JP2000503847A

JP2000503847A - 植物におけるトランスジーンの発現のためのキイチゴプロモーター

Info

Publication number: JP2000503847A
Application number: JP9527070A
Authority: JP
Inventors: アンケロッグ，ジル; キースベストウィック，リチャード
Original assignee: アグリトープ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 2000-04-04
Also published as: EP0877814A1; WO1997027307A1; AU712253B2; AU1755997A; CA2243850A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、キイチゴゲノム由来の２つの異なるプロモーター領域の同定および単離に関する。このプロモーター領域は、ネイティブなキイチゴゲノムにおいて、キイチゴdru1遺伝子のコード領域に作動可能に連結されている。本発明のプロモーターは、その制御下に異種植物遺伝子の中程度の構成的発現を制御し得る。本発明はさらに、キメラ遺伝子、カセットベクター、キット、トランスジェニック植物、およびこのようなプロモーターを使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】植物におけるトランスジーンの発現のためのキイチゴプロモーター本発明の分野本発明は、異種植物遺伝子の構成的発現を提供し得るキイチゴ由来のプロモーターの同定、およびキメラ遺伝子、カセットベクター、キット、トランスジェニック植物、およびそのようなプロモーターを使用する方法に関する。参照文献 Adams,D.O.,and Yang,S.F.,Plant Physiology 70:117-123(1977). Akama,K.et al.,Plant Cell Reports 14(7):450-454(1995). Ausubel,F.M.,et al.,in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John W iley andSons,Inc.,Media PA(1992). Balazs,E.,et al.,Gene 19(3):239-249(1982). Beachy,R.,et al.,Annu.Rev.Phytopathol.28:451-74(1990). Beck,et al.,Gene 19:327-336(1982). Bellini,C.,et al.,Bio/Technol 7(5):503-508(1989). Benfey,P.N.,et al.,Science 250:959-966(1990). Benvenuto,E.,et al.,XXIst Annual Meeting of the Italian Society for Agricultural Genetics,Como,Italy,September 30-October 2,1987 Genet.Agrar .42(1)(1988). Bestwick,R.K.,et al.,PCT International Publication No.WO 95/35387,pu blished 28December 1995. Brunke,K.J.and Wilson,S.L.,European Patent Publication No.0 559 603 A2,publishedSeptember 08,1993. 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19Sプロモーター(Fraleyら，1994)、およびゴマノハグサモザイクウイルス（FMV)（Rogers，1995）プロモーターを含む。植物において遺伝子発現を調節するために有用であって、そして細菌供給源から得られたプロモーター（例えば、Agrobacterium由来のプロモーター）が、同定され、そして単離されている。このようなプロモーターはAgrobacterium Ｔ-DNAオパイン（ opine）シンターゼ遺伝子由来のプロモーターを含み、そして、ノパリンシンターゼ（nos）プロモーター（Rogers，1991）、およびオクトピンシンターゼ（ocs ）プロモーター（LeisnerおよびGelvin，1988）およびマンノピンシンターゼ（m as）プロモーターを含む。構成的発現を提供するのに有効な植物プロモーター（植物供給源由来のプロモーター）は、あまりよく知られておらず、そしてhsp80（カリフラワー由来の熱ショックタンパク質80）（BrunkeおよびWilson，1993）、およびトマトユビキチンプロモーター（Pictonら、1993）を含む。これらのプロモーターは、異種核酸配列の形質転換植物組織における構成的発現を指向するのに使用され得る。現在のところ、比較的少数の植物プロモーター、特に構成的植物プロモーターが同定されている。このようなプロモーターの植物遺伝子工学における使用は、現在の所、かなり限定されている。なぜなら、植物における遺伝子発現は、大部分は、典型的には、組織、発達または環境調節型であるからである。発明の要旨本発明は、制御下に配置された核酸配列の中程度のレベルの構成的発現を別々におよび組み合わせで提供するキイチゴプロモーターに関する。本発明のプロモーターはまた、異種の非構成的プロモーターにおける構成的発現をも与える。本発明は、ネイティブなキイチゴゲノムにおいて、dru1遺伝子のコード領域に作動可能に連結したプロモーターに関する。本発明のキメラ遺伝子は、キイチゴ dru1プロモーターの転写制御下に目的の産物をコードするDNA配列を含む。このD NA配列は、典型的にはプロモーターに対して異種であり、そして産物の構成的発現を可能にするようにプロモーターに作動可能に連結されている。一つの実施態様において、産物は、このような細胞が、非形質転換細胞に対して毒性である抗生物質のある量に対して耐性であるようにすることにより、キメラ遺伝子を含む形質転換植物細胞の選択を可能にするポリペプチドである。産物の例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼのようなアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない。１つのこのような実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼIIをコードするhpt遺伝子配列を含む。代替の実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするnptII遺伝子配列を含む。別の実施態様において、産物は、ポリペプチドを発現する形質転換植物細胞に除草剤耐性を与えるポリペプチドである。１つのこのような実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるブロモキシニル特異的ニトリラーゼをコードするbxn遺伝子を含む。このキメラ遺伝子を含む形質転換植物はブロモキシニル特異的二トリラーゼを発現し、そしてブロモキシニル含有除草剤の適用に対して耐性である。除草剤耐性を与える遺伝子をコードする他のDNA配列の例は、グリフォセートに対する耐性を与えるEPSPシンターゼ遺伝子（5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ酵素をコードする）；除草剤「GLEAN」に対して耐性を与える、アセトラクテートシンターゼ遺伝子；ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT）をコードするビアラホス耐性遺伝子（bar遺伝子）、ならびにグリフォセート耐性遺伝子、CP4およびGO Xを含む。本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターに作動可能に連結されているこれらの除草剤耐性遺伝子に１つ以上を含む。別の実施態様において、DNA配列またはcDNA配列は、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質、キュウリモザイクウイルスコートタンパク質、タバコ条斑ウイルスコートタンパク質、ジャガイモウイルスコートタンパク質、タバコ茎えそウイルスコートタンパク質およびタバコモザイクウイルスコートタンパク質のようなウイルスコートタンパク質をコードする。１つのこのような実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、dru1プロモーターの転写調節下にあるAL MV、CMV、TSV，PVX、TRV、またはTMVのようなウイルスコートタンパク質を含む。あるいは、DNA配列は、エチレン非感受性を与えるETR1遺伝子の変異形態のような優性欠損タンパク質をコードする遺伝子に対応する。さらに別の実施態様において、DNA配列は、ACCD遺伝子のような植物生化学経路を改変する能力のある遺伝子に対応する。ACCD遺伝子は、エチレン生合成経路において前駆体を分解する産物を形成する。別の局面では、本発明は、キイチゴdru1遺伝子由来の構成的プロモーターを含む単離されたDNA分子を含む。１つのキイチゴdru1プロモーターの例は、dru110 プロモーターであり、本明細書中で配列番号３で表される。別の構成的キイチゴプロモーターの例は、dru259プロモーターであり、配列番号４で表される。さらなるフラグメントは、全長dru1プロモーター、配列番号２を表す配列由来であり得、ここでこのより小さなフラグメントは、それらの制御下でDNA配列の構成的発現を調節するのに有効である。本発明はまた、植物形質転換ベクターを生成するための上記のキメラ遺伝子、 DNA構築物、および単離DNA配列の使用を含む。このようなベクターは、Agrobact eriumに基づく方法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment )を含む任意の植物細胞形質転換方法において使用され得る。これらのベクターはまた、植物形質転換キットの一部を形成し得る。キットの他の成分は、植物細胞形質転換に有用な試薬を含み得るが、これらに限定されない。別の実施態様では、本発明は、上記のキイチゴプロモーター、キメラ遺伝子またはDNA構築物のいずれかを含む植物細胞、植物組織、トランスジェニック植物、果実細胞、全果実、種子、またはカルスを包含する。本発明の別の局面において、本明細書中に記載のdruプロモーターは、トランスジェニック植物において、選択可能なマーカー遺伝子のような異種遺伝子の中程度の発現を提供するための方法に使用され得る。この方法において、選択可能なマーカー産物をコードするDNA配列を含む本発明のキメラ遺伝子（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）は、植物の前駆細胞に導入される。キメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物は、非形質転換細胞には毒性である選択薬剤（例えば、ハイグロマイシン、ゲネシチン、またはカナマイシン）のある量の存在下で成長できる能力により選択される。次いで、このように選択された形質転換植物細胞が再生されて、分化した植物を提供し、続いて、産物を発現する形質転換植物の選択が行われる。さらに、本発明は、トランスジェニック果実含有植物を産生する方法を含有する。本方法において、代表的には、植物細胞において選択を可能にする発現ベクターに有される本発明のキメラ遺伝子は、選択された植物の前駆細胞に導入される。次いで、これらの前駆細胞が生育されて、トランスジェニック植物を産生する。本方法は、以下の工程による、dru１プロモーター（dru110またはdru259のような）の単離をさらに包含する：（i）キイチゴdru1遺伝子DNAの領域に相同な配列を含むプローブDNA分子を選択する工程、（ii）プローブとキイチゴゲノムに由来する複数の標的DNA分子とを、プローブ分子とプローブ分子に相同な標的分子との間の特異的なハイブリダイゼーションを好む条件下で接触させる工程、（iii）キイチゴdru1遺伝子に相同なDNA配列を有する標的分子を同定する工程、（iv）標的分子と関連するプロモーター配列を単離する工程、および（v）１つ以上の単離された配列またはその部分を、その制御下の下流遺伝子の構成的発現を調節する能力について評価する工程。本発明のキメラ遺伝子、ベクター、構築物、単離されたDNA分子、産物および方法は、本質的に上記のようなキイチゴdru1プロモーター配列を用いて産生され得る。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図面および実施例とともに読まれた場合に、より十分に明らかになる。図面の簡単な説明図１は、本明細書中でdru259proと呼ばれる例示のキイチゴdru1プロモーターおよびnptII遺伝子を含むプラスミドpAG-431の作製を示した模式図である；図２は、キメラdru110pro-nptII遺伝子を含むベクターpAG-421の構築において従った工程を表すフローチャートである；図３は、nptII遺伝子に融合されたdru110proを含む、pAG-1542およびpAG-421 由来のAgrobacteriumバイナリーベクターpAG-7242の構築に関与した工程を概略する；図４は、キメラdru259pro-nptII遺伝子を含むAgrobacteriumバイナリーベクターpAG-7342の作製を示すフローチャートである；図５は、３つの異なるプロモーター-nptIIキメラ遺伝子組み合わせについての、10のトランスジェニック事象におけるnptII遺伝子発現の相対レベルを表すグラフである；図6Aおよび6Bは、dru1遺伝子のゲノムDNA配列を示す。図で示されているのは、 CAATボックス、TATAボックス、ATG開始コドン、２つのエキソン、１つのイントロン、スプライス部位、終止コドンおよびポリアデニル部位である；図7Aおよび図7Bは全長dru1プロモーターのDNA配列を示す；図８は、dru110プロモーターのDNA配列を示す；図９は、dru259プロモーターのDNA配列を示す；図10は、キイチゴ小核果タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の代表的な結果を示す；図11Aおよび11Bは、キイチゴdru1遺伝子の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-P CR; Kawasakiら、1989;Wangら、1990）クローン化を模式的に示す；図12は、dru1の遺伝子構成およびタンパク質構造の模式図を示す；図13は、dru1のコード配列のKyte-Doolittleの親水性(hydrophilicity)プロットを示す。図において、親水性ウインドウサイズは7である；図14は、キイチゴ葉および花托におけるdru1 RNA発現のRNAドットプロット分析を示す。RNAは、緑(green)、成熟緑(mature green)、変色(breaker)およびオレンジ(orange)／完熟(ripe)キイチゴ(それぞれ、I、II、IIIおよびIV期に対応する）から単離した；図15は、キイチゴ葉および果実におけるdru1 RNAの発現を評価するRNAハイブリダイゼーション研究の結果を示す；図16は、成熟の種々の期での小核果から得られるキイチゴ小核果タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す、そして図17Aおよび17Bは、プラスミドpAG-1542の構築をまとめるフローチャートを示す。