ES2279524T3 - Promotor de un gen especifico de la corteza radicular. - Google Patents
Promotor de un gen especifico de la corteza radicular. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBE UNA MOLECULA DE ADN AISLADA QUE INCLUYE UNA SECUENCIA PROMOTORA DE ADN QUE DIRIGE LA TRANSCRIPCION ESPECIFICA DEL CORTEX DE RAIZ DE UN SEGMENTO DE ADN HETEROLOGO CORRIENTE ABAJO EN UNA CELULA VEGETAL. UN CONSTRUCTO DE ADN INCLUYE UN MODULO DE EXPRESION QUE INCLUYE, EN LA DIRECCION 5 A 3 , UN PROMOTOR DE LA PRESENTE INVENCION Y UN SEGMENTO DE ADN HETEROLOGO COLOCADO CORRIENTE ABAJO DEL PROMOTOR Y ASOCIADO DE FORMA OPERATIVA A ESTE. SE DESCRIBEN PLANTAS TRANSFORMADAS, TALES COMO PLANTAS DE TABACO, QUE INCLUYEN CELULAS VEGETALES TRANSFORMADAS QUE CONTIENEN UN CONSTRUCTO DE ADN HETEROLOGO QUE INCLUYE UN MODULO DE EXPRESION COMO SE HA DESCRITO ANTERIORMENTE.
Description
Promotor de un gen específico de la corteza
radicular.
Esta invención se refiere a promotores de genes
específicos de tejido y, especialmente, se refiere a un promotor
que se activa en la corteza radicular de las plantas.
Un promotor es una secuencia de ADN que flanquea
un gen transcrito y al cual debe unirse la ARN polimerasa si ésta
tiene que transcribir a ARN mensajero al gen al que flanquea. Un
promotor puede estar formado por varios elementos reguladores
diferentes que afectan a un gen estructural, asociado de forma
operativa con el promotor de diferentes formas. Por ejemplo, un gen
regulador puede potenciar o reprimir la expresión de un gen
estructural asociado, someter a ese gen a regulación durante el
desarrollo o contribuir a la regulación específica de tejido de ese
gen. Las modificaciones de los promotores pueden posibilitar
patrones opcionales de expresión génica, usando procedimientos de
ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Old y Primrose,
Principles of Gene Manipulation (4ª edición, 1989).
Un ejemplo de un promotor vegetal es el promotor
que se encuentra flanqueando el gen de la subunidad pequeña de la
ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa en
Petunia. Véase la Patente de EE.UU. Nº 4.962.028. Otro
ejemplo es el promotor que comprende la región flanqueante 5' del
gen Em de trigo. Véase la Solicitud EPO Nº 335.528. Incluso otro
ejemplo es el elemento regulador inducible por estrés descrito en la
Solicitud EPO Nº 0.330.479.
A pesar de su importante papel en el desarrollo
de la planta, se han realizado relativamente pocos trabajos sobre
la regulación de la expresión génica en raíces. En parte, la
deficiencia es el resultado de una escasez de funciones bioquímicas
específicas de la raíz fácilmente identificables, cuyos genes puedan
clonarse y estudiarse fácilmente. Evans y col., Mol. Gen.
Genet. 214, 153-157 (1988), intentaron
sin éxito aislar clones de ADNc específico de la raíz a partir del
guisante, y concluyeron que las especies de ARNm específico de raíz
(si existen) están sólo presentes a muy baja cantidad en la
población de ARNm de la raíz. Fuller y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80, 2594-2598 (1983), han clonado y
caracterizado varios genes específicos de nódulo radicular. Las
comparaciones de las secuencias 5' de ADN del inicio de la
transcripción revelan un octanucleótido repetido presente en los
tres genes examinados. Desafortunadamente, la falta de sistemas de
transformación/regeneración eficaces en la mayoría de
Leguminaceae ha dificultado el análisis funcional de estas
secuencias que actúan en cis. Bogusz y col., Nature
331, 178-180 (1988), aislaron un gen de
hemoglobina expresado específicamente en raíces de plantas no
noduladas por su homología con el gen de la hemoglobina de especies
noduladas estrechamente relacionadas. Keller y Lamb, Genes &
Dev. 3, 1639-1646 (1989), aislaron un gen
que codificaba un glucoproteína rica en hidroxiprolina de la pared
celular expresada durante el inicio de la raíz lateral. Lerner y
Raikhel, Plant Physiol. 91, 124-129
(1989), describieron recientemente la clonación y caracterización de
una lectina específica de la raíz de cebada.
Muchos patógenos y plagas de plantas dañan las
raíces de la planta, causando graves daños y pérdidas en la
cosecha. El tejido radicular que se daña con más frecuencia es la
corteza radicular, una capa compuesta principalmente de parénquima
de almacenamiento que queda bajo la capa epidérmica y rodea el
cilindro vascular central de la raíz. La corteza radicular puede
contener adicionalmente esclerénquima, células secretoras, conductos
de resina y otras estructuras y tipos celulares. Las células de la
corteza radicular muestran semejanzas morfológicas y de desarrollo
con las células corticales del brote aéreo.
Para transmitir características útiles a plantas
mediante la expresión de genes extraños usando técnicas de
ingeniería genética, serán necesarios diversos promotores
específicos de tejido para permitir que se expresen de forma
selectiva nuevas características en los tejidos apropiados de la
planta. La presente invención se basa en nuestras investigaciones
continuadas en relación con este problema.
La presente invención se basa en la
identificación del promotor RD2 del tabaco (TobRD2), que dirige la
expresión específica de la corteza radicular de los genes
asociados. Un primer aspecto de la presente invención es una
molécula de ADN aislada que dirige la transcripción específica de la
corteza radicular de un segmento de ADN heterólogo después del
extremo 3' en una célula vegetal, teniendo la molécula de ADN
aislada una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por
(a) las SEQ NOs: 1-9 proporcionadas en este
documento y (b) las secuencias de ADN que hibridan con cualquiera
de las SEQ ID NOs: 1-9 en condiciones rigurosas y
que dirigen la transcripción específica de la corteza radicular de
un segmento de ADN heterólogo después del extremo 3' en una célula
vegetal.
La presente invención puede ser un casete de
expresión que consta de un promotor RD2 de tabaco y un segmento de
ADN heterólogo colocado antes del extremo 3' del promotor y asociado
con éste de forma operativa.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un casete de expresión que comprende un promotor y un segmento de
ADN heterólogo específicos de la corteza radicular, la secuencia del
promotor específico de la corteza radicular seleccionada entre las
SEQ ID NOs: 1-9 proporcionadas en este documento y
las secuencias de ADN que hibridan con cualquiera de las SEQ ID
NOs: 1-9 en condiciones rigurosas y que dirigen la
transcripción específica de la corteza radicular.
Aspectos adicionales de la presente invención
son células vegetales que contienen los casetes de expresión
descritos anteriormente, procedimientos para producir plantas
transformadas a partir de estas células vegetales y las plantas
transformadas que comprenden estas células vegetales
transformadas.
