ES2229327T3 - Promotor procedente del tabaco. - Google Patents

Promotor procedente del tabaco.

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ES2229327T3
ES2229327T3 ES97900916T ES97900916T ES2229327T3 ES 2229327 T3 ES2229327 T3 ES 2229327T3 ES 97900916 T ES97900916 T ES 97900916T ES 97900916 T ES97900916 T ES 97900916T ES 2229327 T3 ES2229327 T3 ES 2229327T3
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Pierre Fobert
Venkatram N. Iyer
Brian Miki
Jiro Hattori
Helene Labbe
Therese Ouellet
Elizabeth Eva James
Elizabeth Foster-Atkinson
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Canada Minister of Natural Resources
Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Carleton University
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Carleton University
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN MARCAJE DE ADN-T CON UN GEN DE BE -GLUCURONIDASA (GUS) SIN PROMOTOR QUE PRODUCE UNA PLANTA TRANSGENICA DE NICOTIANA TABACUM QUE EXPRESA CONSTITUTIVAMENTE LA ACTIVIDAD GUS. LA FUSION GENETICA HA SIDO CLONADA Y SECUENCIADA. DICHO GEN DE BE -GLUCORONIDASA HA SIDO REINSERTADO EN DICHA PLANTA DE N.TABACUM POR TRANSFORMACION MEDIADA DE AGROBACTERIUM. EL ADN DE N.TABACUM, SITUADO AGUAS ARRIBA DE DICHO GEN GUS, TIENE APROX. 2 KB DE LONGITUD Y NO PRESENTA HOMOLOGIA CON SECUENCIAS CONOCIDAS. DICHO ADN, EL CUAL CONTIENE UN PROMOTOR CONSTITUTIVO, ES UTIL PARA CONTROLAR LA EXPRESION DE GENES EXOGENOS EN PLANTAS TRANSGENICAS DE DIFERENTES ESPECIES DE PLANTAS.

Description

Promotor procedente del tabaco.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un promotor identificado de Nicotiana tabacum (tabaco). Esta invención se refiere además al uso de dicho promotor para controlar la expresión de ADN exógenos de interés en plantas transgénicas de diversas especies de plantas.
Antecedentes de la invención
Las bacterias del género Agrobacterium tienen la capacidad de transferir segmentos específicos de ADN (ADN-T) a células de plantas, donde se integran establemente en los cromosomas nucleares. Los análisis de plantas que albergan el ADN-T han revelado que este elemento genético puede integrarse en numerosas localizaciones, y puede encontrarse ocasionalmente en genes. Una estrategia que se ha explotado para identificar eventos de integración es transformar células de plantas con vectores de ADN-T diseñados especialmente que contienen un gen informador desprovisto de señales de expresión transcripcional y traduccional de actuación en cis (concretamente sin promotores) localizado al final del ADN-T. Tras la integración, se yuxtapondrá el codón de iniciación del gen sin promotor (gen informador) con las secuencias de la planta. La consecuencia de la inserción de ADN-T adyacente a y cadena abajo de elementos promotores génicos puede ser la activación de la expresión del gen informador. Los genes híbridos resultantes, designados como fusiones génicas mediadas por ADN-T, consisten en promotores de plantas desconocidos y por tanto no caracterizados que residen en su localización natural en el cromosoma, y la secuencia de codificación de un gen marcador localizado en el ADN-T (Fobert et al., 1991, Plant Mol. Biol.. 17,
837-851).
Se ha supuesto generalmente que la activación de genes marcadores sin promotor o sin potenciador es el resultado de las inserciones de ADN-T en o inmediatamente adyacente a genes. El reciente aislamiento de diversos mutantes insercionales de ADN-T (Koncz et al., 1992, Plant Mol. Biol. 20, 963-976; revisado en Feldmann, 1991, Plant. J. 1, 71-82; Van Lijsebettens et al., 1991, Plant Sci. 80, 27-37; Walden et al., 1991, Plant J. 1: 281-288; Yanofsky et al., 1990, Nature 346, 35-39) muestra que ese el caso para al menos algunas inserciones. Sin embargo, existen otras posibilidades. Una de estas posibilidades es que la integración del ADN-T active secuencias reguladoras silenciosas que no están asociadas a genes. Lindsey et al., (1993, Transgenic Res. 2, 33-47) designaban estas secuencias como "pseudopromotores" y sugerían que pueden ser responsables de la activación de genes marcadores en algunas líneas transgénicas. Fobert et al. (1994, Plant. J. 6, 567-577) han clonado dichas secuencias y las han designado como "promotores crípticos".
