の多くでレポーター遺伝子が根と茎頂で強く発現していた。。
産 業 上 の 利 用 可 能 性
このプロモーターを利用して、線虫または土壌病原体に対する抵抗性物質を根で合成させたり、根の発達を促進する物資を根で合成させたり、あるいは遺伝子組換え植物の作成時に、再分化植物体の選抜マーカーの発現を幼植物の根に限定し成熟時の発現を抑制することなどが可能になる。また茎頂の発現能力を利用して、増殖の盛んな細胞の遺伝子発現を制御する技術の開発にも利用しうる。
本発明のＣａｔＢ遺伝子プロモーター領域の一部の塩基配列を用いれば、外来遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位で発現させることができる。従ってこのプロモーターを用いて、根および茎頂の少なくとも１つの部位で合成されるタンパク質または細胞外に分泌される物質を利用した遺伝子操作による植物（例えば、イネ等）の品種改良のための根および茎頂の少なくとも１つの部位に特異的なプロモーターの開発に有用である。
例えば、このプロモーターを利用して、線虫または土壌病原体に対する抵抗性物質を根で合成させたり、根の発達を促進する物資を根で合成させたり、あるいは遺伝子組換え植物の作成時に、再分化植物体の選抜マーカーの発現を根に限定し成熟時の発現を抑制することなどが可能になる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、実験に用いた各種ＤＮＡの構築物（コンストラクト）である。
図２は、Ｂ１（＝ＣａｔＢＤ１−ＧＵＳ／ｐＴＮ２）およびＢ２（＝ＣａｔＢＤ２−ＧＵＳ／ｐＴＮ２）の作成方法である。
図３は、Ｂ１を導入したイネ（Ｔｏ、再分化当代）の幼植物のＧＵＳ染色写真である。
図４は、Ｂ１を導入したアラビドプシス（Ｔ２世代）の幼植物のＧＵＳ染色写真である（（ａ）暗い背景；（ｂ）明るい背景）。
図５は、ＣａｔＢプロモーター領域を示す。
本発明は、植物に外来遺伝子を導入して根および／または茎頂で発現させるプロモーターに関する。さらに詳しくは、イネのカタラーゼ遺伝子Ｂ（以下、ＣａｔＢという）のプロモーター領域の一部を用いて根および／または茎頂で外来遺伝子を発現させる方法に関する。
背 景 技 術
根は植物が倒れないように支える役目のほかに、水および養分の吸収という大きな役目を果たしている。根は分枝することにより表面積を広げて吸収できる面積を大きくしている。物質を吸収しやすいように有機酸を分泌して、リンまたは鉄などと結合させてリンまたは鉄を吸収する機能もある。根の先端が土の中を伸びるのを助けるように潤滑油のような物質を合成して分泌する機能もある。根には植物ホルモンを合成し貯蔵する役目もある。根には光合成で得たエネルギーを蓄えたり、あるいは若いときにリンを蓄えてその後転流させたりするなどの機能がある。動物のように動くことができない植物は、環境から多くのストレスを受けており、多くの対抗策を持っており、特に根も多くの対抗策を備えている。
これらの根の機能に関連して、イネでは、サイクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｙｌｌｉｎ；Ｃｙｐ）遺伝子（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８３７−８４３（１９９４））、リピッドトランスファータンパク質（ＬＴＰ）遺伝子（Ｖｉｇｎｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６：２６５−２７０（１９９４））、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ−ＺＢ８遺伝子（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：５３５−５５０（１９９５））、ヒストンＨ３遺伝子（Ｔｅｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：１７−２６（１９９５））、塩基性キチナーゼ（ＲＣ２４）遺伝子（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：３８７−４０１（１９９６））、カレオシン（ｃａｌｅｏｓｉｎ）遺伝子（Ｎａｅｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：４６３−４７６（２０００））などの遺伝子が根で発現することが既に知られている。
イネ以外では、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の延長因子ｅＥＦ１Ａ遺伝子（Ｔｒｅｍｏｕｓａｙｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ ２０：５５３−５６１（１９９９）、ミロシナーゼ（ｍｙｒｏｓｉｎａｓｅ）遺伝子Ｐｙｋ１０（Ｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６１：３３７−３４６（２００１））、鉄トランスポーター（ＩＲＴ２）遺伝子Ｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ ２６：１８１−１８９（２００１））など、タバコのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子（Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２：６７９−６８８（２０００））、硝酸還元酵素（ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（Ｈａｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５２：１２５１−１２５８（２００１））など、また亜麻（ｆｌａｘ）のペクチンメチルエステラーゼ（Ｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６０：７１３−７２１（２００１））などが既に根で発現する遺伝子として知られている。
茎頂とは栄養成長期にある茎の先端およびその近傍部を指す。高等植物では、新しく細胞をつくり出す分裂機能を持つ。茎頂で発現する遺伝子としては例えば以下の遺伝子が知られている。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）では、リピッドトランスファータンパク質（Ｉｔｐ１）遺伝子（Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：５１３−５２４（１９９６））、ホメオボックス（ＮＴＨ１５）遺伝子（Ｔａｍａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３８：９１７−９２７（１９９７））、ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ３ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ遺伝子（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２０：１５−２４（１９９９））、アラビドプシスではｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１４：１２１５−１２２４（１９９７））、ＥＲＥＣＴＡ遺伝子（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：３０１−３１０（１９９８））、ＡＴＭＬ１遺伝子（Ｓｅｓｓｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２０：２５９−２６３（１９９９））、ＦＡＤ３遺伝子（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，２１３：８３３−８４０（２００１））である。これらの遺伝子の発現の組織特異性はそのプロモーターによって規定されていることが、これらの研究によって明らかになっている。
最近になって、バイオテクノロジーを利用した方法として、根で発現するプロモーターに根の発達、耐病性または耐ストレス性を助ける機能を持つ遺伝子をつなげて植物に導入する方法が有望視されている。
根で外来遺伝子を発現させるために植物ウイルスの遺伝子のプロモーターを利用する試みもある（例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅ ａｎｄ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６７：２９−３５（２０００）；Ｍａｚｉｔｈｕｌｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５５：２１−２９（２０００））が、ウイルスは感染後に拡散するので、遺伝子発現部位を細胞レベルで限定するには、植物遺伝子由来のプロモーターの方が優れている。
根で発現する遺伝子のプロモーターはトウモロコシなどで数種類が知られている。組換えＤＮＡ技術による耐病性付与の例として、線虫抵抗性付与の例（米国特許６，２８４，９４８：Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）においては、線虫抵抗性の遺伝子を植物ユビキチン遺伝子のプロモーターで発現させているが、このユビキチンプロモーターは器官特異性が低く、恒常的に発現する。
根特異的プロモーターの例としては、米国特許第６，２７１，４３７号：Ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（大豆遺伝子プロモーター）があるが、これは大豆のシスト線虫抵抗性遺伝子のプロモーターを、根での外来遺伝子発現に用いるために使用する方法である。また、根特異的プロモーターの例としては、米国出願２００１／００１６９５４：Ｒｏｏｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（根特異的プロモーター）がある。この例では、アラビドプシス由来のｂ１−チューブリン遺伝子のプロモーター、リボソームタンパク質ＲＰＬ１６Ａ遺伝子のプロモーター、ＡＲＳＫ１遺伝子のプロモーター、およびエンドウ豆のメタロチオネイン様遺伝子のプロモーターが含まれている。これらのプロモーターも利用法として、線虫に対する抵抗性の付与が記載されている。