発明の詳細な説明 I．定義本明細書中で用いられる以下の用語は、示されるような意味を有する：本明細書中で定義される「キメラ遺伝子」は、異なる遺伝子の部分から構成される非天然に生じる遺伝子をいう。キメラ遺伝子は、代表的には、「異種」DNA 配列に作動可能に連結されたプロモーター配列から構成される。植物への形質転換のための本発明の代表的なキメラ遺伝子は、キイチゴdruプロモーター（例えば、dru110またはdru259プロモーター）、異種構造DNAコード配列（例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（nptII）遺伝子）、および３’非翻訳ポリアデニル化部位を含む。「構成的」プロモーターは、特定の型の細胞および組織においてより高度なレベルでRNA合成を指向する組織プロモーター（例えば、例えば、トマトE4またはE 8プロモーターのような果実特異的プロモーター（Cordesら,1989; Bestwickら、 1995)）に対して、植物形質転換体の多くのまたは全ての組織において、RNA産生を指向するプロモーターをいう。「プロモーター」とは、下流の異種遺伝子の転写を指向させ、そしてオペレーター領域との結合、ランダムまたは調節変異誘発、エンハンサー配列の付加または複製、合成リンカーの付加または修飾などの手段により誘導されるプロモーターを含むDNAの配列が意味される。「植物プロモーター」により、ネイティブな形態で植物ゲノムDNAに由来したプロモーター（上記）が意味される。「キイチゴプロモーター」は、ネイティブな形態でキイチゴゲノムDNAに由来したプロモーター（上記）をいう。例えば、dru110またはdru259のようなdru1プロモーターは、ネイティブなキイチゴゲノムでdru1遺伝子のコード領域に作動可能に連結した非コード調節領域である。特定の遺伝子に由来するキイチゴプロモーター（例えば、dru110またはdru259 のようなdru1遺伝子由来のキイチゴプロモーター）は、プロモーターの少なくとも１つ以上の領域が特定のキイチゴ遺伝子に由来するプロモーターを含む。この型のプロモーターの例は、プロモーター（例えばdru259プロモーター）の領域が、宿主細胞における得られたキメラ遺伝子の発現を実質的に低減させたり、または非改変dru259プロモーターの機能を改変したりすることなく、異なる遺伝子に由来する１つ以上の配列と置き換えられているプロモーターである。「プロモーター長」とは、適切な標準（カリモウイルスキャッサバ斑点葉脈ウイルスプロモーターCASまたはhsp80プロモーター）と比較した、植物組織（単数または複数）における異種遺伝子のプロモーター制御型（例えば、dru110、dru2 59）発現のレベルをいう。発現レベルは、適切なレポーター遺伝子（例えば、GU S（β-グルクロニダーゼ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはnptII（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ））にプロモーターを連結させることにより測定され得る。レポーター遺伝子の発現は、蛍光測定、分光光度測定、または組織化学アッセイ（Jeffersonら、1987a;Jefferson，1987b）により、容易に測定され得る。本発明の目的のために、中程度のプロモーターとは、hsp80のようなプロモーターにより得られるレベルの約10〜約90％でレポーター遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。「異種」DNAコード配列は、形質転換を受ける植物にとってネイティブでないか、またはタンパク質産物の改善された特徴付けのために操作された構造的コード配列である。プロモーターに関して、異種とは、現在結合しているプロモーターと同じ遺伝子において天然に存在しないコード配列をいう。 dru1遺伝子と配列同一性を共有するとみなされる遺伝子か、またはその特定の領域（単数または複数）は、本明細書中に示されるキイチゴdru1ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１〜４）に対応するポリヌクレオチド配列の長さにわたって少なくとも約60％または好ましくは80％の全配列同一性を有する。「配列同一性」は、本質的に以下のように決定される。同じ長さの（好ましくは、遺伝子のコード配列に対応する）２つのポリヌクレオチド配列は、もし、AL IGNプログラムを用いてそれらを整列させたとき、最高のスコアのアラインメントにおいて核酸の60％以上か、または好ましくは80％以上が、１のktup、デフォルトのパラメーターおよびデフォルトのPAM行列（Dayhoff，1972）を用いて同一に整列された場合、互いに同一（すなわち、相同）であるとみなされる。 ALIGNプログラムは、FASTAバージョン1.7配列比較プログラムのスイート（Pea rsonおよびLipman，1988; Pearson 1990;プログラムは、William R．Pearson，D epartment of Biological Chemistry，Box 440，Jordan Hall，Charlottesville ,VAから入手可能）において見い出される。２つの核酸フラグメントは、それらがコード配列あるいはその変異体に対して特異的にハイブリダイズし得るか、またはポリメラーゼ連鎖増幅反応を特異的にプライムし得る場合、dru1遺伝子に由来するポリヌクレオチドに対して「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる：（i）例えばManiatisら、1982、3 20頁〜328頁および382頁〜389頁に記載される代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で;（ii）せいぜい約25〜30％の塩基対のミスマッチを許容するような低減したストリンジェンシーの洗浄条件を使用すること、例えば：２× SSC（ナトリウム、3.0 M NaClおよび0.3 M クエン酸ナトリウムを含む、pH7.0 ）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液、室温で30分ずつ２回；次いで、２×SSC、0.1％SDS、37℃、30分１回；次いで、２×SSC、室温で２回、各10分間、または（iii）標準的な条件下の代表的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、Saikiら、1988）における使用のためのプライマーを選択すること、このプライマーは、所望の標的配列またはその変異体の配列の特異的な増幅を生じる。好ましくは、高度に相同な核酸鎖は、20〜40％未満の塩基対のミスマッチを含み、さらにより好ましくは、５〜20％未満の塩基対のミスマッチを含む。これらの相同性（すなわち配列同一性）の程度は、当業者に周知の方法で、遺伝子ライブラリー（または、遺伝物質の他の供給源）からクローンを同定するための適切なストリンジェンシーの洗浄条件を使用することにより選択され得る。「dru1コード化プロペプチド」は、dru1コード化ポリペプチドに相同な（すなわち、本質的に同じ配列同一性を有する）任意のポリペプチドとして本明細書で定義される。１つの実施態様において、ポリペプチドは、dru1またはその変異体の配列に対して選択的にハイブリダイズする核酸によってコードされる場合、dr u1コード化ポリペプチドに相同である。別の実施態様において、ポリペプチドは、上記のように、dru1またはその変異体によりコードされる場合、dru1コード化ポリペプチドに相同である。この群のポリペプチドは、代表的には、15、好ましくは25、またはより好ましくは35より大きい連続したアミノ酸である。さらに、約60アミノ酸より長いポリペプチドについて、「ポリペプチド相同性」または「ポリペプチド配列同一性」を決定するための配列比較が、局所アラインメントプログラムLALIGNを用いて実施される。ポリペプチド配列は、上記のように、１のktup、デフォルトのパラメーターおよびデフォルトのPAMを有するLALIGNプログラムを用いて、dru1アミノ酸配列またはその変異体のいずれかに対して比較される。 60アミノ酸より長い最適化アラインメント、および55％または好ましくは80％より多くの同一に整列されたアミノ酸を有する任意のポリペプチドは、「相同なポリペプチド」であるとみなされる。LALIGNプログラムは、FASTAバージョン1.7 配列比較プログラムのスイート（PearsonおよびLipman，1988; Pearson 1990;プログラムは、William R.Pearson,Department of Biological Chemistry,Box440 ，Jordan Hall，Charlottesville，VAから入手可能）において見い出される。ポリヌクレオチドは、それがdru1タンパク質コード配列、dru1のcDNAまたはそれらの相補配列の領域と同一か、実質的に同一の塩基対配列を有する場合、または上記の相同性を示す場合、dru1「由来」である。ポリペプチドまたはポリペプチド「フラグメント」は、それが(i)dru1遺伝子によりコードされるか、または(ii)上記のようにdru1コード化ポリペプチドと相同性を示す場合、dru1「由来」である。本発明の文脈において、表現「核酸配列」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする配列をいう場合、相同なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド配列、ならびに開示される配列をコードする縮重核酸配列を含むことが意図される。本明細書中で使用されるように、「植物細胞」は、未分化組織（例えば、カルス）ならびに植物種子、花粉、プロガグル（progagule）および胚を含む植物由来の任意の細胞をいう。 II．キイチゴdru1プロモーターの同定および単離本発明は、１つの局面において、ネイティブなキイチゴゲノムにおいて（i）d ru1遺伝子のコード領域に作動可能に連結されていて、そして(ii)中程度の強度の構成的プロモーターとして機能する、プロモーターに関する。本発明のこの局面は、果実成熟において非常に高レベルで発現される、キイチゴにおけるdru1遺伝子の発見に基づく。全長dru1プロモーターにより指向される発現は果実特異的で、かつ果実成熟の間活性である。 dru1プロモーターの機能的活性に対して、両方が全長キイチゴdru1プロモーター由来の、（i）構成的プロモーターとして機能する（すなわち、果実特異的ではない）そして、（ii）中程度のレベルでその制御下で遺伝子の発現を駆動する２つのプロモーターが、予想外に発見され、以下でより詳細が説明される。キイチゴ由来のdru1遺伝子の同定、ならびに本発明の２つの例示のdru1プロモーター、dru110およびdru259の単離を、以下に説明する。 A．dru1 タンパク質同定、精製、および配列決定キイチゴにより産生されるタンパク質のような、果実成熟により産生されるタンパク質（単数または複数）は、代表的にはゲル電気泳動で分析される。可溶性小核果タンパク質のクマシーブルー染色SDSポリアクリルアミドゲルを、図１０（実施例1A-B）に示す。図10から分かり得るように、キイチゴから単離可能な２つの非常に豊富なタンパク質が、約17および15kDで観察され、そして、本明細書中においては、それぞれdrupe１およびdrupe２と称する。全量に対するdrupe１およびdrupe２の可溶性タンパク質の量は、例えば、走査型デンシトメトリーにより、決定され得る。図10において例示されたゲルの走査型デンシトメトリー分析は、drupe１およびdrupe２がそれぞれ、キイチゴ小核果の全可溶性タンパク質の約23％および約37％を構成することを示す。本決定の結果（すなわち、drupe １およびdrupe２の高レベル）として、drupe１およびdurpe２の精製および配列決定は、例えば、直接ウェスタンブロットアプローチを用いることにより、実施され得る。ウェスタンブロット分析を実施することにおいて、全小核果タンパク質をPDVF 膜にウェスタンブロットし(実施例1B)、そしてdrupe１およびdrupe２に対応する領域をN末端アミノ酸配列分析に供する。drupe１サンプルは30アミノ酸N末端配列を生じる（実施例1B）。アミノ末端drupe１配列を、本明細書中で配列番号１１として示す。Ｂ．dru1 コード配列のクローン化 1．dru1 cDNA クローンのRT-PCRおよびクローン化。遺伝子のゲノムコピーの cDNA合成から逆PCRまでの、dru1クローン化のための全手順を、図11Aおよび11B に模式的に示す。クローン化手順を実行することにおいて、成熟緑キイチゴ小核果mRNAを、実施例2Aおよび2Bに記載のように調製し、そしてcDNA合成反応においてテンプレートとして使用する。反応は、図11Aおよび11Bにおいて示されるdTRANDOMプライマー（配列番号12）を使用してプライムする。得られたcDNA（実施例2C）を、dTRAND OMプライマーの一部およびdrupe1アミノ末端配列に基づいた512倍縮重プライマー（Drupe20）に対応するプライマーを用いて標準PCR反応に供する（実施例３）。次いで、PCR増幅産物を分析する。上記のPCR反応からの産物は、710bp産物を含み、これは、アガロースゲル精製され、そしてベクターpCRIIにサブクローン化される（実施例３）。続くこれらのクローンのいくつかの配列解析により、dr upe1のアミノ末端配列に合致するタンパク質をコードする配列を有するそれらのクローンの同定が可能になる。２．dru1 遺伝子のゲノムコピーの逆PCRクローン化。dru1遺伝子のクローン化のこのアプローチにおいて、ゲノムキイチゴDNAが、上記のように得られたcDN A配列に対して内部にあるプライマーを用いてPCR反応において使用される（実施例４）。この反応は、タンパク質コード領域のほとんどを含むdru1遺伝子のゲノムクローンを生じる。１つのイントロンが、このクローンの続く配列分析から同定された（図6B）。逆PCR戦略は、dru1プロモーターを含む遺伝子の５’領域を特徴付けそして配列決定するのに使用され得る（実施例５）。図11Aおよび図11B は、これがどのようにして達成され得るかを模式的に示す。逆PCR技術を用いるdru1ゲノムDNAの５’隣接領域の特徴づけにおいて、キイチゴゲノムDNAをNsiIで消化し、そして希釈条件下で連結させ、制限フラグメントの環化を行う。次いで、連結DNAを、dru1コード配列に対して内部であり、かつ互いに反対方向を向いたプライマーを使用したPCR増幅に供する。これは、第一エキソンの一部およびこのプロモーターの1.35kbを含むPCR反応産物を産生する。前述のクローンからの配列情報と組み合わせた本クローンの続く配列分析は、完全dru1配列を生じる。３．遺伝子発現パターンの配列決定および評価。dru1遺伝子（図6A、6B）は、配列番号20に示された推定アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。このタンパク質の推定分子量は17,088であり、これは、全小核果タンパク質のゲル電気泳動により決定される17kdの分子量（図10を参照のこと）と密に合致する。 dru1タンパク質は、比較的酸性で、推定pIは4.8である。現在の配列データベースの核酸およびタンパク質相同性サーチが、有意な合致を検索するために実行され得る。