JP2005143338A - カルス及び種子胚特異的発現活性を有するプロモーター - Google Patents
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
【解決手段】 以下の(a)、(b)又は(c)に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。(a)特定の配列で示す塩基配列からなるDNA。(b)特定の配列表で示す塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA。(c)特定の配列で示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA。
【選択図】 図3
Description
(1) 以下の(a)、(b)又は(c)に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。
(a)配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1に示す塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA
(c)配列表の配列番号1に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA
(2) (1)に記載のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA。
(3) (1)又は(2)に記載のDNAに選抜マーカー遺伝子を連結したDNA。
(4) (3)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(5) (3)に記載のDNAと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
(6) (4)又は(5)に記載の組換えベクターを導入した形質転換植物体。
(7) (4)又は(5)に記載の組換えベクターを植物材料に導入し、該植物材料をカルス形成用培地にて培養し、培養カルスの中から選抜マーカー遺伝子の発現の有無を指標に形質転換カルスを選抜することを含む、形質転換植物体の選抜方法。
本発明に係るプロモーターとして機能しうるDNA(以下、「プロモーター」という)は、配列番号1に示す塩基配列からなるDNAである。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、ノパリン合成酵素(NOS)、オクトピン合成酵素(OCS)等の遺伝子を上記プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法(後述)により植物細胞のゲノムに挿入した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
本発明の組換えベクターは、上記1.のプロモーターに選抜マーカー遺伝子を連結したDNAを、適当なベクターに連結することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系(Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P.: The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation., Plant Mol Biol., 25: 989-94, 1994)、pCAMBIA系(http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm)、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌(Escherichia coli)及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である(EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991))。一方、pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カルフラワーモザイクウイルス(CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス(BGMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
上記2.で調製した組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。
本発明のプロモーターは、選抜マーカー遺伝子をカルス及び種子胚でのみ発現し、根、茎、葉などの他の組織では発現しないので、該プロモーターに選抜マーカー遺伝子を連結したDNAは、形質転換細胞の選択時にのみ発現できる新規な選抜マーカーとして利用できる。なお、該プロモーターの発現制御を受けるマーカー遺伝子を組み込んだイネでは、カルス以外で種子胚でもマーカー遺伝子の発現が観察されるが、収穫されたイネ種子は精米処理により胚部分が除去されるため、マーカー遺伝子の発現が見られない胚乳部分が可食部となり得る。
(実施例1) イネ#15遺伝子プロモーター配列の単離及び形質転換用ベクターへの導入
(1)プロモーターの単離
配列番号2に示す塩基配列を有するイネ#15遺伝子(DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp):アクセッション番号AK073888)の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ(品種:日本晴)幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit(キアゲン社)を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp:アクセッション番号AP005620)に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマー#15-5(5’-ATGCAAGCTTCTCTCACTGGTCACTTGTATG-3’:配列番号4)と#15-3(5’-GCCGCCATGGATGGCGCCAATTATGTACTC-3 :配列番号5)をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、#15遺伝子のmRNAの情報から予測される翻訳開始コドンATGの5’上流に位置する1865塩基対[配列番号1において7位(1位〜6位はHindIII認識配列)の塩基から1871位(うち1870位〜1871位はNcoI認識配列ccATGgの一部)までに塩基に対応]の配列を増幅するように設計した。なお、この1865塩基対の配列中には開始コドンより156bp上流にTATA配列が存在し、170bp上流に転写活性化に関与すると考えられるCCAATボックスが存在する。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端(#15-5)及び3’末端(#15-3)に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
