HU218034B - Új növényi promoter - Google Patents

Új növényi promoter Download PDF

Info

Publication number
HU218034B
HU218034B HU9204053A HU9204053A HU218034B HU 218034 B HU218034 B HU 218034B HU 9204053 A HU9204053 A HU 9204053A HU 9204053 A HU9204053 A HU 9204053A HU 218034 B HU218034 B HU 218034B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
promoter
hsp80
gene
region
dna construct
Prior art date
Application number
HU9204053A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9204053D0 (en
Inventor
Karen J. Brunke
Stacy L. Wilson
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HU9204053D0 publication Critical patent/HU9204053D0/hu
Publication of HU218034B publication Critical patent/HU218034B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Egy Brassica promotert (hsp80) izoláltak, amely lehetővé tesziheterológ gének expresszióját a növényi szövetek és szervek széleskörében. A találmány különböző deléciós és hibrid mutánsokat ismertet,amelyek aktivitásukat megtartják, és/vagy fokozott aktivitástmutatnak. Ismertetnek 5’-irányban található aktiválószekvenciákat,amelyek külön vagy egymással kombinációban konstitutív génexpresszióteredményeznek. Ezek a szekvenciák heterológ, nem konstitutívpromoterekre is kiválthatnak konstitutív expressziót. ŕ

Description

A találmány tárgyát egy, a növényekben működő új promoter képezi, közelebbről egy olyan promoter, amely egy kívánt gén konstitutív expresszióját irányítja. A találmány kiterjed továbbá olyan, 5’-irányban található szekvenciákra is, amelyek kívánt aktivitású hibrid promoterek létrehozásához alkalmazhatók.
Hősokkgének (hsp gének) ismeretesek különböző szervezetekben, így élesztőkben, Drosophilában (muslica) és néhány növényi fajban. A hősokkgének egy csoportja csak hő okozta stressz hatására expresszál fehérjét. A hősokkgének egy másik csoportja alacsony alapaktivitással rendelkezik, amely hő hatására erősen megemelkedik.
Növényekben heterológ gének géntechnikai úton való létrehozásánál a promoter megválasztása sokszor kritikus tényező. Míg bizonyos gének esetén kívánatos, hogy csupán adott hatásra (ingerre) expresszálódjanak vagy expressziójuk bizonyos szövetekre lokalizálódjon, más gének esetén konstitutív expresszió kívánatos, vagyis a géneknek az egész növényben, folyamatosan, a legtöbb szövetben végbemenő expressziója előnyös. Régebben a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét alkalmazták heterológ gének konstitutív expressziójára. Szabályozási és egyéb okokból előnyös lenne a heterológ gének expresszióját olyan promoterrel irányítani, amely nem kórokozóból származik. Emellett egy növényi promoter használata egyes szövetekben megváltoztathatja az aktivitási szintet és a szövetek azon körét, ahol expresszió érhető el víruspromoterrel.
A találmány tárgya tehát karfiolból (Brassica oleracea „Delira” változat) származó, konstitutív promoter, vagyis egy olyan promoter, amely folyamatosan expresszál géneket a legtöbb szövetben és szervben. A promoter működőképes formában hozzákapcsolható bármely kívánt génhez, és annak expresszióját irányítani képes. Ezt a promotert a korábban ismertetett hsp gének promotereitől az különbözteti meg, hogy konstitutív expressziójának alapszintje magas, és hő hatására az expresszió csupán kismértékben fokozódik.
Ezt a promotert „hsp80 promoter”-nek neveztük, mivel ez egy hősokk-konszenzus-elemmel rendelkező konstitutív promoter, és egy olyan génből származik, amely bizonyos homológiát mutat más fajok hsp80 génjeivel. A hsp80 promoter a hősokkfehérjék normál hőmérsékleten (20-25 °C) történő magas alapszintű termelését irányítja, és hőstressz hatására (35-40 °C) az expresszió csak mérsékelten emelkedik.
A mellékelt 1. ábra a pZ0217 plazmidot, valamint a pZ0601 és a pZ0601BS plazmidok előállítását mutatja.
A 2. ábra a pZ0602 plazmidot mutatja be.
A teljes promoter szekvenciáját az 1. táblázatban adtuk meg (1. szekvencia). A teljes natív szekvencia 1568 bázispárból áll. A nukleotidokat a natív hősokkprotein transzlációs kezdőkodonjától (ATG) visszafelé, (negatív irányban) számoztuk. A szekvencián belül a következő részleteket jelöltük:
A) A „TATA box” nyolc bázispárból álló „TATATATA” szekvencia, amely a -97. helytől a -90. helyig terjed.
B) Létezik egy 61 bázispárból álló vezetőszekvencia, amely a -61. helytől a -1. helyig terjed.
C) Egy cap helyet azonosítottunk a -61. bázisnál.
D) Úgy tűnik, hogy a -604. és -488. bázisok közti szakasz egy 5’ irányban található aktiválószekvenciát tartalmaz a promoter számára. Ezt a szakaszt UAS 1nek neveztük. Megfigyeltük, hogy ez a rész egy tranziens vizsgálatban konstitutív aktivitást hoz létre, és előzőleg „konstitutív box”-nak neveztük.
E) Úgy tűnik, hogy a -1000. és a -604. bázisok közti szakasz egy további, 5’-irányban található aktiválószekvenciát tartalmaz. Ezt a részt UAS 2-nek neveztük.
F) Úgy tűnik, hogy a -488. és -120. bázisok közti szakasz egy további, 5’-irányban található aktiválószekvenciát tartalmaz. Ezt a szakaszt UAS 3-nak neveztük.
G) Két közvetlen ismétlődés található a -779. és -741. bázisok, valamint a -740. és -702. bázisok között. Ugyancsak a közvetlen ismétlődés egy részét tartalmazó szekvenciát találtunk a -701. és a -677. bázisok között.
H) Egy hősokk-konszenzus-elem található a -131. és -120. bázisok között, egy másik pedig a -244. és -237. bázisok között.
A találmány tehát egyrészt olyan DNS-konstrukcióra vonatkozik, amely a Brassica hsp80 promotert tartalmazza működőképes formában egy heterológ génhez kapcsolva. Mivel elfogadott az a tény, hogy ezen a DNS-szekvencián belül kisebb változtatások létrehozhatók a promoter aktivitásának lényeges befolyásolása nélkül, a találmány ugyancsak kiterjed olyan DNS-szekvenciákra, amelyek „funkcionális megfelelői” a Brassica hsp80 promotemek, és olyan konstrukciókra, amelyek ilyen DNS-szekvenciákat tartalmaznak működőképes formában egy heterológ génhez kapcsolva.