Sumario de la invención
La presente invención se dirige a un promotor identificado de Nicotiana tabacum (tabaco).
La planta del tabaco transgénica T1275 contenía un fragmento EcoRI/XbaI de 4,38 kb que contenía el gen GUS-nos de 2,15 kb sin promotor y 2,23 kb de ADN de tabaco 5' flanqueante (2225 pb). Este ADN 5' flanqueante no mostró homología con secuencias conocidas.
Por tanto, esta invención abarca un promotor caracterizado porque comprende al menos una secuencia contigua de 18 pb de SEC Nº ID 1.
El promotor no pudo detectarse en soja, patata, girasol, Arabidopsis, B. napus, B. oleracea, maíz, trigo o pícea negra por análisis de transferencia Southern. La expresión del fragmento clonado en tabaco transgénico, N. tabacum c.v. Petit Havana, SRI y B. napus c.v. Westar transgénico se observó en hoja, tallo, raíz, semilla en desarrollo y flor. Mediante análisis de la expresión transitoria, se observó también la actividad GUS en tejido de hoja de soja, alfalfa, Arabidopsis, tabaco, B. napus, guisante y células cultivadas en suspensión de avena, maíz, trigo y cebada.
Por tanto, esta invención proporciona también un promotor que es un promotor constitutivo. Además, este promotor funciona en diversas especies de plantas cuando se introduce en un vector de clonación.
La presente invención abarca también un promotor constitutivo que tiene una secuencia de ADN sustancialmente homóloga de la SEC Nº ID 1.
El sitio de inicio de la transcripción para el gen GUS introducido en tabaco transgénico se localizó en el ADN de la planta cadena arriba del sitio de inserción. Era el mismo en hoja, tallo, raíz, semillas y flor. Además, el sitio nativo era silencioso tanto en tabaco no transformado como transgénico.
Por tanto, según la presente invención, se proporciona un promotor constitutivo de tabaco que es críptico y que funciona en diversas especies de plantas cuando se introduce en un vector de clonación.
Esta invención se refiere también a un constructo de gen quimérico que comprende un ADN de interés para el que se desea la expresión constitutiva y un promotor constitutivo que comprende al menos una secuencia contigua de 18 pb de la SEC Nº ID 1.
Esta invención se refiere además a un vector de clonación que contiene dicho constructo génico quimérico.
Esta invención incluye también una célula de planta que se ha transformado con dicho gen quimérico, o dicho vector de clonación. Además, esta invención abarca plantas transgénicas que contienen dicho gen quimérico o dicho vector de clonación.
Esta invención se refiere además a cualquier planta transgénica que contenga un promotor constitutivo que tenga una secuencia de ADN sustancialmente homóloga de la SEC Nº ID 1, unido operativamente a una región de ADN que se transcribe a ARN.
Se incluye también en la presente invención un procedimiento para conferir la expresión constitutiva de un gen a una planta, que comprende: unir operativamente un ADN exógeno de interés para el que se desea la expresión constitutiva con un promotor constitutivo que comprende al menos una secuencia contigua de 18 pb de la SEC Nº ID 1 para producir un constructo de gen quimérico, e introducir el constructo de gen quimérico en una planta capaz de expresar el constructo de gen quimérico.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros rasgos de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra la expresión constitutiva de GUS en todos los tejidos de la planta T1275, incluyendo segmentos de hoja (a), secciones transversales de tallo (b), raíces (c), secciones transversales de flor (d), secciones transversales de ovario (e), embriones inmaduros (f), embriones maduros (g) y secciones transversales de semilla (h).
La Figura 2 muestra la actividad GUS específica, que revela que el nivel de expresión de GUS en T1275 es comparable a los niveles en plantas que expresan genes 35S de CamV-GUS-nos en tejidos de hoja.
La Figura 3 es el análisis de transferencia Southern de ADN de T1275 digerido con EcoRI con una sonda de la región de codificación del gen GUS (carril 1) y una sonda de la región de codificación del gen nptII (carril 2), que revela un solo sitio de inserción de ADN-T en la planta T1275.
La Figura 4 muestra la fusión génica de GUS clonado de pT1275. La flecha indica el sitio de inicio del ARNm de GUS en la secuencia de ADN de planta.
La Figura 5 muestra el mapa de restricción de la secuencia de ADN de planta aislado. La flecha indica el sitio de inicio del ARNm de GUS en la secuencia de ADN de planta.