dru1については、現在の配列データベースの核酸およびタンパク質相同性サーチは、有意な合致を生じなかった。この結果は、タンパク質のアミノ末端配列によって得られた、drupe1が新規タンパク質であるという元の観察を支持する。 dru1の遺伝子発現パターンはまた、全長プロモーターの組織特異性を確認するために、RNAおよびタンパク質レベルで評価され得る。異なる成熟期におけるキイチゴ葉および花托由来の全RNAのノーザンドットブロット（図14および図15）は、組織および期特異的な遺伝子発現パターンを示す。これは、種々の他の植物組織に由来する全RNAのノーザンブロットの比較により確認され得る。dru1の組織および期特異的遺伝子発現パターンは、葉、花托、および小核果由来の全RNA のノーザンブロットにおいて確認された（図14および15を参照のこと）。両方の場合において、葉RNAではdru1発現は観察されない。花托におけるRNA発現パターンは時間的に調節されており、一方小核果においては、分析された２つの期（すなわち緑および完熟）において完全に発現される。異なる成熟期由来の小核果溶解物のタンパク質ゲルもまた実施され、dru1の期特異的発現をさらに支持し得る。図16に示されるように、種々の成熟期（すなわち、緑、成熟緑、変色、オレンジ、および完熟）の小核果から得られたキイチゴ小核果タンパク質の電気泳動分析は、小核果における期特異的発現パターンをさらに支持する（図16）。Ｃ．全長dru1プロモーターの単離 dru1ゲノムクローンの特徴付けは、dru１プロモーターの単離を可能にする。典型的な全長dru1プロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号２に示す。 III．プロモーターdru110およびdru259の単離本発明の２つの代表的なキイチゴプロモーター、dru110およびdru259が、dru1 プロモーターの全長転写物から単離され、期および果実特異的プロモーターであると特徴づけられた。驚くことに、これらの２つの新規のdru１由来プロモーターは、異種遺伝子と融合され、そして形質転換植物において得られる発現パターンの結果について評価した場合、中程度のレベルの、構成的プロモーターとして機能することが見い出された。切断されたdruプロモーター、dru110およびdru259は、実施例７および８に記載のように全長dru1プロモーターから得られ得る。このアプローチを利用することにおいて、第１エキソンの一部およびdru1プロモーターの1.35kbを含むPCR反応産物（節II.Ｂ.2で上記）は、プラスミドpCRII （Invitrogen、Carlsbad，CA）に連結され、全長dru1プロモーターを含むサブクローンpAG-310が、図１および２に示されるように形成する。次いで、pAG-310からの1.3kb DNAフラグメントを、プライマーDrupeUp（５’プライマー、配列番号７）およびDruneLow（３’プライマー、配列番号８）を用いて標準条件下でPCR 増幅する。増幅されたDNAの回収は、代表的には、反応混合物への溶媒の添加、続いて、遠心分離、水相の回収、および酢酸ナトリウムによる沈澱により実施される。次いで、回収されたDNAは、代表的には、遠心および洗浄の反復、それに続く回収されたペレットの乾燥により精製される。 1.3kb DNAフラグメントは、制限酵素NsiIおよびXbaIを用いて完全に消化され、続いて精製およびXbaIおよびPstIで消化された植物発現ベクターp35S-GFP（Cl ontech，Palo Alto，CA）に連結される。制限酵素PstI（p35S-GFPを消化するのに用いられた）およびNsiI（dru1 PCR産物を消化するのに用いられた）の両方が、同じ３’突出付着末端（TGCA）を生成し、それゆえ連結の際にどちらの制限部位も再構築されない。得られた中間プラスミドは、pAG-155と命名され、模式的に図１および２に示される。キイチゴdru259プロモーターの単離は、プラスミドpAG-155を、ともに平滑末端カッターである、制限酵素SnaBIおよびEcoRVで消化し、259bp dru1プロモーターフラグメント（本明細書中でdru259という）を放出することにより達成される。キイチゴdru110プロモーターの単離は、プラスミドpAG-155において、プライマーdru1-118H3（配列番号９）およびGFPStartR（配列番号10）を用いて、標準的なPCR反応条件下で行われるdru1の166bpフラグメントを増幅することにより達成される。次いで、増幅された産物は反応混合物から回収され、そして上記のように精製し、続いて、HindIIIおよびEcoRVを用いて166bpの産物を消化して、本明細書中でdru110という112bpプロモーターを生成する。キイチゴプロモーター、dru110およびdru259は、異種遺伝子の発現を調節するために使用され得る。druプロモーターの例であるdru259は、本明細書中に配列番号４で示されるヌクレオチド配列を有する。druプロモーターの例であるdru11 0は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する。 dru259およびdru110にそれぞれ対応するヌクレオチド配列を含む例示的なサブクローンpAG-431およびpAG-421の構築は、図１および２に示される。 IV．植物dru1プロモーターの同定本発明はまた、種々の植物供給源（例えば、キイチゴ）由来のdru1プロモーター（例えば、dru110およびdru20a）の同定および単離のための方法を提供する。このようなプロモーターは、異種遺伝子（例えば、選択マーカー遺伝子および除草剤耐性を与える遺伝子）を含むベクター構築物の作製に有用である。サザンブロット実験は、例えば、イチゴ、モモ、またはスモモにおいてキイチゴdru1遺伝子と相当な配列同一性を有する（すなわち、代表的には、標準的な配列比較プログラムを用いて、55％より高く、より好ましくは80％同一性より高い）DNA分子の存在を実証するのに使用される。同様のサザンブロット分析が、他の果実含有植物においてさらなるdru1遺伝子を同定するのに実施され得る。 dru1ホモログは、キイチゴdru1遺伝子のコード配列を含む標識DNAフラグメントを用いてプローブされる植物のゲノムDNAサザンブロット(Ausubelら、1992)において同定される。プローブは、代表的には、プロモーター配列よりはむしろdru1のコード配列を含むように選択される。なぜなら、コード配列は、代表的には、プロモーター配列よりも種から種でより保存されているからである。プローブ分子は、プライマー特異的増幅（Mullis、1987；Mullisら、1987）を用いてキイチゴゲノムDNAから生成される。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅領域が本明細書中に提供されるキイチゴdru1遺伝子の全コード配列を含むように選択される。プライマーはまた、キイチゴdru1遺伝子の選択された領域のみを増幅するように選択され得る。あるいは、プローブは、プラスミドDNA由来の目的の配列を含む制限消化フラグメントを単離することにより作製され得る。このプローブは、相同標的分子の続きの同定を可能にするために、検出可能な部分で標識される。標識部分の例は、商業的供給源から入手可能な放射性ヌクレオチド（例えば、³²P標識ヌクレオチド、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチドなど）を含む。プライマー増幅プローブの場合、標識ヌクレオチドは、増幅プロセスの間に直接プローブに取り込まれ得る。プラスミドDNA由来の制限消化フラグメントのような、すでに単離されたDNA由来のプローブ分子は、代表的には末端標識される（Ausubelら、1992）。上記の植物のゲノム由来のHindIIIDNAフラグメントのような標識分子は、ゲル上で電気泳動され、ナイロンまたはニトロセルロースフィルター上にブロットされ、そして固定化される。次いで、標識プローブ分子は、プローブ分子とプローブ分子に相同な標的分子との間の特異的ハイブリダイゼーションに好ましい条件下で、標的分子と接触される（Maniatisら、1982；Sambrookら、1989;Ausubelら、1992）。 dru1遺伝子を含む植物の同定に続いて、プロモーター領域を含む、所望の遺伝子を含むDNAは、例えば、キイチゴdru1遺伝子の単離のために本明細書中に記載された方法により、おのおのの種から単離され得る。切断プロモーターの生成は、例えば、dru110およびdru259プロモーターの単離のために、本明細書中に記載されたような５’欠失により達成され得る。 dru1プロモーターの変異体は、上述の方法により異なるキイチゴ品種および他の植物から単離され得る。GUS（β-グルクロニダーゼ）のようなレポーター遺伝子が、このようなプロモーターにより調節される構成的な中程度のレベルの発現について組織を試験するのに使用され得る。GUSタンパク質の発現は、蛍光計的、吸光度計的、または組織化学的アッセイ（Jefferson，1987a; Jefferson 1987 b）により容易に測定され得る。さらに、レポーター遺伝子配列に作動可能に連結されたdru1プロモーター配列を含むキメラ遺伝子を使用して、例えば、欠失分析（Benfeyら、1990）を用いて、調節ドメインに対応するDNA配列が同定され得る。例えば、配列番号４に示されるdru259プロモーター配列は、機能的にGUSレポーター遺伝子に連結され得る。次いで、欠失分析が、標準方法（Ausubelら、1992；Maniatisら、1982;Sambrook ら、1989）により実行される。あるいは、全長dru1プロモーター配列の領域は、図１および２に例示されるように配列特異的プライマーを用いてPCRで増幅され得る。次いで、これらの増幅されたフラグメントは、GUSコード配列の５’に挿入され、そして生じる発現パターンが、本発明のキイチゴプロモータの特徴である中程度レベルの構成的発現について評価され得る。Ｖ．植物形質転換本発明の支持において、異種DNA配列に作動可能に連結したキイチゴ植物プロモーター配列を含む例示的なキメラ遺伝子が構築される。キメラ遺伝子構築物の例は、dru110pro:nptII（実施例10）およびdru259pro:nptII（配列番号９）を含む。nptII遺伝子により発現され得るタンパク質、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼであり、これは、産物を発現するトランスジェニック植物にカナマイシン耐性を与える。このタンパク質、ならびに他の選択可能なマーカー産物、および除草剤耐性を与える産物は、トランスジェニック植物において（i）構成的に、および（ii）（過剰発現よりはむしろ）中程度のレベルで発現される場合、より効率よく機能し得る。したがって、プロモータの例、dru110およびdru259はこの目的を満たすのに理想的なプロモーターを示す。Ａ．Agrobacterium バイナリー植物形質転換ベクターの構築上記の代表的な２つのキメラ遺伝子を含むAgrobacteriumバイナリーベクターp AG-7242およびpAG-7342の構築は、実施例10および実施例19（図３〜４において、それぞれdru110pro:nptIIおよびdru259pro:nptIIを模式的に示す）に記載のように実施され得る。これらのバイナリーベクターはまた、SAMase、S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ（Ferroら、1995；Hughesら、1987）をコードする遺伝子を含み、これらは本発明に対して未成熟である。１．dru259::nptII キメラ遺伝子を含むバイナリー植物形質転換ベクターpAG -7342 の構築。バイナリー植物形質転換ベクター、pAG-7342は、13kb nos pro::n ptIIフラグメントをサブクローンpAG1542からHindIIIおよびBamHIを用いた消化により切り出し、続いて、サブクローニングベクターpAG-431由来の1.1kb HindI II-BamHIフラグメントに連結し、dru259::nptIIキメラ遺伝子を挿入することにより構築した。プラスミドpAG-1542は、当該分野で公知の従来のクローニング技術（Sambrook ら、1989）を用いて調製され得る。この例示的なサブクローニングバイナリーベクターは、レフトボーダーの近くに位置するnosプロモーターの制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII選択可能マーカー遺伝子（nptII）遺伝子、およびライトボーダー近くに位置するトマトE8プロモーター（Deikmanら、1988 ；Deikmanら、1992）によって駆動されるSAMase遺伝子(Ferroら、1995)を含む。前述のように、トマトE8:SAMase構築物の存在は、本明細書中に記載の発現結果に対して重要でない。 dru259::nptIIキメラ遺伝子を含むサブクローンpAG-431の構築は、実施例７に記載される。バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築は、図４に模式的に示され、そして実施例９で詳細に説明される。プラスミドpAG-1542の構築をまとめたフローチャートは図17に示される。２．dru110::nptII キメラ遺伝子を含むバイナリー植物形質転換ベクターの構築。類似のアプローチを利用して、バイナリー植物形質転換ベクター、pAG-72 42は、13kb nos pro::nptIIフラグメントを、サブクローンpAG1542からHindIII およびBamHIを用いた消化により切り出し、続いて、pAG-421由来の0.95 kb dru2 59::nptIIフラグメントに連結し、バイナリー植物形質転換べクターpAG-7242を形成することにより構築される。バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7242の構築は、図３に模式的に示され、そして実施例10で説明される。dru110::nptキメラ遺伝子を含むサブクローンpAG -421の構築は、実施例８に記載される。Ｂ．植物の形質転換方法上記のキメラ遺伝子は、例えば、植物細胞に挿入され得る。これらの例示的なキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物は、本発明のキイチゴプロモーターにより調節されており、抗生物質カナマイシンに対する耐性を産物を発現する植物に与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIを発現する。本発明の支持において実施された実験において、キメラ遺伝子は、トマト植物細胞に挿入され、そして得られたnptII選択可能マーカー遺伝子の発現のレベルとパターンが試験された。nptIIは、その制御下に遺伝子の発現を調節するための本発明のキイチゴ植物プロモーターの能力を例示するマーカー遺伝子の例として選択されたが、これは、任意の多数の異種遺伝子の発現が本発明のプロモーターにより指向され得ることが理解される。例えば、nptIおよびnptIIは、それらのアミノ酸配列および基質特異性の両方で差異を有する異なる別々の酵素である（Beckら、1982）。本発明のキイチゴプロモーターは、これらのネオマイシンホスホトランスフェラーゼのいずれかの発現を指向するのに適している。