Leírásunkban a következő definíciókat alkalmaztuk:
„Funkcionális megfelelő” alatt bármely olyan DNSszakaszt értünk, amely komplementer azzal a DNSszekvenciával, amely szigorú (stringent) hibridizációs körülmények között a referenciaszekvenciával hibridizéi, és a Brassica hsp80 promoterhez hasonló aktivitással rendelkezik.
„Szigorú (stringent) hibridizációs körülmények” alatt azt értjük, hogy a hibridizálás 60 °C-on, 2,5 χ nátrium-klorid-citrát pufferben (SSC puffer) történik, és ezt csak öblítés követi 37 °C-on, olyan csökkentett pufferkoncentráció mellett, amely a hibridizációt nem befolyásolja.
„Heterológ gén” alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely bármely, a Brassica hsp80 proteintól különböző peptidet vagy proteint kódol.
„Deléciót hordozó promoter” alatt bármely Brassica hsp80 promotert értünk, amelyben deléció van és aktivitása egy részét megtartja.
A „deléciót hordozó promoter funkcionális megfelelője” egy olyan, deléciót hordozó promoter, amely további deléciót szenvedett, mindazonáltal az előbbivel összehasonlítva lényegében azonos aktivitást mutat.
„Szabályozható promoter” alatt bármely olyan promotert értünk, melynek aktivitását cisz vagy transz-működésű faktorok szabályozzák.
HU 218 034 Β „Konstitutív promoter” alatt bármely olyan promotert értünk, amely folyamatosan aktív a legtöbb szervben és szövetben.
A hsp80 promotert (vagy ennek funkcionális megfelelőit) felhasználhatjuk bármely, kívánság szerinti heterológ gén konstitutív expressziójára. Ilyen alkalmazható heterológ gének például: inszekticid toxinok (például a Bacillus thuringiensis toxin), herbicidrezisztencia-gének, antibakteriális gének, gombarezisztencia-gének, vírusrezisztencia-gének és antifeedant gének.
Előnyös esetben a hsp80-heterológ génkonstrukciót egy vektorba inszertáljuk, és ezt a vektort eukarióta-gazdaszervezet transzformálására használjuk. Az eukarióta gazdaszervezet előnyösen egy növényi sejt vagy növényi protoplaszt. Az előnyös vektorok természetesen a választott gazdaszervezettől függően változhatnak. Kétszikűek esetében a vektort elektroporációval juttathatjuk a protoplasztba, vagy a vektor lehet egy Agrobacterium tumefaciens (A. t.) Ti-plazmid-származék, amely megfertőzi a sejtet vagy protoplasztot, és A. t. közvetítette transzformációban alkalmazható, beleértve az úgynevezett bináris technikákat [lásd például Gasser C. S., és munkatársai, Science, 244., 1293-1299. (1989)]. Egyszikűek előnyösen transzformálhatok az úgynevezett „ballisztikus” technikával (Gasser és munkatársai, lásd fent), vagy ugyancsak transzformálhatok protoplasztok felhasználásával. Bármely esetben a megfelelő transzformációs vektorok és standard transzformációs eljárások a gyakorlatban ismeretesek. A transzformált sejteket vagy protoplasztokat megfelelő tápfolyadékban tenyésztjük, és a transzformált növényt regeneráljuk. A transzformáit növény konstitutív módon expresszálja a heterológ gént.
Meglepő módon azt is kimutattuk, hogy ebben a promoterben különböző deléciókat hozhatunk létre, és a kapott deléciót hordozó promoter vagy a) megemelkedett aktivitással, b) lényegében a natív promoterével megegyező aktivitással vagy c) (részben) megtartott aktivitással rendelkezik.
így a találmány tárgyát képezi egy, a Brassica hsp80 promoteréből előállított, deléciót hordozó promotert tartalmazó DNS-szekvencia. A találmány tárgyköréhez tartozik továbbá egy olyan DNS-konstrukció, amely egy deléciót hordozó promotert tartalmaz működőképes formában egy heterológ génhez kapcsolva. A találmány ugyancsak kiterjed a deléciót hordozó promoterek funkcionális megfelelőire és a funkcionálisan megfelelő, deléciót hordozó promotert és egy heterológ gént tartalmazó konstrukciókra.
Különböző deléciót hordozó és hibrid promotereket állítottunk elő a példákban ismertetettek szerint. A deléciót hordozó promoterek első sorozatát 60IBS sorozatnak neveztük. Ezeket a promotereket a -118-tól a -246-ig terjedő bázispárokat magukban foglaló deléció jellemzi. Azt találtuk, hogy ennek a sorozatnak a 601BS-delta-2-3 nevezetű promotere, amelyből a -118-tól a -246-ig terjedő bázispárokat deletáltuk, az intakt promoterhez képest az aktivitás körülbelül 50-75%-át tartotta meg.
A deléciót hordozó promoterek második sorozatát 602-es sorozatnak neveztük. Ezen promoterek mindegyikéből kiestek legalább a -488-tól a -134-ig terjedő bázisok, és különböző hosszúságú 5’-végi delécióval rendelkezhetnek, amint azt a 3. példában összefoglaltuk. Meglepő módon néhány deléció fokozta az aktivitást.
A 603-as számú deléciót hordozó promotert a -1125-től a - 134-ig terjedő bázisok deléciója jellemzi. Ez a promoter csupán 10%-át tartotta meg az intakt promoter aktivitásának. A 604-es számú deléciót hordozó promoter deléciót szenvedett a -1568-tól a -1125ig és a -496-tól a -134-ig terjedő bázisok közti szakaszon, és az aktivitásnak körülbelül 25%-át tartotta meg. A 605-ös számú deléciót hordozó promotert a -488. bázispártól felfelé az összes bázispárok deléciója jellemzi, ennek megfelelően az aktivitás az eredetinek csupán 6-8%-ára csökkent.
Az aktivitásban szerepet játszó, egy különösen fontos terület található a -134. és a -120. bázispárok között. A 601BS(BSph) nevezetű deléciót hordozó promoterből csak ezt a kis szakaszt deletáltuk, annak aktivitása azonban az intakt promoter aktivitásának csupán körülbelül 50-75%-ára csökkent. A találmány szerinti előnyös promoterek tehát legalább ezt a rövid szekvenciát tartalmazzák.