La Figura 6 muestra que la actividad GUS específica varía en hojas de plantas de tabaco individuales regeneradas crecidas en invernadero seleccionadas al azar (Figura 6A) y está generalmente correlacionada con el nivel de ARNm de GUS acumulado medido mediante el ensayo de protección de ARNasa y la densitometría de autorradiogramas (Figura 6B).
La Figura 7 muestra que los transcriptos correspondientes a la secuencia de la planta nativa in situ no se acumulan (3) en hojas de plantas de tabaco no transformado (carril U) o transgénico (carril T25); mientras que los transcriptos correspondientes a la misma secuencia de planta condensada con el gen GUS en el ADN-T insertado en la planta transgénica T25 (carril T25) están presentes en el fragmento protegido indicado (2). Se presenta la sonda no digerida (1) en el carril P como control.
Descripción de la realización preferida
La presente invención se refiere a secuencias reguladoras de genes de plantas. Específicamente, esta invención se refiere a un promotor, identificado por marcaje de ADN-T con un gen de \beta-glucuronidasa sin promotor (GUS), para generar una planta N. tabacum transgénica que expresa la actividad GUS constitutivamente.
Esta invención se dirige también a un promotor que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 18 pares de bases contiguas de la SEC Nº ID 1. También son útiles oligonucleótidos de 18 pb o más en la construcción de promotores heterólogos que comprenden fragmentos del promotor como se define en la SEC Nº ID 1.
El uso de dichos promotores heterólogos está bien establecido en la bibliografía. Por ejemplo, se han duplicado o combinado fragmentos de elementos específicos en el promotor 35S de CaMV con otros fragmentos de promotor para producir promotores quiméricos con las propiedades deseadas (por ejemplo, documentos US 5.491.288, 5.424.200, 5.322.938, 5.196.525, 5.164.316). Además, los oligonucleótidos de 18 pb o más largos son útiles como sondas o cebadores de PCR en la identificación o amplificación de secuencias de ADN o ARN relacionadas en otros tejidos u organismos.
En el contexto de esta descripción, el término "promotor" o "región promotora" designa una secuencia de ADN, habitualmente cadena arriba (5') de la secuencia de codificación de un gen estructural, que controla la expresión de la región de codificación al proporcionar el reconocimiento de la ARN polimerasa y/o otros factores necesarios para que la transcripción se inicie en un sitio particular.
Existen generalmente dos tipos de promotores, promotores inducibles y constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o genes no se transcribirán. Típicamente, el factor proteína, que se une específicamente a un promotor inducible para activar la transcripción, está presente en una forma inactiva que se convierte después directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico, o un estrés fisiológico impuesto directamente mediante calor, frío, sales o elementos tóxicos o indirectamente mediante la acción de un patógeno o agente patológico tal como un virus. Puede exponerse una célula de planta que contiene un promotor inducible a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta, tal como mediante pulverización, riego, calentamiento o procedimientos similares.
Un promotor constitutivo dirige la expresión de un gen a lo largo de las diversas partes de una planta y continuamente a lo largo del desarrollo de la planta.
Los ejemplos de promotores constitutivos conocidos incluyen aquellos asociados al transcripto 35S de CaMV (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), los genes de actina 1 (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165) y triosafosfato isomerasa 1 (Xu et al., 1994, Plant Physiol., 106: 459-467) de arroz, el gen de ubiquitina 1 de maíz (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), los genes de ubiquitina 1 y 6 de Arabidopsis (Holtrof et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y el gen 4A del factor de iniciación traduccional del tabaco (Mandel et al., 1995, Plant. Mol. Biol., 29: 995-1004). La presente invención está dirigida a una secuencia de ADN que contiene un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen. Preferiblemente, el promotor es un promotor constitutivo aislado de N. tabacum.
El término "constitutivo" como se utiliza en la presente memoria no indica necesariamente que un gen se expresa al mismo nivel en todos los tipos celulares, sino que el gen se expresa en un amplio intervalo de tipos celulares, aunque se observa a menudo cierta variación en su abundancia.
La presente invención se dirige adicionalmente a un constructo de gen quimérico que contiene un ADN de interés unido operativamente al promotor de la presente invención. Puede utilizarse cualquier gen exógeno y manipularse según la presente invención para dar como resultado la expresión de dicho gen exógeno. Un ADN de interés puede incluir, pero sin limitación, un gen que codifica una proteína, un ADN que se transcribe para producir ARN sin sentido o un producto transcripto que funciona de alguna manera que media la expresión de otros ADN, por ejemplo que da como resultado la coexpresión de otros ADN o similar.