La Figura 1A muestra la localización in
situ de las transcripciones de RD2 del tabaco en un corte
transversal de la raíz de tabaco de una plántula de siete días.
La Figura 1B muestra la localización in
situ de las transcripciones de RD2 de tabaco en un corte
longitudinal de la raíz de tabaco de una plántula de siete
días.
La Figura 2 es una secuencia de 2.010 pares de
bases (SEQ ID NO: 1) de la región 5' de TobRD2.
La Figura 3 es un esquema que muestra las
construcciones de promotor TobRD2/glucuronidasa (GUS) usadas para
analizar la capacidad del promotor RD2 para dirigir la expresión
génica específica de la corteza radicular.
La Figura 4 es una gráfica de barras que resume
la actividad \beta-glucuronidasa (GUS) en las
raíces (barras rellenas), hojas (barras rayadas) y tallos (barras
punteadas) de plantas transformadas con las construcciones del gen
indicador quimérico, como se muestran en la Tabla 1. La gráfica
muestra la actividad entre las plantas transformadas con las
construcciones génicas utilizando diferentes promotores (CaMV35S;
\Delta2.00; \Delta1.50; \Delta1.40; \Delta1.25;
\Delta0.80; \Delta0.70; \Delta0.60; \Delta0.30) y utilizando
el vector pBI101.3 solo como control. La actividad GUS se midió en
pmoles de MU/\mug proteína/min.
La Figura 5A es una gráfica de barras que resume
la actividad \beta-glucuronidasa (GUS) relativa
en raíces y hojas de plantas de tabaco transformadas con
construcciones del gen indicador quimérico usando diferentes
promotores (CaMV35S; \Delta2.00; \Delta1.50; \Delta1.40;
\Delta1.25; \Delta0.80; \Delta0.70; \Delta0.60;
\Delta0.30) y utilizando el vector pBI101.3 solo como control,
como se muestra en la Tabla 1. La actividad GUS se midió en pmoles
de MU/\mug proteína/min y la actividad relativa mostrada es la
actividad en raíces/actividad en hojas.
La Figura 5B es una gráfica de barras que resume
la actividad \beta-glucuronidasa (GUS) relativa
en raíces y tallos de plantas transformadas con construcciones del
gen indicador quimérico usando diferentes promotores (CaMV35S;
\Delta2.00; \Delta1.50; \Delta1.40; \Delta1.25;
\Delta0.80; \Delta0.70; \Delta0.60; \Delta0.30) y
utilizando el vector pBI101.3 solo como control, como se muestra en
la Tabla 1. La actividad GUS se midió en pmoles de MU/\mug
proteína/min y la actividad relativa mostrada es la actividad en
raíces/actividad en tallos.
La Figura 6A es una micrografía que muestra la
localización histoquímica de la actividad GUS en un corte
transversal de la raíz de una planta de tabaco transformada con un
gen indicador (GUS) dirigido por el promotor \Delta2.0.
La Figura 6B es una micrografía que muestra la
localización histoquímica de la actividad GUS en la punta de una
raíz de una planta de tabaco transformada con un gen indicador (GUS)
dirigido por el promotor \Delta2.0.
Las secuencias de nucleótidos se presentan en
este documento sólo como cadenas sencillas, en la dirección 5' a
3', de izquierda a derecha. Los nucleótidos se representan en este
documento en la forma recomendada por la Comisión de Nomenclatura
Bioquímica de la IUPAC-IUB.
Las plantas transgénicas que expresan péptidos
que inhiben o matan una plaga o patógeno en particular proporcionan
un procedimiento para reducir daños y pérdidas en la cosecha. Por
ejemplo, la expresión de la proteína de Bacillus
thuringiensis en maíz transgénico proporciona resistencia al
barrenador europeo del maíz. Sin embargo, la expresión de
transgenes en todos los tejidos de una planta (expresión
constitutiva) es desventajosa ya que puede exponer a organismos no
diana a la proteína transgénica y, además, aumentar la presión
selectiva para el desarrollo de patógenos y plagas que son
resistentes a la proteína transgénica. Los altos niveles de
expresión del transgén en toda la planta también pueden afectar
negativamente al crecimiento y rendimiento de la planta. Una
estrategia alternativa es expresar un péptido tóxico sólo en el
órgano o tejido afectado por una plaga o patógeno en particular. La
implementación de esta estrategia contra plagas y patógenos que
atacan a las raíces de la planta se ha visto entorpecida por la
falta de promotores caracterizados específicos de la raíz.
La transcripción de un gen se inicia cuando se
forma un complejo estable entre la enzima ARN polimerasa y un
promotor génico. Los promotores se encuentran al inicio de todas las
unidades de transcripción, tienen aproximadamente 100 pares de
bases de longitud y se localizan inmediatamente antes del extremo 5'
sitio de inicio de la transcripción. Véase, por ejemplo, Maniatis y
col., Science 236:1238 (1987). Los promotores varían
en cuanto a su "potencia", es decir, en su capacidad para
iniciar la transcripción de forma segura y eficaz. Se piensa que la
holoenzima ARN polimerasa abarca una región de aproximadamente 50
bases inmediatamente antes del extremo 5' de la región transcrita.
En algunos casos la potencia de inicio de la transcripción puede
incrementarse mediante proteínas auxiliares que se unen a sitios
adyacentes a la región del promotor que está inmediatamente antes
del extremo 5' del ADN transcrito. Véase, por ejemplo, Singer
y Berg, Genes and Genomes, 140-145, University
Science Books, Mill Valley, CA (1991).
Ejemplos específicos de promotores específicos
de la corteza radicular de la presente invención son las moléculas
de ADN que tienen una secuencia que se corresponde con una
cualquiera de las mostradas en las SEQ ID NOs: 1-9,
todas las cuales se discuten con más detalle a continuación. Será
aparente que pueden prepararse otros fragmentos de secuencia de la
región que flanquea el extremo 5' de RD2 de tabaco, más largos o más
cortos que las secuencias mencionadas anteriores, o con menos
adiciones, deleciones o sustituciones realizadas en ellas, que
también lleven el promotor específico de la corteza radicular
TobRD2, todos los cuales se incluyen dentro de la presente
invención. Un aspecto adicional de la presente invención incluye los
promotores aislados de otros genes del tabaco, o de otras plantas
distintas al tabaco como se muestra más adelante, que son homólogos
al promotor RD2 del tabaco y que son capaces de dirigir la
transcripción específica de la corteza radicular de un segmento de
ADN heterólogo situado después del extremo 3' en una célula
vegetal.
Según se usa en este documento, un promotor
TobRD2 se refiere a una molécula de ADN que tiene una secuencia
idéntica, o sustancialmente homóloga, a un segmento continuo del ADN
que se encuentra en el extremo 5' de la región transcrita del gen
RD2 del tabaco. La SEQ ID NO: 1 dada en este documento proporciona
la secuencia de la región de 2 kb que se encuentra inmediatamente
5' del inicio de la transcripción del gen RD2 del tabaco. Los
promotores TobRD2 incluyen la región de al menos 100 pares de bases,
la región de 150 pares de bases o, preferiblemente, la región de
200 pares de bases inmediatamente 5' de la región trascrita de
TobRD2, y dirige la expresión específica de la corteza
radicular.