A -604. és -488. bázisok közti szakasz (UAS 1) vagy ennek része, amint azt fent említettük, úgy tűnik, számos szövetben felelős a konstitutív aktivitás előidézéséért. Úgy tűnik, hogy az UAS 2 és az UAS 3 további szövetekben fejt ki aktivitást, amint azt fent ismertettük. A találmány további tárgyát képezi tehát konstitutív aktivitás átvitele egy egyébként nem konstitutív pi omoterre (például egy olyanra, amely egyébként indukálható vagy más módon szabályozható) egy vagy több olyan felfelé (5’-irányban) található aktiválórégiónak működőképes formában egy indukálható vagy szabályozható promoterhez való kapcsolásával, illetve abba való inszertálásával, amely önmagában aktív néhány szervben/szövetben vagy azok többségében, és együtt úgynevezett konstitutív aktivitást hoznak létre. A találmány kiterjed az ilyen átvitt konstitutív aktivitással rendelkező, működőképes formában struktúrgénekhez kapcsolt promotereket tartalmazó DNS-konstrukciókra, kiterjed eljárásokra, például növényi sejtek és protoplasztok transzformálásának eljárására, továbbá a konstrukciókkal transzformált növényi sejtekre és protoplasztokra.
Felismertük, hogy elégségesek lehetnek az UAS 1-, 2- és 3-régióknál kisebb régiók a konstitutív aktivitás átvitelére. Ez vizsgálható az ezekben a régiókban létrehozott deléciók segítségével, a gyakorlatban jól ismert technikák felhasználásával. Az UAS-régiókban deléciókat hordozó promotereknél ezután vizsgálhatjuk a konstitutív aktivitás megtartottságát. Ezek a vizsgálati módszerek szintén ismeretesek a mindennapi gyakorlatban.
Az UAS 1-, 2- és 3-régiók egyedül vagy együttesen egy olyan promoter aktivitásának visszaállítására is felhasználhatók, amely deléció és/vagy mutáció révén
HU 218 034 Β inaktívvá vált. Az előbbi megoldás szintén a találmány tárgykörébe tartozik. Ennek egyik példáját a CaMV 35S promoter képezi, amelyet addig deletáltunk, amíg el nem vesztette működőképességét. Az UAS 1-, 2- és 3-elemek egyedül vagy együttesen történő inszerciója visszaállítja a promoter aktivitását néhány vagy az öszszes szövetben.
A találmányt a következő, nem kizárólagos példákkal szemléltetjük.
1. példa
A hsp80 promoter izolálása
Brassica oleracea (’Delita’ változat) génkönyvtárat létesítettünk Charon 35 Lambda fágban, K802 sejtekben, lényegében Maniatis és munkatársai által ismertetett módszer szerint eljárva [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 282-283. (1982)]. Ezt a génbankot Drosophila hsp83 gén Pvul-Stul fragmensével vizsgáltuk [Hackett, R. W., és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 11., 7011-7030. [(1983)]. Húsz, a Drosophila génnel nyilvánvaló homológiát mutató rekombinánst nyertünk, és próbaként a Drosophila hsp83 gén ffagmensét használva Southem-lenyomat-vizsgálatot végeztünk. Egy 5,8 kb nagyságú HindlII fragmenst választottunk szubklónozás céljára pUC9 vektorba, és az így kapott plazmidot pZ0217-nek neveztük. Ezt a plazmidot mutatja az 1. ábra.
A következőkben a kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) gént (Pharmacia) az ismert vektor, a pUC19 PstI hasítási helyére inszertáltuk. Ezután a NOS terminátor szekvenciát [Bevan, M. és munkatársai, „Structure and Transcription of the Nopaline Synthase Gene Region of T-DNA”, Nucl. Acids Rés., 11. (2) (1983)] inszertáltuk a Pstl-HindlII hasítási helyre. Az így kapott plazmidot pZ030-nak neveztük. A pZ0217 plazmid BglII fragmensét különválasztottuk, és a pZ030 BamHI hasítási helyére szubklónoztuk. Ez a promoter-CAT génNOS terminátor konstrukciót eredményezte, amelyet egy EcoRI-HindlII fragmensként vittünk át a kereskedelemben hozzáférhető pTZ18R vektorba (Pharmacia), így kaptuk a pZ0601 plazmidot, amint azt az 1. ábra mutatja.
2. példa
Plazmidkonstrukciók
A pZ0601-ben található hsp80 promotert in vitro mutagenezisnek vetettük alá, az „Oligonucleotid Directed In Vitro Mutagenesis System” felhasználásával (Amersham). A gyártó utasításai szerint két oligonukleotidot szintetizáltunk, hogy két egyedi restrikciós hasítási helyet hozzunk létre a promoterben a „TATA box”-tól 5’-irányban, BamHI hasítási helyet a -134. és Sphl hasítási helyet a -120. bázisnál. (Minden nukleotidpozíciót a transzlációs kezdőkodonhoz viszonyítva adtunk meg.) Ezt az új plazmidot pZ0601BS-nek neveztük, és szintén az 1. ábra mutatja.
A pZ0602 éspZ0603 plazmidok
A) A pZ0601BS plazmidot BamHI enzimmel emésztettük, és a végeket DNS-polimeráz Klenow-fragmense segítségével feltöltöttük. A DNS-t ezután KpnI enzimmel emésztettük, és az így kapott, promoter nélküli fragmenst alacsony olvadáspontú agarózgélen elválasztottuk.
B) A pZ0601BS plazmidot BamHI és KpnI enzimekkel emésztettük, és a hsp80 promotert alacsony olvadáspontú agarózgélen elválasztottuk. Ezt a fragmenst ELUTIP (Schleicher és Schnell) felhasználásával tisztítottuk, és vagy Dral, vagy FnuDII enzimekkel emésztettük.
C) A B) lépésben nyert, a -1568-tól a -488. bázisig terjedő Dral fragmenst az A) lépésben kapott, promoter nélküli szakaszba kapcsoltuk. A kapott plazmidot pZ0602-nek neveztük, és a 2. ábrán mutatjuk be.
D) A -1568-tól a -1125. bázisig terjedő FnuDII szakaszt az A) lépésben kapott, promoter nélküli fragmensbe kapcsoltuk. Az így kapott plazmidot pZ0603-nak neveztük.
A pZ0604 plazmid
A) A pZ0601BS plazmidot Smal és BamHI enzimekkel emésztettük, és a BamHI helyet T4 DNS-polimeráz és dezoxinukleotidok felhasználásával feltöltöttük. Az így nyert, promotert nem tartalmazó fragmenst alacsony olvadáspontú agarózgélen elválasztottuk.
B) A pZ0601BS plazmidot FnuDII-vel emésztettük. A -1125-től a -496. bázisig terjedő szakaszt az A) lépésben nyert, promoter nélküli fragmensbe kapcsoltuk, így kaptuk a pZ0604 plazmidot.