El constructo de gen quimérico de la presente invención puede comprender adicionalmente una región 3' no traducida. Una región 3' no traducida designa aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento de ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente efectuando la adición de trazas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen habitualmente mediante la presencia de homología con la forma canónica 5'-AATAAA-3', aunque las variaciones no son infrecuentes.
Son ejemplos de regiones 3' adecuadas las regiones 3' no traducidas transcritas que contienen una señal de poliadenilación de genes de plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen nopalina sintasa (gen Nos) y genes de plantas tales como los genes de proteína de almacenamiento de soja y la subunidad pequeña del gen de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO). La región 3' no traducida del gen estructural del presente constructo puede utilizarse por lo tanto para construir genes quiméricos para expresión en plantas.
El constructo de gen quimérico de la presente invención puede incluir también potenciadores adicionales, tanto potenciadores de la traducción como de la transcripción, según sea necesario. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas para expertos en la técnica, y pueden incluir el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. El codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación para asegurar la traducción de la secuencia completa. Las señales de control de la traducción y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. Las regiones de iniciación traduccional pueden proporcionarse por la fuente de la región de iniciación transcripcional o por el gen estructural. La secuencia puede derivar también del promotor seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse especialmente de modo que aumente la traducción del ARNm.
Para ayudar a la identificación de células de planta transformadas, los constructos de esta invención pueden manipularse adicionalmente para incluir marcadores detectables de plantas. Los marcadores detectables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a un antibiótico tal como gentamicina, higromicina, kanamicina y similares. De forma similar, son útiles enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por el cambio de color tal como GUS (\beta-glucuronidasa) o por luminiscencia, tal como luciferasa.
Se consideran también parte de esta invención plantas transgénicas que contienen el constructo de gen quimérico que comprende el promotor de la presente invención. Son conocidos en la técnica procedimientos de regeneración de plantas enteras a partir de células de plantas, y el procedimiento de obtención de las plantas transformadas y regeneradas no es crítico para esta invención. En general, las células de plantas transformadas se cultivan en un medio apropiado que puede contener agentes selectivos tales como antibióticos, en el que se utilizan los marcadores detectables para facilitar la identificación de células de planta transformadas. Una vez se forma el callo, puede fomentarse la formación de brotes empleando las hormonas de plantas apropiadas según procedimientos conocidos, y transferirse los brotes a medio de enraizamiento para la regeneración de las plantas. Las plantas pueden utilizarse después para establecer generaciones repetitivas, a partir de semillas o utilizando técnicas de propagación vegetativa.
Los constructos de la presente invención pueden introducirse en células de plantas utilizando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de dichas técnicas, véanse por ejemplo Weissbach y Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology", Academy Press, Nueva York VIII, pág. 421-463 (1988); y Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2ª ed. (1988). La presente invención incluye además un vector adecuado que comprende el constructo de gen quimérico.
Cuando se designan secuencias específicas en la presente invención, se entiende que estas secuencias incluyen en su alcance secuencias que son "sustancialmente homólogas" de dichas secuencias específicas. Las secuencias son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente un 70%, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de los nucleótidos coinciden en una longitud definida de la molécula. Las secuencias que son "sustancialmente homólogas" incluyen cualquier sustitución, deleción o adición en la secuencia. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en experimentos de hibridación Southern, por ejemplo en condiciones estrictas de hibridación (véase Maniatis et al., en "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pág. 387 a 389).
Las secuencias específicas, designadas en la presente invención, incluyen también secuencias que son "funcionalmente equivalentes" a dichas secuencias específicas. En la presente invención, las secuencias funcionalmente equivalentes designan secuencias que, aunque no idénticas a las secuencias específicas, proporcionan la misma o sustancialmente la misma función. Las secuencias de ADN que son funcionalmente equivalentes incluyen cualquier sustitución, deleción o adición en la secuencia. Con referencia a la presente invención, las secuencias funcionalmente equivalentes dirigirán constitutivamente la expresión de un gen exógeno.
Aunque esta invención se describe con detalle con referencia particular a las realizaciones preferidas de la misma, dichas realizaciones se ofrecen para ilustrar pero no limitar la invención.
Ejemplos Caracterización de un promotor constitutivo-Fusión GUS
Se realizó la transferencia de constructos binarios a Agrobacterium y la transformación de discos de hojas de N. tabacum SR1 como se describe en Fobert et al., (1991, Plant. Mol. Biol. 17, 837-851). Se mantuvo el tejido de planta en sulfato de kanamicina 100 \mug/ml (Sigma) a lo largo del cultivo in vitro.