Según se usa en este documento, las regiones que
son "sustancialmente homólogas" son al menos el 75%, y más
preferiblemente son el 80%, 85%, 90% o incluso el 95% homólogas.
Según se usa en este documento, un promotor
específico de la corteza radicular es un promotor que dirige
preferentemente la expresión de un gen asociado de forma operativa
en el tejido de la corteza radicular, según la comparación con la
expresión en el tejido de la hoja o del tallo, u otros tejidos de la
raíz.
Las secuencias del promotor específico de la
corteza radicular procedentes de otras plantas incluyen aquellas
que son al menos aproximadamente el 75 por ciento homólogas (y más
preferiblemente el 80%, 85%, 90% o incluso el 95% homólogas) al
segmento de aproximadamente 100 bases del promotor RD2 de tabaco
inmediatamente antes del extremo 5' de la región de ADN transcrita
y que son capaces de dirigir la transcripción específica de la
corteza radicular de un segmento de ADN situado después del extremo
3' en una célula vegetal. Los promotores específicos de la corteza
radicular de otras plantas incluyen aquellos que son al menos el 75
por ciento homólogos (y más preferiblemente el 80%, 85%, 90% o
incluso el 95% homólogos) a las porciones continuas del promotor
TobRD2 según se define en este documento por las SEQ ID NO:
1-9, y que son capaces de dirigir la transcripción
específica de la corteza radicular de un segmento de ADN heterólogo
situado después del extremo 3' en una célula vegetal.
Las condiciones de hibridación muy rigurosas que
permitirán a las secuencias de ADN homólogas hibridar con una
secuencia de ADN como las proporcionadas en este documento son bien
conocidas en la técnica. Por ejemplo, la hibridación de estas
secuencias con el ADN descrito en este documento puede realizarse en
formamida al 25%, SSC X5, solución de Denhardt X5, con 100
\mug/ml de ADN de cadena sencilla y sulfato de dextrano al 5% a
42°C, con condiciones de lavado de formamida al 25%, SSC X5, SDS al
0,1% a 42°C durante 15 minutos, para permitir la hibridación de
secuencias con aproximadamente el 60% de homología. Condiciones más
rigurosas están representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl
0,3 M, citrato sódico 0,03 M, SDS al 0,1% a 60°C o incluso a 70°C
usando un ensayo de hibridación in situ convencional. (Véase
Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2ª edición
1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). En general, las secuencias
de ADN de una planta que codifica promotores específicos de la
corteza radicular y que hibridan con la secuencia de ADN que
codifica los promotores específicos de corteza radicular RD2 de
tabaco descritos en este documento serán al menos el 75%, 80%, 85%,
90%, o incluso el 95% homólogos o más con las secuencias de ADN que
codifican los promotores RD2 de tabaco específicos de corteza
radicular descritos en este documento.
Los promotores específicos de la corteza
radicular de la presente invención son útiles para dirigir la
expresión específica de tejido de transgenes en plantas
transformadas. Esta expresión de transgenes específica de tejido es
útil para proporcionar resistencia frente a daños causados por
plagas y patógenos que atacan a las raíces de las plantas. Además,
puesto que la corteza radicular es el principal órgano de absorción
para el almacenamiento de fotosintato, mediante estos promotores
puede dirigirse la expresión de transgenes diseñados para alterar
los hidratos de carbono almacenados. Los genes exógenos de especial
interés para la expresión específica de la corteza radicular
incluyen aquellos que codifican las proteínas que se unen a metales
pesados (tal como metalotioneína); proteínas que proporcionan
resistencia a plagas y patógenos transmitidos por el suelo;
proteínas que confieren resistencia al calor, a la sal (salinidad)
y a la sequía; proteínas para la desalinización y proteínas que
metabolizan los compuestos almacenados por la planta en formas o
productos alternativos preferidos.
Los promotores específicos de tejido también
pueden usarse también para convertir pro-pesticidas
en formas activas en los sitios seleccionados del tejido. Hsu y
col. Pestic. Sci., 44, 9 (1995) describieron el uso
de un gen quimérico que comprendía el promotor específico de raíz,
TobRB7 y el gen de la enzima \beta-glucuronidasa,
para convertir preferiblemente un pro-pesticida en
una forma activa en las raíces. El pro-pesticida
inactivo (un glucurónido de hidroximetiloxamilo) se aplicaba al
follaje y después era transportado a través del floema de la planta
hasta las raíces, donde se convertía en una forma nematocida activa
mediante la glucuronidasa.
Adicionalmente, los promotores específicos de la
corteza radicular son útiles con fines histológicos para
identificar o teñir tejido de la corteza radicular usando un gen
indicador, tal como la \beta-glucuronidasa.
La expresión "asociado de forma operativa",
como se usa en este documento, se refiere a secuencias de ADN
contenidas en una única molécula de ADN con la que se asocia, de
modo que la función de una se ve afectada por la otra. De este
modo, un promotor se asocia de forma operativa con un gen cuando es
capaz de afectar a la expresión de dicho gen (es decir, el gen está
bajo el control transcripcional del promotor). El promotor se dice
que está "antes del extremo 5'" del gen, que a su vez se dice
que esta "después del extremo 3'" del promotor.
Las construcciones de ADN, o los "casetes de
expresión", de la presente invención incluyen,
5'-3' en la dirección de la transcripción, un
promotor de la presente invención, un segmento de ADN heterólogo
asociado de forma operativa con el promotor y, opcionalmente,
regiones de terminación de la transcripción y de la traducción,
tales como una señal de terminación o una región de poliadenilación.
Todas estas regiones reguladoras deben ser capaces de funcionar en
la célula transformada. La región de terminación del extremo 3'
puede proceder del mismo gen del que procede la región de inicio de
la transcripción o de un gen diferente.
Las plantas pueden dividirse en aquellas que
carecen de clorofila (tales como los hongos) y aquellas que
contienen clorofila (tales como algas verdes, musgos); y
adicionalmente se dividen en aquellas que contienen clorofila y
tienen tejido vascular (tales como helechos, gimnospermas,
coníferas, monocotiledóneas y dicotiledóneas). El úlitmo grupo de
plantas incluye aquellas que pueden presentar raíces, tallos y
hojas. Según se usa en este documento, el término "planta"
abarca a todos aquellos organismos descritos anteriormente. Según se
usa en este documento, la expresión "ADN natural vegetal"
significa ADN aislado de plantas no alteradas genéticamente o sin
transformar (por ejemplo, variedades de plantas que se producen
mediante cultivo selectivo).