A pZ0605 plazmid
A) A pZ0601BS plazmidot BamHI és Smal enzimekkel emésztettük, és a kapott, promoter nélküli fragmenst alacsony olvadáspontú agarózgélen elválasztottuk.
B) A pZ0601BS plazmidot Dral enzimmel emésztettük. A -488-tól a -134. bázisig terjedő fragmenst az A) lépésben kapott, promoter nélküli fragmensbe kapcsoltuk, így nyertük a pZ0605 plazmidot.
Deléciót hordozó mutánsok
A pZ0602 plazmidból a hsp80 promoter 5’-végi delécióinak sorozatát állítottuk elő. A pZ0602 plazmidot SacI és Smal enzimekkel emésztettük, hogy az Exonukleáz III (Stratagene) emésztés számára megfelelő szubsztrátot kapjunk. Különböző ideig tartó, Exonukleáz III-mal végzett kezelés után a kapott DNS-fragmenseket tompa végűvé alakítottuk Mung-babnukleáz (Boehringer Mannheim) felhasználásával. A DNS-fragmenseket alacsony olvadáspontú agarózgél-elektroforézis segítségével elválasztottuk. Az előtűnő csíkokat kivágtuk, hígítottuk és ligáltuk. Transzformációt követően deléciót hordozó mutánsokat választottunk, és ezeket a kapcsolódási ponton túl szekvenáltuk.
A pZ0601BS plazmidból a hsp80 promoter 3’-végi delécióinak sorozatát állítottuk elő, a plazmid BamHI és Sphl enzimekkel való emésztését követően az 5’végi deléciók létrehozásánál követett eljárást folytattuk.
3. példa
Biológiai próbák Sárgarépa-sejtvonal fenntartása „Redwood City Wild Carrot” (RCWC) szuszpenziós tenyészetet (a Stanford Egyetemről) a következő,
HU 218 034 Β répaszuszpenziós tápfolyadékban (Carrot Suspension Médium) tartottunk fenn: IxMS sók, I mg/1 nikotinsav, 1 mg/1 piridoxin-HCl, 1 mg/1 tiamin, 100 mg/1 inozit, 0,1 mg/1 2,4-D, 30 g/1 szacharóz, KOH-val pH 5,8-ra beállítva. A tenyészetet minden 7. napon friss tápfolyadékban való 1:10 arányú hígítással tartottuk fenn.
Protoplaszt képzése
Az RCWC szuszpenziós tenyészetet használat előtt négy nappal 1:10 arányban hígítottuk. 50 ml tenyészetet (megfelel körülbelül 5 ml ülepített sejttérfogatnak), 10 percig 500 g-vel ülepítettünk. A sejteket ezután a következő szűrt répaenzimoldat (Carrot Enzyme Solution) 50 ml-ében újraszuszpendáltuk: 10 g/1 Cellulysin (Calbiochem), 5 g/1 Rhozyme (Genecor), 0,4 mol/1 mannit, 50 mmol/1 CaCl2, 10 mmol/1 NaOAc, pH 5,8. A sejteket az emésztés alatt két óra hosszat kíméletesen görgettük. A protoplasztokat kétszer mostuk, és répatenyészet-tápfolyadékban (Carrot Culture Médium, CCM) újraszuszpendáltuk, amely azonos volt a fent ismertetett „Carrot Suspension Medium”-mal, azzal az eltéréssel, hogy ahhoz 0,4 mol/1 mannitot adtunk. Hemocitométerben megszámoltuk az 1:10 hígításban található protoplasztokat, a sejtsűrűség meghatározása céljából.
Elektroporáció
A cirkuláris elektróddal rendelkező PG200 Progenitor II (Hoefer) készüléket használtuk az összes elektroporációhoz. A mintákat 24 rekeszű steril mikrolemezben elektroporáltuk, 250 voltnál 100 msec-ig.
Mindegyik CAT- (Pharmacia) konstrukciót tartalmazó plazmid 3-4 párhuzamos mintáját vizsgáltuk többszöri kísérletben. 30-50 pg pZ0601BS plazmid DNS-t használtunk mindegyik kísérletben kontrollként. Az összes többi plazmidból a pZ0601BS plazmidhoz viszonyítva azonos moláris mennyiségű DNS-t vizsgáltunk.
Körülbelül 106 protoplasztot 1,5 ml térfogatú csövekbe osztottunk szét, két percig 500 g-vel centrifugáltuk, és a felülúszó nagyobb részét eltávolítottuk. Mindegyik DNS-mintát 75 pl 2 mol/l-es KCl-hez adtuk. A térfogatot 1 ml-re egészítettük ki CCM hozzáadásával (a pH-t 8,0 -ra állítottuk be), ezt a keveréket elektroporáltuk, és azonnal 5 ml CCM-ben (pH 5,8) hígítottuk egy Petri-csészében. A hígított mintákat 1-2 napig sötét helyen tároltuk, mielőtt azokat CAT-vizsgálat céljára elővettük.
Promoter Deletált szakasz Relatív aktivitás
60 IBS semmi 100%
602 deIta-3-2 -1568-tól -1000-ig és -488-tól -134-ig 125-175%
602 delta-3-3 -1568-tól -948-ig és -488-tól -134-ig 75-125%
602 delta-4-9 -1548-tól - 830-ig és -488-tól -134-ig 100-150%
602 delta-4-6 - 1548-tól -628-ig és -488-tól -134-ig 75-100%
601BS delta-2-3 -493-tól -118-ig 50-75%
Promoter Deletált szakasz Relatív aktivitás
603 -1125-től -134-ig körülbelül 10%
604 -1568-tól -1125-ig és -496-tól - 134-ig körülbelül 25%
605 -1568-tól -488-ig 6-8%
601BS(BSph) -134-től -120-ig 50-75%
4. példa
Konstitutív expresszió a teljes növényben
Dohányt transzformáltunk a következő eljárás szerint.
Növényi szövet
Dohánylevél-explantátumokat steril körülmények között növesztett dohánynövényekből nyertünk. A steril dohánynövényeket körülbelül egy hónapos időközönként vegetatív módon szaporítottuk tovább úgy, hogy a meglevő palánta csúcshajtásait eltávolítottuk, és azokat 75 ml, agarral szilárdított, hormonmentes táp folyadékot (0-Ό tápfolyadékot) tartalmazó, szivaccsal kombinált zárókupakkal ellátott edényben tenyésztettük. A táp folyadék Murashige-Skoog-sókat, 100 mg/ml töménységű mioinozit törzsoldatból 1 ml/l-t, 5 ml/1 vitamixoldatot (amely 0,5 mg/1 piridoxin-HCl-ot, 0,5 mg/1 nikotinsavat és 1,0 mg/1 tiamint biztosít) és 3% szacharózt tartalmazott. A dohánynövényeket közepes erősségű, folyamatos megvilágítás mellett tartottuk. Az edényeket, kupakjukat zöld papírszalaggal körberagasztva vagy - a jobb gázcsere érdekében - a nélkül, tartottuk.