これらのプロモーターの活性は、一般的に実用に用いられるには低い、イネ等の穀類を含む単子葉植物では機能しない、あるいは器官特異性が低い等の問題点がある。
従って、穀類の各発生段階に機能するプロモーターを多数単離し、それぞれの特徴を明らかにした上で、異なる組織特異性および高い活性を持ったプロモーターカセットを作成すれば、イネ等の作物の品種改良に非常に有用である。
（発明が解決しようとする課題）
本発明の課題は、根および／または茎頂で高い活性を有する植物用プロモーターを提供することにある。より詳細には、本発明は、従来のプロモーターの活性が有する問題点（一般的に実用に用いられるには低い、イネ等の穀類を含む単子葉植物では機能しない、あるいは器官特異性が低い等）を克服し、実用的なプロモーターを提供することを課題とする。
発 明 の 要 旨
（課題を解決するための手段）
上記課題は、本発明は、イネのカタラーゼＢ（ＣａｔＢ）遺伝子のプロモーター領域の一部の塩基配列を用いることによって、外来遺伝子を根で発現させることができることを見いだして完成されたものである。
本発明は、以下を提供する。
１． 配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
２． 項目１に記載のプロモーターであって、該プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
３． 項目１に記載のプロモーターであって、該プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
４．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための組成物であって、該組成物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、組成物。
５． 項目４に記載の組成物であって、前記プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、組成物。
６． 項目４に記載の組成物であって、前記プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、組成物。
７．前記植物は、単子葉植物または双子葉植物である、項目４に記載の組成物。
８．前記植物は、単子葉植物である、項目４に記載の組成物。
９．前記植物は、イネ、アラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、トマト、キュウリ、ナス、ジャガイモ、レタス、ダイコンまたはニンジンである、項目４に記載の組成物。
１０．前記所望の遺伝子は、抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子である、項目４に記載の組成物。
１１．前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、根端部を含む、項目４に記載の組成物。
１２．前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、単子葉植物の幼生植物の分裂組織領域を含む、項目４に記載の組成物。
１３．前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、茎頂部を含む、項目４に記載の組成物。
１４．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための植物発現カセットであって、該カセットは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物発現カセット。
１５．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるためのプラスミドであって、該プラスミドは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含し、ここで、該プロモーターは、該所望の遺伝子に作動可能に連結される、プラスミド。
１６．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物細胞であって、該植物細胞は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物細胞。
１７．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物組織であって、該植物組織は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物組織。
１８．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、トランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、トランスジェニック植物。
１９．所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物種子であって、該植物種子は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物種子。
２０．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を該植物に提供する工程；
２）該植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）該植物を該プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する、方法。
２１．植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法によって得られる遺伝子産物であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を該植物に提供する工程；
２）該植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）該植物を該プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する、
遺伝子産物。
２２．根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現するように改変された植物を生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターを含むプラスミドを提供する工程；
２）該プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および
３）該形質転換された植物細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
上記項目１４〜２２は、項目５〜１３の特徴事項で特定され得る。
発 明 の 詳 細 な 説 明
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（配列の説明）
配列番号１は、ＣａｔＢのプロモーター領域の核酸配列（１３６４ｂｐ）（ｃＤＮＡの開始点を＋１として−１０６６〜＋２９８；図５を参照）を示す。
配列番号２は、ＣａｔＢ遺伝子の核酸配列（４９８５ｂｐ）を示す。
配列番号３は、ＢΔ３断片（８６６ｂｐ）を示す。
配列番号４は、Ｂ１断片（６２７ｂｐ）を示す。１〜６位は、ＣａｔＢカタラーゼ遺伝子塩基配列中のＡＡＡＡＡＡをＡＡＧＣＴＴに変換し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を作成した。４６０位は、ＴをＣに置換し、ＣａｔＢカタラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンを壊した。
配列番号５は、Ｂ２断片（５２４ｂｐ）を示す。１〜６位は、ＣａｔＢカタラーゼ遺伝子塩基配列中のＡＡＡＡＡＡをＡＡＧＣＴＴに変換し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を作成した。３５７位は、ＴをＣに置換して、ＣａｔＢＣａｔＢカタラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンを壊した。
配列番号６は、ＣａｔＢ ｃＤＮＡの１０２−１３１に相当する配列である。
配列番号７は、ＣａｔＢ ｃＤＮＡの４８４−４５５に相当する配列である。
配列番号８は、本明細書の１実施形態で使用されるプライマー３Ｄ３−Ｆ１である。
配列番号９は、本明細書の１実施形態で使用されるプライマー３Ｄ３−Ｆ２である。
配列番号１０は、本明細書の１実施形態で使用されるプライマーＢＤ３−ＭＲである。
配列番号１１は、ＣａｔＢ遺伝子の−３２９〜＋２９８のプロモーター領域を示す。
配列番号１２は、ＣａｔＢ遺伝子の−３２９〜−２２７のプロモーター領域を示す。
（用語の定義）
本明細書において使用される「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める遺伝エレメントまたは因子をいう。本明細書において、「プロモーター領域」とは、ある構造遺伝子配列付近の領域であって、プロモーター活性を有する領域をいう。プロモーター領域は、遺伝子の転写が開始される際にＲＮＡポリメラーゼが結合する通常遺伝子上流の塩基配列で特定される領域である。本明細書において、ある因子が「プロモーター活性」を有するとは、その因子がＲＮＡポリメラーゼなどに作用し、転写が開始する活性をいう。
本明細書において用いられる「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
本明細書において使用される「根および茎頂の少なくとも１つの部位」は、根および茎頂からなる部位群の少なくとも１つの部位を指す。従って、「根および茎頂の少なくとも１つの部位」には、根の一部または茎頂の一部が包含される。「根および茎頂の少なくとも１つの部位」にはまた、分裂組織も含まれる。