Según se usa en este documento, la expresión gen
heterólogo o segmento de ADN heterólogo significa un gen (o
segmento de ADN) que se usa para transformar una célula mediante
técnicas de ingeniería genética y que no se puede dar de forma
natural en la célula. Los genes estructurales son aquellas porciones
de genes que comprenden un segmento de ADN que codifica una
proteína, polipéptido o porción de ellos, que incluyen posiblemente
un sitio de unión al ribosoma y/o un codón de inicio de la
traducción, pero que carece de un promotor. El término también
puede referirse a copias de un gen estructural que se encuentra de
forma natural en la célula, pero introducido de forma artificial.
Los genes estructurales pueden codificar una proteína que no se
encuentra normalmente en la célula vegetal en la que se introduce
el gen o en combinación con el promotor al cual está asociado de
forma operativa. Los genes que pueden estar asociados de forma
operativa con un promotor de la presente invención para su
expresión en una especie vegetal pueden proceder de un gen
cromosómico, ADNc, un gen sintético o combinaciones de ellos. Según
se usa en este documento, la expresión segmento de ADN heterólogo
también incluye segmentos de ADN que codifican productos no
proteicos, tales como ribozimas o ARN complementarios. Los ARN
complementarios son bien conocidos (véase, por ejemplo, la
Patente de EE.UU. Nº 4.801.540 (Calgene, Inc.)).
Los genes de interés para su uso con la presente
invención en plantas incluyen aquellos que afectan a una amplia
variedad de propiedades fenotípicas o no fenotípicas. Entre las
propiedades fenotípicas son proteínas, tales como enzimas, que
proporciona resistencia a diversos tipos de estrés ambiental, que
incluyen, pero sin limitaciones, el estrés causado por
deshidratación (resultado del calor, salinidad o sequía),
herbicidas, metales tóxicos, oligoelementos, plagas y patógenos. La
resistencia puede deberse a un cambio en el sitio diana, al aumento
de la cantidad de una proteína diana en la célula hospedadora, al
aumento de las cantidades de una o más enzimas implicas en la ruta
biosintética de un producto que protege al hospedador frente al
estrés y similares. Los genes estructurales pueden obtenerse de
procariotas o de eucariotas, de bacterias, hongos (por ejemplo, de
levaduras, virus, plantas y mamíferos) o pueden sintetizarse en su
totalidad o en parte. Ejemplos de genes incluyen el gen de
resistencia a glifosfato,
3-enolpiruvil-fosfosiquimato
sintetasa, nitrilasa, los genes de la ruta de biosíntesis de la
prolina y glutamina y
metalotioneínas.
metalotioneínas.
Los genes estructurales asociados de forma
operativa con el promotor de la presente invención pueden ser
aquellos que codifican una proteína tóxica para insectos, tal como
la proteína cristal de Bacillus thuringiensis tóxica para
insectos. En la Patente de EE.UU. Nº 4.853.331 se describe una
secuencia de ADN que codifica una toxina de B. thuringiensis
tóxica para Coleoptera y variaciones de esta secuencia en las
que se retiene la codificación de toxicidad (véase también las
Patentes de EE.UU. N^{os} 4.918.006 y 4.910.136) (las
descripciones de todas las referencias de Patentes de EE.UU.
citadas en este documento se incorporan en él en su totalidad por
referencia). En la Solicitud PCT WO 90/02804 se describe una
secuencia génica de B. thuringiensis que hace a una especie
de planta tóxica para Lepidoptera. La Solicitud PCT WO
89/04868 describe plantas transgénicas transformadas con un vector
que promueve la expresión de una proteína cristal de B.
thuringiensis, cuya secuencia puede emplearse en conexión con
la presente invención. La Solicitud PCT WO 90/06999 describe el ADN
que codifica una toxina proteína cristal de B. thuringiensis
activa frente a Lepidoptera. Otra secuencia génica que
codifica una proteína cristal insecticida se describe en la Patente
de EE.UU. Nº 4.918.006. Ejemplos de secuencias génicas que
codifican otras toxinas para insectos son secuencias génicas que
codifican una quitinasa (por ejemplo, EC3.2.1.14), como se describe
en la Patente de EE.UU. Nº 4.940.840 y en la Solicitud PCT Nº WO
90/07001. Un gen que codifica una proteína de poro inducible por
nematodo útil para producir plantas transgénicas resistentes a
nematodos de raíz se describe en la solicitud de Patente de EE.UU.
Nº 08/007.998. Las cepas de B. thuringiensis que produce
toxinas polipeptídicas activas frente a nematodos se describen en
las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.948.734 y 5.093.120 (Edwards y
col.).
Cuando el producto de expresión del gen se tiene
que localizar en un compartimento celular que no sea el citoplasma,
el gen estructural puede construirse de modo que incluya regiones
que codifiquen secuencias particulares de aminoácidos que tienen
como resultado la translocación del producto a un sitio en
particular, tal como la membrana plasmática celular, o su secreción
en el espacio periplásmico o en el entorno externo de la célula. En
la bibliografía se describen diversas secuencias líderes secretoras
de integración en membrana y secuencias de translocación para
dirigir el producto de expresión peptídico a un sitio en particular.
Véase, por ejemplo, Cashmore y col., Biotechnology (1985)
3:803-808, Wickner y Lodish, Science (1985)
230:400-407.
Se puede proporcionar el casete de expresión
como una construcción de ADN que también tiene al menos un sistema
de replicación. Por comodidad, es frecuente tener un sistema de
replicación funcional en Escherichia coli, tal como ColE1,
pSC101, pACY184 o similares. De esta manera, en cada estadio después
de cada manipulación, la construcción resultante se puede clonar,
secuenciar y determinar si la manipulación ha sido correcta. Además,
o en lugar del sistema de replicación de E. coli, puede
emplearse una amplia gama de sistemas de replicación de
hospedadores, tal como los sistemas de replicación de plásmidos con
incompatibilidad P-1, por ejemplo, pRK290. Además
del sistema de replicación, puede estar presente al menos un
marcador, que puede ser útil en uno o más hospedadores, o
diferentes marcadores para hospedadores individuales. Es decir,
puede emplearse un marcador para la selección en un hospedador
procariota mientras que puede emplearse otro marcador para la
selección en un hospedador eucariota, especialmente el hospedador
vegetal. Los marcadores pueden proporcionar protección frente a un
biocida, tal como antibióticos, toxinas, metales pesados o
similares; puede proporcionar complementación transmitiendo
fototrofia a un hospedador autotrófico; o puede proporcionar un
fenotipo visible a través de la producción de un nuevo compuesto en
la planta. Ejemplos de genes que pueden emplearse incluyen la
neomicina fosfotransferasa (NPTII), la higromicina fosfotransferasa
(HPT), la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), nitralasa y el
gen de resistencia a gentamicina. Para la selección de hospedadores
vegetales, ejemplos no limitantes de marcadores adecuados son la
beta-glucuronidasa (GUS) (que proporciona la
producción de una coloración azul índigo), luciferasa (que
proporciona la producción de luz visible), NPTII (que proporciona
resistencia a kanamicina o resistencia a G418), HPT (que proporciona
resistencia a higromicina) y el gen aroA mutado (que proporciona
resistencia a
glifosato).
glifosato).