Agrobacterium vektor
Agrobacterium tumefaciens organizmusok transzformálására egy binárisvektor-rendszert használtunk, majd ezen baktériumok segítségével transzformáltuk a dohánysejteket.
Általános módszerek
Az Agrobacterium vektorokat -70 °C-on tároltuk. A transzformálás előtt körülbelül 18 órával 25 ml, a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó steril LB3 tápfolyadékba (lásd lentebb) 100-500 mikroliter Agrobacterium kultúrát oltottunk. A kultúrát 28 °C-on, 250 fordulat/perc sebességgel rázatva egy éjszakán át tenyésztettük.
LB3 tápfolyadék összetétele (1 literre)
Tripton 10 g
Elesztőkivonat 5 g
NaCl 4 g
KC1 1 g
MgSO4.7H2O 3 g
Vízzel kiegészítve 1 literre, és flaskánként 25 ml-es adagokban kimérve.
A használt antibiotikumok 25 pg/ml sztreptomicin és 50 pg/ml kanamicin voltak. A transzformációt lehetőség szerint a sejtek logaritmikus fázisában végeztük; a 600 nm-en mért fényelnyelés mértéke előnyösen 0,50-1,0 közé esett. A kultúrát 108 sejt/ml sűrűségre hígítottuk 50 ml hormonmentes 0/0 tápfolyadékban.
A dohánylevél-explantátumokat 3 percig a fentiek szerint készült, transzformált Agrobacterium kultúra 10x
HU 218 034 Β sejt/ml hígításába mártottuk. Az explantátumokat ezután kivettük, majd steril Whatman szűrőpapírral szárazra itattuk. Ezután 2 napra antibiotikummentes regeneráló táptalajra helyeztük. A harmadik napon az explantátumokat a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó regeneráló táptalajra helyeztük. Az explantátumok 3-4 hétig maradtak ezeken a lemezeken, vagy addig, amíg a feltehetően transzformált hajtások nem elég nagyok ahhoz, hogy gyökereztető táptalajra kerüljenek. A gyökereztető táptalaj fele töménységre hígított 0/0 táptalaj, amely 250 mg/ml karbenicillint és a genetikai konstrukciótól függően vagy 100 mg/ml kanamicint, vagy 50 mg/ml higromicint tartalmazott. Körülbelül két héten belül a hajtások gyökeret eresztettek és megzöldültek. Ezután tenyésztőedényekbe kerültek, és azonosítási számot kaptak. Ezt követően különböző szöveteken kíséreltünk meg konstitutív promoteraktivitást kimutatni. Transzformációs vektorok pZ0639
A pZ0601 előállításához hasonlóan plazmidot készítettünk, azzal a különbséggel, hogy az a hsp80-CAT gén NOS terminátora helyett a hsp80-GUS-NOS terminációs kazettát tartalmazta. Ezt a plazmidot pZ0612-nek neveztük.
A pBinl9 (Clonetech) plazmidot EcoRI és HindlII enzimekkel hasítottuk. A pZ0612 plazmidot Seal, EcoRI és HindlII enzimekkel vágtuk. Mindkét emésztés termékeit alacsony olvadáspontú agarózgélen szeparáltuk. A 12 kb méretű pBinl9 vektorfragmenst és a 3,6 kb méretű hsp80-GUS-NOS fragmenst izoláltuk és egymáshoz ligáltuk. Az így kapott, pZ0639-nek nevezett plazmid PstI enzimmel való hasítás alapján volt azonosítható.
pZ0640
A fent ismertetett eljárást követve állítottuk elő a pZ0640 plazmidot. Ez a plazmid abban különbözik a pZ0639-től, hogy csonka hsp80 ffagmenssel rendelkezik (0,624 kb a teljes 1,56 kb promoterrel szemben). pZ0641
A fent ismertetett eljárást követve állítottuk elő a pZ0641 plazmidot. A pZ0641 a teljes promoter helyett egy 0,252 kb hosszúságú hsp80 promotert tartalmaz. pZ0642
A fent leírt eljárást követve állítottuk elő a pZ0642 plazmidot. A hsp80 promoter és ennek származékai helyett a pZ0642 a CaMV 35S promoter-GUS-NOS fragmenst tartalmazza.
5. példa
Promoter aktivitása
A 4. példában előállított növényeket a heterológ gén, a GUS expressziójára nézve vizsgáltuk. Szövetmintákat vettünk, és azokat GUS jelenlétére nézve vizsgáltuk. Minden szövetmintában kimutattunk GUS-aktivitást. Kontrollszöveteket (olyan nem transzformált növényekből, amelyeket azonos tenyésztési és regenerációs eljárásnak vetettünk alá) is vizsgáltunk GUS-aktivitásra nézve; ilyen aktivitást nem találtunk. A zárójelben szereplő szám a mintául szolgáló növények számát jelöli. Az eredményeket a pozitív esetek számában adjuk meg (kék szín észlelése). NT: nem vizsgáltuk, NA: nem hozzáférhető, M: mutáns.
Plazmid Konstrukció (plusz GUS; NOS terminátor)
pZ0639 Teljes hsp80-hossz
pZ0640 hsp80 -1000--488+-134--23 területe (tartalmazza az UAS 1+UAS 2+TATA területet)
pZ0641 hsp80 -628--488 + -134--23 területe (tartalmazza az UAS 1 +TATA területet)
pZ0642 35S promoter
Szövet (7) pZ0639 (?) pZ0649 (6) pZ0641 (5) pZ0642 (7)
Levélmezofil- lum 1/7 1/5; INT 1/5 5/7
Levélér 5/7 1/6 2/5 3/7
Levélszőr 4/7 1/6 2/5 1/7
Oldalmerisz- téma 2/7 0/5; INT 1/5 4/7
Oldalszőr 1/7 0/6 0/5 1/7
Csészelevélér 3/7 3/6 2/4; INA 4/6; INA
Csészelevélszőr 4/7 1/6 0/4 0/6; INA
Termőlevél 2/7 4/6 0/4; INA 4/6; INA
Virágcső/szirom- ér 1/7 1/6 1/4; INA 3/6; INT
Virág- cső/sziromszőr 4/7 2/6 0/4 3/6; INT
Éretlen portok 4/7 5/6 2/3; INA; 1M 3/5; INA; INT
Pollen 5/5; 2NA 5/6 3/3; INA; 1M 0/6; INA
Gyökér 6/7; INT 1/4; 2NT 0/4; INT 3/6; INT
Törzs 2/2; 6NT 0/2; 4NT 0/1; 4NT l/l; 6NT
Ezek az adatok azt mutatják, hogy a hsp80 promoter bizonyos mértékig minden vizsgált szövetben aktív, azonban a legtöbb esetben a festődés intenzitása kisebb volt a 35S promotemél tapasztaltnál. A levélmezofillumok általában nem festődnek csak vákuuminfiltráció után, azután azonban a sejtek nagy számban festődnek, bár a megjelenésük inkább hasonlít trichomákra, mint típusos mezofillumsejtekre.