A partir de las plantas transgénicas producidas se eligió uno de éstas, T1275, para estudio detallado debido a su alto nivel de expresión constitutiva de GUS.
Se realizaron ensayos fluorogénicos e histológicos de GUS según Jefferson (Plant Mol. Biol. Rep., 1987, 5, 387-405), modificado en Fobert et al., (Plant Mol. Biol. 1991, 17, 837-851). Para el examen inicial, se recogieron hojas de plántulas crecidas in vitro. Después, se recogieron nueve tejidos diferentes: hoja (L), tallo (S), raíz (R), antera (A), pétalo (P), ovario (O), sépalo (Se), semillas de 10 días después de la antesis (S1) y semillas de 20 días después de la antesis (S2) de plantas crecidas en invernadero, y se analizaron. Para un análisis cuantitativo detallado de la actividad GUS, se recogieron tejidos de hoja, tallo y raíz de progenie F1 resistente a kanamicina crecida in vitro. Se recogieron tejidos florales en las etapas de desarrollo 8-10 (Koltunow et al., 1990, Plant Cell 2, 1201-1224) de las plantas transgénicas originales. Se marcaron también flores y se recogieron semillas en desarrollo de cápsulas a 12 y 20 dpa. En todos los casos, el tejido se pesó, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC.
Los tejidos analizados mediante ensayo histológico estaban en las mismas etapas de desarrollo que los enumerados anteriormente. Se analizaron diferentes secciones cortadas a mano para cada órgano. Para cada planta, se realizaron los ensayos histológicos en al menos dos ocasiones diferentes para asegurar la reproducibilidad. Excepto por los órganos florales, se ensayaron todos los tejidos en tampón fosfato según Jefferson (1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405), con X-Gluc 1 mM (Sigma) como sustrato. Se ensayaron las flores en el mismo tampón que contenía 20% (v/v) de metanol (Kosugi et al., 1990, Plant. Sci. 70, 133-140).
Se encontró actividad GUS en la planta T1275 en todos los tejidos. La Figura 1 muestra la expresión constitutiva de GUS mediante tinción histoquímica con X-Gluc de T1275, incluyendo hoja (a), tallo (b), raíz (c), flor (d), ovario (e), embriones (f y g) y semilla (h).
Se confirmó la expresión constitutiva de GUS con el ensayo fluorogénico más sensible de tejido de planta de la planta transformada T1275. Estos resultados se muestran en la Figura 2. La expresión de GUS fue evidente en todos los tipos de tejido, incluyendo hoja (L), tallo (S), raíz (R), antera (A), pistilo (P), ovario (O), sépalo (Se), semillas a 10 dpa (S1) y a 20 dpa (S2). Además, el nivel de expresión de GUS es comparable al nivel de expresión en plantas transformadas que contienen el promotor constitutivo 35S de CaMV en una fusión GUS-nos. Como se reseñó en Fobert et al., (1991, Plant Molecular Biology 17: 837-851), la actividad GUS en plantas transformadas que contenían pBI121 (Clontech), que contiene un gen quimérico 35S de CaMV-GUS-nos, era del orden de 18.770 \pm 2.450 (pmol de MU por minuto por mg de proteína).
Análisis genético de la planta transgénica T1275
El ADN-T contiene un gen de resistencia a la kanamicina. Se esterilizó la superficie de semillas de plantas transgénicas autopolinizadas con etanol al 70% durante 1 min y blanqueador Javex sin diluir (hipoclorito de sodio al 6%) durante 25 min. Se lavaron después las semillas varias veces con agua destilada estéril, se secaron a flujo laminar y se dispusieron en placas Petri que contenían medio MS0 suplementado con kanamicina 100 \mug/ml como se describe en Miki et al. (1993, "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology", Eds. B.R. Glick y J.E: Tompson, CRC Press, Boca Ratón, 67-88). Se contaron al menos 90 plántulas para cada transformante. Se contó el número de plántulas verdes (resistentes a la kanamicina) y blanqueadas (sensibles a la kanamicina) después de 4-6 semanas, y se analizaron utilizando el ensayo Chi^{2} a un nivel de significancia de p<0,05.
Los resultados del análisis genético se muestran a continuación en la tabla 1, que muestra los loci de ADN-T segregados en forma de un solo locus de inserción.