Los diversos fragmentos que comprenden las
diversas construcciones, casetes de expresión, marcadores y
similares pueden introducirse consecutivamente mediante escisión
con enzimas de restricción de un sistema de replicación apropiado e
inserción de la construcción o fragmento en particular en el sitio
disponible. Después del ligamiento y clonación, la construcción del
ADN puede aislarse para una manipulación adicional. Todas estas
técnicas se ilustran ampliamente en la bibliografía. Véase, por
ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1982).
Un vector es una construcción de ADN que se
puede replicar. Los vectores que pueden usarse para transformar
tejidos vegetales con construcciones de ADN de la presente
invención, incluyen tanto vectores de Agrobacterium y
vectores balísticos, así como vectores adecuados para la
transformación mediada por ADN. Las células de Agrobacterium
tumefaciens que contienen una construcción de ADN de la presente
invención, en las que la construcción de ADN comprende un plásmido
Ti, son útiles en procedimientos para producir plantas
transformadas. Las células vegetales se infectan con
Agrobacterium tumefaciens para producir una célula vegetal
transformada y, a continuación, se regenera una planta a partir de
la célula vegetal transformada.
Se conocen numerosos sistemas de vectores de
Agrobacterium útiles para realizar la presente invención.
Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.459.355 describe un
procedimiento para transformar plantas susceptibles, incluyendo
dicotiledóneas, con una cepa de Agrobacterium que contiene el
plásmido Ti. La transformación de plantas leñosas con un vector de
Agrobacterium se describe en la Patente de EE.UU. Nº
4.795.855. Además, la Patente de EE.UU. Nº 4.940.838 de
Schilperoort y col. describe un vector binario de
Agrobacterium (es decir, uno en el que el
Agrobacterium contiene un plásmido que tiene la región vir de
un plásmido Ti, pero no la región T-ADN, y un
segundo plásmido que tiene la región T-ADN, pero no
la región vir) útil para realizar la presente invención.
Las micropartículas que llevan una construcción
de ADN de la presente invención, cuya micropartícula es adecuada
para la transformación balística de una célula vegetal, también son
útiles para producir plantas transformadas de la presente
invención. La micropartícula es introducida en una célula vegetal
para producir una célula vegetal transformada y a partir de la
célula vegetal transformada se regenera una planta. Puede usarse
cualquier metodología de transformación balística de células
adecuada para poner en práctica la presente invención. En la
Patente de EE.UU. Nº 4.945.050 de Sanford y Wolf se describen
ejemplos de aparatos y procedimientos y en la publicación de la
Solicitud de Patente de Agracetus Nº 0.270.356, titulada
"Pollen-mediated Plant Transformation". Cuando
se usen procedimientos de transformación balística, el casete de
expresión puede incorporarse en un plásmido capaz de replicarse en
la célula que se va a transformar. Ejemplos de micropartículas
adecuadas para el uso en estos sistemas incluyen esferas de oro de
1 a 5 \mum. La construcción de ADN puede depositarse sobre la
micropartícula mediante cualquier técnica adecuada, tal como
mediante precipitación.
Una célula hospedadora transformada es una
célula que se ha transformado o trransfectado con construcciones
que contienen una secuencia de ADN, como se describe en este
documento, usando técnicas de ADN recombinante. Las especies de
plantas pueden transformarse con la construcción de ADN de la
presente invención mediante la transformación mediada por ADN de
protoplastos de células vegetales y la posterior regeneración de la
planta a partir de los protoplastos transformados de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica.
Las secuencias de promotor descritas en este
documento pueden expresarse para expresar una secuencia de ADN
heterólogo en cualquier especie de planta capaz de utilizar el
promotor (es decir, cualquier especie de planta cuya ARN polimerasa
se una a las secuencias de promotor descritas en este documento).
Ejemplos de especies de plantas adecuadas para la transformación
con las construcciones de ADN de la presente invención incluyen
tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas e incluyen, pero sin
limitaciones, tabaco, soja, patata, algodón, remolacha azucarera,
girasol, zanahoria, apio, lino, col y otras plantas crucíferas,
pimiento, tomate, cítricos, judía, fresa, lechuga, maíz, alfalfa,
avena, trigo, arroz, cebada, sorgo y colza. De este modo, una
categoría ilustrativa de plantas que pueden transformarse con las
construcciones de ADN de la presente invención son las
dicotiledóneas, y una categoría más particular de plantas que pueden
transformarse usando las construcciones de ADN de la presente
invención son los miembros de la familia Solanaceae.
Cualquier tejido vegetal capaz de la posterior
propagación clonal, mediante organogénesis o embriogénesis, puede
transformarse con un vector de la presente invención. El término
"organogénesis", como se usa en este documento, significa un
proceso por el cual se desarrollan secuencialmente brotes y raíces a
partir de centros meristemáticos; el término "embriogénesis",
como se usa en este documento, significa un proceso por el cual los
brotes y raíces se desarrollan juntos de forma concertada (no
secuencialmente), a partir de células somáticas o de gametos. El
tejido en particular elegido variará dependiendo de los sistemas de
propagación clonal disponibles, y más adecuados, para la especie en
particular que se va a transformar. Ejemplos de dianas tisulares
incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones,
hipocótilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático
existente (por ejemplo, meristemos apicales, yemas axilares y
meristemos radiculares) y tejido de meristemo inducido (por
ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo del hipocotilo).
Los Ejemplos que siguen se proporcionan para
ilustrar diversas realizaciones específicas de la presente invención
y no se deben interpretar como una limitación de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se construyó una biblioteca genómica de tabaco
(Nicotiana tabacum) de ADN aislado de plántulas de tabaco en
el vector EMBL 3 SP6/T7 lambda (ClonTech, Palo Alto, CA). Se usó el
ADNc de TobRD2 (Conkling y col., Plant Phys. 93, 1203 (1990))
como sonda para aislar clones genómica que contenían los genes RD2
del tabaco a partir de la biblioteca primaria. Se analizaron un
total de 1,2 x 10^{7} fagos recombinantes en células bacterianas
K802. Las placas se transfirieron a membranas de nailon (Magnagraph)
y el ADN se inmovilizó mediante autoclavado (10 minutos, ciclo de
gravedad). Todas las hibridaciones se realizaron a 65°C en solución
acuosa (SSCx5 [cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM],
solución de DenhardtX5 [Ficoll, BSA, polivinilpirrolidona al 0,1%
cada uno], SDS al 0,5%, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado) durante 16 horas. Los filtros se lavaron en SSCX0,2
y SDS al 0,1% a 60°C.
Se identificaron trece clones genómicos que
hibridaban con la sonda del ADNc de TobRD2 a partir de la selección
de los 1,2 x 10^{7} fagos recombinantes. Estos clones se aislaron
y caracterizaron posteriormente mediante mapeo de restricción. Se
construyeron mapas mediante el procedimiento de mapeo rápido de
Rachwitz y col., Gene, 30:195 (1984). Un clon,
homólogo del ADNc de TobRD2 se secuenció en su totalidad y se
identificó su promotor. Alineando el ADNc de TobRD2 y el clon
genómico, se identificó la región del extremo 5' de la región
traducida del clon genómico. Se examinó la secuencia de esta región
sin traducir y se identificó la caja TATAA del probable promotor.