6. példa
Hibrid promoterek
A hsp80 promoter különböző, 5’-irányban található szakaszait egy nem aktív heterológ minimálpromoterhez kapcsoltuk, annak megállapítása céljából, hogy az
HU 218 034 Β
5’-irányban található szakasz aktivitást hoz-e létre. Az alább bemutatott fragmenseket a CaMV transzkripciós kezdőhelyéhez viszonyítva -46-tól a +131. bázisig terjedő (a „TATAAA box” -31-től -25-ig terjed) csonka CaMV 35S promotertől 5’-irányba klónoztuk, az előbbi promotert a továbbiakban „-46 35S promoter”-nek nevezzük. (Megjegyezzük, hogy a csonkított CaMV 35S azonosítására itt használt számozás a CaMV 35S-re vonatkozik, és nem azonos a hsp80 és annak fragmenseire máshol használt számozással.) A pZ0625 plazmid tartalmazza a -46 35S promotert, a kukorica ADH1S gén 6os intronját, a β-glukuronidáz (GUS) kódolószakaszát, és a pT7T3 18U-ban levő NOS terminátort (Pharmacia). A következő Brassica hsp80 fragmenseket klónoztuk a -46 35S promoterszakasztól 5’-irányba:
Fragmcns (az 1. táblázat szerinti számozás) Plazmid
-628-tól -488-ig, és -134-től -120-ig pZ0670
-1000-tól -488-ig és -134-től -120-ig pZ0681
-1000-től -604-ig pZ0682
-488-tól -120-ig pZ0683
-1548-tól -488-ig, és -134-tól -120-ig pZ0689
A fenti plazmidokban található hibrid promotereket 670-es, 681-es, 682-es, 683-as és 689-es hibrid promotereknek neveztük.
Ugyancsak vizsgáltuk a pZ0612 plazmidot (amely azonos a pZ0601 plazmiddal, azzal az eltéréssel, hogy a CAT-gént a GUS-génnel cseréltük fel), amely a teljes hosszúságú hsp80 promoter által irányított GUS-t tartalmazza NOS-terminátorral (de intron nélkül) a pTZ 18Rben.
Protoplasztokat az előzőekben ismertetett módon répából, fekete mexikói édeskukoricából (BMS) és dohányból készítettünk. A protoplasztokat a kívánság szerinti plazmiddal elektroporáltuk, egy napig regenerálódni hagytuk, majd extraháltuk, és az extraktumokat GUS-aktivitásra vizsgáltuk. A GUS-aktivitást spektrofotometriásán mértük. Az eredmények mint átlagértékek szerepelnek, a pZ0663 (35S a -366-tól a +131. bázisig, 6-os intron, GUS, NOS-terminátor) teljes hosszúságú 35S promoterkonstrukcióra vonatkoztatva. A teljes hosszúságú 35S promotert Franck és munkatársai ismertették [Cell., 21., 285-294. (1980)].
Tranziens GUS-vizsgálat
Plazmid Dohány Répa BMS
pZ0663 1,0 1,0 1,0
pZ0625 0,03 0,01 0,03
pZ0670 0,16 0,28 0,02
pZ0681 0,13
pZ0682 0,24 0,23 0,08
pZ0683 0,17,
pZ0689 0,16 0,32 0,03
pZ0612 0,65
Tranziens CAT-vizsgálat
Plazmid Répa
pZ0602 delta-4-6 0,75-1,0
pZ0602 delta-3-2 1,25-1,75
pZ0605 0,06-0,08
pZ0601 BS-delta-2-3 0,05-0,75
pZ0601 BS 1,0
Amint a fenti táblázatból kitűnik, mindegyik 5’irányban található szakasz alapvetően azonos aktivitást eredményezett a 35S-46 promoterhez való kapcsolás után, és additív hatásuk, úgy tűnik, kicsi.
SZEKVENCIALISTA 30 1. Általános információ:
i) Bejelentő: Sandoz Limited ii) Bejelentés címe: Új növényi promoter iii) Szekvenciák száma: 1
2. Információk az 1. szekvenciára vonatkozóan:
i) Szekvenciajellemzők:
A) Hossz: 2042 bázispár
B) Típus : nukleinsav
C) Szálszám: kettő
D) Topológia: lineáris ii) Molekula típusa: DNA (genomiális) iii) Hipotetikus: nem iv) Antiszensz: nem xi) Szekvencia leírása: 1. szekvencia
ATCGATAACC ACGACCACGA CCAAAACCAC GATAGGAATA ATTTCCTTTT TCCGGATTTT CTTTGGTTCC CGTGGGTCGG GCATTGTGGT CTATTATAAG CGCCACAGCG AGTTCAGAGA CTTGTAGAAC ATAATGATTT TTGTGGAACG CCGAGACAGG CTTACCGCAA TAATCTAATT ACGTTTCCAC TTTTTCAAAA TCTTGAAATC GGAGAGTAAT TTTCTTTTGG TTATCAAACC GATCTTTGGT TCTCGCATAA TCATGCGTAA TCACGGCCTT AGCCTTTTCA TGAGAGGTTG TTTTCTCGGA ATCTAGATGA AGCTCCATGT TTACTTCCAA TGCCGGAAAC TGAAGTTTCT ATAAATAAAA ATTATTAGAA TATTATTCAT
GATTGTGACC ACGGCCACGA CCACGCCCAC 60 TTATATCCGT TGCATTTACC TCAGGAAATG 120 TTTTAATGAG GAGTTCATTA TTTCTCTCCG 180 ACCTCGTATA CCCACAATTT CTATATTGTT 240 TTTGGTAAGT TTTCTCGAGC ATTTCCGCTT 300 GCGCCGCTAT TCTCAATATA GCGGAATTGT 360 GTAGATTTTT CCACTCATCG AGTGCATGGG 420 TCTCCTTCAG AGCTTTCCAA AGATCTAAGG 480 GATTTTCATC TAGATGTCTT CTCAGAAATA 540 ATATATTGCC TTCTCTTATT GTTTCGAGTA 600 TTGTAACCCA TGCCGTGTAG TTTGTCCCAG 660 CGATTTTTGC CATTTGTATT TCTAAAGAAC 720 ATTAA.AAGAA ACCGTTTACA TTGATCATGC 7 80
HU 218 034 Β