TABLA 1 Análisis genético de la planta transgénica T1275
1
Análisis de transferencia Southern
Se analizó el ADN-T en la planta transgénica T1275 utilizando una sonda de la región de codificación del gen GUS o una sonda de la región de codificación del gen nptII.
Se aisló ADN genómico de hojas liofilizadas utilizando el protocolo de Sanders et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15, 1543-1558). Se digirieron 10 \mug de ADN de T1275 durante varias horas con EcoRI utilizando el tampón suministrado por el fabricante apropiado suplementado con espermidina 2,5 mM. Después de electroforesis mediante un gel de TAE-agarosa al 0,8%, se realizó el análisis de transferencia Southern utilizando protocolos estándar. Puesto que el ADN-T del constructo que contiene el constructo promotor constitutivo-GUS-nos contiene sólo un único sitio de reconocimiento de EcoRI, los fragmentos de hibridación están compuestos tanto por secuencias de ADN-T como de ADN flanqueante de tabaco. La longitud del fragmento variará dependiendo de la localización del sitio EcoRI más cercano. Utilizando el gen GUS como sonda (Figura 3-carril 1), se detectará el fragmento del sitio EcoRI más cercano en el ADN de la planta. Con T1275, se localizó uno de dichos fragmentos. Utilizando la región de codificación de nptII como sonda (Figura 3, carril 2), que hibrida con secuencias en el lado opuesto al sitio EcoRI, fue evidente de nuevo sólo una banda de hibridación. Como puede observarse en la Figura 3, no aparecieron redistribuciones importantes en el ADN-T.
Clonación y análisis de la fusión promotor constitutivo-GUS
Se aisló ADN genómico de hojas según Hattori et al. (1987, Anal. Biochem. 165, 70-74). Se digirieron 10 \mug de ADN total de T1275 con EcoRI y XbaI según las instrucciones del fabricante. Se fraccionó por tamaños el ADN digerido en un gel de agarosa al 0,7%. Se aislaron los fragmentos de ADN de aproximadamente 4 a 6 kb del gel utilizando el kit Elu-Quick (Schleicher y Schuell) y se ligaron a brazos lambda GEM-2 previamente digeridos con EcoRI y XbaI y tratados con fosfatasa. Se transfirieron aproximadamente 40.000 placas a una membrana de nailon (Hybond, Amersham) y se examinaron con el inserto GUS de 2 kb marcado con ^{32}P aislado de pBI121 esencialmente como se describe en Rutledge et al., (1991, Mol. Gen. Genet. 229, 31-40). Se aislaron los clones positivos. Se aisló el fragmento XbaI-EcoRI (véase el mapa de restricción de la Figura 4 y la Figura 5) del fago lambda, se clonó en pTZ19R previamente digerido con XbaI y EcoRI y se trató con fosfatasa intestinal de ternero.
La secuencia de ADN de planta en el clon no se ha reseñado anteriormente en bases de datos de secuencias. No se observa entre diversas especies, ya que las transferencias Southern no revelaron bandas que hibridasen con el fragmento en soja, patata, girasol, Arabidopsis, B. napus, B. oleracea, maíz, trigo o pícea negra (datos no mostrados). En tabaco, las transferencias Southern no revelaron evidencias de grandes redistribuciones en o cadena arriba del sitio de inserción de ADN-T (datos no mostrados).
Para el análisis de la expresión transitoria de la actividad GUS mediada por biolística (Sandford et al., 1983, Methods Enzymol. 217: 483-509), se subclonó el fragmento XbaI-EcoRI en pUC19 y se detectó la actividad GUS mediante tinción con X-Gluc como se describe anteriormente. Se examinó en tejido de hoja de plantas crecidas en invernadero o en cultivos de suspensión celular el número de puntos azules que se tiñeron. Como se muestra en la Tabla 2, el gen promotor T1275-GUS era activo en cada una de las diversas especies examinadas.
TABLA 2 Expresión transitoria de la actividad GUS en tejidos de diversas especies de planta
2
* Número de puntos azules: 1-10(+), 10-100(++), 100-400(+++).