本発明のキイチゴプロモーターを用いた形質転換に適した植物は、キイチゴ、トマト、イチゴ、バナナ、キーウィフルーツ、アボカド、メロン、マンゴ、パパイヤ、リンゴ、モモ、ダイズ、ワタ、アルファルファ、アブラナ、アマ、テンサイ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、コムギ、イネ、およびレタスを含むが、これらに限定されない。キイチゴプロモーター（例えば、dru110およびdru259）を含むキメラ遺伝子は、多数の植物形質転換方法のいずれかにより、植物細胞に移入され得る。本明細書中で使用される、１つのこのような方法は、A．tumefaciensにより保有される T-DNAを欠くTiプラスミドへのキメラ遺伝子の挿入、それに続く、植物細胞とA． tumefaciens細胞の共存培養を含む。実施例11に提供されるように、Agrobacteriumバイナリー植物形質転換ベクター、pAG-7242およびpAG-7342は、個々に、エレクトロポレーション（Nagelら、1 990）によりA．tumefaciensの無毒化した株に導入され、それに続いて、トマト植物細胞と共存培養し、キメラ遺伝子をトマト植物細胞に移入する。 Agrobacteriumに基づく方法に加えて、代替の方法（例えば、リーフディスクに基づく形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント（パーティクルガン形質転換））が、植物宿主の形質転換を誘発するために使用され得る。これらの方法は、当該分野で周知であり（Fryら、1987;ComaiおよびConing，1993;Kleinら、1988;Miki ら、1987;Belliniら、1989）、そして植物ゲノムへの選択されたDNAを導入する手段を提供する。このようなDNAは、異種コード配列に機能的に隣接するキイチゴプロモーター（例えば、dru110、dru259）からなるDNAカセットを含み得る。さらに、反復培養選択法が、植物形質転換体を作製するのに使用され得、そして特にキイチゴのような木本種の形質転換に適している。この方法は、1995年12 月28日に公開された、国際公開番号第WO 95/35388号に「植物遺伝子形質転換法およびトランスジェニック植物」というタイトルで、詳細に記載される。反復性培養選択形質転換法の使用において、目的のキメラ遺伝子は、例えば、目的のベクターを含むAgrobacteriumの存在下で標的外植片を共存培養することにより、標的植物組織外植片の細胞に挿入される。代表的には、共存培養は、液体中で約１日〜約３日の間実施される。植物組織外植片は、種々の植物組織（葉、子葉、葉柄および分裂組織を含むがこれらに限定されない）から得られ得る。次いで、形質転換外植片細胞は、閾値濃度の選択薬剤を有する選択培地において培養されるそれらの能力についてスクリーニングされる。選択培地において生長し得る外植片は、代表的には、同じ培地の新鮮な供給源へ移され、再び培養される。次いで、外植片は、再生条件で培養されて、再生植物苗条を生成する。次いで、これらの再生苗条は、外植片を生成するのに使用される。次いで、選択され再生した植物苗条からのこれら外植片は、高濃度の選択薬剤で培養される。これらの反復培養法は、本質的に純粋なトランスジェニック外植片が得られるまで反復される。純粋なトランスジェニック外植片は、再生植物苗条を外植片に分け、この外植片を培養し、そして全ての外植片の生長が使用された選択薬剤の最高濃度に耐性であることを確かめることにより同定される。すなわち、選択薬剤の存在下で、外植片細胞の壊死または有意な退色は存在しない。本質的に純粋なトランスジェニック外植片の産生の確認の際に、トランスジェニック植物は、純粋なトランスジェニック外植片から植物を再生することにより生成される。Ｃ．植物形質転換体の同定および評価トランスジェニック植物は、産物mRNA、DNA、タンパク質を合成する能力についておよび／またはアミノグリコシド抗生物質（例えば、カナマイシン）に対する耐性について、アッセイされる。アッセイは、代表的には、種々の植物組織供給源（例えば、葉、茎、または果実）を用いて実施される。葉に基づくアッセイは、異種遺伝子（トランスジーン）を駆動するキイチゴプロモーターが、葉の組織内で少なくともいくらか活性である場合、例示的なプロモーターdru110およびdru259についての場合と同じように、有益である。このような場合、葉に基づくアッセイは、トランスジーンの発現レベルの最初のスクリーニングに有用である。なぜなら、果実に基づくアッセイよりはるかに早く実施され得るからである。反対に、果実に基づくアッセイは、果実のような標的組織自身におけるトランスジーンの発現のより正確なデータを提供する。 RNAに基づくアッセイは、例えば、RNase保護アッセイ（RPA）を用いて実施され得る。このようなアッセイを実施する場合、mRNAは、代表的には形質転換植物および野生型植物の両方に由来する植物細胞から抽出される。RNAase保護アッセイ（RPA）は、以前にLeeら、1987により記載されたように、Ambion Inc（Hialea h,FL）の「RPAII」キットを用いて、製造者の指示に従って実施され得る。キイチゴプロモーターにより調節されるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物についての遺伝子発現パターンはまた、ノーザンドットブロットを実施することにより評価され得る（例えば、実施例６）。プロモーター機能（すなわち、組織および／または期特異的な発現、あるいは構成的な発現）は、異なる成熟期での葉と果実組織由来の総RNAのノーザンブロットと、他の種々の植物組織由来の総RNAのノーザンブロットとを比較することにより評価され得る。本発明の支持により実施された実験は、キイチゴプロモーターdru110およびdr u259が、期または組織特異的プロモーターとして機能しないことを示す。これは、いくらか驚くべきことである。なぜなら、全長dru1プロモーターにより調節される、dru1の組織および期特異的な遺伝子発現パターンが、葉、花托、および小核果からの全RNAのノーザンブロットにより検証されるからである。本発明のキイチゴプロモーターにより調節される下流異種遺伝子の発現のさらなる確認として、ウェスタンブロット分析が実施され得る。代表的なウェスタンブロット実験の実施において、総可溶性タンパク質が、凍結植物組織から抽出され、そして、例えば、Coomassie Plusタンパク質アツセイ（Pierce，Rockford,I L）を用いて測定される。既知量の可溶性タンパク質、または既知量の精製タンパク質産物（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII、ポジティブコントロール）をポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてナイロンメンブランに移される。次いで、結合したタンパク質は、タンパク質産物に特異的に免疫応答性のモノクローナル抗体でプローブされる。本発明のキイチゴプロモーターにより指向される遺伝子発現を確認するための別のアプローチにおいて、サザンハイブリダイゼーション分析が実施される。代表的には、植物DNAは、凍結植物組織を抽出緩衝液中での粉砕により抽出され、続いて、遠心分離、得られた上清の分離、そして塩化セシウム沈澱を行う。次いで、得られたCsCl勾配物は、さらなる時間（例えば、48時間）遠心分離され、そして回収されたDNAは透析され、そしてエタノールで沈澱される。植物DNAの回収の際に、DNAは、DNAフラグメントを得るために適切な制限酵素で消化され、続いてアガロースゲルで電気泳動分離される。得られたバンドはニトロセルロース（Southern、1975）に移され、次いで、ブロットは、トランスジーンのヌクレオチド配列を含む標識DNAフラグメントでプローブされて、上記のように、キイチゴプロモーターキメラ遺伝子構築物に対応するDNAの存在を確認する。Ｄ．遺伝子発現およびプロモーター強度の比較評価本発明の支持により実施された実験は、本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110、dru259）に作動可能に連結されたキメラ遺伝子によるトマト植物の形質転換を示す。これらの実験の結果から明らかなように、本発明のキイチゴプロモーターは、その制御下に配置した遺伝子の発現を調節し得、そして中程度レベルの構成的なプロモーターとして機能する。トマト植物は、植物形質転換ベクターpAG-7242およびpAG-7342（各々nptII遺伝子に作動可能に連結されたキイチゴプロモーターを含む）により形質転換された（実施例11）。上記の節V.A.1-2で詳細に説明されたように、植物形質転換ベクターpAG-7242は、dru110::nptII遺伝子を含み；そして構築物pAG-7342は、dru 259::nptII遺伝子を含む。nptII遺伝子に融合されるhsp80プロモーターまたはCA Sプロモーター（カリモウイルスキャッサバモットルベイン(caulimovirus cassv a mottle vein）（ウイルスプロモーター）のいずれかを含むキメラ遺伝子はまた、調製され、そしてトマト植物を形質転換するのに使用され、本発明のキイチゴプロモーターの能力を評価するための比較基準を提供する。上記の構築物を用いた10の別々のトランスジェニック事象からの結果は実施例 12に提供される。植物形質転換体におけるnptII酵素活性の存在を検出するために、培養時に入手可能な根のある植物の葉組織由来のタンパク質抽出物はELISA でアッセイされた。いくつかの場合において、１つの植物のみがアッセイに利用可能であるが（例えば、表１、最後の２行、IV列）、一方他の例においては（例えば、表１、２行、IV列）10の別々のトランスジェニック事象が分析に利用可能であった。ここで、本発明のキイチゴプロモーター（dru110、dru259）を含むトランスジェニック植物に関連して、表１の結果（特に、３〜７行）から示され得るように、nptII酵素活性は、アッセイした植物の高い百分率で検出され、その値は使用された選択薬剤の濃度および試験した根のある植物の数に依存して約20〜100％の範囲であった。これらの結果は、公知のプロモーター::nptII構築物を含むトランスジェニック植物について得られる結果と匹敵し、そして本発明のキイチゴプロモーターが、それらの制御下に配置される異種遺伝子の発現を調節するのに効果的であることを示す。表１にはまた、形質転換頻度の比較（つまり、百分率として表された、最初の外植片の総数に対する選択薬剤の存在下で発根し得る再生苗条を生成する組織外植片数）の割合が提供される。III列の結果に基づき、そして本発明のキイチゴプロモーターを含む植物に関連して、平均で、キイチゴプロモーター含有構築物で形質転換した植物の少なくとも約半数は抗生物質選択において生存した（つまり、非形質転換植物細胞にとってさもなくば毒性である、選択薬剤量の存在下で発根し得た）。上記のネオマイシンホスホトランスフェラーゼアッセイの場合のように、これらの結果は公知の植物プロモーター（hsp80、CAS）で得られる結果と一致し、そしてさらに、（i）それらの制御下に配置した遺伝子の発現を調節する本発明のキイチゴプロモーターの能力、および（ii）植物宿主を形質転換して異種遺伝子を発現するトランスジェニック植物を形成するための、キメラ遺伝子構築物およびキイチゴプロモーター（dru110、dru259）を含む形質転換ベクターの形成および使用を図解する。本発明のキイチゴプロモーターは、例示的な植物形質転換ベクターpAG-7242およびpAG-7342で形質転換されたトランスジェニック植物から得られた全ての組織におけるnptII活性の検出により証明されるように、異種遺伝子の構成的発現を提供する。プロモーターで駆動されたnptII遺伝子の発現は、形質転換体におけるnptII酵素レベルを決定することにより評価された。結果は表２および図５に示される。 CAS::nptIIキメラ遺伝子を含む形質転換体から得られた葉組織のタンパク質レベルは、表にも図にも含まれない。なぜなら、２つのアッセイされたCAS::nptII事象からの値が6000pg/mlを超えており、これはCASプロモーター（すなわち強力なプロモーター）により調節される高レベルの遺伝子発現を示すからである。本発明のdru1プロモーターは、hsp80プロモーターについて観察されるレベルよりいくらか低いレベルでトランスジーン発現を指向するが、一方dru110およびdru259 の両方は中程度のレベルのプロモーターとして機能すると考えられる。表２における最初の２つのトランスジェニック事象についての結果の観察において、dru110（dru259）::nptII植物についての平均nptII酵素レベルは、CAS::n ptII植物について測定されるレベルの約５〜９％であった。比較の基準としてhsp80プロモーター用いたこれらの同じ結果を試験することにおいて、dru110（dru259）::nptII植物について測定された平均nptII酵素活性は、hsp80::nptII植物について測定されたnptII酵素活性の約40〜60％であった。従って、dru1遺伝子由来のプロモーター（例えば、dru110およびdru259）は、 hsp80プロモーターよりもいくらか低いレベルの遺伝子発現を提供したが、中程度の強度のプロモーターとして機能もすると考えられる。上記のデータの結果により支持されるように、本明細書中で記載される例示的なキイチゴプロモーターの各々は、多数の異種遺伝子産物のいずれかの発現を調節することにおける使用を支持するのに十分なレベルでトランスジーンの構成的発現を指向し得る。さらに、本発明のキイチゴプロモーターを使用したトマト植物の形質転換は、キイチゴ由来のプロモーター領域が完全に異なる植物の属、科、または種由来の植物細胞内の遺伝子の発現を促進するために使用され得ることを例示する。 VI．本発明のベクター本発明は、植物の形質転換に適切なベクターを提供する。本発明のベクター、キメラ遺伝子およびDNA構築物はまた、異種遺伝子の発現に有用である。本発明のキメラ遺伝子を有するトランスジェニック植物は、組換え的に発現した物質の有用な供給源であり得る。１つの実施態様において、本発明のキメラ遺伝子は、以下の２つの成分を有する：（i）dru1遺伝子に由来する構成的プロモーター、および（ii）所望の産物をコードする異種DNA配列。本発明のベクターは、目的のDNAコード配列のための挿入部位を含む発現カセットを有するように構築され得る。次いで、そのような挿入DNAの転写は、適切な本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110proまたはdru259pro）の制御下にある。そのような発現カセットは、単一または複数の転写終末シグナルを、発現されるべきDNA配列のコード３’末端に有し得る。発現カセットはまた、例えば、（i ）リーダー配列（例えば、分泌または液胞の標的化を可能にする）および（ii）翻訳終末シグナルをコードするDNA配列を含み得る。さらに、本発明のベクターは、植物細胞における使用のための選択可能なマーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（nptII）またはネオマイシンホスホトランスフェラーゼI遺伝子）を含み得る。nptII遺伝子の存在は、抗生物質、カナマイシンに対する耐性を与える。本発明のベクターにおける使用のための別のアミノグリコシド耐性遺伝子は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（すなわち、hpt遺伝子（Gritzら、1983））をコードする遣伝子を含む。