本明細書において使用される「分裂組織（メリステム、ｍｅｒｉｓｔｅｍ）」とは、分化細胞からなる植物の形成組織で，分化して他の分裂細胞または特殊な型の細胞をつくる能力をもつ部位をいう。分裂組織は主に、生長部分にみられる。分裂組織としては、生長点（ｇｒｏｗｔｈ ｐｏｉｎｔ）、茎頂（シュート頂；ｓｈｏｏｔ ａｐｅｘ）、根端（ｒｏｏｔ ａｐｅｘ，ｒｏｏｔ ｔｉｐ）、根端分裂組織（ｒｏｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ）、頂端分裂組織（ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ）などが挙げられる。
本明細書において使用される「根」（ｒｏｏｔ）とは、地下部にあり，体支持と水吸収をする器官をいう。先端は根冠（ｒｏｏｔ ｃａｐ）といい、内部は表皮にかこまれて中心柱という。中心柱の中に導管と篩管が通る。根端の少し後方に表皮細胞の一部が突起した根毛がある。根毛およびその付近の細胞の表皮細胞で水分吸収が盛んであるが、根毛の寿命は数日から数週間で、根は常に伸長するので，その位置は常に前進する。本明細書では、根全体を根系（ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ）ともいう。例えば、イネでは，種子根は１本の鞘葉節以上の節から不定根が各節あたり約５〜２０本出る。節から出る根を冠根という。根は上位節で多く出る。上位節から１次、２次の分枝根が出る。根は、最長１ｍ程度になる。根は分裂組織を含む。
本明細書において使用される「茎頂」とは、シュート頂とも呼ばれ、茎の頂端分裂組織とその周辺の部位をいう。茎頂には、茎および側生的に葉を形成する栄養期茎頂と花序または花を形成する生殖期茎頂とがある。茎頂は分裂組織を含む。茎頂は、栄養成長期にある茎の先端及びその近傍部を指す。高等植物では、新しく細胞をつくり出す分裂機能を持つ。
本明細書において使用される「カタラーゼ」とは、過酸化水素を分解する反応を触媒する酵素をいう（ＥＣ１．１１．１．６）。カタラーゼはまた、Ｈ２Ｏ２，ＣＨ３ＯＯＨ，Ｃ２Ｈ５ＯＯＨの存在で、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＮＯ２などを酸化し得る。動物、植物、微生物を問わず好気的細胞にはすべて存在し、動物では肝臓、腎臓、赤血球に特に多い。ウシの肝臓のカタラーゼは分子量約２３万で，酵素１分子に作用基として４個のプロトヘマチンが含まれている。植物では、本発明者らが単離したカタラーゼＢなどがある。
本明細書において、核酸分子の「断片」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、少なくともプローブまたはプライマーとしての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。ある核酸分子の断片を、それが由来した元の核酸分子に対する選択的プローブまたは選択的プライマーとして使用するためには、特異的にハイブリダイズし得る断片である必要がある。本明細書においてあるＤＮＡが「特異的にハイブリダイズ」するとは、提供された核酸分子を互いに区別して検出または増幅し得ることをいう。選択的プローブには、代表的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも３０、４０または５０ヌクレオチド長であり得、５０を超えるヌクレオチド長も使用され得る。選択的プローブは、選択的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物として入手され得る。１対のプライマーの少なくとも一方に、選択的プライマーをＰＣＲに使用する場合、選択的プライマーは、代表的には少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０または５０ヌクレオチド長であり得る。
本明細書において、核酸分子の「ホモログ」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明のプロモーターについていう場合、「ホモログ」とは、プロモーター配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その発現特性（例えば、部位特異性、時期特異性、ストレス応答性など）が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
従って、本発明のプロモーター配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本発明のプロモーターと同一または類似の活性を有し得る。そのような活性は、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、またはＧＦＰの遺伝子をレポーター遺伝子として使うアッセイ、生化学的あるいは細胞組織学的な検定により確認することができる。そのようなアッセイは、当該分野における周知慣用技術に属することから（Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５：３８７（１９８７）；Ｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６（１９８６）；Ｓｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：７７７−７８４（１９９５））、当業者は何ら困難を伴わずに、本発明の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子が本発明のプロモーターと同一または類似のあるいは実質的に同等以上の活性を有することを確認することができる。本明細書では、上記アッセイにおいて、検出誤差範囲内で同じプロモーター活性を有することが判定されたときに実質的に同等以上のプロモーター活性を有するという。
本発明のプロモーターの長さは、通常１０ヌクレオチド以上であるが、好ましくは、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、６０ヌクレオチド以上、７０ヌクレオチド以上、８０ヌクレオチド以上、９０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、１５０ヌクレオチド以上、２００ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上の長さであり得る。
本発明のプロモーターは、従来のプロモーター（例えば、ミニマムプロモーター（３５Ｓプロモーター由来の約８０塩基対からなるプロモーター（Ｈａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：８５９−８７６（１９９５）；Ｒｏｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：４３５−４４０（１９９８）；Ｗａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：１−１２（１９９９））など）につなげて利用することができる。この場合、従来組織特異性を示さないまたは弱い特異性を示す、あるいは別の特異性を示すプロモーターであっても、本発明のプロモーターまたはその断片を付加することによって、根および／または茎頂に組織特異的に強く機能するプロモーターを作製することができる（Ｈａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：８５９−８７６（１９９５）；Ｒｏｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：４３５−４４０（１９９８）；Ｗａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：１−１２（１９９９））。
本発明のプロモーターは、単子葉植物だけでなく双子葉植物および他の生物の改変にも利用し得る。これは、両植物間で転写調節の基本的な機構が類似していることにより説明される。例えばトウモロコシのｚｅｉｎ遺伝子プロモーターがタバコで同じ組織特性で発現すること（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７：１２４９−１２５５（１９８８））、イネのグルテリン遺伝子プロモーターがタバコで同じ組織特性で発現すること（Ｌｅｉｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：４１−５０（１９８９））が報告されている。特に好ましい対象植物としては、イネのほか、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ソルガム、カンキツ類、白菜、レタス、タバコ、モモ、ジャガイモ、トマト、およびリンゴなどが挙げられる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等が例示される。
ベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、以下を用いた形質転換などが挙げられる：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。
本発明のプロモーターによる発現の「検出または定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンプロット法、ドットプロット法またはＰＣＲ法等が例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等が例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法等が例示される。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、本発明のタンパク質またはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンプロット法、ドットプロット法、ＰＣＲ法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。発現量の絶対量または相対量を観察することにより、あるプロモーターが特異的に作用しているかどうかを検出することができる。
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。