En los promotores vegetales, la caja TATAA típicamente esta en los
nucleótidos -35 a -29 del punto de inicio de la transcripción.
Usando experimentos de extensión del cebador, se identificó el
extremo 5' de
transcripción.
transcripción.
En la Figura 2 (SEQ ID NO: 1) se proporciona una
región de 2.010 pares de bases antes del extremo 5' de la región
transcrita del ADNc de TobRD2. Esta secuencia incluye la región
predicha de inicio de la transcripción (en el nucleótido 2.000) y
la caja TATAA del promotor (nucleótidos
1.971-1.975).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los fragmentos de restricción de los clones
genómicos aislados (Ejemplo 1) se subclonaron en vectores bluescript
(pBS KS II+ o pBS SKII+; Stratagene, La Jolla, CA). Se obtuvieron
de cada clon y de ambas cadenas de ADN series de deleción
unidireccional mediante digestión con exonucleasa III y nucleasa S1
(Henikoff, Gene 28, 351 (1984). La secuencia de ADN
se determinó por el procedimiento didesoxi de terminación de cadena
(Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463
(1977)) usando la enzima Sequenase (U.S. Biochemicals, Cleveland,
OH). En todos los casos, se secuenciaron ambas cadenas de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Para determinar la distribución especial de las
transcripciones del ARNm de TobRD2 en los diversos tejidos de la
raíz, se realizaron hibridaciones in situ en plantas no
transformadas. Las hibridaciones in situ de la cadena
complementaria de TobRD2 con el ARNm de TobRD2 en el tejido de la
raíz se realizaron usando técnicas como las descritas en
Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5, 242 (1987) y
Smith y col., Plant Mol. Biol. Rep. 5, 237 (1987).
Raíces de plántulas de tabaco (Nicotiana tabacum) de siete
días se fijaron en glutaraldehído tamponado con fosfato, se
incluyeron en Paraplast Plus (Monoject Inc. St. Louis, MO) y se
hicieron cortes de 8 mm para obtener secciones transversales así
como longitudinales. Se usaron como sondas las transcripciones de
TobRD2 complementarias, sintetizadas in vitro en presencia de
^{35}S-ATP. El ARN marcado se hidrolizó mediante
tratamiento alcalino para producir longitudes de 100 a 200 bases
antes del uso.
Las hibridaciones se realizaron en formamida al
50% durante 16 horas a 42°C, con ARN marcado con aproximadamente 5
x 10^{6} cuentas por minutos (cpm) por mililitros de solución de
hibridación. Tras la exposición, las preparaciones se desarrollaron
y visualizaron en un microscopio de campo claro y oscuro.
Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, la señal
de hibridación se localiza en la capa cortical de las células de
las raíces. La comparación de ambas imágenes en campo claro y oscuro
de los mismos cortes localizaban las transcripciones de TobRD2 en
las células parenquimatosas de la corteza radicular. No había
señales de hibridación visibles en la epidermis ni en el cilindro
vascular.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se construyó una serie de deleciones del
promotor mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los
moldes fueron las diversas deleciones de las regiones flanqueantes
5' del clon genómico de TobRD2 que se habían generado mediante
digestiones con exonucleasa III/nucleasa S1 (Ejemplo 2).
Todos los moldes se amplificaron usando el mismo
conjunto de cebadores oligonucleotídicos. Un cebador era un cebador
sentido del bacteriófago M13 modificado (véase, por ejemplo, Sanger
y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977));
el extremo 5' del oligonucleótido contenía la secuencia de
reconocimiento de HindIII, junto con una secuencia 5' adicional que
permite una escisión más eficaz por la enzima de restricción. El
otro cebador se diseñó para que tuviera un sitio BamHI (junto con
nucleótidos adicionales para una escisión eficaz) en su extremo 5'
y era homólogo a la secuencia de 16 nucleótidos de la TobRD2 que se
encuentra a 22 bases del extremo 5' del codón de inicio ATG (es
decir, el cebador era homólogo a las bases
1.973-1.988 de la SEQ ID NO: 1).
La reacción de amplificación por PCR contenía el
ADN plasmídico molde (5-10 ng); tampón de reacción
(KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0 [a 25°C], Triton
X-100 0,1%, MgCl 1,5 mM); dATP, dGTP, dTTP y dCTP,
0,25 mM cada uno; 40 ng de cada cebador; 1,25 unidades de la Taq
ADN polimerasa (Promega, Madison, WS).
El ciclo de PCR desnaturalizaba los moldes a
94°C durante 1 minuto, hibridaba los cebadores a 46°C durante 1
minuto y permitía que la elongación de la cadena se produjera a 72°C
durante 5 minutos. Este ciclo se repitió 40 veces y el último ciclo
de elongación se prolongó durante 10 minutos. Las amplificaciones
por PCR se realizaron en un termociclador programable
(PTC-100, M.J. Research).
Los productos amplificados se digirieron con
HindIII y BamHI, y se clonaron en los sitios HindII y BamHI del
vector binario de Agrobacterium pBI 101.3 (R. Jefferson y
col., EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)). Este vector
contiene un gen indicador \beta-glucuronidasa
(GUS) y un marcador susceptible de ser seleccionado nptII
flanqueado por las secuencias límites del T-ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Las construcciones del gen indicador quimérico
se introdujeron en un hospedador de Agrobacterium portador
de un plásmido Ti desarmado (LBA4404) capaz de proporcionar (en
posición trans) las funciones vir requeridas para la
transferencia de T-ADN y la integración en el genoma
de la planta, esencialmente como describen An y col., en S. Belvin
y R. Schilperoot, editores., Plant Molecular Bioloqy Manual,
Martinus Nijhoff, Dordrecht, Holanda, pág.
A3-1-19 (1988). Las construcciones
se introdujeron en el hospedador a través del apareamiento
triparental o electroporación de células de Agrobacterium
electrocompetentes, que son conocidas por los expertos en la
materia. Los discos de transformación de las hojas de tabaco (SR1) y
la regeneración de la planta se realizaron como se describe en An y
col. Plant. Physiol. 81, 301-305
(1986). Se seleccionaron plantas resistentes a la kanamicina para
un análisis
adicional.
adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La tinción histoquímica se realizó en raíces,
tallos y hojas escindidas de plantas transformadas. Los tejidos de
explante se incubaron en
5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-glucuronido
(X-Gluc) 1 mM, tampón fosfato sódico (pH 7,0) 25
mM, DMSO al 0,5% a 37°C durante una noche después de una breve
infiltración al vacío del sustrato. Los tejidos que expresan la
actividad GUS escinden este sustrato y, por tanto, se tiñen de
azul.