hpt遺伝子を含む植物細胞は、アミノシクリトール(aminocyclitol) 抗生物質、ハイグロマイシンＢの存在下で増殖し得る。本発明における使用のための他の選択可能なマーカー配列は、グリフォセート耐性CP4およびCOX遺伝子（Zhouら、1995）を含む。これらの遺伝子のいずれかを発現するトランスジェニック植物は、グリフォセートに対する耐性を示し、植物形質転換体を選択するための選択培地中に使用され得る。ベクターはまた、複製起点および選択可能マーカーを含む配列のような、二次宿主において選択および増殖を可能にする配列を含み得る。代表的な２次宿主は、バクテリアおよび酵母を含む。１つの実施態様において、二次宿主は、Escher ichia coliであり、複製起点は、colE1型であり、そして選択可能マーカーは、アンピシリン耐性をコードする遺伝子である。このような配列は当該分野で周知であり、市販もされている（例えば、Clontech、Palo Alto，CA；Stratagene，L aJolla，CA）。本発明のベクターはまた、改変されて、Agrobacterium tumefaciensベクターに相同な領域、Agrobacterium tumefaciens由来のT-DNAボーダー領域、およびキメラ遺伝子または発現カセット（上記）を含む植物形質転換プラスミドを媒介する。さらに、本発明のベクターは、Agrobacterium tumefaciensの無力化した植物腫瘍誘導プラスミドを包含し得る。本発明のベクターは、植物細胞における核酸コード配列の中程度のレベルの構成的発現に有用である。例えば、選択されたペプチドまたはポリペプチドコード配列は、本発明のベクターの発現カセットに挿入され得る。次いで、ベクターは、宿主細胞に形質転換され、宿主細胞は、タンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下で培養され、そして発現されたペプチドまたはポリペプチドが細胞から単離される。形質転換された前駆細胞はまた、果実を有するトランスジェニック植物を作製するのに使用され得る。本発明のベクター、キメラ遺伝子、およびDNA構築物は、植物細胞形質転換における使用およびそれに続くトランスジェニック植物の作製のために個々か、または、キット中において販売され得る。Ａ．異種遺伝子本明細書中で記載される方法および結果は、本発明のキイチゴプロモータの、トランスジェニック植物における構成的中程度のレベルの遺伝子発現を提供する能力を示す。本発明のキイチゴプロモーターは、多くの植物組織においてすぐ隣接した（下流の）遺伝子の転写を構成的に促進するDNAの領域を含む。本発明の方法に従って、異種遺伝子は、本発明のキイチゴプロモーターに作動可能に連結される。植物の形質転換のための例示的な異種遺伝子は、その産物が抗生物質耐性を与えるのに効果的な遺伝子を含む。nptII遺伝子を含む、これらの遺伝子のいくつかは、以上に記載される。本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110、dru259）と共に使用され得る目的の他の遺伝子は、以下を含むが、それらに限定されない：真菌耐性を与え得る遺伝子（例えば、Phaseolus vulgaris由来のポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（PGIP）遺伝子（Toubartら、1992））ならびに植物グルカナーゼ、キチナーゼ(Jongedijkら、1995)、および他の病原関連（PR）遺伝子（Melchersら、1 994；Ponsteinら、1994；Woloshukら、1991）の改変形態）。これらの遺伝子産物（例えば、キチナーゼまたはβ-1,3-グルカナーゼ）は、例えば、Fusarium、S clerotinia sclerotiorum、およびRhizoctonia solaniのような真菌に対する耐性を増強し得る。これらの産物を発現する形質転換植物は、苗立枯病、根腐れ病などのような病気に対する増大した耐性を示す。トランスジェニック植物に対するウイルスおよび真菌耐性の両方を与える他の代表的な遺伝子は、「VIRUS AND FUNGAL RESISTANCE: FR0M LAB0RATORY TO FIELD」（Van Den Elzenら、1994）に記載される。本発明のキイチゴプロモーターを用いた使用のためのさらなる例示的な異種遺伝子は、その産物が形質転換植物細胞に除草剤耐性を与えるのに効果的な遺伝子を含む。例示的な除草剤耐性遺伝子は、ホスフィノスリシン(phosphinothricin) アセチルトランスフェラーゼ（PAT）をコードするバイアラホス(bialaphos)耐性遺伝子（bar）（Akamaら、1995）を含む。この遺伝子を含むトランスジェニック植物は、除草剤「BASTA」に対する耐性を示す。この遺伝子はまた、選択可能マーカー遺伝子としても使用され得る。なぜなら、bar遺伝子を保有する外植片が、バイアラホスの活性成分であるホスフィノスリシン（PPT）を含む選択培地で生長し得るからである。さらなる除草剤耐性遺伝子は、グリフォセート含有除草剤に対する耐性を与える遺伝子を含む。グリフォセートは、その酸性形態またはアニオン形態のいずれかにおいてN-ホスホノメチルグリシンをいう。この活性成分を含む除草剤は、「 ROUNDUP」および「GLEAN」を含む。例示的なグリフォセート耐性を与える遺伝子は、EPSPシンターゼ遺伝子（5-エノールピルビル-3-ホスホシキミ酸シンターゼ）（Delanneyら、1995；Tiniusら、1995）、またはアセトラクテートシンターゼ遺伝子（Yaoら、1995）を含む。他の例示的なDNAコード配列は、dru1プロモーターの転写制御下のブロモキシニル(bromoxynil)特異的ニトリラーゼコードするbxn遺伝子（Stalkerら、1988）を含む。このキメラ遺伝子を含む形質転換植物は、ブロモキシニル特異的ニトリラーゼを発現し、そしてブロモキシニル含有除草剤の適用に対して耐性である。本発明のプロモーターを用いて発現するために有用であり得る他の遺伝子産物は、トランスジェニック植物におけるコートタンパク質媒介ウイルス耐性を増強するウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子を含む。例示的な遺伝子は、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質（AlMV）、キュウリモザイクウイルスコートタンパク質（CMV）、タバコ条斑病(streak)ウイルスコートタンパク質（TSV）、ジャガイモウイルスコートタンパク質(PVY)、タバコラトル(rat tle)ウイルスコートタンパク質(TRV)、およびタバコモザイクウイルスコートタンパク質（TMV）（Beachyら、1990）を含む。従って、本発明のキメラ遺伝子は、キイチゴdru1プロモーターの転写制御下で、ウイルスコートタンパク質遺伝子（例えば、ALMV、CMV、TSV、PVX、TRV、またはTMV遺伝子）を含む。Ｂ．異種植物系における発現本発明の支持により実施される実験は、本発明のキメラ遺伝子構築物の汎用性を示す。本発明のベクター構築物は、プロモーター配列の元の植物供給源に非依存的なトランスジェニック植物における異種配列の形質転換および発現のために使用され得る。例えば、dru110::nptIIおよびdru259::nptIIキメラ遺伝子は、トマト植物細胞に首尾良く導入された。これらのデータは、本発明のキイチゴプロモーター（例えば、dru110、dru259 ）が、異種植物系（すなわち、トマトのようなキイチゴ以外の植物細胞）における遺伝子発現の促進に有用であることを示唆する。さらに、このプロモーターにより媒介される発現は、異種植物でさえも構成的であると思われる。これらの知見は、植物の形質転換のための本発明のベクター、キメラ遺伝子、およびDNA 構築物の有用性を支持する。 VII．利用本発明の支持により実施される実験は、dru1プロモーター（例えば、dru110またはdru259）により指向されるnptIIの遺伝子発現パターンが種々の植物組織（例えば、葉、茎、果実、根）で観察されることを示す。従って、本発明のキイチゴプロモーターの使用は、その制御下に配置した外来遺伝子の構成的発現を可能にする。本発明のキイチゴdru１由来プロモーター、dru110およびdru259は、本明細書中に記載の配列情報を利用して本明細書中上記のようにクローン化され得る。これらのキイチゴプロモーターは、その機能が中程度のレベルの構成的プロモーターにより増強されるかまたは可能になる、任意の異種遺伝子を発現するために使用され得る。例示的な遺伝子は、以上に記載される。これらのプロモーターの使用は、特に本発明のキイチゴプロモーターを用いたトマトの首尾良い形質転換を考慮して、キイチゴに限定されるとみなされ得ない。キイチゴは、本質的には、小型の核果果実(drupe furuit)であり、キイチゴプロモーターは、おそらく他の核果果実で機能する。本発明の構築物および方法は、全ての高等植物（以下：液果様果実、例えばVitis（ブドウ）、Fragaria（イチゴ）、Rubus（キイチゴ、セイヨウヤブイチゴ、ローガンベリー）、Ribes（スグリおよびセイヨウスグリ）、Vaccinium（コケモモ(blueberry)、コケモモ(bil berry)、欧州コケモモ、ツルコケモモ）、Actinida（キーウィーフルーツおよびシナスグリ）を含むが、これらに限定されない）に適用可能である。さらに、他の核果果実は、Malus（リンゴ）、Pyrus（セイヨウナシ）、Prunus属のほとんどの一員、アカテツ科の実、マンゴ、アボカド、アンズ、モモ、サクランボ、スモモ、およびネクタリンを含むが、これらに限定されない。さらなる植物供給源は以上に記載される。本発明は、構成的な様式で任意の遺伝子の植物細胞発現を調節するための組成物および方法を提供する。１つの実施態様において、本発明のプロモーターは、 nptIIのような選択可能なマーカー遺伝子の発現を調節するのに使用され得る。あるいは、キイチゴプロモーターは、除草剤耐性遺伝子の発現を促進するか、または増強されたウイルス耐性を提供するためのウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節するために使用され得る。本発明のキイチゴプロモーターは、植物細胞の形質転換を促進するために、キメラ遺伝子、植物形質転換ベクター、発現カセット、キットなどにおいて使用され得る。本明細書中に記載されたキイチゴプロモーターはまた、トランスジェニック植物において異種遺伝子（例えば、選択可能なマーカー）の中程度のレベルの発現を提供するための方法において使用され得る。以下の実施例が例示されるが、本発明の範囲を制限することを決して意図されない。材料と方法生物学的試薬は、代表的には以下の販売会社から得られた：５’to ３’Prime ,Boulder, CO;New England Biolabs, Beverly, MA;Gibco/BRL、Gaithersburg,MD ;Promega,Madison,WI;Clontech,Palo Alto, CA;およびOperon Alameda,CA。標準的な組換えDNA技術が全ての構築物において使用された（AdamsおよびYang、1977 、Ausubelら、1992;HooykaasおよびSchilperoot、1985、Sambrookら、1989;Wang ら、1990;Kawasakiら、1989、Veluthambiら、1988;Benvenutoら、1988）。実施例１キイチゴ小核果タンパク質の特徴付けおよび精製Ａ．タンパク質溶解物の調製およびゲル電気泳動液体窒素を含む乳鉢と乳棒を使用して、１つの全ベリーの凍結した核果を微細な粉末にすりつぶすことによって、キイチゴタンパク質サンプルを調製した。サンプル緩衝液（0.05M Tris、pH6.8、１％ SDS、５％ β-メルカプトエタノール、10％グリセロール；Laemelli、1970）を組織に添加（900μl）し、そしてこのサンプルをボルテックスすることによって混合した。サンプルを、10分間90〜 9 5℃で加熱し、そして４℃で10分間、14K rpmで遠心分離した。上清を、不溶性の細片のペレットから取り出し、そして−20℃で保存した。小核果タンパク質を、標準的な手順を用いて、クマシーブルー染色と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS PAGE）によって分析した。可溶性小核果タンパク質のクマシーブルー染色したSDSポリアクリルアミドゲルを、図10に示す。この図において：レーン１は分子量マーカー（ BioRad，Richmond，CA）であり、レーン２、３、および５は、それぞれ個々の果実から別々に調製した９μｇのキイチゴ小核果タンパク質溶解物を含む。レーン４は、さらに多い量の溶解物を含んだ。２つの非常に豊富なタンパク質が、約17kdおよび15kdに観察され、それぞれdr upe1およびdrupe2と名付けた。図10において、これらの２つのタンパク質を矢印で示す。このゲルの走査型デンシトメトリー分析は、drupe1およびdrupe2が、キイチゴの小核果中の全可溶性タンパク質のそれぞれ約23％および37％を構成することを示した。結果として、タンパク質の精製および配列決定のための直接的なウェスタンブロットアプローチが続いた。Ｂ．配列決定のためのタンパク質ブロットタンパク質ブロット（Applied Biosystems，Inc．User Bulletin Number 58;A usubelら、1992）を、上記のキイチゴタンパク質溶解物を使用して調製した。種々の量のキイチゴタンパク質溶解物（12〜36μg／ウェル）を、4.5％のスタッカーを有する10ウェルの18％ SDS-PAGEミニゲル（1.5m・厚）上にロードし、そして25mM Tris、192mMグリシン、0.1％ SDS緩衝液中で２〜2.5時間、100ボルトで電気泳動した。タンパク質を、25mM Tris、192mM グリシン、10％メタノール緩衝液中で90ボルトで２時間、４℃にて、Applied BioSystemの「PROBLOTT」ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）メンブレンにトランスブロットした。タンパク質の転移後、ブロットをクマシーブルー染色し、15および17キロダルトン（kd）のタンパク質バンドがブロット上に存在し、そしてこれらを切り出した。タンパク質のＮ末端配列決定を、New Haven，CTのW.M．Keck Foundation，Biotechnology Resourc e Laboratoryで行った。 drupe1サンプルは、30アミノ酸のＮ末端配列を生じた。drupe2サンプルは、おそらくブロックされたアミノ末端のために、有用な配列情報を産生しなかった。アミノ末端のdrupe1配列を、配列番号11として示す。この30アミノ酸のdrupe1配列を、BLAST検索を使用してタンパク質データベースと比較した；有意な合致は見られず、このことはdrupe1が新規のタンパク質であることを示す。実施例２ Drupe1 タンパク質に対応するcDNAクローンの回収Ａ．小核果全RNAの調製 RNAを、成熟緑キイチゴ小核果から抽出した。４つの成熟緑キイチゴの果実（食べ頃に摘み取り、そして−80℃で保存した）を使用してRNAを抽出した。小核果の推定の重量は12グラムである。液体窒素を含む冷乳鉢中で、全ベリーを乳棒でそれらを軽くたたくことによって破砕した。小核果を花托から分離した。花托を、乳鉢から取り出し、そして破棄した。小核果を、組織を凍結状態に維持するために必要である場合は液体窒素を添加しながら、乳鉢の中で粉末にすりつぶした。