本明細書において発現される「遺伝子」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、遺伝形質を規定する因子をいう。本発明の方法において発現される、所望の遺伝子は特異的に発現させることが所望される遺伝子であればなんでもよいが、例としては、例えば、線虫または土壌病原体などに対する抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーなどが挙げられる。
本明細書において「再分化する」とは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、細胞および葉または根などの組織片から植物体が形成される。
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；＿Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などが挙げられる。従って、当業者は、上記周知方法を目的とするトランスジェニック植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。
再分化した形質転換体が、所望の改変された特性を有することは、当該特性の種類に応じて適切なアッセイを行うことにより確認し得る。例えば、レポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子とプロモーターとを融合し、植物体に導入して形質転換体を作出し、ＧＵＳ活性の組織染色で検出することが可能である。ここでは、蛍光タンパク質であるＧＦＰの遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として使うことも可能である。これらはいずれも各種プロモーターのアッセイに使われている。詳細は下記実施例に記載される。また、ストレス耐性として病原性細菌に対する耐性の付与が意図される場合、再分化した植物体にモデル菌、例えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ）を接種し、コントロールの植物体と比較して接種による変化の有無を観察することで、特性の変化を評価し得る。
本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、およびアラビドプシスの栽培法（丹羽康夫）ｐｐ．３３−４０（監修 島本功、岡田清孝）に例示されており、本明細書では詳述しない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで４０〜５０粒の種子が得られ、播種後２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。種子の休眠期間は短く、完熟種子は１週間程度乾燥させれば吸水後２〜３日で発芽する。ただし、吸水・播種後２〜４日間４℃で低温処理を行うと発芽が斉一化される。
（発明を実施する最良の形態）
１つの局面において、本発明は、配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸配列に関する。この配列は、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。好ましくは、この核酸配列は、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み得る。
より好ましくは、本発明は、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。この核酸分子は、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。この核酸分子は、分裂組織を含む根での発現を特異的に促進させるプロモーター活性を有する。本発明者の知る限りこのようなプロモーター活性を付与する配列は特に、イネでもアラビドプシスでもこれまで見い出されていないことから、本発明は、当該分野において顕著な効果を奏することを達成したといえる。
上述の特定の配列の範囲は、本発明において１つの好ましい配列範囲を示すものであり、本発明はそれらに限定されないことを付言しておく。従って、本発明は、本明細書に記載される方法に従って、当業者が選択した他に適切な領域に特定することも可能である。そのような選択方法は本明細書の他の記載または当該分野において周知慣用技術を参酌することにより過度な実験を要することなく実施することができる。
別の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための組成物を提供する。この組成物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する。上述のように１）のプロモーターは、根および茎頂の少なくとも１つの部位で特異的な発現を促進させることから、このような組成物は根および茎頂の少なくとも１つの部位で特異的に発現する系を提供するという当該分野において顕著な有用性を提供する。
１つの実施形態において、上記プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。
別の実施形態において、上記プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有し得る。別の実施形態において、上記植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得るが、生物は、単子葉植物または双子葉植物に限定されることはない。従って、本発明のプロモーターが同様な効果を奏する限り、生物は、動物などの植物以外の生物、または単子葉植物および双子葉植物以外の植物であり得る。好ましい実施形態において、上記植物は、単子葉植物であり得る。より好ましくは、上記植物は、イネ、アラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、トマト、キュウリ、ナス、ジャガイモ、レタス、ダイコンまたはニンジンであり得る。
別の好ましい実施形態において、本発明のプロモーターの長さは、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、６０ヌクレオチド以上、７０ヌクレオチド以上、８０ヌクレオチド以上、９０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、１５０ヌクレオチド以上、２００ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上の長さであり得る。
別の実施形態において、本発明のプロモーターは、他のプロモーターにつなげて提供され得る。この場合、従来組織特異性を示さないまたは弱い特異性を示す、あるいは別の特異性を示すプロモーターであっても、本発明のプロモーターまたはその断片を付加することによって、根および茎頂の少なくとも１つの部位に組織特異的に強く機能するプロモーターを作製することができる
別の実施形態において、上記所望の遺伝子は、例えば、線虫または土壌病原体に対する抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。
別の実施形態において、上記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、根端部を含み得る。別の実施形態において、上記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、茎頂部を含み得る。根および茎頂の少なくとも１つの部位は、単子葉植物（例えば、イネ）の幼生植物の分裂組織を含み得る。幼生植物のみでの発現を促進することによって、作物（例えば、イネ）では導入した遺伝子産物が発現または残留しない植物を作製することができる。
他の局面において、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための植物発現カセットを提供する。このカセットは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含し得る。植物発現カセットは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。そのような作製方法は、本明細書の実施例においても例示されている。
他の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるためのプラスミドを提供する。このプラスミドは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。ここで、上記プロモーターは、上記所望の遺伝子に作動可能に連結される。このようなプラスミド（またはベクター）を作製する方法は当該分野において周知慣用であり、本明細書の実施例にも例示されている。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物細胞を提供する。この植物細胞は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。そのような植物細胞を作製する方法は当該分野で周知であり、例えば、本発明のプラスミドを用いた形質転換、トランスフェクション、形質導入などによって実施することができる。そのような方法は、本明細書においても上記に具体的に記載し、かつ、実施例においても例示されている。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物組織を提供する。この植物組織は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。植物組織は、例えば、本発明の植物細胞から再分化することにより作出することができる。あるいは、植物組織に直接本発明の組成物を注入することによって作製することも可能である。そのような方法は、当該分野において周知である。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、トランスジェニック植物を提供する。このトランスジェニック植物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。トランスジェニック植物は、例えば、本発明の植物細胞を再分化することによって作出することができる。そのような再分化方法は、当該分野において周知であり、例えば、タバコやアラビドプシス等の双子葉植物については、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；＿Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；＿Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；イネについては、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４）；Ｔｏｋｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７）など。）などが挙げられる。