Se aisló el fragmento de 4,2 kb que contenía aproximadamente 2,2 kb del promotor de T1275 condensado con el gen GUS y nos 3' mediante digestión de pTZ-T1275 con HindIII y EcoRI. Se ligó el fragmento aislado con el vector pRD400 (Datla et al., 1992, Gene, 211: 383-384) previamente digerido con HindIII y EcoRI, y se trató con fosfatasa intestinal de ternero. Se realizaron la transferencia del vector binario a Agrobacterium tumefaciens y la transformación del disco de hoja de N. tabacum SR1 como se describen anteriormente. Se examinó la actividad GUS en diversos órganos de muchas líneas transgénicas independientes. Se examinó el ARNm de GUS en el mismo órgano mediante el ensayo de protección de ARNasa (Melton et al., 1984, Nucleic Acids Res. 121: 7035-7056) utilizando una sonda que cartografió el extremo 5' del ARNm tanto en tejidos no transformados como transgénicos. Se aisló el ARN de tejidos molidos congelados utilizando el reactivo TRIZOL (Life Technologies) como se describe por el fabricante. Para cada ensayo, se hibridaron 10-30 \mug de ARN total con una sonda de ARN sin sentido correspondiente a 600 bases de la secuencia de planta T1275 y 400 bases del gen GUS. Se realizaron los ensayos utilizando el kit RPAII (Ambion CA) como se describe por el fabricante. Se separaron los fragmentos protegidos en gel desnaturalizante Long Ranger con acrilamida al 5% (J.J. Baker, N.J.), que se secó y expuso a película Kodak X-RP.
El análisis de hojas de plantas crecidas en invernadero seleccionadas aleatoriamente regeneradas del cultivo reveló un amplio intervalo de actividades GUS específicas (Figura 6A). Las plantas transformadas con PBI 121 (CLONETECH) que contienen el gen 35S-GUS-nos proporcionaron niveles de actividad específica comparables (datos no mostrados). Generalmente, el nivel de ARNm de GUS en las hojas (Figura 6B) se correlacionaba con las actividades GUS específicas. Además, la presencia de una sola banda de aproximadamente 600 bases en todas las muestras indicaba que el sitio de inicio de la transcripción de GUS se localizaba aproximadamente 180 bases cadena arriba del sitio de inserción del ADN-T en la secuencia de ADN de planta.
Para el análisis de la expresión de GUS en diferentes órganos, se examinaron con detalle líneas derivadas de la progenie de las líneas anteriores. La Tabla 3 muestra las actividades GUS específicas en una de estas plantas. Se expresa en hoja, tallo, raíz, semillas en desarrollo y órganos florales, sépalos, pétalos, anteras, pistilos y ovarios a niveles variables, confirmando la expresión constitutiva. La introducción del mismo vector en B. napus reveló también la expresión de actividad GUS en estos órganos (datos no mostrados), indicando que la expresión constitutiva no era específica del tabaco. El examen de ARNm de GUS en los órganos del tabaco mostró que los sitios de inicio de la transcripción eran los mismos en todos, y el nivel de ARNm era similar excepto en capullos de flores en que era inferior (Tabla 3).
Los ensayos realizados con ARN de hojas, tallo, raíz, semillas en desarrollo y flores de tabaco no transformado no revelaron un fragmento protegido utilizando la misma sonda que anteriormente (Figura 7). Por lo tanto, se supone que el sitio de inserción es transcripcionalmente silencioso en el tabaco no transformado y se activa mediante la inserción de ADN-T. La región cadena arriba del sitio de inserción es por lo tanto otro ejemplo de un promotor críptico de planta (Fobert et al., 1994, Plant J. 6: 568-577).
TABLA 3 Actividad GUS específica y niveles relativos de ARN en los órganos de progenie de la línea transgénica T64
3
* No realizado
Todas las publicaciones científicas y documentos de patentes se incorporan a la presente memoria como referencia.
La presente invención se ha descrito con respecto a realizaciones preferidas. Sin embargo, resultará obvio para expertos en la técnica que pueden hacerse una serie de variaciones y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención como se describe en las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SU MAJESTAD EN NOMBRE DE CANADÁ, REPRESENTADA POR EL MINISTRO DE AGRICULTURA Y AGROALIMENTACIÓN DE CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Central Experimental Farm
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Ottawa
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Ontario
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Canadá
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): K1A 0C6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: PIERRRE FOBERT
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 707 Tobin Terrace
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Saskatoon
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Saskatchewan
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Canadá
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): S7N 4P4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: VENKATRAN N. IYER
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2595 Maquinna ROad
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Kelowna
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Columbia Británica
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Canadá
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): V1W 2R9
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Promotor de tabaco
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 1:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2224 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:
4
5

Claims (22)

1. Un promotor aislado que comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una secuencia contigua de 18 pb de la SEC Nº ID 1.
2. El promotor aislado de la reivindicación 1, que comprende un fragmento de ADN caracterizado por el mapa de restricción de la Figura 5, de XbaI a SalI.