種子を、意図的に完全なままにした。ホモジナイズ緩衝液、２ml／グラムの組織を使用してRNAを抽出した。［ホモジナイズ緩衝液：200mM Tris-HCl pH8.5 、300mM LiCl、10mM Na₂EDTA、１％（w/v）デオキシコール酸ナトリウム、1.5％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、8.5％（w/v）不溶性ポリビニルポリピロリドン（PVPP）、１％（v/v）NP-40、１mM アウリントリカルボン酸（ATA）、５mM チオ尿素、および10mM ジチオトレイトール（DTT）；最後の３つの成分は、オートクレーブ後に添加した。］凍結粉末小核果組織を、添加と添加との間にボルテックスしながら、全ての組織が湿るまで３〜５部分で緩衝液に添加した。組織および緩衝液の溶液（本明細書中でパルプという）を、滅菌水で１：１に希釈し、そして0.75容量のホモジナイズ緩衝液を希釈したパルプに添加した。サンプルを、65℃で10〜15分間インキュベートし、続いてスウィングバケットローター中で9000ｇで15分間、４℃にて遠心分離した。上清を、清潔なチューブに移した。塩化セシウム（CsCl）を、0. 2g/mlで上清に添加した。サンプルを、CsClが溶解するまで混合した。４mlのクッションを、Beckman １×3.5インチポリアロマー超遠心チューブに分配した（クッション：5.7M CsCl、10mM Tris-HCl，pH8.0、１mM Na₂EDTA，pH8 ）。サンプルをクッションの上に穏やかに上層した。サンプルを、SW 28ローターを用いてBeckman L8-80M超遠心分離器中で、23,000rpmで20℃にて20時間回転させた。超遠心分離器からサンプルを取り出した後、上清を、吸引機に取り付けた吸引（drawn）パスツールピペットを使用することによってサンプルから吸引除去した。透明なレンズ様のペレットを、チューブの底に見ることが可能であった。ペレットを、500μlのSSTEに溶解し、そしてミクロ遠心チューブに移した（SS TE：0.8M NaCl、0.4％ SDS、10mM Tris-HCl,pH8.0および1mM Na₂EDTA,pH8）。サンプルを、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）で２回抽出した。RNAを沈澱させるために、2.5容量のエタノールを、水相に添加した。サンプルを遠心分離によって回収し、75％エタノールで２回洗浄し、そして100μlのTE に再懸濁した。収量は、1.6mgであった。RNAを、−20℃での保存のために、1/9 容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび３容量のエタノールを用いて再び沈澱させた。Ｂ．小核果mRNAの調製成熟緑キイチゴ小核果の全RNAからのmRNAの単離を、「STRAIGHT A'S」mRNA単離システム（Novagen，Madison，WI）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。mRNAを、上記の成熟緑色キイチゴ小核果から抽出した1.6mgの全RNAから単離した。この手順によるmRNAの収量は、6.6μgであった。Ｃ．緑キイチゴ小核果mRNAからのcDNAの調製成熟緑キイチゴ小核果RNA由来のmRNAを、cDNA合成のためのテンプレートとして使用した。cDNA反応のためのプライマーは、dTRANDOM（配列番号12；Operon T echnologies，Inc.，Alameda，CAにより合成された）であった。オリゴ（dT）領域が、mRNAプールのポリ（Ａ）領域にハイブリダイズした。他の15ヌクレオチドは5'オーバーハングを作製し、これは、クローニングプロセスの後の工程でPCR 増幅を容易にするために使用された。以下の反応混合物を、cDNA合成反応のために組み立てた：H₂O，10.2μl；250n g mRNA，0.8μl；５×BRL RT緩衝液(BRL，Bethesda，MD)、4.0μl；100mM DTT （ジチオトレイトール−BRL，Bethesda，MD)、0.2μl；「RNAguard」(23.4U/μ ｌ；Pharmacia，Piscataway，NJによるRNaseインヒビター)、0.5μl；dNTP（各2 .5mM)、2.0μl；50μM プライマー、1.0μl；[³²P]dCTP（3000Ci/mmol；DuPont/ NEN，Boston，MA)、1.0μl；およびAMV-逆転写酵素（38U/μl；Life Sciences， Inc.，St．Petersburg，Florida)、0.3μl。cDNA反応を、65℃で３分間の反応および加熱のために、mRNAと水とを組み合わせることによって行った。混合物を氷上で冷却し、そしてミクロ遠心分離した（縮合物を回収するために）。次いで、残りの反応成分を添加した。 42℃で１時間のインキュベーション後、cDNA反応物を氷上に移動して、PCR反応で使用する前に４℃で保存した。実施例３ cDNAdru1 フラグメントのPCR増幅およびクローニング縮重PCRプライマーDrupe20を、dru1タンパク質配列の逆翻訳に基づいてcDNAの 5'末端について設計した。dru1の既知のアミノ酸配列（配列番号13）の断片を、アミノ末端に対するその近接、およびその逆翻訳した配列（配列番号14；Drupe2 0）における相対的に低いレベルの縮重について選択した。Drupe20プライマー（ i）は、配列番号13として示されるアミノ酸配列に対応する512倍の縮重ヌクレオチド配列であり、そして（ii）を3'プライマーとして使用した。 5'PCRプライマー（DrupeRAN18、配列番号15、cDNAプライマーdTRANDOMに対応）を、3'末端について設計した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Perkin-Elmer Ce tus，Norwarlk，CT; Mullis，1987; Mullisら、1987）を、「AMPLITAQ」（Perki n Elmer Cetus)、PCR緩衝液II (50.0mM KCl、10mM Tris-HCl，pH8.3)、２mM MgCl₂、0.2mMの各dNTP、成熟緑小核果cDNA、ならびにDrupe20およびDrupeRAN18 プライマーを使用して、製造業者の手順に従って以下の条件下で行った：１サイクル：95℃１分 35サイクル：95℃１分、42℃１分、および72℃１分１サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。増幅反応の２つの主要な生成物：約700bpの優勢な生成物および約500bpのより少ない生成物が存在した。700bpのバンドを、供給者の説明書に従って、βアガロース（agarase）（New England Biolabs，Beverly，MA）を使用する１％「S EAPLAQUE」アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントを、製造業者の説明書に従って、Invitrogen（San Diego，CA）によるTAクローニングベクターであるベクターpCRIIに連結した。 dru1遺伝子のcDNAクローンを、アルカリ溶解法（Ausubelら、1992）を使用して、1.6mlの培養物から調製したプラスミドミニプレップDNAをスクリーニングすることによって同定した。２本鎖DNAを、「SEQUENASE」ver.2酵素およびキット成分（Uniterd States Biochemical，Cleveland，Ohio）および[α-³⁵S]-dATP（ DuPont/NEN）を使用して、ジデオキシ鎖終結法によって配列決定した。反応を、 M13ユニバーサル正方向プライマーおよび逆方向プライマー（New England Biola bs，Beverly，MA）を使用してプライムした。配列決定反応を、アクリルアミドゲル（「LONG RANGER GEL」、FMC，Rockland，Maine）上で行い、そしてオートラジオグラフィーでバンドを検出した。配列を、オートラジオグラフから読み、そしてdrupe1由来の逆翻訳したＮ末端タンパク質配列とのその相同性について分析した。タンパク質配列の逆翻訳によって得られる縮合DNA配列に対抗するものとして、実際のDNA配列を決定した。cD NAとＮ末端タンパク質配列の残りとの間の相関関係を確認した。これらの判断基準（criteria）後、さらなる特徴付けのために１つのクローン（pAG-301と名付けた）を選択した。pAG301のdru1 cDNAインサートの核酸配列を、配列番号16に示す。遺伝子のゲノムコピーの逆PCRのためのcDNA合成による完全なdru1のクローニング手順を、図11Aおよび11Bに模式的に示す。実施例４ dru1 cDNA に対応するゲノムDNAフラグメントの回収「CTAB」（ヘキサデシル-トリメチル-臭化アンモニウム）法（DoyleおよびDoy le，1990）を使用して、キイチゴの葉からDNAを抽出した。PCRプライマー（DruG en5'、配列番号17；DruGen3'、配列番号18）を、完全なdru1 cDNA配列に基づいて設計した。プライマーの設計を容易にするための、「OLIGO」（National Bios ciences，Inc．（Plymouth，MN）による複合関数プログラム）を使用した。PCR を、「AMPLITAQ」(Perkin-Elmer Cetus)、PCR緩衝液(50.0mM KCl、10mM Tris-HC lpH8.3、および1.5mM MgCl₂)、0.2mMの各dNTP、キイチゴのゲノムDNA、ならびに DruGen5'およびDruGen3'プライマーを使用して、製造業者の手順に従って以下（「H0TSTART」）の条件下で行った：１サイクル：97℃５分、その後、「AMPLITAQ」を添加した、２サイクル：97℃１分、52℃１分、および72℃１分 25サイクル：94℃１分、52℃１分、および72℃１分、１サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。この増幅反応は、３つの主要な生成物：710bpの優勢な生成物ならびに690bpおよび625bpの２つのより少ない生成物を産生した。次いで、PCR反応生成物を、製造業者の説明書に従って、Invitrogen（San Diego，CA）によるTAクローニングベクターであるベクターpCRIIに連結した。710bpのインサートを有するクローンを選択し、pAG-302と命名した。 pAG-302のプラスミドDNAを、アルカリ溶解法（Ausubelら、1992）を使用して1 .6mlの培養物から調製し、「SEQUENASE」ver.2酵素およびキット成分（USB，Cle veland，Ohio）および[α-³⁵S]-dATP（DuPont/NEN）を使用して、ジデオキシ鎖終結法によって配列決定した。配列決定反応を、M13ユニバーサル正方向プライマーおよび逆方向プライマー（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いてプライムした。さらなる配列決定反応を、２つのさらなる内部プライマーを用いてプライムした。配列決定反応物を、アクリルアミドゲル上で分離し、そしてオートラジオグラフィーで検出した。 pAG-302中のdru1ゲノムDNAのインサートの配列を、配列番号19として表す。クローンの配列は、dru1 cDNAに対応するゲノムDNAフラグメントを単離したことを示す。実施例５逆PCRによるdruIゲノムDNAの5'隣接領域の回収逆PCRプライマー（Dru1nvUp（配列番号５）およびDruInvLow（配列番号６）と名付けた）を、ゲノムDNA配列に基づいて設計し、そしてOLIGOを使用して最適化した。キイチゴのゲノムDNAを、制限酵素NsiIで消化した。cDNA配列に基づいて、NsiIが遺伝子の3'非翻訳領域で切断することが公知であったので、NsiIを選択した。NsiI消化したDNAの小さい部分を、分析用アガロースゲル上で泳動し、そしてサザントランスファーを行った（Ausubelら、1992）。サザンブロットを、pAG-302に含まれるcDNAフラグメントでプローブした。プローブは、２〜2.3kbのNsiIフラグメントを同定した：このフラグメントは、ゲノムクローンと強力にハイブリダイズした。第２のより小さいフラグメントもまた、プローブとハイブリダイズしたが、ゲノムクローンとは弱くハイブリダイズした。残ったNsiI消化したキイチゴDNAを、１％「SEAPLAQUE」アガロースゲル（FMC, Rockland，ME）上で電気泳動した。BstEIIλサイズ標準を指針として使用して、２〜2.3kbの範囲の消化したDNAをゲルから切り出した。DNAを、製造業者の説明書に従って、β-アガロース（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いて精製した。DNAを、環状の連結反応生成物の形成に片寄らせるために、比較的希釈した濃度（１μg/ml）で自己連結させた（Ochmanら、1990）。続いて逆PCRを、自己連結させた、NsiI消化した、サイズ選択したキイチゴのゲノムDNAについて行った。Perkin Elmer Corporation/Applied Biosystems Div islon（Foster City，CA）による「AMPLITAQ」を使用して、DNAを増幅した。製造業者の手順に従って、PCR緩衝液、0.2mMの各dNTP、キイチゴのゲノムDNA（本明細書中上記のように調製した）、ならびにDruInvUpプライマー（配列番号５）およびDruInvLowプライマー（配列番号６）を使用した。以下（「H0TSTART」）の反応条件を使用した：１サイクル：97℃５分、その後、「AMPLITAQ」を添加した、２サイクル：97℃１分、58℃１分、および72℃１分 25サイクル：94℃１分、58℃１分、および72℃１分、１サイクル：72℃５分、そして５℃まで冷却。この反応は、２つの主要な増幅生成物：１つは1.8kbおよび１つは900bpを産生した。1.8kbのバンドを、β-アガラーゼを使用する１％の「SEAPLAQUE」アガロースゲルから単離した。このフラグメントをpCRIIに連結して、pAG-310を生じた。サブクローンpAG-310の調製の模式的な提示を、図１および２に示す。 pAG-310インサートを、その全体を配列決定し（配列番号１）、そしてdru1インサートの配列が、配列を共有している領域内のcDNAクローン（配列番号16）およびゲノムクローン（配列番号19）と同一であることを見出した。CAATボックス、TATAボックス、ATG開始コドン、２つのエキソン、イントロン、スプライシング部位、停止コドン、およびポリアデニル化部位を含む、植物遺伝子の通常のエレメントおよびそれらの調節構成要素を同定した（図６Ａおよび６Ｂ）。 dru1の遺伝子の構成およびタンパク質構造を、図12に模式的に示す。この遺伝子は、配列番号20として示される推定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。推定のタンパク質は、17,087.64の計算された分子量および4.80の推定p Iを有する。dru1タンパク質のKyte-Doolittle疎水性(hydrophobicity)プロットを、図13に示す。実施例６ dru1 遺伝子発現の特徴付けＡ．RNA ドットブロット RNAドットブロットを、５μgのキイチゴの葉の全RNA、ならびに緑キイチゴ、成熟緑キイチゴ、変色キイチゴ、およびオレンジ／完熟キイチゴ由来の全花托RN Aの各５μgを使用して、RNAドットブロットを調製した（それぞれ、図14のＩ、I I、III、IV期に対応）。