他の局面において、本発明は、所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物種子を提供する。この植物種子は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）上記所望の遺伝子、
を包含する。このような植物種子は、上記トランスジェニック植物を稔性を保つようにして再分化することによって作出することができる。そのような再分化方法は、当該分野において周知であり、例えば、タバコやアラビドプシス等の双子葉植物については、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；イネについては、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４）；Ｔｏｋｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７）など。）などが挙げられる。
他の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法を提供する。この方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を上記植物に提供する工程；
２）上記植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）上記植物を上記プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する。このような方法は、本発明のプロモーターさえ特定されれば、当業者に周知慣用の技術を用いて行うことができる。そのような発現方法は、本明細書において上述した。
他の局面において、本発明は、植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法によって得られる遺伝子産物を提供する。ここで、上記方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を上記植物に提供する工程；
２）上記植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）上記植物を上記プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する。根および茎頂の少なくとも１つの部位は、新生の盛んな組織であることから、この方法によって所望の遺伝子が多量に得られる。
他の局面において、本発明は、根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現するように改変された植物を生産する方法を提供する。この方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターを含むプラスミドを提供する工程；
２）上記プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および
３）上記形質転換された植物細胞を培養する工程、
を包含する。プラスミドを提供する方法、形質転換する方法、および培養する方法は当該分野において周知であり、本明細書においてすでに説明した。
既に本発明者らは、イネ・カタラーゼＣａｔＢ遺伝子を単離して構造解析した（ＤＤＢＪ登録番号Ｄ６４０１３）。さらに、その５’上流のプロモーター領域（ｃＤＮＡ開始点を＋１として、−１０６６から＋２９８：本文ではこのＤＮＡ断片をＢΔ０と呼ぶ）をレポーター遺伝子（ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ））と融合し、イネの培養細胞系統（Ｏｃ細胞）から調製したプロトプラストにエレクトロポレーションで導入して一過性遺伝子発現によるＧＵＳ酵素活性を指標にしてプロモーター活性を測定したところ、植物の遺伝子導入によく使用されるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの約２０倍の活性を示すことを見いだした。これにより、本プロモーターが有用遺伝子の発現のためのプロモーターカセットの作出に利用できることを明らかにして発明を完成し、特許出願した（特許第２９５５６４４号「イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター」）。
さらに本発明者らは、ノーザンハイブリダイゼーション分析により、ＣａｔＢはイネ幼植物の根で強く発現しているが、成熟個体の根では発現がしないこと、葉、茎、花では強い発現はないことを明らかにした（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５１：３９−４６（２０００））（表１）。
具体的には、ＣａｔＢ遺伝子プロモーター領域ＢΔ０を５’側から欠損して作成した各種ＤＮＡ断片にレポーター遺伝子（ＧＵＳ）を融合してベクターに組み込み（図１、２）、イネおよびアラビドプシスに導入して形質転換し、再分化当代あるいは後代の植物の各組織をＧＵＳ組織染色して発現部位を調べた。
その結果、ｃＤＮＡ開始点（＋１）の上流−３２９から＋２９８までの短いプロモーターＤＮＡ断片（Ｂ１）でもイネの幼植物の根（図３、表２、３）、およびアラビドプシスの幼植物の根および茎頂（図４、表４）でのレポーター遺伝子の発現を可能にすることを明らかにした。
イネ幼植物の根における発現の特異性はプロモーター領域を５‘側から欠損すると減少し、その順は高い方から、ＢΔ０（７１％）＝ＢΔ３（７５％）＞Ｂ１（４８％）＞Ｂ２（１９％）である（表２）。プロモーター領域は長い方が発現特異性は強いが、Ｂ１でも再分化個体の集団からから望ましい個体を選抜すれば，特異的発現をしている植物体を得ることができるので、目的に応じてＢΔ０、ＢΔ３あるいはＢ１の中から選ぶことができる。
−３２９から−２２７を欠損したプロモーター（Ｂ２）では、イネおよびアラビドプシスの根での発現は大きく減少するので（表２、４）、この−３２９から−２２７の領域は根での発現に必要である。この領域には、根での発現に関与する既知のシスエレメントは存在しないので、新規のシスエレメントがある可能性が高い。
この結果から先に特許出願したイネ・カタラーゼＣａｔＢ遺伝子由来の１，３６４塩基のプロモーター領域のうち、約６３０塩基の長さまでの各配列を用いることによって、イネ等の単子葉およびアラビドプシスなどの双子葉において、幼植物の根および茎頂で外来遺伝子を発現させることを可能にする方法が開発された。
一般的にプロモーター塩基配列は保存度が低く、数百塩基のプロモーター塩基配列を用いてのスクリーニングで類似した活性を持つプロモーターを検出するのは容易ではない。プロモーター領域の中の、転写調節因子（タンパク質）が結合するサイト（シスエレメント）は保存性が高いことから、本発明の特定の配列を参酌し、シスエレメントデータベースを用いて電子計算機によるサーチを行うと、シスエレメント候補はたくさん出てくる。どれが実際に機能しているかの判断は、バイオインフォーマティクス技術により行うことができるものと考えられる。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
実 施 例
（実施例１：イネカタラーゼＣａｔＢ遺伝子の単離）
イネカタラーゼＣａｔＢ遺伝子の単離方法は、「イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター」（平成１１年７月特許登録２９５５６４４）に記載されている。簡潔には以下のとおりである。
（ゲノミックライブラリーからのスクリーニング）
ＣａｔＡｃＤＮＡの一部を、ＣａｔＢ遺伝子のクローニングに用いた。ＣａｔＡｃＤＮＡのクローニングの過程で得られた不完全長ｃＤＮＡ（全長約１．８ｋｂｐのうち、５’非翻訳領域及び若干のコード領域の合計約４５０ｂｐを欠損する３’末端側の１．３５ｋｂｐ）を含むラムダファージ（クローン＃５１）のインサート部分をＰＣＲで増幅した。同ファージよりＤＮＡを調製してこれをテンプレートとし、プライマーとしてλｇｔｌ１−Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ及びλｇｔｌ１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（東洋紡）を用いた。生成物をセントリコン−１００（ａｍｉｃｏｎ）で精製し、濃度を２５ｎｇ／１０μｌにして、マルチプライムラベル法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプローブとした。
米国クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したイネのゲノミックＤＮＡライブラリー（ＲＩＣＥ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ）を用いて、ＣａｔＢ遺伝子をスクリーニングした。ゲノミックライブラリーを構成するファージλＥＭＢＬ−３を常法に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５３８株に感染させ、ファージプラークを形成させた。このファージプラークをナイロンメンブレンに移し、下記の標準的条件で上記プローブとハイブリダイズさせた。なお、プローブは、３２Ｐで標識した。
ハイブリダイズ溶液：６ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：６５℃；ハイブリダイズ時間：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ。