3. El promotor aislado de la reivindicación 1, en el que dicho promotor es un promotor constitutivo.
4. El promotor aislado de la reivindicación 1, en el que dicho promotor es un promotor críptico.
5. El promotor constitutivo aislado de la reivindicación 3, en el que dicho promotor tiene una secuencia nucleotídica coincidente con al menos un 70%, preferiblemente un 80%, y lo más preferiblemente un 90% de los nucleótidos de la SEC Nº ID 1.
6. El promotor constitutivo aislado de la reivindicación 3, en el que dicho promotor tiene una secuencia nucleotídica funcionalmente equivalente a la SEC Nº ID 1, que dirige constitutivamente la expresión de un gen exógeno.
7. Una molécula de ADN aislada que comprende la secuencia nucleotídica de la SEC Nº ID 1.
8. Un constructo de gen quimérico que comprende un ADN de interés para el que se desea la expresión constitutiva, y dicho promotor constitutivo según la reivindicación 3.
9. El constructo de gen quimérico según la reivindicación 8, en el que dicho promotor constitutivo tiene una secuencia nucleotídica coincidente con al menos un 70%, preferiblemente un 80% y lo más preferiblemente un 90% de los nucleótidos de la SEC Nº ID 1.
10. Un constructo de gen quimérico que comprende la molécula de ADN aislada de la reivindicación 7.
11. Un vector que comprende el constructo de gen quimérico de la reivindicación 9.
12. Un vector que comprende el constructo de gen quimérico de la reivindicación 10.
13. Un procedimiento para conferir la expresión constitutiva de un gen en una planta, que comprende: unir operativamente un ADN de interés, para el que se desea la expresión constitutiva, con un promotor constitutivo del tabaco, comprendiendo dicho promotor constitutivo al menos una secuencia contigua de 18 pb de la SEC Nº ID 1, para producir un constructo de gen quimérico, e introducir el constructo de gen quimérico en una planta capaz de expresar el constructo de gen quimérico.
14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho promotor constitutivo tiene una secuencia nucleotídica coincidente con al menos un 70%, preferiblemente un 80% y lo más preferiblemente un 90% de los nucleótidos de la SEC Nº ID 1.
15. Una célula de planta transgénica que contiene el constructo de gen quimérico de la reivindicación 8.
16. La célula de planta transgénica según la reivindicación 15, en la que dicho promotor constitutivo tiene una secuencia nucleotídica coincidente con al menos un 70%, preferiblemente un 80% y lo más preferiblemente un 90% de los nucleótidos de la SEC Nº ID 1.
17. Una célula de planta transgénica que contiene el constructo quimérico de la reivindicación 10.
18. Una célula de planta transgénica según la reivindicación 16, seleccionada del grupo constituido por tabaco, N. tabacum, B. napus, soja, alfalfa, Arabidopsis, maíz, trigo y cebada.
19. Una planta transgénica que contiene el constructo de gen quimérico de la reivindicación 8.
20. La planta transgénica según la reivindicación 19, en la que dicho promotor constitutivo tiene una secuencia nucleotídica coincidente con al menos un 70%, preferiblemente un 80% y lo más preferiblemente un 90% de los nucleótidos de la SEC Nº ID 1.
21. Una planta transgénica que contiene el constructo de gen quimérico de la reivindicación 10.
22. La planta transgénica según la reivindicación 21, seleccionada del grupo constituido por tabaco, B. napus, soja, alfalfa, Arabidopsis, maíz, trigo y cebada.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999067389A2 (en) * 1995-05-15 1999-12-29 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Canada Cryptic regulatory elements obtained from plants
US20010047091A1 (en) * 1998-09-09 2001-11-29 Brian Miki Cryptic regulatory elements obtained from plants
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GB0312449D0 (en) * 2003-05-30 2003-07-09 Horticulture Res Internat Novel promoters
CN1282773C (zh) 2005-05-30 2006-11-01 武汉大学 二步凝固浴法制备再生纤维素纤维的方法
RU2519652C2 (ru) * 2012-08-16 2014-06-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ТРАНСГЕННОГО ТАБАКА Nicotiana tabacum L., СОДЕРЖАЩЕГО ГЕН UIDA
WO2023036691A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339684C (en) * 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
HU218034B (hu) * 1992-01-09 2000-05-28 Novartis Ag. Új növényi promoter
FR2703054B1 (fr) * 1993-03-23 1995-06-16 Sanofi Elf Promoteur vegetal inductible au stress et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur.

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