AAGCAATTAC AAGGAGAAGC GATGTAAAGA AAAGTAAACC GATATTCATC CTAAATTCTC 840 TTGGAGTAAA TTCTCCAACG GATAAACCAT AAATAGAAAC ACAAATAAAA ATGGCACATA 900 AAAACAAAAG TGCGCGAATC ATCTTTCTTG AAAAAAAAAA TCGGAAGAGA GCGATTTGAA 960 ATTTTTGAGA GAAGATGAAA TATTTTGGAT GATGAAATGG AGTGAAAATG AGTTGTATTT 1020 ATAGATGAAA AACACTGTTC ATAACCGTTG GAGAAAGGGG AAATTTTGAA AAAATTTCTT 1080 TGTGACCGTT GGGGTTAAAT CGAGTGCACT AAAAATCAGT CTGAGAATAT CGTATTAAAC 1140 AGTCAATCAA ATCTATAAAA TTTCATAAAA GTAAAAATTA TGGCAATGAA ATATTTATGT 1200 TATGACAACA AATCATGCGA CGGCTCAGCC GATCAATGCA GAGTAATAAA TAAATTATAC 1260 GGCGGCTCGG CCGACCAATT AATAATAAAC AGAATATAAG GCGGCTCGGC CGACCAATAA 1320 ATAATAAACA GAATATAAGG CGGCTCGGCC GACCATTAAT AAATTAAATT ATTAGTAAAT 1380 AATATAGGCG GTATTCCGGC CATTATAACA ΤΑΑΤΑΤΑΛΛΤ AATAGTAGAG GCGGTATACC 1440 GACCATTATA ACAGGGTATA AATGATACAA ATAAATTTTA CCGAATCGCA GAGTGATCGT 1500 GCTGATAACG TGTTATGAAA ATAACTGAAA TTTTATTATA TCGCGGGAAT TTAAATAAGG 1560 GCAAAATTTT ATACCCGTAA AAATTATAAC ACTGAAAGAA AGTGTTTATC TGAGAGAGAA 1620 GGGAAGAGTG AAGTGTGTTC TTGAAACGAT CGAACTTGAT CGTATATATA AAGAAAAAAT 1680 CTACTGTGCA AATAGTGCAG CGGGCCCCAC ATCATTTATA ATTTCAACTT ATGCGGCGCT 1740 GTGTTCTCTG ACTTTCATAA CAAAATTATG TTATTTGTTT TAACACAAAA AAGTAGAAAA 1800 TTATAAAGAA GAAGAAAATA ACACATTGAC CAAAAAGAAG TAAATTAGTT ACACCCCAAG 1860 ATTATTGGGC CCAACTTGTC TCAAACTAAC AAGTTAAGCA TAATGGATCT CAGAAGGATC 1920 TAGAAACCCT ATAACGTTTG TGTATATATA CGTAACTTGT CTCTTCACTA CCTCGCATCT 1980 GCTCTCTCTA TTATCGTACC TCCTTGATAA ACCCTAGATC TCCCCGATTC TCAGCAACGA 2040 TG 2042

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy Brassica hsp80 promotert vagy ennek funkcionális megfelelőjét működőképes formában egy heterológ génhez kap- 30 csolódva tartalmazza.
  2. 2. DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy Brassica hsp80 promoter egy deléciós alakját vagy hibrid promoterét, vagy funkcionális megfelelőjét tartalmazza működőképes formában egy heterológ génhez kapcso- 35 lódva.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy deléciót hordozó promoterként a következő deléciós promoterek közül valamelyiket vagy ezek funkcionális megfelelőjét tartalmazza: 602, 602 delta- 40 3-3, 602 delta-4-9, 602 delta-4-6.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy hibrid promoterként a következő hibrid promoterek valamelyikét vagy ezek funkcionális megfelelőjét tartalmazza: 670, 681, 682, 683, 689. 45
  5. 5. Eljárás konstitutív aktivitás átvitelére egy indukálható, más módon szabályozható vagy inaktivált promoterre, azzal jellemezve, hogy
    a) Brassica hsp80 promoter 5’-irányban levő egy vagy több aktiválórégióját izoláljuk, és 50
    b) konstitutív aktivitás elérésére az említett régiót vagy régiókat működőképesen kapcsoljuk vagy inszertáljuk egy indukálható, más módon szabályozható vagy inaktivált promoterhez vagy promoterbe.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 55 hogy az 5’-irányban levő aktiválórégióként a Brassica hsp80 -604. és -488. bázisok közé eső régióját vagy annak egy részét tartalmazó régiót alkalmazunk.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5’-irányban levő aktiválórégióként a Bras- 60 sica hsp80 -1000. es a -604. bázisok köze eső szakaszt vagy annak egy részét tartalmazó régiót alkalmazunk.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5’-irányban levő aktiválórégióként a Brassica hsp80 -488. és -120. bázisok közé eső szakaszt vagy annak egy részét tartalmazó régiót alkalmazunk.
  9. 9. Konstitutív promoter, azzal jellemezve, hogy az egy indukálható, egyébként szabályozható vagy inaktivált promoter, amely különbözik a Brassica hsp80 promotertől, és az indukálható, más módon szabályozható vagy inaktivált promoterhez működőképes formában hozzákapcsolva vagy abba inszertálva a Brassica hsp80 egy vagy több, 5’-irányban található aktiválórégióját tartalmazza.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti promoter, azzal jellemezve, hogy az 5’-irányban található aktiválórégió tartalmazza a Brassica hsp80 promoter -604. és -488. bázisok közti szakaszát vagy annak egy részét.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti promoter, azzal jellemezve, hogy az 5’-irányban található aktiválórégió tartalmazza a Brassica hsp80 promoter -1000. és -604. bázisok közti szakaszát vagy annak egy részét.
  12. 12. A 9. igénypont szerinti promoter, azzal jellemezve, hogy az 5’-irányban található aktiválórégió tartalmazza a Brassica hsp80 promoter -488. és -120. bázisok közti szakaszát vagy annak egy részét.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti promotert tartalmazó DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy működőképes formában egy heterológ génhez van kapcsolva.
  14. 14. Az 1., 2. vagy 13. igénypont szerinti DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy heterológ génként inszekticid gént, herbicidrezisztencia-gént, antibakteriális gént,
    HU 218 034 Β gombaellenes gént, vírusellenes gént és/vagy anti-feedant gént tartalmaz.