ブロツトを、ランダムプライム法（Boeringer Mannheim Biochemicals，Random Primed reaction kit，Indianapolis，IN）によって[32 -P]dCTP（＞3000Ci/mmole）で標識したdru1 cDNAフラグメントでプローブした。ブロットを、「HYBRIS0L I」（Oncor，Gaithersburg，MD）中で45℃にて一晩、ハイブリダイズさせた。1.2×10⁷DPM/mlのプローブ濃度を使用した。ブロットを、一晩のハイブリダイゼーション後に、0.1×SSCを使用して42℃で１時間の最終洗浄を含んで洗浄した。ハイブリダイゼーションプローブを標準的なオートラジオグラフィー法によって検出した。フィルムへのブロットの露出は、−80℃で増感スクリーンを用いて４時間10分であった。この分析の結果を、図14に示す。この図において、RNAドットは、それぞれ、左から右に、葉RNA、ならびに緑キイチゴ（図14「Ｉ」）、成熟緑キイチゴ（図1 4「II」）、変色キイチゴ（図14「III」）、およびオレンジ／完熟キイチゴ（図 14「IV」）由来の花托RNAである。Ｂ．さらなるRNAハイブリダイゼーション分析植物RNA抽出法（Changら、1993）を、花托および葉について使用した。上記のキイチゴの小核果RNA抽出方法を、小核果およびストロベリーの果実について使用した。ノーザンブロットを、５μg／レーンの各サンプルRNAを用いて調製した。RNA サンプルは以下の通りであった：キイチゴの葉（図15、レーン１）、成熟緑キイチゴの花托（図15、レーン２）、オレンジ／完熟キイチゴの花托（図15、レーン３）、成熟緑キイチゴの小核果（図15、レーン４）、およびオレンジ／完熟キイチゴの小核果（図15、レーン５）。ブロットを、ランダムプライム反応によって[³²P]dCTP（＞3000Ci/mmole）で標識したdru1 cDNAフラグメントでプローブした。ハイブリダイゼーションを、「HYBRISOL I」（Oncor，Gaithersburg，MD）中で45℃にて一晩行った。4.2×10⁶ DPM/mlのプローブ濃度を使用した。ブロットを、一晩のハイブリダイゼーション後に、0.1×SSCを使用して50℃で30分間の最終洗浄を含んで洗浄した。ハイブリダイズしたプローブを、標準的なオートラジオグラフィー法によって検出した。増感スクリーンを使用せずに、室温で１時間、ブロットをフィルムに曝した。この分析の結果を、図15に示す。そしてこれは、小核果における期特異的発現パターンを支持する。Ｃ．タンパク質発現分析タンパク質溶解物を、成熟の種々の期のキイチゴ小核果から調製した（実施例１に記載のように）。溶解物を、PAGEによってサイズ-分画し、そしてクマシーブルー（50％ Me0H、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂）でゲルを染色した。結果を図16に示す。この図において、レーン中の溶解物は以下の通りである：レーン１、緑色の小核果；レーン２、成熟した緑色の小核果；レーン３、変色した小核果；レーン４、オレンジ色の小核果；およびレーン５、完熟した小核果。この分析の結果は、小核果における期特異的発現パターンを支持する。実施例７ dru259 プロモーターを含有するサブクローンpAG-431の作製全長のdru1プロモーターを含有するサブクローンpAG-310の作製を、先の実施例５に記載する。 dru1プロモーターを含有するDNAフラグメントを、プライマー（5'プライマー、DrupeUp（配列番号７）および3'プライマー、DrupeLow(配列番号８)）を使用して標準的なPCR反応条件下でサブクローンpAG-310からPCR増幅した。PCR反応混合物は、以下の成分を含んだ：79.0μlの水、10.0μlの10×Vent緩衝液、1.0μl のDrupeUpプライマー（50μMの溶液）、1.0μlのDrupeLowプライマー（50μMの溶液）、8.0μlのdNPT（各2.5mM）、1.0μlのテンプレートDNA（100ng）。使用したPCR反応条件は以下の通りであった：１サイクル：97℃４分、その後、AMPLITAQを添加した； 25サイクル：94℃１分、49℃１分、および72℃１分；１サイクル：72℃５分、続いて５℃まで冷却。この増幅反応は、図１および２の上部に示されるような1.3kbフラグメント産物を産生した。このフラグメントを、以下のように反応混合物から精製した。PCR反応混合物を、軽量のPhase Lock Gelチューブ（5 Prime to 3 Prime，Boulder，CO）に移した。以下の溶媒の組み合わせ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24:１)）を、PCR反応容量と等しい容量でこのチューブに添加した。このチューブを、製造業者の説明書に従ってミクロ遠心分離器中で回転させた。上部の水相を、Select G-50スピンカラム（5 Prime to 3 Prime，Boulder，CO）に移し、そしてDNAを製造業者の説明書に従ってカラムを通して遠心分離した。D NAを沈澱させるために、溶出物に、1／10容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5容量のエタノールを添加した。サンプルを、10分程度氷上でインキュベートし、次いで、14,000rpmで30分間、４℃でミクロ遠心分離した。上清をチューブからデカントし、ペレットを75％エタノールで２回洗浄した。ペレットを乾燥させ、次いで25μlの1/2強度のTE（５mM Tris-HCl、0.5mM EDTA，pH8）に再懸濁した。DN Aフラグメントを、制限酵素NsiIおよびXbaIで完全に消化して、dru1プロモーターフラグメントを産生した。このフラグメントを、上記のPCR産物と同じ様式で精製した。非組み込み型植物発現ベクターp35S-GFP（Clontech Laboratories，Palo Alto ,CA）を、XbaIおよびPstIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）上で泳動した。3. 7kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体からから切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）によるβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。0.85kbの35Sプロモーターを含むゲル領域を廃棄した。p35S-GFP2からの3.7kbのフラグメントおよび 1.3kbのdru1プロモーターフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書に従って連結反応において組み合わせて中間プラスミドpA G-155を形成した。図１および２に示されるような、キイチゴdru1プロモーターを含む得られたプラスミドを、pAG-155と名付けた。プラスミドpAG-155を、いずれも平滑切断である、SnaBIおよびEcoRVで完全に消化して、本明細書中でdru259と称される259bpのdru1プロモーターフラグメントを遊離させた。ここで、ヌクレオチド番号１はATG開始コドンの5'に隣接している。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC B ioProducts，Rockland，ME）で泳動した。259bpのdru1プロモーターフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、βアガラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。プラスミドの残りを含むゲル領域を廃棄した。 nos::nptIIカセットを含むサブクローンpAG-411を、以下のように調製した。 HIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaqu e，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。3.2kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New Eng land Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。 Germany）を、XbaIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。 1.48kbのnos::nptIIフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、βアガラーゼ（New England Biolabs，Beverly ，MA）を用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。13.3kbのフラグメント含むゲル領域を廃棄した。トを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書にしたがって連結反応において結合させて中間プラスミドpAG-411を形成した。プラスミドpAG-411を、いずれも平滑切断であるHincIIおよびPshAIで完全に消化して、636bpのnosプロモーターフラグメントを遊離させた。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC Bio Products，Rockland ，ME）で泳動した。４kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、βアガラーゼ（New England Biolabs，Be verly，MA）を用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。636bpのno sプロモーターフラグメントプラスミドを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-411由来の４kbのフラグメントおよびpAG-155由来の259bpのdru1プロモーターフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書にしたがって連結反応において結合させて中間ＢＥクターpAG-431を形成した。短型プロモーターdru259のヌクレオチド配列を、配列番号４として本明細書中に示す。実施例８ dru110 プロモーターを含むサブクローンpAG-421の作製全長のdru1プロモーターを含むプラスミドpAG-155の構築は、実施例７に記載する。 166bpのdru1プロモーターを含有するDNAフラグメントを、プライマーDru1-118 H3（配列番号９）およびGFPStartR（配列番号10）を使用して以下のPCR反応条件下でサブクローンpAG-155からPCR増幅した。１サイクル：97℃３分、その後、AMPLITAQを添加した；２サイクル：97℃１分、47℃１分、および72℃１分； 25サイクル：94℃１分、47℃１分、および72℃１分；１サイクル：72℃５分、続いて５℃まで冷却。次いで、166bpのdru1プロモーターフラグメントを以下のように精製した。PCR 反応混合物を、軽量のPhase Lock Gelチューブ（5 Prime to 3 Prime，Boulder ，CO）に移した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24：1 )）を含有する混合溶媒系を、PCR反応容量と等しい容量でこのチューブに添加した。次いで、このチューブを、製造業者の説明書に従ってミクロ遠心分離器中で回転させた。上部の水相を、Select G-50スピンカラム（5 Prime to 3 Prime，B oulder，CO）に移し、そしてDNAを製造業者の説明書に従ってカラムを通して遠心分離した。溶出物に、1／10容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5容量のエタノールを添加してDNAを沈殿させた。サンプルを、10分程度氷上でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを14,000rpmで30分間、４℃でミクロ遠心分離した。上清をチューブからデカントし、ペレットを75％エタノールで２回洗浄した。ペレットを乾燥させ、次いで31.6μlのH₂Oに再懸濁した。このフラグメントを、制限酵素HindIIIおよびEcoRVで完全に消化して、112bpのdru1プロモーターフラグメントを産生した。このフラグメントを、上記のPCR産物と同じ様式で精製した。 nos::nptIIカセットを含むサブクローンpAG-411の作製は、先の実施例７に記載する。プラスミドpAG-411を、HindIIIおよびPshAIで完全に消化して、620bpのnosプロモーターフラグメントを遊離させた。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。４kb のフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。420bpのnosプロモーターフラグメントを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-411由来の４kbのフラグメントおよびpAG-155由来の112bpのdru1プロモーターフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書に従って連結反応において結合させて中間ベクターpAG-421を形成した。プラスミドpAG-421の構築における工程を、図２に模式的に示す。実施例９ dru259::nptII キメラ遺伝子を含むバイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築Ａ．プラスミドpAG-1542の構築プラスミドpAG-1542の構築を要約するフローチャートを、図17に示す。プラスミドpAG-1542を、当該分野で公知の従来のクローニング技術（Sambrookら、1989 ）を使用して構築した。サブクローニングバイナリーベクターpAG-1542は、左の境界の近くに配置されるnosプロモーター、および右の境界の近くに配置されたトマトE8プロモーター(Deikmanら、1989；Deikmanら、1992）によって駆動されるSAMase遺伝子（Ferroら、1995）の制御下にあるnptIIマーカー遺伝子を含んだ。Ｂ．バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築 dru259::nptIIキメラ遺伝子を含むサブクローンpAG-431の構築を、実施例７に記載する。プラスミドpAG-1542を、HindIIIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME ）で泳動した。13kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβ アガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。1.46kbのno s::nptIIフラグメントを含むゲル領域を廃棄した。