Los ensayos fluorimétricos de GUS se realizaron
como describen Jefferson y col., EMBO J. 6,
3901-3907 (1987) para cuantificar el nivel de
expresión de GUS. Los extractos celulares de las raíces, hojas y
tallos se incubaron en presencia de
4-metilumbeliferil-B-D-glucuronido
(MUG) 1 mM a 37°C. Las muestras se tomaron a intervalos de 0, 5,
10, 15 y 20 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la
adición de carbonato sódico 0,2 M. El fluorímetro se calibró con
MUG 10 nM y 100 nM. La concentración de proteína en la muestras se
determinó según el procedimiento de Bradford, Anal. Biochem.
72, 248 (1976).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para determinar si la secuencia de 2.010 pares
de bases del gen TobRD2 (SEQ ID NO: 1) abarcaba elementos promotores
que dirijan la expresión específicamente en las células
parenquimatosas de la corteza radicular, se construyeron genes
quiméricos Se amplificó, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa, una región de 1.988 pares de bases (SEQ ID NO: 2) y se
clonó el extremo 5' del gen indicador GUS (como se describe
anteriormente). El gen quimérico se introdujo en el tabaco (como se
describe anteriormente) y se analizó la capacidad de las plantas
transgénicas para expresar GUS (como se describe anteriormente).
Los resultados del análisis de 9 transformantes
individuales (es decir, cada transformante era el producto de un
suceso de transformación independiente) se muestran en la Tabla 1,
líneas 25-33 (transformantes 325II1 - 325IV5). Se
encontró que el promotor \Delta2.0 (SEQ ID NO: 2) dirigía la
expresión génica a niveles elevados (aproximadamente 4 veces
superior a los del promotor CaMV35S, normalmente calificado como
promotor "potente") (Figura 4). La expresión del indicador no
podía detectarse en hojas o en tallos a niveles mayores que el
control (véanse las Figura 4, 5A y 5B, que muestran las actividades
medias tomadas de la Tabla 1). La actividad GUS se limitaba
básicamente a la raíz y, como se muestra en la Figura 6, estaba
específicamente limitada a la corteza radicular. La planta mostrada
en la Figura 6 se transformó usando GUS dirigido por el promotor
\Delta2.0, en pBI101.3.
Los múltiples discos foliares transformados
individuales se colocaron en placas de Petri. La nomenclatura de
los transformantes de la Tabla 1 indica el promotor/la placa de
petri numerada/ y el número del transformante independiente. De
este modo, 325II1 se refiere a un transformante que usa el promotor
\Delta2.0, en la placa de Petri II y del disco foliar 1; mientras
que 101.I1 se refiere a una transformación que usa pBI101.3 (GUS
sin promotor usado como control) y para el transformante número 1 en
la placa de Petri I. En la Tabla 1, el prefijo 121 se refiere al
uso de pBI121 (promotor CaMV35S con GUS); 325 se refiere al promotor
\Delta2.0 (SEQ ID NO: 2) con GUS; 484 se refiere al promotor
\Delta1.4 (SEQ ID NO: 3) con GUS; 421 se refiere al promotor
\Delta1.3 (SEQ ID NO: 4) con GUS; 428 se refiere al promotor
\Delta1.0 (SEQ ID NO: 5) con GUS; 490 se refiere al promotor
\Delta0.7 (SEQ ID NO: 6) con GUS; 491 se refiere al promotor
\Delta0.6 (SEQ ID NO: 7) con GUS; 492 se refiere al promotor
\Delta0.5 (SEQ ID NO: 8) con GUS; 495 se refiere al promotor
\Delta0.2 (SEQ ID NO: 9) con GUS. "R-GUS" se
refiere a la actividad GUS en tejidos de la raíz;
"L-GUS" se refiere a la actividad GUS en los
tejidos de la hoja y "S-GUS" se refiere a la
actividad GUS en los tejidos del tallo. R/L proporciona la
actividad GUS relativa en raíces/hojas; R/S proporciona la actividad
GUS relativa en raíces/tallos. La actividad GUS se proporciona en
pmoles de MU/\mug de proteína/min.
Los siguientes experimentos se realizaron
esencialmente de la misma forma que se describe en el Ejemplo 7,
anterior, excepto porque la longitud de la región flanqueante de
TobRD2 empleado como promotor se variaba para explorar cómo
afectaban las diversas porciones de la región flaqueante a la
expresión de GUS.
Se generaron una serie de siete mutaciones
anidadas de deleción de 5' en la región antes del extremo 5' de la
secuencia de 2.010 pares de bases de TobRD2 (SEQ ID NO: 1) para su
uso como secuencias promotoras. Estos mutantes de deleción se
muestran gráficamente en la Figura 3 y se denominan como \Delta2.0
(SEQ ID NO: 2); \Delta1.4 (SEQ ID NO: 3); \Delta1.3 (SEQ ID NO:
4); \Delta1.0 (SEQ ID NO: 5); \Delta0.7 (SEQ ID NO: 6);
\Delta0.6 (SEQ ID NO: 7); \Delta0.5 (SEQ ID NO: 8) y \Delta0.2
(SEQ ID NO: 9).
Las construcciones de genes quiméricos según se
describen en el Ejemplo 3 y que contenían el promotor \Delta2.00
(SEQ ID NO: 2) o un promotor truncado (SEQ ID NOs:
3-9) se introdujeron en tabaco mediante una
transformación mediada por Agrobacterium de discos foliares
(como se describe en el Ejemplo 4). El vector pBI101.3 de
Agrobacterium se uso solo como control y el promotor CaMV35S
se usó para proporcionar un patrón de referencia. Se ensayó la
actividad GUS en las raíces, hojas y tallos de plantas regeneradas
(Tabla 1; Fig. 4).
La Figura 4 proporciona una representación
gráfica de la actividad GUS en raíces, hojas y tallos usando el
promotor TobRD2 de longitud completa, las series de deleción del
promotor, el promotor del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV35S) y el vector pBI101.3 como control. Como se muestra en la
Figura 4, se encontró que seis de los promotores ensayados
conferían niveles elevados de expresión específica de la corteza
radicular: \Delta2.00 (SEQ ID NO: 2); \Delta1.4 (SEQ ID NO: 3);
\Delta1.3 (SEQ ID NO: 4); \Delta1.0 (SEQ ID NO: 5); \Delta0.7
(SEQ ID NO: 6); \Delta0.6 (SEQ ID NO: 7). La Figura 4 muestra los
datos promedio de la Tabla 1.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 4,
la pérdida de una región de aproximadamente 50 pares de bases de
longitud (en comparación con \Delta0.6 (SEQ ID NO: 7) y
\Delta0.5 (SEQ ID NO: 8)) disminuye dramáticamente el nivel de
expresión de GUS. Sin embargo, los resultados muestran que el nivel
de expresión de GUS en los tejidos de la raíz proporcionada por el
promotor \Delta0.5 (SEQ ID NO: 8) era equivalente a la producida
por el promotor CaMV35S. La expresión GUS en la corteza radicular
proporcionada por el promotor \Delta0.2 (SEQ ID NO: 9) era
aproximadamente la mitad de la proporcionada por el promotor
CaMV35S.