以上のイネ遺伝子プロモーター配列のクローニング手順を図1に示す。
上記のプロモーター配列をイネに導入するために、植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターpSMAHdN627-M2GUSを構築した(図2)。図2に示すように、本バイナリーベクターには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、アグロバクテリウムTiプラスミド由来Nos(ノパリン合成酵素遺伝子)プロモーター::大腸菌由来HPT(ハイグロマシン耐性)遺伝子のコード領域::Tiプラスミド由来TiaaM(トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子)ターミネーターを配置し、形質転換された植物体がハイグロマイシンB耐性を示すようにした。また、その隣接部位にベータグルクロニダーゼ(GUS)遺伝子のコード領域::Tiプラスミド由来Nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、GUS遺伝子の5’上流側にプロモーター配列を挿入できるようにマルチクローニング部位を設けた。また、left border(LB)配列とright border(RB)の配列の外側には、微生物細胞で機能し得るスペクチノマイシン耐性(SpR)遺伝子、大腸菌で機能するpBR322由来(ColE1型)複製開始領域、アグロバクテリウム細胞内においてプラスミドが安定に保持されるための配列Sta、及び複製開始領域Repを設けた。
pGEM-T easyベクターをHindIII及びNcoIで二重消化することにより、イネ#15遺伝子プロモーター断片を切り出し、(2)で構築したpSMAHdN627-M2GUSベクターの対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドをpSMAHdN627-15GUSと命名し、バイオラッド社のE. coliパルサーを用いたエレクトロポレーション法(0.2 cmキュベット、パルス条件:2.4kV/cm、25μF、200Ω)により、アグロバクテリウムEHA105系統に導入した。
イネの形質転換は超迅速形質転換法(WO 01/06844 A1 (2001)参照)により行った。イネ(品種:日本晴)種子を、70 %エタノール、続いて次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌蒸留水ですすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6 salts 及びvitamins (Chu C.C., C.S.Wang, C.C.Sun, C. Hsu, K.C. Yin, C.Y. Chu, Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources, Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975))、30 g/L ショ糖、 0.3 g/L カザミノ酸、2.8 g/L プロリン、2 mg/L 2,4-D, 2 g/L ゲルライト、pH5.7〕に置床し、30℃かつ明条件下で5日間培養した。
イネに導入した#15遺伝子プロモーターの活性を観察するため、GUS酵素活性の組織化学的染色を実施した。実験に用いた植物組織材料のうち、カルス、花器官、根についてはイネ個体あるいはカルス(培養細胞)から切り取った材料をそのまま反応液に浸漬した。葉身については展開葉を5〜10 mmの幅で切り取り5%の寒天に包埋し、マイクロスライサー(堂阪イーエム、DTK1000)を用いて80μmの厚さの切片を作製した〔植物細胞工学 第4巻281-285頁(1992)〕。稈基部については、根を切り取った稈(かん:イネ科植物の茎を表す用語)の根元から5-10 mmの組織を切り取り、また茎頂については前出の稈基部の直上部分を10 mmほど切り取り、葉身と同様の方法で80μmの厚さの切片を作製した。こうして作製した植物材料をGUS活性測定用の反応液〔50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)、1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)、5%(v/v) メタノール、10μg/mlシクロヘキシミド、1 mMジチオスレイトール〕に浸漬し、37℃で穏やかに振盪しながら24時間置いた。その後、100%エタノールで反応液を置換して反応を停止し、さらに24時間静置することにより緑色組織の細胞より葉緑素を除去した。次にエタノールを純水で置換した後、実体顕微鏡あるいは光学顕微鏡で染色パターンを観察した。その結果、カルス細胞においてGUS遺伝子の発現を示す青色の呈色が特に強く検出された。また再分化個体(T1世代)を育成して得られたT2後代種子の胚組織においても比較的強い活性が現われた。その他の組織・器官においては、稈基部の維管束においてわずかにGUS発現が認められた以外、発現が認められなかった(図3)。
Claims (7)
- 以下の(a)、(b)又は(c)に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。
(a)配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1に示す塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA
(c)配列表の配列番号1に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA - 請求項1に記載のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルス及び種子胚に特異的な発現をもたらすプロモーター活性を有するDNA。
- 請求項1又は2に記載のDNAに選抜マーカー遺伝子を連結したDNA。
- 請求項3に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項3に記載のDNAと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項4又は5に記載の組換えベクターを導入した形質転換植物体。
- 請求項4又は5に記載の組換えベクターを植物材料に導入し、該植物材料をカルス形成用培地にて培養し、培養カルスの中から選抜マーカー遺伝子の発現の有無を指標に形質転換カルスを選抜することを含む、形質転換植物体の選抜方法。
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