プラスミドpAG-431を、HindIIIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME ）で泳動した。1.1kbのdru259::nptIIフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverl y，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。プラスミドの残りを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-1542由来の13kbのフラグメントおよびpAG-431由来の1.1kbのdru259::nptI Iフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書に従って連結反応において結合させてバイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342を形成した。バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7342の構築を、図４に模式的に示す。実施例10 dru110::nptII キメラ遺伝子を含有するバイナリー植物形質転換ベクターの構築プラスミドpAG-1542の構築を、実施例９Ａに記載する。 dru110::nptIIキメラ遺伝子を含有するサブクローンpAG-421の構築を、実施例８に記載する。プラスミドpAG-1542を、HindIIIおよびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME ）で泳動した。13kbのフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。1.46kbのnos: :nptIIフラグメントを含むゲル領域を廃棄した。プラスミドpAG-421を、HindIII およびBamHIで消化した。消化したプラスミドを、１％の低融点アガロースゲル（SeaPlaque，FMC BioProducts，Rockland，ME）で泳動した。0.95kbのdru259:: nptIIフラグメントを含むゲル領域を、ゲルの本体から切り出した。次いで、 DNAフラグメントを、New England Biolabs（Beverly，MA）のβアガラーゼを用いて、製造業者の説明書に従ってゲルから精製した。プラスミドの残りを含むゲル領域を廃棄した。 pAG-1542由来の13kbのフラグメントおよびpAG-421由来の0.95kbのdru110::npt IIフラグメントを、Gibco/BRLのT4 DNAリガーゼを使用して、製造業者の説明書に従って連結反応において結合させてバイナリー植物形質転換ベクターpAG-7242 を形成した。バイナリー植物形質転換ベクターpAG-7242の構築を、図３に模式的に示す。実施例11 バイナリーベクターpAG-7242およびpAG7342を使用する植物の形質転換キメラdru110::nptII遺伝子およびdru254::nptII遺伝子をそれぞれ含有するバイナリーベクターpAG-7242およびpAG-7342を使用するAgrobacteriumに基づく植物形質転換を、代表的プラスミドpAG-7242について以下に記載するようにトマト子葉を使用して行った。 Sunseeds Co.（Morgan Hill，CA）から入手したチェリートマト（cherry toma to）株（CH3）を、植物形質転換実験のための標的として使用した。形質転換を、標準的な子葉に基づくAgrobacterium同時培養法（Fillattiら、1987）を使用して行った。 Agrobacterium tumefaciens C58株のdisarmed誘導体であるAgrobacterium tum efaciens EHA101株（Hoodら、1986）を、植物にコード配列を導入するために使用した。この株は、T-DNAを含まないTiプラスミドを含んでいる。pAG-7242プラスミドを、Nagelら（1990）に記載のように本質的にエレクトロポレーションを使用してEHA101に移入した。簡潔には、Agrobacterium tumefaciens培養物を、トリプトン（５g/l）、酵母抽出物（2.5g/l）、NaCl（５g/l）、マンニトール（５g/l）、グルタミン酸ナトリウム（1.17g/l）、K₂HP0₄（0.25g/l）、MgS0₄（0. 1g/l）、およびビオチン（２μg/l）を含有し、水酸化ナトリウムの添加似よってpH7.2に調整したMG/L寒天培地中で、log期の中間（mid-log phase）（OD 6000 .5から1.0）まで増殖させた。トマトの子葉の各末端の約３分の１を切除した後、真ん中の３分の１を、組織移植片として使用した。子葉外植片を、タバコフィーダープレート上で一晩、予め馴化した（Fillattiら、1987）。予め馴化した外植片を、EHA105/pAG-7242の2 0mlの一晩培養物中で15分間置くことによって接種した。次いで、外植片を、Fil lattiら（1987）に記載されるように、タバコフィーダープレート上で２日間、E HA105/pAG-7242と同時培養した。外植片を、2Z培地（Fillattiら、1987）、MurisheegeeおよびSkoog（MS）塩、 NitschおよびNitschビタミン、３％スクロース、２mg/l seatin、500mg/lカルベニシリン、60〜200mg/lカナマイシン、および0.7％寒天を含有する組織培養培地中で増殖させた。外植片を、８〜10週間、組織培養において増殖させた。カルべニシリン処理を全ての培地において２〜３ヶ月間適切に保った。移植片および植物を、対抗選択として土に鉢植えにして、それらがその植物から生存Agrobacter ium tomefaciens細胞を除去するまでカルベニシリン上に保った。表１は、使用した選択薬剤の濃度、および形質転換頻度を含む、植物形質転換実験の要約を示す。本発明の新規のキイチゴプロモーターを使用する植物形質転換実験について得られた結果を、２つの異なる強力な構成的プロモーター、caul imovirusプロモーター、cassava mottle veinウイルスプロモーター（CAS）、およびhsp80プロモーターを含むバイナリーベクターを使用して得られた結果を比較する。CASプロモーターは、The Scripps Research Institute（La Jolla，CA ）から入手した。hsp80プロモーター、そのヌクレオチド配列、およびベクター構築物の単離、ならびにhsp80プロモーターを含むトランスジーンの発現レベルが、記載されている（BrunkeおよびWilson、1993）。上記の、４つのプロモーター-nptIIキメラ遺伝子の組み合わせを使用して産生した形質転換体による10のトランスジェニック事象にわたるnptII発現の相対強度の比較を、図５に示す。実施例12 キイチゴ由来のプロモーターを含有するトランスジェニック植物における nptII マーカー遺伝子の相対発現キイチゴプロモーターdru110およびdru254をそれぞれ含むベクターpAG7242およびpAG-7342を使用する10個の別々のトランスジェニック事象から、葉組織を、 (ｉ)タンパク質抽出および(ii)nptII発現レベルの決定について製造業者（5'-3' ,Inc.，Boulder，CO）に推奨されるプロトコルにしたがって、ELISAによってアッセイしてnptII発現でベルを決定した。形質転換実験による結果を、以下の表１および表２に示す。 nptIIアッセイを、試験時の培養物中で入手可能な根の生えた（rooted）植物を使用するいくつかのサンプルを用いて行った。従って、全ての根の生えた植物をnptII発現について試験したわけではない。ELISAアッセイの結果を、以下の表１の列（IV）に示す。表１：形質転換の結果表１に示すデータを参照して、形質転換頻度を、最初の組織外植片の総数に対する、選択薬剤（カナマイシン）の存在下で根を形成（rooting）し得る再生苗条を生じる組織外植片の数の比として定義して、パーセントで示した。パーセントとして示されるNptII発現レベルは、実施例12において記載されるELISAアッセイの結果に基づく、nptIIについて試験した根を形成した植物の総数に対する、n ptII陽性植物の比である。陽性のnptIIの結果は、バックグラウンドより高いELI SA値である。例えば、列（IV）の最初の数字は、nptIIについて試験した10の事象のうち10が陽性のELISAの結果を示したことを示す。 nptIIの相対的な発現レベルを表２に示す。CAS::nptII構築物を含むトランスジェニック植物からのデータは、CASプロモーターを含む形質転換体において観察される高い発現レベルのために、表２には含まない。アッセイした２つのCAS: :nptII事象による値は、nptIIの6000pg/mlを超えていた。以下の表２に示され、そして図５にグラフで示される事象間の発現の範囲は、植物におけるトランスジーンの発現の典型的なものである。表２：nptIIの発現（pg/ml）上記のデータは、例示的なdru259およびdu110プロモーターが、hsp80プロモーターよりもこれらのプロモーターの制御下に配置された遺伝子のより低いレベルの発現を指向することを示す。しかし、これらの２つの例示的なキイチゴdruプロモーターはいずれも、トランスジェニック植物の選択を可能にするnptIIの十分なレベルを発現し得る。本発明は、特定の方法および実施態様に関して記載しているが、種々の改変および変更が本発明を逸脱することなく行われ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．植物細胞において発現可能なキメラ遺伝子であって：植物細胞において構成的発現を与える能力により特徴付けられ、異種DNAコード配列に作動可能に連結された、配列番号２またはその連続するフラグメントと少なくとも約80％の配列同一性を有するキイチゴdru1プロモーターを含む、キメラ遺伝子。２．前記異種DNA配列が、ポリペプチドを発現する形質転換植物細胞に抗生物質耐性を与える該ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ遺伝子。３．前記ポリペプチドが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびブロモキシニル特異的ニトリラーゼからなる群から選択される、請求項２に記載のキメラ遺伝子。４．前記異種DNA配列が、ポリペプチドを発現する形質転換植物細胞に除草剤耐性を与える該ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ遺伝子。５．前記異種DNA配列がnptII遺伝子を含む、請求項１に記載のキメラ遺伝子。６．前記プロモーターが、配列番号３と少なくとも約80％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ遺伝子。７．前記プロモーターが、配列番号４と少なくとも約80％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ遺伝子。８．前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ遺伝子。９．前記プロモーターが配列番号４を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ遺伝子。１０．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む植物細胞。１１．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクター。１２．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物。１３．植物細胞において構成的発現を与える能力により特徴付けられた、配列番号２またはその連続するフラグメントと少なくとも約80％の配列同一性を有する、キイチゴdru1プロモーター。１４．配列番号３と少なくとも約80％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のプロモーター。１５．配列番号４と少なくとも約80％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のプロモーター。１６．配列番号３を含む、請求項１３に記載のプロモーター。１７．配列番号４を含む、請求項１３に記載のプロモーター。１８．請求項１３〜１７のいずれかに記載のプロモーターを含むDNA構築物。１９．トランスジェニック植物を産生する方法であって、以下の工程を包含する、方法：請求項１〜９のいずれかに記載のキメラ遺伝子で植物の前駆細胞を形質転換して、形質転換前駆細胞を生じさせる工程；および該形質転換前駆細胞を成長させて、トランスジェニック植物を産生する工程。２０．トランスジェニック植物において選択可能なマーカー遺伝子の発現を提供するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：（a）請求項１に記載のキメラ遺伝子で植物の前駆細胞を形質転換して形質転換前駆細胞を生じさせる工程であって、ここで前記DNA配列が、その発現が形質転換植物細胞に抗生物質選択薬剤の存在下で増殖する能力を与える産物をコードする選択可能なマーカー遺伝子を含む、工程、（b）該選択薬剤の存在下で増殖する能力により、該キメラ遺伝子を含む形質転換植物細胞を選択する工程、（c）（b）において選択された形質転換植物細胞を再生して、分化した植物を提供する工程、および（d）該産物を発現する形質転換植物を選択する工程。２１．前記形質転換工程が、Agrobacteriumに基づく形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントからなる群から選択される形質転換方法により実施される、請求項２０に記載の方法。２２．前記選択薬剤がハイグロマイシン、ゲネチシン、およびカナマイシンからなる群から選択される、請求項２０または請求項２１に記載の方法。２３．前記選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（npt）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子、およびブロモキシニル特異的ニトリラーゼ（bxn）遺伝子からなる群から選択される、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。２４．前記形質転換工程における前記キメラ遺伝子が、請求項１４〜１７のいずれかに記載のプロモーターを含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。２５．請求項１１に記載の植物形質転換ベクターを包含する、植物を形質転換するためのキット。２６．請求項２に記載のキメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクターを含む、トランスジェニック植物において選択可能なマーカー遺伝子の発現を提供するためのキット。２７．前記異種DNA配列がネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする、請求項２６に記載のキット。２８．請求項１４〜１７のいずれかに記載のプロモーターを含む、請求項２６または請求項２７に記載のキット。