Las Figura 5A y 5B además ilustra la naturaleza
específica de órgano de la expresión del gen indicador usando los
promotores TobRD2. En todos los casos analizados, la actividad GUS
se expresaba estrictamente en las raíces y se detectada una
actividad insignificante, si es que se daba alguna, en los tallos o
en las hojas de las mismas plantas de tabaco transformadas.
Mientras que el nivel de actividad GUS medida en las raíces
transformadas con los promotores \Delta0.60 y \Delta0.30 era
equivalente o menor al proporcionado por el promotor CaMV35S
(Figura 4), las Figuras 5A y 5B ilustran que la expresión dirigida
por los promotores \Delta0.60 y \Delta0.30 era específica de
raíz, con una actividad insignificante en tallos y hojas, a
diferencia de la expresión dirigida por el promotor CaMV35S.
Los Ejemplos precedentes ilustran la presente
invención y no deberán interpretarse como limitantes de la
misma.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Conkling, Mark A.
\hskip3,9cm Mendu, Nandini
\hskip3,9cm Song, Wen
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Promotor de gen específico de la corteza radicular
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Kenneth D. Sibley; Bell. Seltzer, Park y Gibson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Post Office Drawer 34009
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Charlotte
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Carolina del Norte
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patent In Release Nº 1.0. Versión Nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sibley, Kenneth D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.665
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5051-294
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 919-420-2200
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 919-881-3175
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.010 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.988 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.372 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.294 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.030 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 722 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 574 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 523 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 220 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Una molécula de ADN aislada que dirige la
transcripción específica de la corteza radicular de un segmento de
ADN heterólogo después del extremo 3' en una célula vegetal,
teniendo dicho ADN aislado una secuencia seleccionada entre el
grupo constituido por:
(a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
8 y SEQ ID NO: 9 proporcionadas en este documento, y
(b) secuencias de ADN que hibridan con el ADN
aislado que tiene una secuencia del apartado (a) anterior, en
condiciones representadas por un lavado riguroso de NaCl 0,3 M,
citrato sódico 0,03 M, SDS al 0,1% a 60°C y que dirige la
transcripción específica de la corteza radicular de un segmento de
ADN heterólogo después del extremo 3' en una célula vegetal.
2. Una construcción de ADN que comprende un
casete de expresión, comprendiendo dicha construcción, en la
dirección 5' a 3', un promotor específico de la corteza radicular y
un segmento de ADN heterólogo colocado después del extremo 3' de
dicho promotor y asociado de forma operativa con éste, en la que
dicho promotor específico de la corteza radicular tiene una
secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ
ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y
SEQ ID NO: 9 proporcionadas en este documento y
(b) secuencias de ADN que hibridan con el ADN
aislado que tiene una secuencia del apartado (a) anterior, en
condiciones representadas por un lavado riguroso de NaCl 0,3 M,
citrato sódico 0,03 M, SDS al 0,1% a 60°C y que dirige la
transcripción específica de la corteza radicular de un segmento de
ADN heterólogo después del extremo 3' en una célula vegetal.
3. Una construcción de ADN según la
reivindicación 2, en la que dicha construcción además comprende un
plásmido.
4. Una construcción de ADN según la
reivindicación 2, en la que dicho segmento de ADN heterólogo es un
gen que codifica una proteína insecticida.
5. Una construcción de ADN según la
reivindicación 3, en la que dicho segmento de ADN heterólogo es un
gen que codifica una proteína cristal de Bacillus
thuringiensis tóxica para insectos.
6. Una célula vegetal que contiene una
construcción de ADN según la reivindicación 2.
7. Un procedimiento para producir una planta
transformada que comprende la regeneración de una planta a partir de
una célula vegetal según la reivindicación 6.
8. Una célula de Agrobacterium
tumefaciens que contiene una construcción de ADN según la
reivindicación 2, y en la que dicha construcción de ADN además
comprende un plásmido Ti.
9. Un procedimiento para producir una planta
transformada que comprende infectar a una célula vegetal con
Agrobacterium tumefaciens según la reivindicación 8 para
producir una célula vegetal transformada y regenerar, a
continuación, una planta a partir de dicha célula vegetal
transformada.
10. Una micropartícula portadora de una
construcción de ADN según la reivindicación 2, en la que dicha
micropartícula es adecuada para la transformación balística de una
célula vegetal.
11. Un procedimiento para producir una planta
transformada, que comprende introducir una micropartícula según la
reivindicación 10 en una célula vegetal para producir una célula
vegetal transformada y regenerar, a continuación, una planta a
partir de dicha célula vegetal transformada.
12. Un protoplasto de una célula vegetal que
comprende una construcción de ADN según la reivindicación 2.
13. Un procedimiento para producir una planta
transformada, que comprende regenerar una planta a partir de un
protoplasto de una célula vegetal según la reivindicación 12.
14. Una planta transformada que comprende
células vegetales transformadas, conteniendo dichas células
vegetales transformadas una construcción de ADN heterólogo, cuya
construcción comprende en dirección 5' a 3', un promotor específico
de la corteza radicular y un segmento de ADN heterólogo colocado
después del extremo 3' de dicho promotor y asociado de forma
operativa con éste, dirigiendo dicho promotor la transcripción
específica de la corteza radicular de dicho segmento de ADN
heterólogo, en la que dicho promotor tiene una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
8 y SEQ ID NO: 9, proporcionadas en este documento, y
(b) secuencias de ADN que hibridan con ADN
aislado que tiene una de las secuencias del apartado (a) anterior,
en condiciones representadas por un lavado rigurosos de NaCl 0,3 M,
citrato sódico 0,03 M, SDS al 0,1% a 60°C y que dirige la
transcripción específica de la corteza radicular de un segmento de
ADN heterólogo después del extremo 3' en una célula vegetal.
15. Una planta transformada según la
reivindicación 14, siendo dicha planta una dicotiledónea.
16. Una planta transformada según la
reivindicación 14, siendo dicha planta una monocotiledónea.
17. Una planta transformada según la
reivindicación 14, siendo dicha planta una planta de tabaco
(Nicotiana tabacum).
18. Una molécula de ADN aislada compuesta
esencialmente de un promotor que dirige la transcripción específica
de la corteza radicular de un segmento de ADN heterólogo después del
extremo 3' en una célula vegetal y que tiene una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs:
1-9 proporcionadas en este documento.
19. Una construcción de ADN que comprenden un
casete de expresión en dirección 5' a 3', un promotor según la
reivindicación 18 y un segmento de ADN heterólogo colocado después
del extremo 3' de dicho promotor y asociado de forma operativa con
éste.
20. Una planta transformada que comprende
células vegetales transformadas, conteniendo dichas células
vegetales transformadas una construcción de ADN según la
reivindicación 19.
21. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
22. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.
23. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.
24. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.
25. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
26. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6.
27. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.
28. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8.
29. Una molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9.
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