次に、メンブレンを、以下の比較的緩い条件で洗浄した。洗浄条件：２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ室温５分プラス３０分；１ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６８℃、１時間。
洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブリダイズしたクローンを検出した。ハイブリダイズすることが確認されたファージからそれぞれＤＮＡを調製した。
上記ファージのＤＮＡをＳａｌ ＩとＳｃａ Ｉの制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。分離したＤＮＡ断片をナイロンメンブレンに移して、上述のＣａｔＡｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。ハイブリダイズの条件は上記と同じであり、メンブレン洗浄は以下の条件で行った。洗浄条件：２ｘ ＳＳＣ室温５−１０分 ２回；２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６５℃、３０分。
洗浄後、当該分野で周知の常法に従って、ナイロンメンブレンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を検出した。
シグナルの強さとバンドのパターンがほぼ同一の、従って同じ構造を持つと推定される一群のクローンと、バンドのパターンが一部しか一致しないクローンとがある。前者のシグナルの強さとバンドのパターンがほぼ一致するクローンはＣａｔＡ遺伝子に対応すると考えられた。実際、Ｎｏ．７４のクローンは、ＣａｔＡｃＤＮＡに対応する遺伝子であった。他方、後者のバンドのパターンが一部しか一致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の欠損クローン、あるいはＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ遺伝子のクローンである可能性がある。そこで、ＣａｔＡｃＤＮＡをプローブとして用いて、下記のような緩い条件と厳しい条件でのハイブリダイゼーションを行って、パターンを比較した。
緩いハイブリダイズ条件：５０％ フォルムアミドを添加した、６ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：３７℃；ハイブリダイズ時間：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ。
メンブレン洗浄条件は上記と同じであり、２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ室温５分プラス３０分；１ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６８℃、１時間であった。
ストリンジェントハイブリダイズの条件：５０％ フォルムアミドを添加した、６ｘ ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：４２℃；ハイブリダイズ時間：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ。
メンブレン洗浄条件は、２ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ室温５分プラス３０分；１ｘ ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ ６８℃、１時間であった。
ストリンジェント条件でのハイブリダイズの結果、標準的ハイブリダイズのパターンと同じ数のバンドが検出された。他方、緩い条件のハイブリダイズでは、厳しい条件のハイブリのパターンよりも多数のバンドを示した。これらの結果から、バンドのパターンが一部しか一致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の欠損クローンではなく、ＣａｔＡに似てはいるが、塩基配列が異なる部分を持つＤＮＡ、すなわちＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ遺伝子である可能性が高いことが判った。
約２０個の、バンドのパターンが一部しか一致しないクローンを、カタラーゼアイソザイム遺伝子候補としてさらに解析した。この内のＮｏ．７クローンは、詳細なサザン分析、部分塩基配列の解析、ＣａｔＡ塩基配列に基づくＰＣＲ分析などから、ＣａｔＡとは異なるカタラーゼ遺伝子であると結論した。また、ＣａｔＢｃＤＮＡとも異なる配列であることがわかり、ＣａｔＣと命名された。ＣａｔＣの塩基配列は、日本農芸化学会誌６８、４０４（１９９４）に記載される。
ＣａｔＡともＮｏ．７クローン（ＣａｔＣ）とも異なるパターンを示すクローンがあり、その中からＮｏ．６クローンをさらに詳細に解析した。Ｎｏ．６クローンのＤＮＡについては、部分的に塩基配列も解析した。この配列は、ＣａｔＢ遺伝子のｃＤＮＡ配列（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９４）１０５：１０１５−１０１６）と一致した。
これらの情報を基に、ＣａｔＢ遺伝子の５’非翻訳領域を得るために二つのＤＮＡオリゴマーを合成した。
この中の、上記Ｎｏ．６クローンは、ＰＣＲ増幅した４００ｂｐの上流に、約１ｋｂｐ以上の５’上流域を持ち、且つ全長が約５ｋｂｐ以上であることがわかった。このクローンをクローンＵ６と命名した。クローンＵ６の制限酵素地図を作製した（示さず）。
クローンＵ６から、５’上流域を約１ｋｂｐ含む断片（Ｓａｌ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ消化断片）とその下流の断片（Ｅｃｏ ＲＩ−Ｅｃｏ ＲＩ消化断片）を切り出し、シーケンス解析用のベクター（ｐＵＣ１８）に挿入し、５’側から及び３’側からの段階的欠損プラスミドを多数作成し、塩基配列決定を行った。そのうち、ＣａｔＢの核酸配列（４９８５ｂｐ）は配列番号２に示される。
（実施例２：ＣａｔＢΔ０（−１０６６〜＋２９８）−ＧＵＳ／ｐＢＩ１２１の構築）
ＣａｔＢΔ０（−１０６６〜＋２９８）−ＧＵＳ／ｐＢＩ１２１の構築は、「イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター」（特許２９５５６４４号）に記載されるように行った。簡潔には以下のとおりである。
得られたＣａｔＢ遺伝子は、４９８５ｂｐであった。そして、配列番号２の１０７３番目から１２１６番目に第１エクソン、１３３３番目から１４２９番目に第２エクソン、２３４１番目から２６１８番目に第３エクソン、２９７０番目から３７４６番目に第４エクソン、３９６８番目から４０５７番目に第５エクソン、４２５２番目から４３１９番目に第６エクソン、４４１０番目から４５０３番目に第７エクソン、および４６１６番目から４８８１番目に第８エクソンが存在すること、および、それぞれのエクソンの間に、第１から第７イントロンが存在することがわかった。上記配列から、プロモーター領域は、１０７３番目より前の配列と推定された。この配列情報に基づいて、プロモーター領域を切り出すことができる。イネＣａｔＢ遺伝子プロモーターを有するプラスミド、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−Δ０の作製は以下のとおりである。
クローンＵ６をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、２．３Ｋｂｐの断片を切り出した。この断片を、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ１８に連結した。得られた組換えプラスミドを、Ｅｃｏ４７Ｉ（東洋紡（株）製）で消化し、約２ｋｂｐの断片を回収した。この断片をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で消化し、ついで、ＰｓｔＩで消化した。クローンＵ６の７番目から１３７０番目までの配列（配列番号２）を有する断片Ａが得られた。この断片Ａには、第１エクソンの上流側の配列、第１エクソン、第１イントロン、および、第２エクソンの一部が含まれていた。断片Ａの５’末端側は、ＰｓｔＩ部位であり、３’末端は平滑末端である。
植物細胞用発現ベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、β−グルクウロナーゼ（ＧＵＳ）コーディング領域およびノパリンシンセターゼのターミネーター（ＮＯＳ・Ｔ）を有している。このｐＢＩ２２１を、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩで消化し、ＰｓｔＩ−ＳｍａＩ大断片Ｂを回収する。この大断片Ｂは、ｐＢＩ２２１から、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター領域が削除されている断片である。この大断片Ｂと、上記クローンＵ６の７番目から１３７０番目までの配列を有する断片Ａとを連結させ、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−Δ０を作製した。
（イネ細胞の形質転換とＧＵＳ遺伝子の発現）
３００ｍｌのフラスコに、以下の組成のＡＡ培地を７０ｍｌ入れ、イネＯｃ細胞を、緩やかに攪拌（９０ｒｐｍ）しながら、２８℃で、懸濁培養した。
ＡＡ培地の組成（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６１：６７−７６（１９７８））
１）無機塩 濃度（ｍｇ／ｌ）
ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ １０
Ｈ３ＢＯ３ ３
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２５
ＣｕＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０２５
ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ０．０２５
Ｋｌ ０．７５
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １５０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５０
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １５０
ＫＣｌ ３，０００
２）鉄分 Ｆｅ−ＥＤＴＡ ４０
３）ビタミン・有機物
蔗糖 ２０，０００
ニコチン酸１塩酸チアミン １０
塩酸ピリドキシン １
ｍｙｏ−イノシトール １００
Ｌ−アルギニン １７７
Ｌ−グリシン ７．５
Ｌ−グルタミン ９００
Ｌ−アスパラギン酸 ３００
４）ホルモン酸
２，４−Ｄ １
カイネチン ０．２
ＧＡ３ ０．１
１週間毎に、１０ｍｌの培養物を７０ｍｌの新鮮な培地に移した。移してから５日目の細胞を用いて、プロトプラストを作製した。プロトプラストの作製は、Ｍｏｌ Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ ２０６：４０８−４１３（１９８７）に記載の方法に従った。継代後５日目のカルス細胞サスペンジョンを直径１０ｃｍプラスチックシャーレに移し、アスピレーターで培地を除いて酵素液（４％ セルラーゼＲＳ（ヤクルト）、１％ マセロザイムＲ１０（ヤクルト）、０．４Ｍ マンニトール、０．５％ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．５％ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）２０ｍｌを加えた。パラフィルムをして２８℃の暗所に静置した。約５時間後にナイロンメッシュで濾過して未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返した。
得られたプロトプラストをＥＰ緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ ＭＥＳ、０．４Ｍ マンニトール、蒸留水を加えてｐＨ５．６とし、フィルターで滅菌する：Ｎａｔｕｒｅ３３８：２７４−２７６（１９８９））に懸濁し、その一部（０．５ｍｌ）をとり、上記プラスミドＤＮＡ２０μｇ／ｍｌおよびキャリアＤＮＡとしてのサケ精子ＤＮＡ３０μｇ／ｍｌと混合した。次に、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）を用いて，電極間距離０．４ｃｍのディスポーサブルキュベット中で、５００μＦのキャパシタンスおよび１００Ωの抵抗で、３００Ｖ／ｃｍでエレクトロポレーションした。氷上で１０分インキュベートした後、プロトプラストに１．５ｍｌのＲ２Ｐ培養液を添加してＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＣＡ）に入れ、これを５ｍｌのＲ２Ｐ培地（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４：１１１３−１１２１（１９７３））を含む６ｃｍプラスチックディシュに入れる。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌの外側にナースセルを添加し、２８℃、暗条件で培養した。なお、ナースセルの有無は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−Δ０、およびＣａｔＣ−ＧＵＳ−Δ０の発現には影響を及ぼさなかった。
Ｒ２Ｐ培地の組成
（１）主要成分（ｍｇ／ｌ）
ＫＮＯ３ ４０００
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３３５
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５０
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １５０
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ２７３
（２）マイナー成分（ｍｇ／ｍｌ）
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ １．６
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１２５
Ｈ３ＢＯ３ ３．０
ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１２５
Ｎａ２ＥＤＴＡ ７．５
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５．５
（３）有機成分（ｍｇ／ｍｌ）
イノシトール １００
ニコチン酸 １．０
ピリドキシン塩酸 １．０
チアミン塩酸 １０
蔗糖（ｇ／ｌ） １３７
２，４−Ｄ（ｍｇ／ｌ） ２．０
ｐＨ５．６
ＧＵＳ活性用のプロトプラストの処理は、基本的には、ラボマニュアル：植物遺伝子の機能解析（岩淵雅樹・志村令郎編、丸善、１９９２）ｐ．５５の記述に従って行った。エレクトロポレーション処理後、４日間、２８℃、暗所にて培養したプロトプラストを、１ｍｌファルコン・ピペット（＃７５２１）で１．５ｍｌマイクロチューブにとり、室温で９，０００ｒｐｍ、３分間遠心し、ペレットを分析まで−８０度の保存した。
ペレットに２００μｌの抽出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｌａｕｒｙｌ Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）を加え、氷水中で５分、凍結したペレットを融解した。超音波処理装置（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ ２５０）を用いて、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ２、Ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ １０％の条件で、１分間処理した。処理後、１５，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離した。上清（プロトプラスト抽出液）をとり、ＧＵＳ活性測定用のサンプルとした。サンプル中のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ ７２：２４８−２５４（１９７６））で決定した。
ＧＵＳ活性は、上記のＪｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法に従った。内在性のＧＵＳ活性は、反応液に２０％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを加えることにより最少にした。実験結果は、少なくとも２回の実験の結果であり、それぞれの実験には、同一試料について３つのサンプル（トリプリケート）が含まれていた。
これらの結果、ＣａｔＢ遺伝子プロモーターは、コントロールであるＣａＭＶ、ＣａｔＡおよびＣａｔＣのプロモーターに比べて、非常に高い活性を示していた（示さず）。
（実施例３：ＰＣＲ法による開始コドンの塩基改変とＣａｔＢの５’上流ＤＮＡ断片（Ｂ１断片、Ｂ２断片）の作成とプラスミド構築）
ＰＣＲ法により開始コドンに点変異を導入させたイネ・カタラーゼ遺伝子ＣａｔＢの５’上流ＤＮＡ断片（Ｂ１断片、Ｂ２断片）を作成した。Ｂ１断片（−３２９〜＋２９８、ｃＤＮＡ開始点を＋１とする）はＣａｔＢΔ０（−１０６６〜＋２９８）−ＧＵＳ／ｐＢＩ１２１をテンプレートとし、プライマー３Ｄ３−Ｆ１（５’−ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＡＧ−３’（配列番号８）、ＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）およびＢＤ３−ＭＲ（５’−ＧＴＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＧＴ ＧＧＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＧ−３’（配列番号９）、ＣａｔＢの開始コドンＡＴＧのＴをＣに置換するプライマー）、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅させた。
Ｂ２断片（−２２６〜＋２９８）は、プライマー３Ｄ３−Ｆ２（５’−ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＴＴＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＧＴ ＧＡＴ ＣＣ−３’（配列番号１０）、ＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）とＢＤ３−ＭＲを用いて増幅させた。
増幅させたＤＮＡ断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理したベクターＣａｔＢΔ０−ＧＵＳ／ｐＢＩ２２１のＧＵＳ遺伝子の上流に組み込み、形質転換用の大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５ａｌｐｈａ（東洋紡績）に導入した。大腸菌から精製したベクターは塩基配列を決定して確認した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理してＢ１断片もしくはＢ２断片とＧＵＳ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）（ＮＯＳ−ｔｅｒ）を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理したバイナリーベクターｐＴＮ２（ＦｕｋｕｏｋａらＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：８１５−８２０（２０００））に組み込んだ。
（実施例５：植物への遺伝子導入）
ｐＴＮ２のイネ（品種；日本晴）への導入は、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４））、Ｔｏｋｉ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７））の方法に従って、アグロバクテリウム（ＥＨＡ１０５）を用いて行った。
ｐＴＮ２のアラビドプシス（品種；Ｃｏｌｕｍｂｉａ）への導入は、「モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；減圧湿潤法による形質転換（荒木崇）ｐｐ．１０９−１１３（監修 島本功、岡田清孝）に記載の方法をもとに、一部改変した方法で行った。
（実施例６：植物のＧＵＳ組織染色法）
ＧＵＳ活性の観察は、「植物の細胞を観る実験プロトコール：遺伝子発現から細胞内構造・機能まで」；細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ６２−３；細胞レベルでＧＵＳ活性を観る方法（高橋美佐、森川弘道）ｐｐ．７１−７９（監修 福田裕穂、西村幹夫、中村研三）に記載の方法をもとに一部改変した方法で行った。
▲１▼Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液［１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ，０．３ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．３ｍＭ フェロシアン化カリウム、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００］を調製する。
▲２▼Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液５００μＬを２４穴タイタープレートの各ウエルに分注する。
▲３▼イネおよびアラビドプシスの各組織あるいは切片をウエルに入れ、２８℃、１６時間処理する。
▲４▼Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液を除去し、７０％エタノールを加えて脱色する。
▲５▼７０％エタノールを除去し、組織・切片を５０％グリセロール溶液に浸す。
▲６▼顕微鏡あるいは実体顕微鏡で観察する。
（結果）
形質転換植物では個体間で発現の器官特異性の程度にばらつきがあるが、Ｂ１：：ＧＵＳコンストラクト（図１のＢ１）を導入したイネ再分化当代の約半数でレポーター遺伝子が根で強く発現していた。一方形質転換アラビドプシスでは、Ｂ１：：ＧＵＳコンストラクト（図１のＢ１）を導入したアラビドプシスＴ２世代の多くでレポーター遺伝子が根と茎頂で強く発現していた。。
産 業 上 の 利 用 可 能 性
このプロモーターを利用して、線虫または土壌病原体に対する抵抗性物質を根で合成させたり、根の発達を促進する物資を根で合成させたり、あるいは遺伝子組換え植物の作成時に、再分化植物体の選抜マーカーの発現を幼植物の根に限定し成熟時の発現を抑制することなどが可能になる。また茎頂の発現能力を利用して、増殖の盛んな細胞の遺伝子発現を制御する技術の開発にも利用しうる。
本発明のＣａｔＢ遺伝子プロモーター領域の一部の塩基配列を用いれば、外来遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位で発現させることができる。従ってこのプロモーターを用いて、根および茎頂の少なくとも１つの部位で合成されるタンパク質または細胞外に分泌される物質を利用した遺伝子操作による植物（例えば、イネ等）の品種改良のための根および茎頂の少なくとも１つの部位に特異的なプロモーターの開発に有用である。
例えば、このプロモーターを利用して、線虫または土壌病原体に対する抵抗性物質を根で合成させたり、根の発達を促進する物資を根で合成させたり、あるいは遺伝子組換え植物の作成時に、再分化植物体の選抜マーカーの発現を根に限定し成熟時の発現を抑制することなどが可能になる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、実験に用いた各種ＤＮＡの構築物（コンストラクト）である。
図２は、Ｂ１（＝ＣａｔＢＤ１−ＧＵＳ／ｐＴＮ２）およびＢ２（＝ＣａｔＢＤ２−ＧＵＳ／ｐＴＮ２）の作成方法である。
図３は、Ｂ１を導入したイネ（Ｔｏ、再分化当代）の幼植物のＧＵＳ染色写真である。
図４は、Ｂ１を導入したアラビドプシス（Ｔ２世代）の幼植物のＧＵＳ染色写真である（（ａ）暗い背景；（ｂ）明るい背景）。
図５は、ＣａｔＢプロモーター領域を示す。
Claims (22)
- 配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
- 請求項１に記載のプロモーターであって、該プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
- 請求項１に記載のプロモーターであって、該プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター。
- 植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための組成物であって、該組成物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、組成物。 - 請求項４に記載の組成物であって、前記プロモーターは、配列番号１１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、組成物。
- 請求項４に記載の組成物であって、前記プロモーターは、配列番号１２に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、組成物。
- 前記植物は、単子葉植物または双子葉植物である、請求項４に記載の組成物。
- 前記植物は、単子葉植物である、請求項４に記載の組成物。
- 前記植物は、イネ、アラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、トマト、キュウリ、ナス、ジャガイモ、レタス、ダイコンまたはニンジンである、請求項４に記載の組成物。
- 前記所望の遺伝子は、抵抗性付与ポリペプチドおよび根の発達を促進するポリペプチドおよび再分化植物体の選抜マーカーからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項４に記載の組成物。
- 前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、根端部を含む、請求項４に記載の組成物。
- 前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、単子葉植物の幼生植物の分裂組織領域を含む、請求項４に記載の組成物。
- 前記根および茎頂の少なくとも１つの部位は、茎頂部を含む、請求項４に記載の組成物。
- 植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるための植物発現カセットであって、該カセットは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物発現カセット。 - 植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させるためのプラスミドであって、該プラスミドは、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含し、ここで、該プロモーターは、該所望の遺伝子に作動可能に連結される、プラスミド。 - 所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物細胞であって、該植物細胞は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物細胞。 - 所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物組織であって、該植物組織は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物組織。 - 所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、トランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、トランスジェニック植物。 - 所望の遺伝子を根および茎頂の少なくとも１つの部位において発現するように改変された、植物種子であって、該植物種子は、
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーター；および
２）該所望の遺伝子、
を包含する、植物種子。 - 植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を該植物に提供する工程；
２）該植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）該植物を該プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する、方法。 - 植物の根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現させる方法によって得られる遺伝子産物であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターをコードする核酸を該植物に提供する工程；
２）該植物に所望の遺伝子をコードする核酸を提供する工程；および
３）該植物を該プロモーターが作動する条件下に置く工程、
を包含する、
遺伝子産物。 - 根および茎頂の少なくとも１つの部位で所望の遺伝子を発現するように改変された植物を生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
１）配列番号１に記載の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含み、配列番号１で示される配列と実質的に同等以上のプロモーター活性を有する、プロモーターを含むプラスミドを提供する工程；
２）該プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および
３）該形質転換された植物細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
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