  15. 15. Növényi sejt vagy protoplaszt, azzal jellemezve, hogy az 1., 2., 13. vagy 14. igénypontok szerinti DNSkonstrukcióval van transzformálva.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti sejt vagy protoplaszt, azzal jellemezve, hogy kétszikű.
  17. 17. A 15. igénypont szerinti sejt vagy protoplaszt, azzal jellemezve, hogy egyszikű.
HU9204053A 1992-01-09 1992-12-19 Új növényi promoter HU218034B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79192992A 1992-01-09 1992-01-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9204053D0 HU9204053D0 (en) 1993-04-28
HU218034B true HU218034B (hu) 2000-05-28

Family

ID=25155253

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9204053A HU218034B (hu) 1992-01-09 1992-12-19 Új növényi promoter
HU9204053A HUT69949A (en) 1992-01-09 1994-12-19 Novel plant promoter

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9204053A HUT69949A (en) 1992-01-09 1994-12-19 Novel plant promoter

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0559603A2 (hu)
JP (1) JPH05276951A (hu)
KR (1) KR100276370B1 (hu)
CN (1) CN1079779A (hu)
AU (1) AU661359B2 (hu)
CA (1) CA2086863A1 (hu)
CZ (1) CZ283124B6 (hu)
HU (2) HU218034B (hu)
IL (1) IL104332A0 (hu)
MX (1) MX9300059A (hu)
RU (1) RU2128704C1 (hu)
SK (1) SK280803B6 (hu)
ZA (1) ZA93145B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5659026A (en) * 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
WO1999067389A2 (en) * 1995-05-15 1999-12-29 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Canada Cryptic regulatory elements obtained from plants
JP2000503847A (ja) * 1996-01-29 2000-04-04 アグリトープ，インコーポレイテッド 植物におけるトランスジーンの発現のためのキイチゴプロモーター
NZ326284A (en) * 1996-02-01 2000-01-28 United Kingdom Government Promoter from tobacco to control the expression of exogenous DNA in plant species
BR9810248A (pt) 1997-06-12 2000-09-19 Dow Agrosciences Llc Sequências reguladoras para plantas transgênicas.
ZA9811228B (en) * 1997-12-12 1999-06-14 Mogen Int New constitutive plant promoters
DE69937688T2 (de) * 1998-12-21 2008-11-20 E.I. Dupont De Nemours And Co., Wilmington S-adenosyl-l-methionin synthetase promotor und dessen verwendung zur transgen-expression in pflanzen
US7217858B2 (en) 1998-12-21 2007-05-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company S-adenosyl-L-methionine synthetase promoter and its use in expression of transgenic genes in plants
US7122721B1 (en) 1999-10-05 2006-10-17 Basf Aktiengesellschaft Plant gene expression under the control of constitutive plant V-ATPase promoters
ES2640613T3 (es) * 2000-07-21 2017-11-03 Revance Therapeutics, Inc. Sistemas de transporte de agentes biológicos de múltiples componentes
US7064246B2 (en) 2001-05-01 2006-06-20 Macrae Amy F Use of transposable elements for altering gene expression
WO2008063093A1 (fr) * 2006-11-24 2008-05-29 Institut Fiziko-Khimicheskoi Biologii Im. A.N.Belozerskogo Mgu Procédé de surproduction d'une protéine cible dans un végétal
CA2687760C (en) 2007-05-23 2017-10-31 Syngenta Participations Ag Sugar beet polynucleotide markers
KR101301922B1 (ko) 2011-04-27 2013-09-06 한국생명공학연구원 내서성 양배추 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5447858A (en) * 1984-04-13 1995-09-05 Mycogen Plant Sciences, Inc. Heat shock promoter and gene
ATE112314T1 (de) * 1988-05-17 1994-10-15 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2086863A1 (en) 1993-07-10
AU661359B2 (en) 1995-07-20
HU9204053D0 (en) 1993-04-28
CZ392392A3 (en) 1994-03-16
RU2128704C1 (ru) 1999-04-10
IL104332A0 (en) 1993-05-13
AU3110493A (en) 1993-07-15
EP0559603A3 (hu) 1994-03-02
CN1079779A (zh) 1993-12-22
SK392392A3 (en) 1995-08-09
ZA93145B (en) 1994-07-08
SK280803B6 (sk) 2000-08-14
JPH05276951A (ja) 1993-10-26
CZ283124B6 (cs) 1998-01-14
KR100276370B1 (ko) 2001-02-01
HUT69949A (en) 1995-09-28
EP0559603A2 (en) 1993-09-08
KR930016542A (ko) 1993-08-26
MX9300059A (es) 1993-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Maiti et al. Promoter/leader deletion analysis and plant expression vectors with the figwort mosaic virus (FMV) full length transcript (FLt) promoter containing single or double enhancer domains
US5850019A (en) Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
Williamson et al. Differential accumulation of a transcript driven by the CaMV 35S promoter in transgenic tobacco
EP0223452B1 (en) Protection of plants against viral infection
WO1998005198A9 (en) THE PROMOTER (FLt) FOR THE FULL-LENGTH TRANSCRIPT OF PEANUT CHLOROTIC STREAK CAULIMOVIRUS (PC1SV)
JPH07506485A (ja) 真菌応答性キメラ遺伝子
HU218034B (hu) Új növényi promoter
PL177329B1 (pl) Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA
JPH08224085A (ja) 植物細胞の選択方法およびそれを利用した植物の再生方法
JP2003180354A (ja) 新規シグナル配列
US6420547B1 (en) Use of the full length transcript (FLt) from mirabilis mosaic caulimovirus to express chimeric genes in plants
JPH03112488A (ja) 調節ｄｎａ配列
US5612472A (en) Plant promoter
US5994521A (en) Full length transcript (FLt) promoter from figwort mosaic caulimovirus (FMV) and use to express chimeric genes in plant cells
US6225527B1 (en) Plant pathogen resistance genes and uses thereof
KR19990076504A (ko) 식물의 형질을 변화시키는 전사 인자의 유전자 및 그의 이용
EP0699239A1 (en) Genetic stabilizing elements
US6930182B1 (en) Composition and methods of using the Mirabilis mosaic caulimovirus sub-genomic transcript (Sgt) promoter for plant genetic engineering
Guiltinan et al. Epitope tagging for the detection of fusion protein expression in transgenic plants
KR100432533B1 (ko) 식물의 형질을 변화시키는 전사 인자의 유전자를 포함하는 무성번식 식물
PL172945B1 (pl) Sposób wytwarzania nowego konstruktu promotora roślinnego

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee