JP7453657B2 - 受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導する核酸分子及びベクター、並びに受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物及びその作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導する核酸分子及びベクターと、斯かる核酸及びベクターを用いた、受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物及びその作製方法に関する。

種子植物の種子は、主に胚及び胚乳から構成される。胚は受精卵が発育してなる幼植物個体であり、これが発芽・成長することで次世代の植物となる。胚乳は胚に隣接した組織で、発芽に際して胚の成長に必要な養分を供給する働きを有する。胚乳の構造は、雌性配偶体である胚嚢に由来する内乳と、胞子体組織に由来する周乳とに分けられる。胚及び胚乳は珠皮に包まれて胚珠を構成し、これが成熟して種子を形成する。裸子植物では胚珠は剥き出しで存在するが、被子植物では胚珠が子房に覆われており、子房が成熟して果実を形成する。

被子植物において、雌蕊に含まれる胚嚢は、その一端に３つの反足細胞を、他端には単一の卵細胞を含む３つの細胞からなる卵装置を有する。また、胚嚢の中央には２つの極核が存在する。雌蕊が受粉すると、花粉から伸長した花粉管により２個の精細胞が胚嚢内に運ばれ、これらがそれぞれ胚嚢内の卵細胞及び２つの極核と受精する（これを重複受精（double fertilization）と呼ぶ）。一方の精細胞と卵細胞との受精（これを生殖受精と呼ぶ）により核相２ｎの受精卵が生じ、これが分裂して胚を形成する。また、他方の精細胞と２つの極核との受精（これを栄養受精と呼ぶ）により核相３ｎの胚乳核が生じ、これが胚嚢内で分裂増殖して内乳を形成すると共に、胚乳を形成する。

被子植物においては、精細胞と２つの極核との受精（栄養受精）が生じないと、胚乳が発生しない場合が多い。植物種や個体、更には種々の条件によっては、栄養受精が生じずとも胚乳が発生する場合もあるものの、こうして発生した胚乳は通常、精細胞と卵細胞との受精（生殖受精）により生じた胚を養育する能力を有さない。

作物の生産効率向上等の観点からは、種子植物において、受精を経ずに機能的な胚乳を人為的に誘導することができると望ましい。受精を介さない胚乳の発生を促進する遺伝子としては、例えばＦＩＳ遺伝子（特許文献１：国際公開第２０００／０１６６０９号）等が開発されているが、本遺伝子を導入して得られる変異植物体は何れも劣性変異体で、しかも変異体を母方に有するものでしか効果が発揮されないために、実用性に乏しかった。

国際公開第２０００／０１６６０９号

本発明の課題は、種子植物において、受精を経ずに機能的な胚乳を人為的に誘導する手法を提供することである。

本発明者等は、特定の遺伝子を胚乳発生誘導因子として種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導することが可能となることを見いだし、本発明に到達した。

即ち、本発明は、以下に関する。
［１］種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子であって、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。
［２］胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、下記式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、［１］の核酸分子。
［Ｆ／Ｖ］［Ｋ／Ｑ］［Ａ／Ｑ］ＫＬＲＫＧＬＷＳＰＥＥＤ［Ｅ／Ｄ］ＫＬ［Ｌ／Ｙ］Ｎ［Ｈ／Ｙ］Ｉ［Ｉ／Ｔ］ＲＨＧ［Ｈ／Ｖ］ＧＣＷＳＳＶＰＫＬＡＧＬＱＲＣＧＫＳＣＲＬＲＷＩＮＹＬＲＰＤＬＫＲＧ［Ａ／Ｓ］ＦＳＱ［Ｄ／Ｑ］ＥＥ［Ｄ／Ｓ］ＬＩ［Ｉ／Ｖ］［Ａ／Ｅ］ＬＨ［Ａ／Ｅ］［Ａ／Ｉ］ＬＧＮＲＷＳＱＩＡ［Ｓ／Ｔ］［Ｈ／Ｒ］ＬＰＧＲＴＤＮＥＩＫＮＦＷＮＳＣＬＫＫＫＬＲ［Ｑ／Ｒ］［Ｋ／Ｒ］Ｇ［Ｉ／Ｌ］ＤＰ［Ａ／Ｔ］ＴＨＫＰ［Ｉ／Ｌ］
・・・（Ｉａ）
ＥＲＫＫＧＶＰＷＴＥ［Ｅ／Ｄ］ＥＨ［Ｒ／Ｋ／Ｌ］［Ｑ／Ｌ／Ｒ／Ｓ］ＦＬ［Ｍ／Ｌ］ＧＬＫＫＹＧ［Ｋ／Ｒ］ＧＤＷＲＮＩ［Ａ／Ｓ］［Ｒ／Ｋ］［Ｎ／Ｓ／Ｙ］ＦＶ［Ｔ／Ｉ／Ｑ］［Ｔ／Ｓ］ＲＴＰＴＱＶＡＳＨＡＱＫＹＦ［Ｉ／Ｌ］Ｒ［Ｑ／Ｌ］［Ｖ／Ｌ／Ｎ］［Ｎ／Ｓ／Ｔ］［Ｇ／Ｄ］ＧＫＤＫＲＲ［Ｓ／Ａ］ＳＩＨＤＩＴＴＶＮ［Ｉ／Ｌ］
・・・（Ｉｂ）
［３］胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、及び配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、［１］又は［２］の核酸分子。
［４］胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、及び、配列番号２０より選択される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、［１］～［３］の核酸分子。
［５］前記核酸分子が更に、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されている、［１］～［４］の核酸分子。
［６］転写抑制機能を有するポリペプチドが、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、［５］の核酸分子。
［Ｌ／Ｆ］ＤＬＮ［Ｌ／Ｆ］［Ｘ］Ｐ ・・・（IIａ）
［Ｌ／Ｖ］［Ｒ／Ｋ］ＬＦＧＶＸ［Ｍ／Ｖ／Ｌ］ ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＰ ・・・（IIｃ）
ＴＬＸＬＦＲ ・・・（IIｄ）
（但し、上記式（IIａ）～（IIｄ）中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
［７］転写抑制機能を有するポリペプチドが、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、［５］又は［６］の核酸分子。
［８］転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８からなる群より選択される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、［５］～［７］の核酸分子。
［９］前記核酸分子が更に、プロモーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、プロモーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、［１］～［８］の核酸分子。
［１０］前記核酸分子が更に、ターミネーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、ターミネーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、［１］～［９］の核酸分子。
［１１］［１］～［１０］の核酸分子を担持するベクター。
［１２］植物ウイルスベクター又はアグロバクテリウムベクターである、［１１］のベクター。
［１３］受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物を作製する方法であって、［１］～［１０］の核酸分子、又は、［１１］若しくは［１２］のベクターを、種子植物細胞内に導入して発現させることを含む方法。
［１４］［１］～［１０］の核酸分子、又は、［１１］若しくは［１２］のベクターが、細胞内に組み込まれている組換え種子植物。
［１５］［１３］の方法により作製される組換え種子植物。

本発明によれば、種子植物において、受精を経ずに機能的な胚乳を人為的に誘導することが可能となる。

図１Ａは、シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０及びイネＯｓ０５ｇ０５４３６００ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３、及び１３）のアライメントを示す図である。 図１Ｂは、シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００、Ａｔ２ｇ３８０９０、Ａｔ５ｇ５８９００、イネＯｓ０１ｇ０１４２５００、及びイネＯｓ０１ｇ０８５３７００ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号５、７、９、１５、及び１７）のアラインメントを示す図である。 図２Ａは、実施例１～７で作製したキメラ遺伝子Ａ～Ｇの構成を模式的に示す図である。 図２Ｂは、実施例８～１１で作製したキメラ遺伝子Ｈ～Ｋの構成を模式的に示す図である。 図３は、形質転換植物体Ａ～Ｅのつぼみ、さや、及び胚珠の光学顕微鏡写真である。（ａ）つぼみの外観、（ｂ）さやの外観、（ｃ）さやの内部、及び（ｄ）胚珠を示す。 図４は、形質転換植物体Ｇのさや及び胚珠の光学顕微鏡写真である。（Ａ）さやの外観（野生型との対比で示す）、（Ｂ）さやの内部、並びに（Ｃ１）及び（Ｃ２）胚珠を示す。 図５Ａ～Ｃはそれぞれ、形質転換植物体Ａ、Ｃ、及びＧの胚珠の縦横長を示すグラフである。 図６は、形質転換植物体Ａ、Ｃ、及びＧの胚乳部分の面積を示すグラフである。 図７は、野生型植物体並びに形質転換植物体Ａ～Ｃ及びＧの胚珠のバニリン染色後の光学顕微鏡写真である。 図８Ａ～Ｃは、ココペリ変異体を用いた実験の原理を説明するための図である。 図９は、ココペリ変異体を用いた実験により得られた、野生型並びに形質転換植物体Ａ及びＧの雌蕊にココペリ花粉を交配して得られた植物体の胚珠の光学顕微鏡写真（上段）及び赤色蛍光写真（下段）である。 図１０Ａは、野生型イネ植物体の胚珠の発達ステージ０～４である。 図１０Ｂは、形質転換体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫにおいて除雄しても自発的に肥大した胚珠（発達ステージ３）の代表的な写真である。 図１１Ａは、形質転換植物体Ｈ、Ｉの自家受粉で得られた子孫、及び野生型植物体を除雄した場合、及び除雄しない場合の胚珠肥大の割合を示すグラフである。 図１１Ｂは、形質転換植物体Ｊの自家受粉で得られた子孫、及び野生型植物体を除雄した場合、及び除雄しない場合の胚珠肥大の割合を示すグラフである。 図１２は、形質転換植物体Ｋ当代及び野生型植物体を除雄した場合、及び除雄しない場合の胚珠肥大の割合を示すグラフである。 図１３は、形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫの除雄しても自発的に肥大した胚珠の内容物のヨウ素液染色前後の胚珠の実体顕微鏡写真である。

以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

なお、本明細書で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本明細書に組み込まれるものとする。

［１．種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子及びベクター］
（１－１．概要）
本発明の一側面によれば、種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子（以下適宜「本発明の核酸分子」とする）が提供される。

本発明の核酸分子は、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチド（以下適宜「胚乳発生誘導ポリペプチド」と呼ぶ）をコードする塩基配列を含む。また、任意ではあるが、転写抑制機能を有するポリペプチド（以下適宜「転写抑制ポリペプチド」と呼ぶ）をコードする塩基配列を含んでいてもよい。加えて、やはり任意ではあるが、プロモーター領域やターミネーター領域、更にはその他の配列を含んでいてもよい。

また、本発明の別の側面によれば、本発明の核酸分子を担持するベクター（以下適宜「本発明のベクター」とする）も提供される。

（１－２．胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列）
本発明の核酸分子は、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチド（胚乳発生誘導ポリペプチド）をコードする塩基配列を有する。

本発明において、胚乳発生誘導ポリペプチドのアミノ酸配列は限定されないが、以下から選択されるアミノ酸配列又はこれと類似のアミノ酸配列を有することが好ましい。

・シロイヌナズナＡｔ５ｇ０７２６０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ３８０９０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ５８９００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号９）
・シロイヌナズナＡｔ３ｇ１６３５０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１）
・イネＯｓ０５ｇ０５４３６００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）
・イネＯｓ０１ｇ０１４２５００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５）
・イネＯｓ０１ｇ０８５３７００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１７）
・イネＯｓ０４ｇ０５６９１００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１９）

後述する実施例から明らかなように、これらのシロイヌナズナＡｔ５ｇ０７２６０、Ａｔ５ｇ２６６６０、Ａｔ５ｇ０１２００、Ａｔ２ｇ３８０９０、Ａｔ５ｇ５８９００、及びＡｔ３ｇ１６３５０、イネのＯｓ０５ｇ０５４３６００、Ｏｓ０１ｇ０１４２５００、Ｏｓ０１ｇ０８５３７００、及びＯｓ０４ｇ０５６９１００の各ポリペプチドは、植物細胞内で発現させた場合に胚乳発生誘導を有する。よって、これらのポリペプチドは何れも、本発明における胚乳発生誘導ポリペプチドとして好適に使用できる。

また、これらの各ポリペプチドとアミノ酸配列が類似するポリペプチドも、その構造の類似性ゆえに、植物細胞内で発現させた場合に同様の作用を有する蓋然性が高いことから、やはり本発明における胚乳発生誘導ポリペプチドとして好適に使用できる。

具体的に、本発明において、胚乳発生誘導ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有することが望ましい。

また、胚乳発生誘導ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。

ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。

なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。

ここで、シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０及びイネＯｓ０５ｇ０５４３６００の各ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３及び配列番号１３）のアラインメントを図１Ａに、シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００、Ａｔ２ｇ３８０９０、及びＡｔ５ｇ５８９００、並びにイネＯｓ０１ｇ０１４２５００及びＯｓ０１ｇ０８５３７００の各ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号１７）のアラインメントを図１Ｂにそれぞれ示す。本アラインメントから明らかなように、これらのポリペプチドは相互に高い配列相同性を有することが分かる。

特に、シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０及びイネＯｓ０５ｇ０５４３６００の各ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３及び配列番号１３）は、下記式（Ｉａ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを、シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００、Ａｔ２ｇ３８０９０、及びＡｔ５ｇ５８９００、並びにイネＯｓ０１ｇ０１４２５００及びＯｓ０１ｇ０８５３７００の各ポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号１７）は、下記式（Ｉｂ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを、それぞれ共有していることが分かる。

［Ｆ／Ｖ］［Ｋ／Ｑ］［Ａ／Ｑ］ＫＬＲＫＧＬＷＳＰＥＥＤ［Ｅ／Ｄ］ＫＬ［Ｌ／Ｙ］Ｎ［Ｈ／Ｙ］Ｉ［Ｉ／Ｔ］ＲＨＧ［Ｈ／Ｖ］ＧＣＷＳＳＶＰＫＬＡＧＬＱＲＣＧＫＳＣＲＬＲＷＩＮＹＬＲＰＤＬＫＲＧ［Ａ／Ｓ］ＦＳＱ［Ｄ／Ｑ］ＥＥ［Ｄ／Ｓ］ＬＩ［Ｉ／Ｖ］［Ａ／Ｅ］ＬＨ［Ａ／Ｅ］［Ａ／Ｉ］ＬＧＮＲＷＳＱＩＡ［Ｓ／Ｔ］［Ｈ／Ｒ］ＬＰＧＲＴＤＮＥＩＫＮＦＷＮＳＣＬＫＫＫＬＲ［Ｑ／Ｒ］［Ｋ／Ｒ］Ｇ［Ｉ／Ｌ］ＤＰ［Ａ／Ｔ］ＴＨＫＰ［Ｉ／Ｌ］
・・・（Ｉａ）
ＥＲＫＫＧＶＰＷＴＥ［Ｅ／Ｄ］ＥＨ［Ｒ／Ｋ／Ｌ］［Ｑ／Ｌ／Ｒ／Ｓ］ＦＬ［Ｍ／Ｌ］ＧＬＫＫＹＧ［Ｋ／Ｒ］ＧＤＷＲＮＩ［Ａ／Ｓ］［Ｒ／Ｋ］［Ｎ／Ｓ／Ｙ］ＦＶ［Ｔ／Ｉ／Ｑ］［Ｔ／Ｓ］ＲＴＰＴＱＶＡＳＨＡＱＫＹＦ［Ｉ／Ｌ］Ｒ［Ｑ／Ｌ］［Ｖ／Ｌ／Ｎ］［Ｎ／Ｓ／Ｔ］［Ｇ／Ｄ］ＧＫＤＫＲＲ［Ｓ／Ａ］ＳＩＨＤＩＴＴＶＮ［Ｉ／Ｌ］
・・・（Ｉｂ）

但し、上記式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）では、各アミノ酸残基を１文字コードで表している。また、角括弧（［ ］）内にスラッシュ（／）で区切って複数のアミノ酸残基を表示している箇所は、これらのアミノ酸残基の何れかであることを表している。

よって、前記式（Ｉ）で表されるモチーフを有するポリペプチドは、植物細胞内で発現させた場合に胚乳発生誘導を有する蓋然性が高い。従って、前記式（Ｉ）で表されるモチーフを有するポリペプチドも、本発明における胚乳発生誘導ポリペプチドとして好適に使用することが可能である。

斯かる胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列は限定されないが、以下から選択される塩基配列又はこれと類似の塩基配列を有することが好ましい。

・シロイヌナズナＡｔ５ｇ０７２６０遺伝子の塩基配列（配列番号２）
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０遺伝子の塩基配列（配列番号４）
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００遺伝子の塩基配列（配列番号６）
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ３８０９０遺伝子の塩基配列（配列番号８）
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ５８９００遺伝子の塩基配列（配列番号１０）
・シロイヌナズナＡｔ３ｇ１６３５０遺伝子の塩基配列（配列番号１２）
・イネＯｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子の塩基配列（配列番号１４）
・イネＯｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子の塩基配列（配列番号１６）
・イネＯｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子の塩基配列（配列番号１８）
・イネＯｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子の塩基配列（配列番号２０）

具体的に、本発明において、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列は、前記の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、及び配列番号２０からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。

なお、２つの塩基配列の配列同一性は、例えばEMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）（好ましくはバージョン５．００又はそれ以降）のNeedleプログラムにより、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して決定される（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）。

（１－３．転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列）
本発明の核酸分子は、前述の胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列に加えて、転写抑制機能を有するポリペプチド（転写抑制ポリペプチド）をコードする塩基配列を有することが好ましい。この場合、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されていることが好ましい。

本発明において、転写抑制ポリペプチドのアミノ酸配列は限定されないが、以下から選択されるアミノ酸配列又はこれと類似のアミノ酸配列を有することが好ましい。

・シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子の転写抑制領域を改変したＳＲＤＸポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２１）
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ３６０８０遺伝子の転写抑制領域ＢＲＤポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２３）
・シロイヌナズナＷＵＳＣＨＥＬ遺伝子の転写抑制領域ＷＵＳ－ｂｏｘポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２５）
・シロイヌナズナＡｔＭＹＢＬ２遺伝子の転写抑制領域Ｌ２Ｒポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２７）

前記のＳＲＤＸ、ＢＲＤ、ＷＵＳ－ｂｏｘ、及びＬ２Ｒの各ポリペプチドは、本発明者らが開発したＣＲＥＳ－Ｔ（Chimeric repressor silencing technology）法に用いられる転写抑制ドメインの発現産物である。具体的に、ＳＲＤＸポリペプチドについては、例えば国際公開第２００３／０５５９９３号等に、ＢＲＤポリペプチドについては、例えば特開２００９－２１３４２６号等に、ＷＵＳ－ｂｏｘポリペプチドについては、例えばIkeda et al., Plant Cell, (2009), 21:3493-3505等に、Ｌ２Ｒポリペプチドについては、例えばMatsui et al., Plant J., (2008), 55:954-967等に、それぞれ詳細に記載されている。

これらのＳＲＤＸ、ＢＲＤ、ＷＵＳ－ｂｏｘ、及びＬ２Ｒの各ポリペプチドをコードする塩基配列を、前記の胚乳発生誘導ポリペプチドとインフレームで連結し、植物細胞内に導入して発現させると、胚乳発生誘導ポリペプチドの胚乳発生誘導が強化される。よって、これらのポリペプチドは何れも、本発明における転写抑制ポリペプチドとして好適に使用できる。

また、これらの各ポリペプチドとアミノ酸配列が類似するポリペプチドも、その構造の類似性ゆえに、植物細胞内で発現させた場合に同様の作用を有する蓋然性が高いことから、やはり本発明における転写抑制ポリペプチドとして好適に使用できる。

具体的に、本発明において、転写抑制ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び、配列番号２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有することが望ましい。

また、転写抑制ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び、配列番号２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。

また、前記のＳＲＤＸ、ＢＲＤ、ＷＵＳ－ｂｏｘ、及びＬ２Ｒの各ポリペプチドは、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを有し、これらがその転写抑制機能を発揮する上で重要な機能を果たしていることが知られている。従って、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドも、転写抑制ポリペプチドとして好適に使用することができる。

［Ｌ／Ｆ］ＤＬＮ［Ｌ／Ｆ］［Ｘ］Ｐ ・・・（IIａ）
［Ｌ／Ｖ］［Ｒ／Ｋ］ＬＦＧＶＸ［Ｍ／Ｖ／Ｌ］ ・・・（IIｂ）
ＴＬＸＬＦＰ ・・・（IIｃ）
ＴＬＸＬＦＲ ・・・（IIｄ）

但し、上記式（IIａ）～（IIｄ）では各アミノ酸残基を１文字コードで表している。また、角括弧（［ ］）内にスラッシュ（／）で区切って複数のアミノ酸残基を表示している箇所は、これらのアミノ酸残基の何れかであることを示す。また、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。

斯かる転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列は限定されないが、以下から選択される塩基配列又はこれと類似の塩基配列を有することが好ましい。

・ＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子の転写抑制領域を改変したＳＲＤＸの塩基配列（配列番号２２）
・Ａｔ２ｇ３６０８０遺伝子の転写抑制領域ＢＲＤの塩基配列（配列番号２４）
・ＷＵＳＣＨＥＬ遺伝子の転写抑制領域ＷＵＳ－ｂｏｘの塩基配列（配列番号２６）
・ＡｔＭＹＢＬ２遺伝子の転写抑制領域Ｌ２Ｒの塩基配列（配列番号２８）

具体的に、本発明において、転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列は、前記の配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び、配列番号２８からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することが望ましい。

（１－４．プロモーター領域）
本発明の核酸分子は、プロモーター領域を有することが好ましい。プロモーター領域は、通常は胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の５’側に、胚乳発生誘導ポリペプチドと機能的に連結されるように配置されることが好ましい。

プロモーター領域は、ウイルスに由来するプロモーターでもよく、微生物に由来するプロモーターでもよく、植物に由来するプロモーターでもよく、その他の生物に由来するプロモーターでもよい。

また、プロモーターの機能部位としては、植物体全体で機能するプロモーターでもよく、雌性配偶体とその始原細胞を含む周辺部位でのみで機能するプロモーターでもよい。さらには、特定の化学物質処理時や特定の生育環境下において、特異的に機能するプロモーターでもよい。

プロモーター領域の塩基配列は制限されない。例としては、以下の何れかのプロモーターの塩基配列を有するプロモーター領域が挙げられる。

・カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（配列番号２９）。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ０７２６０遺伝子のプロモーター（配列番号３０）。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０遺伝子のプロモーター（配列番号３１）。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００遺伝子のプロモーター（配列番号３２）。
・シロイヌナズナＡｔ２ｇ３８０９０遺伝子のプロモーター（配列番号３３）。
・シロイヌナズナＡｔ５ｇ５８９００遺伝子のプロモーター（配列番号３４）。
・シロイヌナズナＡｔ３ｇ１６３５０遺伝子のプロモーター（配列番号３５）。
・イネ・アクチン遺伝子のプロモーター（配列番号３６）。
・トウモロコシ・ユビキチン１遺伝子のプロモーター（配列番号３７）
・イネＯｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子のプロモーター（配列番号３８）
・イネＯｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子のプロモーター（配列番号３９）
・イネ・ＦＳＴ遺伝子のプロモーター（配列番号４０）。
・イネＯｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子のプロモーター（配列番号４１）
・イネＯｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子のプロモーター（配列番号４２）

また、配列番号２９～配列番号４２の各塩基配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなるプロモーターも、本発明の核酸分子におけるプロモーター領域として好ましく利用できる。

（１－５．ターミネーター領域）
本発明の核酸分子は、ターミネーター領域を有することが好ましい。ターミネーター領域は、通常は胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の３’側に、胚乳発生誘導ポリペプチドと機能的に連結されるように配置されることが好ましい。

ターミネーター領域は、ウイルスに由来するターミネーターでもよく、植物に由来するターミネーターでもよく、その他の生物に由来するターミネーターでもよい。

また、ターミネーターの機能部位としては、植物体全体で機能するターミネーターでもよく、雌性配偶体とその始原細胞を含む周辺部位でのみで機能するターミネーターでもよい。さらには、特定の化学物質処理時や特定の生育環境下において、特異的に機能するターミネーターでもよい。

ターミネーター領域の塩基配列は制限されない。例としては、以下の何れかのターミネーターの塩基配列を有するターミネーター領域が挙げられる。

・アグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（配列番号４３）。
・シロイヌナズナのヒートショックタンパク質遺伝子のターミネーター（配列番号４４）。

また、配列番号４３又は配列番号４４の各塩基配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなるターミネーターも、本発明の核酸分子におけるターミネーター領域として好ましく利用できる。

（１－６．その他の遺伝子要素）
本発明の核酸分子は、その他の１又は２以上の遺伝子要素を有していてもよい。その他の遺伝子要素の例としては、抗生物質耐性遺伝子、制限酵素配列、相同組換え配列等が挙げられる。

（１－７．核酸の構成）
本発明の核酸分子は、前述の胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を有すると共に、好ましくは任意選択要素として転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列を有し、更には任意選択要素として、プロモーター領域、ターミネーター領域、及び／又はその他の遺伝子要素を有する。特に、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列以外の任意選択要素を有する場合には、通常は転写抑制ポリペプチドをコードする塩基配列が胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列とインフレームで連結されると共に、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の５’側にプロモーター領域が、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列の３’側に転写抑制領域及び／又はターミネーター領域が配置され、それぞれ胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列と機能的に連結される。これにより、本発明の核酸分子が種子植物の植物細胞に導入され、好ましくはゲノム内に組み込まれた場合に、各遺伝子要素が機能的に連関して作動し、胚乳発生誘導ポリペプチドが自律的に発現される。即ち、本発明の核酸分子は、キメラ遺伝子カセットとして構成されていることが好ましい。

（１－８．ベクター）
本発明の核酸分子は、通常はこれを植物細胞内に導入してゲノム内に組み込むべく、ベクターに担持した形態で使用される。

斯かるベクター（本発明のベクター）の形態は任意であり、直鎖状の形態であっても環状の形態であってもよい。但し、環状の形態、例えばプラスミドの形態であることが好ましい。ベクターの具体的な態様の例としては、植物ウイルスベクター、アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。

植物ウイルスベクター法は、標的遺伝子を挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡを試験管内転写し、得られたＲＮＡをベクターとして植物に接種して感染させ、ウイルス自身の増殖能及び全身移行能を利用して、発現対象遺伝子を植物に発現させる手法である。植物ウイルスベクターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）ベクター、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクター、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ベクター等が挙げられる。

アグロバクテリウムベクター（Ｔ－ＤＮＡベクター）法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のＴｉプラスミドが有するＴ－ＤＮＡ（transfer DNA）配列を利用した手法である。Ｔ－ＤＮＡ配列は右境界配列（right border sequence：ＲＢ配列）と左境界配列（left border sequence：ＬＢ配列）とを両端に有し、これらの配列に挟まれた領域の遺伝子を植物ゲノムへ組み込む作用を有する。現在は、Ｔｉプラスミドを改変した２種のプラスミド、即ち、バイナリープラスミドとヘルパープラスミドとを組み合わせたＴ－ＤＮＡバイナリー系が確立されており、植物の形質転換による外来遺伝子の導入を行うことが主流である。

本発明の核酸分子をベクターに担持させる場合、好ましくは、本発明の胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列が植物ゲノム内に組み込まれ、機能的に発現するように構成する。

なお、本発明の核酸分子が、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列に加えて、プロモーター領域やターミネーター領域を有し、植物細胞内で自律的に発現しうるキメラ遺伝子カセットとして構成されている場合には、ベクター側にプロモーターやターミネーター等の調節要素を組み込むことは必須ではなく、植物ゲノムへの組み込みに必要な要素（例えば相同組換えのためのフランキング配列や、Ｔ－ＤＮＡのＬＢ配列及びＲＢ配列等）のみをベクターに設ければよい。

一方、本発明の核酸分子がプロモーター領域やターミネーター領域を欠き、植物細胞内で自律的に発現しうるキメラ遺伝子カセットとして構成されている場合には、ベクターに植物ゲノムへの組み込みに必要な要素のみならず、プロモーターやターミネーター等の調節要素を組み込み、本発明の核酸分子が有する胚乳発生誘導ポリペプチドの発現を誘導するように構成することが好ましい。或いは、本発明のベクターを植物ゲノム内に組み込んだ場合に、本発明の核酸分子が有する胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を、植物ゲノム内のプロモーターやターミネーター等の調節要素と機能的に連関して作動し、胚乳発生誘導ポリペプチドが発現されるように構成してもよい。

本発明のベクターは、必要に応じて、他のヘルパープラスミドと併用してもよい。他のヘルパープラスミドの例としては、Ｔ－ＤＮＡベクターの場合、ｖｉｒ領域を有するヘルパープラスミド等が挙げられる。

本発明のベクターは、当業者に周知の各種の遺伝子組み換え技術を適宜組み合わせて用いることにより、容易に作製することが可能である。

［２．受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物及びその製造方法］
本発明の別の側面によれば、受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物を作製する方法（以下適宜「本発明の方法」とする）が提供される。

本発明の方法は、上述の本発明の核酸分子又は本発明のベクターを、種子植物のゲノム内に導入して発現させることを含む。本発明の核酸分子又は本発明のベクターは、複数種を併用して用いてもよい。

種子植物の種類は特に制限されないが、通常は被子植物が対象となる。被子植物の例としては、これらに制限されるものではないが、例えばナス科、マメ科、アブラナ科、イネ科、キク科、ハス科、バラ科、ウリ科、ユリ科等に属する植物種が挙げられる。具体例としては、タバコ、シロイヌナズナ、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、オートムギ、エンドウマメ、落花生、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、コムギ、フジ、堅果植物、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、キスゲ、パラゴムノキ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、イガマメ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ブドウ等が挙げられる。中でも、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、麦類、果実類等が好ましい。

上述の本発明の核酸分子又は本発明のベクターを、種子植物のゲノム内に導入する手法は任意である。例えば、本発明のベクターを種子植物に生物的に感染させ、或いはアグロインフィルトレーション、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等の手法で種子植物の各組織に導入し、種子植物のゲノム内に導入することができる。更には本発明のベクターを用いず、CRISPR/Cas9システム等の公知の手法を用いて、本発明の核酸分子を直接植物のゲノム内に組み込むことも可能である。また、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを種子植物の組織断片に導入し、これを培養して植物体とすることにより、本発明のベクターがゲノム内に導入された、本発明の核酸分子を恒常的に発現する再分化個体を得ることも可能である。

以上の本発明の方法により、胚乳発生誘導ポリペプチドをコードする塩基配列を含む本発明の核酸分子がゲノム内に組み込まれて、胚乳発生誘導ポリペプチドを発現する組換植物が得られる。斯かる組換植物は、胚乳発生誘導ポリペプチドを発現することにより、受精を経ずに胚乳を発生する能力を有する。しかもこうして得られる胚乳は、従来の未受精植物で発生する非機能的な胚乳とは異なり、胚を養育する能力を備えた機能的な胚乳である。

なお、前述の本発明の方法により作製される組換種子植物や、本発明の核酸分子又は本発明のベクターをゲノム内に含む組換え種子植物、受精を経ずに機能的な胚乳を発生する能力を有する組換え種子植物等、更にはそれらの植物の子孫又はそれらの部分も、本発明の対象となる。ここで、「植物の子孫」とは、当該植物の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫をいい、当該植物のクローンを含む。例えば、当該植物体やその子孫から繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に当該植物の子孫を作出することが可能である。また、本発明において「植物若しくはその子孫、又はそれらの一部」としては、当該植物又はその子孫の植物における、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストが挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
なお、以下に記載のプライマー塩基配列の表記のうち、大文字と小文字が混在しているものについては、大文字は増幅対象遺伝子の塩基配列と相補的な領域を意味し、小文字は付加配列を意味する。

［概要］
実施例１は、Ａｔ５ｇ０７２６０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０７２６０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ａ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＡ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察すると共に、受精胚の養育能力を解析することにより、コンストラクトＡのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例２は、Ａｔ５ｇ２６６６０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターで作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ２６６６０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｂ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＢ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＢのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例３は、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｃ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＣ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察すると共に、受精胚の養育能力を解析することにより、コンストラクトＣのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例４は、Ａｔ２ｇ３８０９０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ３８０９０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｄ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＤ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＤのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例５は、Ａｔ５ｇ５８９００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ５８９００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｅ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＥ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＥのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例６は、Ａｔ３ｇ１６３５０遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ１６３５０ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｆ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＦ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察すると共に、受精胚の養育能力を解析することにより、コンストラクトＦのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例７は、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＡｔ５ｇ０１２００プロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｇ）を有する形質転換用プラスミド（コンストラクトＧ）を構築し、これをシロイヌナズナ植物体に導入して得られた形質転換植物の形態を観察すると共に、受精胚の養育能力を解析することにより、コンストラクトＦのシロイヌナズナにおける自発的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例８はＯｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＺｅａ ｍａｙｓ ＵＢＱ１プロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＺｍＵＢＱ１:Ｏｓ０５ｇ０５４３６００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｈ）を有する形質転換プラスミド（コンストラクトＨ）を構築し、これをイネカルスに導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＨのイネにおける自律的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例９はＯｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にＺｅａ ｍａｙｓ ＵＢＱ１プロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＺｍＵＢＱ１:Ｏｓ０１ｇ０１４２５００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｉ）を有する形質転換プラスミド（コンストラクトＩ）を構築し、これをイネカルスに導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＩのイネにおける自律的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例１０はＯｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にイネＦＳＴプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０１ｇ０８５３７００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｊ）を有する形質転換プラスミド（コンストラクトＪ）を構築し、これをイネカルスに導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＪのイネにおける自律的胚乳発生促進効果を調べたものである。

実施例１１はＯｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子に転写抑制ドメインであるＳＲＤＸをコードする遺伝子断片を直結し、これを更にイネＦＳＴプロモーターの下流で作動するように連結したキメラ遺伝子ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０４ｇ０５６９１００ＳＲＤＸ（キメラ遺伝子Ｋ）を有する形質転換プラスミド（コンストラクトＫ）を構築し、これをイネカルスに導入して得られた形質転換植物の形態を観察することにより、コンストラクトＫのイネにおける自律的胚乳発生促進効果を調べたものである。

［実施例１］形質転換用コンストラクトＡ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０７２６０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（１－１）コンストラクトＡの構築
（ａ）プラスミドｐＢＩＧ２の構築
米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ－ＨＹＧ（Becker, Nucleic Acid Research, (1990), 18(1):203）を制限酵素HindIII及びSstIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分離することで、ＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ－ＨＹＧのＤＮＡ断片を得た。

また、プラスミドｐ３５Ｓ－ＧＦＰ（Clontech社、米国）を制限酵素HindIII及びBamHIで切断し、切断断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ＣＡＭＶ ３５Ｓプロモーター（以下適宜「ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ」とする）を含むＤＮＡ断片を回収した。

また、以下の配列番号４５及び４６の塩基配列を有するＤＮＡを常法により合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。このＤＮＡ断片は、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）由来のオメガ(omega)配列の５’末端に制限酵素部位BamHI、３’末端に制限酵素部位SmaI及びSalIを結合させた配列を有する。この配列を導入することで、３’側に存在する遺伝子の発現効率を高めるとともに、以降のプラスミド構築に必須な制限酵素サイトを導入した。

５’－ＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴ－３’（配列番号４５）
５’－ＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧ－３’（配列番号４６）

前記のＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓを含むＤＮＡ断片、及び、前記の合成した２本鎖ＤＮＡを、前記のＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ－ＨＹＧのHindIII及びSstI部位に挿入することにより、ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓを担持する植物形質転換用ベクターを得た。これをプラスミドｐＢＩＧ２とする。

（ｂ）プラスミドｐ３５ＳＲＤＸの構築
シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子の転写抑制ドメインであるＳＲＤＸの塩基配列の５’末端にＧＧＧを、３’末端にストップコドンをそれぞれ付与した、以下の配列番号４７及び４８の塩基配列を有する相補的な二本のＤＮＡ断片を作製した。

５’－ＧＧＧＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＴＡＡＧ－３’（配列番号４７）
５’－ＣＴＴＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＧＧＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣ－３’（配列番号４８）

合成された二本のＤＮＡ断片をアニールし、制限酵素SmaIで切断した上記のプラスミドｐＢＩＧ２に挿入し、シークエンスを確認して、ＳＲＤＸが順方向に導入されたものを選抜した。これをプラスミドｐ３５ＳＲＤＸとする。

（ｃ）プラスミド３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０７２６０ＳＲＤＸ（コンストラクトＡ）の構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ０７２６０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号４９の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５０の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ０７２６０遺伝子の全長配列からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＣＧＡＧＧＡＴＴＴＴ－３’ （配列番号４９）
５’－ＡＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＴＴ－３’ （配列番号５０）

なお、ＰＣＲ反応は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。

得られたＡｔ５ｇ０７２６０遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法に従ってシークエンスを確認し、Ａｔ５ｇ０７２６０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ５ｇ０７２６０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ５ｇ０７２６０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０７２６０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＡ」と略称し、コンストラクトＡが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０７２６０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ａ」と略称する。キメラ遺伝子Ａの構成を図２Ａに模式的に示す。

（１－２）形質転換植物体Ａの作成
コンストラクトＡによるシロイヌナズナ植物体の形質転換は、“Transfomation of Arabidopsis thaliana byvacuum infiltration”（http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm）に記載の方法に従った。但し、感染させるのにバキュームは用いず、単に浸すだけにした。コンストラクトＡを、土壌細菌（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（koncz and Schell, Molecular and General Genetics, (1986), 204[3]:383-396）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を２５０ｍＬのＬＢ培地で二日間培養した。

次いで、培養液から菌体を回収し、５００ｍＬの感染用培地（Infiltration medium）に懸濁した。この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び生育させ結種させた。回収した種子を５０％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌した種子を３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む１／２ＭＳ選択培地に蒔種した。コンストラクトＡにより首尾よく形質転換された植物体は、ハイグロマイシン耐性を獲得する。そこで、上記ハイグロマイシン培地で生育する形質転換植物体を選抜し、土壌に植え換え、生育させた。こうして得られた、コンストラクトＡにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ａ」と略称する。

［実施例２］形質転換用コンストラクトＢ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ２６６６０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（２－１）コンストラクトＢの構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ２６６６０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号５１の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５２の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ２６６６０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＡＡＧＣＡ－３’ （配列番号５１）
５’－ＡＡＧＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＴＡＡＧ－３’ （配列番号５２）

得られたＡｔ５ｇ２６６６０遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１－１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ５ｇ２６６６０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ５ｇ２６６６０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ５ｇ２６６６０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ２６６６０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＢ」と略称し、コンストラクトＢが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ２６６６０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｂ」と略称する。キメラ遺伝子Ｂの構成を図２Ａに模式的に示す。

（２－２）コンストラクトＢを用いた形質転換による形質転換植物体Ｂの作成
前記［実施例１］（１－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＢによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＢにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｂ」と略称する。

［実施例３］形質転換用コンストラクトＣ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（３－１）コンストラクトＣの構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号５３の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５４の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＡＧＴ－３’ （配列番号５３）
５’－ＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＣＴ－３’ （配列番号５４）

得られたＡｔ５ｇ０１２００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１－１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ５ｇ０１２００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＣ」と略称し、コンストラクトＣが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｃ」と略称する。キメラ遺伝子Ｃの構成を図２Ａに模式的に示す。

（３－２）コンストラクトＣを用いた形質転換による形質転換植物体Ｃの作成
前記［実施例１］（１－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＣによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＣにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｃ」と略称する。

［実施例４］形質転換用コンストラクトＤ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ３８０９０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（４－１）コンストラクトＤの構築
シロイヌナズナＡｔ２ｇ３８０９０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号５５の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５６の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ２ｇ３８０９０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＣＣ－３’ （配列番号５５）
５’－ＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＴＡＣＧＣＡＴＴＧＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡＡ－３’ （配列番号５６）

得られたＡｔ２ｇ３８０９０遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１－１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ２ｇ３８０９０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ２ｇ３８０９０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ２ｇ３８０９０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ３８０９０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＤ」と略称し、コンストラクトＤが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ２ｇ３８０９０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｄ」と略称する。キメラ遺伝子Ｄの構成を図２Ａに模式的に示す。

（４－２）コンストラクトＤを用いた形質転換による形質転換植物体Ｄの作成
前記［実施例１］（１－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＤによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＤにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｄ」と略称する。

［実施例５］形質転換用コンストラクトＥ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ５８９００ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（５－１）コンストラクトＥの構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ５８９００遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号５７の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５８の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ５８９００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＧＡＧＧＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＣＡ－３’ （配列番号５７）
５’－ＴＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＣＧＴＣＡＴＡ－３’ （配列番号５８）

得られたＡｔ５ｇ５８９００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１－１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ５ｇ５８９００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ５ｇ５８９００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ５ｇ５８９００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ５８９００ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＥ」と略称し、コンストラクトＥが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ５８９００ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｅ」と略称する。キメラ遺伝子Ｅの構成を図２Ａに模式的に示す。

（５－２）コンストラクトＥを用いた形質転換による形質転換植物体Ｅの作成
前記［実施例１］（１－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＥによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＥにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｅ」と略称する。

［実施例６］形質転換用コンストラクトＦ（ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ１６３５０ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（６－１）コンストラクトＦの構築
シロイヌナズナＡｔ３ｇ１６３５０遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号５９の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号６０の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ３ｇ１６３５０遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＡＣＴＣＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＧＣＡＴＴＧＴＡＧＣＡＡ－３’ （配列番号５９）
５’－ＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴ－３’ （配列番号６０）

得られたＡｔ３ｇ１６３５０遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の［実施例１］（１－１）（ａ）及び（ｂ）で作製したプロモーターＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドｐ３５ＳＲＤＸに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ａｔ３ｇ１６３５０遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ３ｇ１６３５０遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｔ３ｇ１６３５０遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ１６３５０ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＦ」と略称し、コンストラクトＦが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ３ｇ１６３５０ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｆ」と略称する。キメラ遺伝子Ｆの構成を図２Ａに模式的に示す。

（６－２）コンストラクトＦを用いた形質転換による形質転換植物体Ｅの作成
前記［実施例１］（１－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＦによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＦにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｆ」と略称する。

［実施例７］形質転換用コンストラクトＧ（ＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸ）の構築及びシロイヌナズナ植物体の形質転換

（７－１）コンストラクトＧの構築
（ａ）プラスミドｐ３５ＳＲＤＸの構築
前記の［実施例１］（１－１）（ａ）及び（ｂ）と同様の手順により、プロモーターＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが導入されたプラスミドｐ３５ＳＲＤＸを構築した。

（ｂ）プラスミドＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００－ＳＲＤＸ－ＮＯＳの構築
プラスミドｐ３５ＳＲＤＸに対して、常法に従い、attL1配列の５’側のHindIIIサイトに変異を導入した。これをHindIII及びSmaIで切断し、マルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片を挿入することにより、ｐＳＲＤＸ－ＮＯＳとした。

一方、シロイヌナズナのゲノムを鋳型として、以下の配列番号６１の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号６２の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子のコード領域の５’上流域にある約２．３ｋｂｐのプロモーター領域を増幅した。

５’－ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＴＧＴＣＣ－３’ （配列番号６１）
５’－ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＣ－３’ （配列番号６２）

なお、ＰＣＲ反応は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
得られたＡｔ５ｇ０１２００遺伝子のプロモーター領域（以下適宜「ＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００」とする）の増幅産物を、常法に従ってHindIII及びBamHIで切断し、アガロールゲル電気泳動で回収した。同様に、上記のプラスミドｐＳＲＤＸ－ＮＯＳを、常法に従ってHindIII及びBamHIで切断し、アガロールゲル電気泳動で回収した。得られたプラスミドｐＳＲＤＸ－ＮＯＳの切断断片に、前記プロモーターＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００の切断断片を、常法に従って挿入し、シークエンスを確認することにより、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子の５’上流域が順方向に導入されており、且つＰＣＲエラーが入っていないものを選抜した。得られたプラスミドをＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００－ＳＲＤＸ－ＮＯＳベクターと呼ぶ。

（ｃ）プラスミドへのＡｔ５ｇ０１２００の挿入によるＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸの構築
シロイヌナズナＡｔ５ｇ０１２００遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、前記［実施例３］（１－１）と同様に、配列番号５３の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号５４の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

得られたＡｔ５ｇ０１２００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、上記の（ｂ）で作製したプロモーターＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００及び転写抑制ドメインＳＲＤＸを有するプラスミドＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００－ＳＲＤＸ－ＮＯＳに、常法により挿入した。シークエンスを確認して、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＡｔ５ｇ０１２００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００、Ａｔ５ｇ０１２００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＡｔ５ｇ０１２００：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸを担持する。この形質転換用プラスミドを適宜「コンストラクトＧ」と略称し、コンストラクトＧが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＣａＭＶ ３５Ｓ：Ａｔ５ｇ０１２００ＳＲＤＸを適宜「コンストラクトＧ」と略称する。キメラ遺伝子Ｆの構成を図２Ａに模式的に示す。

（７－２）コンストラクトＧを用いた形質転換による形質転換植物体Ｇの作成
前記［実施例１］（１－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＧによるシロイヌナズナ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＧにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｇ」と略称する。

［評価１］形質転換植物体の形質の確認
形質転換植物体Ａ～Ｇのつぼみから雄蕊を取り除き（除雄）、未受精のさや及び胚珠の形質を観察した。また、コントロールとして、野生型のシロイヌナズナ植物体の未受精のさや及び胚珠の形質を同様に観察した。形質転換植物体Ａ～Ｅについて得られた光学顕微鏡写真を図３に、形質転換植物体Ｇについて得られた光学顕微鏡写真を図４にそれぞれ示す。図３の写真は、野生型植物体及び形質転換植物体Ａ～Ｅの各々の（ａ）つぼみの外観、（ｂ）さやの外観、（ｃ）さやの内部、及び（ｄ）胚珠を示す。図４の写真は、形質転換植物体Ｇの（Ａ）さやの外観（野生型との対比で示す）、（Ｂ）さやの内部、並びに（Ｃ１）及び（Ｃ２）胚珠を示す。図３及び図４の写真から明らかなように、形質転換植物体Ａ～Ｇの何れにおいても、野生型植物体と比較して、未受精条件下でのさやの伸長と胚珠の肥大が確認された。このことより、キメラ遺伝子Ａ～Ｇを有するコンストラクトＡ～Ｇは、シロイヌナズナにおいて自発的胚珠肥大（未受精下での胚珠肥大）を誘導することが証明された。

また、形質転換植物体Ａ、Ｃ、及びＧの胚珠の縦横長を測定し、胚乳部分の面積を算出した。形質転換植物体Ａ、Ｃ、及びＧの胚珠の縦横長を示すグラフを、それぞれ図５Ａ～Ｃに、形質転換植物体Ａ、Ｃ、及びＧの胚乳部分の面積を示すグラフを図６に示す。形質転換植物体Ａ、Ｃ、及びＧの何れにおいても、胚乳の発生がみられた。このことより、キメラ遺伝子Ａ、Ｃ、及びＧを有するコンストラクトＡ、Ｃ、及びＧは、シロイヌナズナにおいて自発的胚乳発生（未受精下での胚乳発生）を誘導することが証明された。

［評価２］形質転換植物体の胚珠における種皮発生の解析
形質転換植物体Ａ～Ｃ及びＧの未受精のさやを分解し、取り出した胚珠をバニリン染色液（バニリン０．２ｇを６Ｎ ＨＣｌ溶液１０ｍｌに懸濁したもの）で染色し、染色後の胚珠を光学顕微鏡を用いて観察した。また、コントロールとして、野生型のシロイヌナズナ植物体の胚珠を同様にバニリン染色し、光学顕微鏡を用いて観察した。得られた野生型植物体並びに形質転換植物体Ａ～Ｃ及びＧの光学顕微鏡写真を図７に示す。形質転換植物体Ａ～Ｃ及びＧの何れの未受精胚珠においても、バニリン染色液による赤色の呈色が確認された。

バニリン染色液は種皮のプロアントシアニジンを染色し、赤色を呈する。種皮のプロアントシアニジンの蓄積は胚乳の発生によって誘導されることが知られており、よって、バニリン染色は胚乳発生のマーカーとされている。つまり、形質転換植物体Ａ～Ｃ及びＦの未受精胚珠においてバニリン染色が見られたという事実から、形質転換植物体Ａ～Ｃ及びＧの胚乳が受精なしに胚乳を発達させていることが分かる。このことより、キメラ遺伝子Ａ～Ｃ及びＧを有するコンストラクトＡ～Ｃ及びＧは、シロイヌナズナにおいて自発的胚乳発達（未受精下での胚乳発達）を誘導することが証明された。

［評価３］形質転換植物体の自発的発生胚乳による胚の養育実験
形質転換植物体Ａ及びＧのつぼみから雄蕊を取り除き（除雄）、未受精の雌蕊に対してココペリ（kokoperi）変異体（赤色の蛍光マーカーを有する）の花粉を受粉した。

ココペリ変異体を用いた実験の原理について、図８Ａ～Ｃを用いて説明する。図８Ａに示すように、一般的な花粉は２つの精細胞を含み、受粉時にはこれらの精細胞がそれぞれ卵細胞及び中央細胞と融合することで、それぞれ受精卵及び胚乳を発達させることが知られている（重複受粉：double fertilization）。一方で、図８Ｂ及びＣに示すように、ココペリ変異体の花粉は一つしか精細胞を含まないため、ココペリ変異体花粉を受粉した胚珠においては、卵細胞または中央細胞のみが受精する（単一受粉：single fertilization）。

そこで、本実施例においては、形質転換植物体Ａ及びＧの雌蕊にココペリ花粉を交配し、卵細胞のみが受精した胚珠における胚の発生を観察することで、形質転換植物体Ａ及びＧの未受精で発達した胚乳が受精胚を養育しうるかどうかを確認した。

野生型並びに形質転換植物体Ａ及びＧの雌蕊にココペリ花粉を交配して得られた植物体の胚珠の光学顕微鏡写真（上段）及び赤色蛍光写真（下段）をそれぞれ図９に示す。野生型の雌蕊にココペリ花粉を受粉した場合（図９Ａ）においては、胚の発達は球状型で停止し、胚珠は潰れた。一方で、形質転換植物体Ａの雌蕊にココペリ花粉を受粉した場合（図９Ｂ）、及び、形質転換植物体Ｇの雌蕊にココペリ花粉を受粉した場合（図９Ｃ）においては、胚の発達は初期心臓型胚まで進行しても、まだ胚珠に余裕があることが確認された。このことから、形質転換植物体Ａ及びＧの未受精で発達した胚乳には、胚の養育能力があることが証明された。

［実施例８］形質転換用コンストラクトＨ（ＰｒｏＺｍＵＢＱ１：Ｏｓ０５ｇ０５４３６００ＳＲＤＸ）の構築及びイネ植物体の形質転換

（８－１）コンストラクトＨの構築
（ａ）プラスミドｐＺｍＵＢＱ１＿ＳＲＤＸ＿ＨＳＰの構築
Yoshida et al., Front Plant Sci. (2013) 4, 383.に記載のベクターｐＵＢＱ１ＳＸＧを制限酵素EcoRI及びSacIで切断し、プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ株式会社、日本）を制限酵素EcoRI及びSacIで切断して生じるＨｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎターミネーターを含むＤＮＡ断片を挿入した。これをプラスミドｐＺｍＵＢＱ１＿ＳＲＤＸ＿ＨＳＰとする。このプラスミドはＺｅａｍａｙｓＵＢＱ１プロモーター、転写抑制ドメインＳＲＤＸをコードする領域、シロイヌナズナＨＳＰ１８．２遺伝子のターミネーター領域を含んでおり、それらの両端にａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２ ＧＡＴＥＷＡＹ組換えサイトを有する。

（ｂ）コンストラクトＨの構築
イネＯｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号６３の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号６４の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ｏｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧ－３’ （配列番号６３）
５’－ＧＡＡＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＧＡＧＣ－３’ （配列番号６４）

得られたＯｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐＺｍＵＢＱ１＿ＳＲＤＸ＿ＨＳＰに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ｏｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＯｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られたプラスミドは、Mitsuda et al., Plant Biotech. J., (2006) 4, 325-332. に記載されているｐＢＣＫＨベクターとＧＡＴＥＡＷＹ ＬＲ反応を起こすことによってｐＢＣＫＨを背景とする形質転換用プラスミドを得た。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＺｍＵＢＱ１、Ｏｓ０５ｇ０５４３６００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＺｍＵＢＱ１：Ｏｓ０５ｇ０５４３６００ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＨ」と略称し、コンストラクトＨが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＺｍＵＢＱ１：Ｏｓ０５ｇ０５４３６００ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｈ」と略称する。キメラ遺伝子Ｈの構成を図２Ｂに模式的に示す。

（８－２）形質転換植物体Ｈの作成
コンストラクトＨによるイネカルスの形質転換は、“A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice”（Nishimura et al. 2006, Nature Protocols, 1:2796）に記載の方法に従った。コンストラクトＨを、土壌細菌（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０５（Hood et al., Transgenic Research (1993) 2: 208-218.）株にエレクトロポレーション法で導入した。

次いで、菌体を回収し、３０ｍＬの感染用培地（AAM containing acetosyringone）に懸濁した。この溶液に、イネ種子から３－４週間誘導した胚発生カルスを１分半間浸し、共存培養用培地（2N6-AS medium）上で４８－６０時間共存培養した。カルスを洗浄後、ハイグロマイシンを含む選抜培地（N6D-S medium）上で３－４週間培養した。コンストラクトＨにより首尾よく形質転換されたカルスは、ハイグロマイシン耐性を獲得する。そこで、上記ハイグロマイシン培地で生育する形質転換カルスを選抜し、ハイグロマイシンを含む再分化培地（MS-NK medium）上で３～４週間、続いてハイグロマイシンを含む植物育成培地（MS-HF medium）上で３～４週間培養することにより形質転換植物体を再生させた。得られた形質転換植物体を土壌に植え換え、生育させた。こうして得られた、コンストラクトＨにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｈ」と略称する。

［実施例９］形質転換用コンストラクトＩ（ＰｒｏＺｍＵＢＱ１：Ｏｓ０１ｇ０１４２５００ＳＲＤＸ）の構築及びイネ植物体の形質転換

（９－１）コンストラクトＩの構築
イネＯｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号６５の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号６６の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ｏｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ｇＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴ－３’ （配列番号６５）
５’－ＡＡＡＣＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＧ－３’ （配列番号６６）

得られたＯｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐＺｍＵＢＱ１＿ＳＲＤＸ＿ＨＳＰに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ｏｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＯｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。この後ｐＢＣＫＨとＧＡＴＥＷＡＹ ＬＲ反応を行い、形質転換用プラスミドを得た。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＺｍＵＢＱ１、Ｏｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＺｍＵＢＱ１：Ｏｓ０１ｇ０１４２５００ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＩ」と略称し、コンストラクトＩが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＺｍＵＢＱ１：Ｏｓ０１ｇ０１４２５００ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｉ」と略称する。キメラ遺伝子Ｉの構成を図２Ｂに模式的に示す。

（９－２）コンストラクトＩを用いた形質転換による形質転換植物体Ｉの作成
前記［実施例８］（８－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＩによるイネ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＩにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｉ」と略称する。

［実施例１０］形質転換用コンストラクトＪ（ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０１ｇ０８５３７００ＳＲＤＸ）の構築及びイネ植物体の形質転換

（１０－１）コンストラクトＪの構築
（ａ）プラスミドｐＯｓＦＳＴｐ－ＳＲＤＸ－ＨＳＰ＿Ｅｎｔｒｙの構築
Mitsuda et al., Plant Cell (2007) 19, 270.に記載のベクターｐＳＲＤＸ－ＮＯＳ＿ｅｎｔｒｙを制限酵素EcoRI及びSacIで切断し、プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ株式会社、日本）を制限酵素EcoRI及びSacIで切断して生じるＨｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎターミネーターを含むＤＮＡ断片を挿入した。これをプラスミドｐＳＲＤＸ－ＨＳＰ＿ｅｎｔｒｙとする。イネゲノムを鋳型として、以下の配列番号６７の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び以下の配列番号６８の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、イネＦＳＴ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。

５’－ＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＣＴＡ－３’（配列番号６７）
５’－ＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴ－３’ （配列番号６８）

なお、ＰＣＲ反応は、９８℃２分の変性反応の後、変性反応９８℃１０秒、アニール反応５５℃２０秒、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。

得られたＦＳＴ遺伝子のプロモーター領域の増幅産物を、常法に従って、AscIとBamHIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐＳＲＤＸ－ＨＳＰ＿ｅｎｔｒｙに挿入した。常法に従ってシークエンスを確認し、ＦＳＴプロモーター領域の塩基配列がゲノム情報と一致しているものを選抜した。これをプラスミドｐＦＳＴｐ-ＳＲＤＸ－ＨＳＰ＿ｅｎｔｒｙとする。このプラスミドはＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＦＳＴプロモーター、転写抑制ドメインＳＲＤＸをコードする領域、シロイヌナズナＨＳＰ１８．２遺伝子のターミネーター領域を含んでおり、それらの両端にａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２ ＧＡＴＥＷＡＹ組換えサイトを有する。

（ｂ）コンストラクトＪの構築
イネＯｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号６９の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号７０の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ａ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ｏｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＧＴＧＣＴ－３’ （配列番号６９）
５’－ＣＡＡＧＴＧＴＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧ－３’ （配列番号７０）

得られたＯｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐＦＳＴｐ-ＳＲＤＸ－ＨＳＰ＿ｅｎｔｒｙに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ｏｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＯｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。

得られたプラスミドは、Mitsuda et al., Plant Biotech. J., (2006) 4, 325-332. に記載されているｐＢＣＫＨベクターとＧＡＴＥＡＷＹ ＬＲ反応を起こすことによってｐＢＣＫＨを背景とする形質転換用プラスミドを得た。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＯｓＦＳＴ、Ｏｓ０１ｇ０８５３７００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０１ｇ０８５３７００ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＪ」と略称し、コンストラクトＪが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０１ｇ０８５３７００ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｊ」と略称する。キメラ遺伝子Ｊの構成を図２Ｂに模式的に示す。

（１０－２）コンストラクトＪを用いた形質転換による形質転換植物体Ｊの作成
前記［実施例８］（８－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＪによるイネ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＪにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｊ」と略称する。

［実施例１１］形質転換用コンストラクトＫ（ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０４ｇ０５６９１００ＳＲＤＸ）の構築及びイネ植物体の形質転換

（１１－１）コンストラクトＫの構築
イネＯｓ０４ｇ０５６９１００ＳＲＤＸ遺伝子のｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列番号７１の塩基配列を有する５’末端アッパープライマー、及び、以下の配列番号７２の塩基配列を有する３’末端ローアープライマーを用いて、前記［実施例１］（１－１）（ｂ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行うことにより、Ｏｓ０１ｇ０１４２５００遺伝子からストップコドンを除いた部分配列を増幅した。

５’－ＧＡＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＣ－３’ （配列番号７１）
５’－ＣＡＣＧＴＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴ－３’ （配列番号７２）

得られたＯｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子のストップコドンを除く増幅産物を、常法に従って、SmaIで切断してアガロールゲル電気泳動で回収し、前記のプラスミドｐＦＳＴｐ-ＳＲＤＸ－ＨＳＰ＿ｅｎｔｒｙに挿入した。常法によりシークエンスを確認して、Ｏｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子が順方向に導入されたものの中から、更にＯｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子とＳＲＤＸの読み枠が一致しているものを選抜した。この後ｐＢＣＫＨとＧＡＴＥＷＡＹ ＬＲ反応を行い、形質転換用プラスミドを得た。

得られた形質転換用プラスミドは、プロモーターＰｒｏＯｓＦＳＴ、Ｏｓ０４ｇ０５６９１００遺伝子、及び転写抑制ドメインＳＲＤＸが作動式に連結されてなるキメラ遺伝子ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０４ｇ０５６９１００ＳＲＤＸを担持する。このプラスミドを適宜「コンストラクトＫ」と略称し、コンストラクトＫが担持するキメラ遺伝子ＰｒｏＯｓＦＳＴ：Ｏｓ０４ｇ０５６９１００ＳＲＤＸを適宜「キメラ遺伝子Ｋ」と略称する。キメラ遺伝子Kの構成を図２Ｂに模式的に示す。

（１１－２）コンストラクトＫを用いた形質転換による形質転換植物体Ｋの作成
前記［実施例８］（８－２）に記載の手順と同様にして、コンストラクトＫによるイネ植物体の形質転換を実施し、首尾よく形質転換された植物体をハイグロマイシン培地による選抜により取得した。こうして得られた、コンストラクトＫにより形質転換された植物体を、適宜「形質転換植物体Ｋ」と略称する。

［評価４］形質転換植物体の形質の確認
形質転換植物体Ｈ、Ｉ、J及びＫの開花期の花序を温湯（４２℃）に７分間浸した後、同日中に開花した花から雄蕊を取り除いた（除雄）。開花が前日までに終了した花と開花前のつぼみは切り落とし、除雄した花において未授精の胚珠の発達を観察した。またコントロールとして、野生型のイネ植物体の花序を同様に除雄し、未授精の胚珠の発達を同様に観察した。また、形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫ、並びに野生型植物体それぞれの除雄しない花序においても、胚珠の発達を同様に観察した。胚珠の発達はステージ０～４に分類した。野生型のイネ植物体の各ステージ、及び、形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫにおいて除雄しても自発的に肥大したステージ３相当の胚珠外観の代表的な写真を図１０Ａ及びＢに示す。ステージ０は開花前と同じ大きさの胚珠であるのに対し、ステージ１～４では胚乳肥大が起こっている。図１０Ａ及びＢのステージ３及び４の右側の写真は胚珠の切断面を示す。ステージ４の胚乳は完全に固形であるのに対し、ステージ３の胚乳は一部～全体が液状である。

形質転換植物体Ｈ、Ｉ、及びＪの自家受粉で得られた子孫、並びに野生型植物体を除雄した場合、及び除雄しない場合の胚珠肥大の割合を図１１Ａ及びＢのグラフに示す。また、形質転換植物体Ｋ当代及び野生型再分化植物体を除雄した場合、及び除雄しない場合の胚珠肥大の割合を図１２のグラフに示す。形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫでは除雄した場合（未授精条件下）でも胚珠の肥大が確認された。このことより、キメラ遺伝子Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫを有するコンストラクトＨ、Ｉ、Ｊ、及びＫは、イネにおいて自発的胚珠肥大（未受精下での胚珠肥大）を誘導することが証明された。

また、形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫの自発的に肥大した胚珠の内容物をヨウ素液（ヨウ化カリウム０．１ｇとヨウ素０．５ｇを蒸留水１０ｍｌに懸濁したもの）で染色し、染色後の胚珠を実体顕微鏡を用いて観察した。得られた形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫのヨウ素液染色前後の実体顕微鏡写真を図１３に示す。ヨウ素液はデンプンを染色し青紫色を呈する。つまり、形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫの未授精胚珠内容物においてヨウ素デンプン反応が見られたという事実から、形質転換植物体Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫの胚珠は受精なしに固形または液状のデンプンを含む胚乳を発達させていることがわかる。このことにより、キメラ遺伝子Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫをそれぞれ有するコンストラクトＨ、Ｉ、Ｊ、及びＫは、イネにおいて自発的胚乳発達を誘導することが証明された。

本発明は、種子植物において受精を経ずに機能的な胚乳を人為的に誘導することを可能とする技術であることから、特に農業生産分野等で高い利用可能性を有する。

Claims (12)

1. 受精を介さず胚乳を発生しうる組換種子植物を作製する方法であって、
   種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子であって、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、又は、前記核酸分子を担持するベクターを、種子植物細胞内に導入して発現させることを含む方法。
2. 胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、下記式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
   ［Ｆ／Ｖ］［Ｋ／Ｑ］［Ａ／Ｑ］ＫＬＲＫＧＬＷＳＰＥＥＤ［Ｅ／Ｄ］ＫＬ［Ｌ／Ｙ］Ｎ［Ｈ／Ｙ］Ｉ［Ｉ／Ｔ］ＲＨＧ［Ｈ／Ｖ］ＧＣＷＳＳＶＰＫＬＡＧＬＱＲＣＧＫＳＣＲＬＲＷＩＮＹＬＲＰＤＬＫＲＧ［Ａ／Ｓ］ＦＳＱ［Ｄ／Ｑ］ＥＥ［Ｄ／Ｓ］ＬＩ［Ｉ／Ｖ］［Ａ／Ｅ］ＬＨ［Ａ／Ｅ］［Ａ／Ｉ］ＬＧＮＲＷＳＱＩＡ［Ｓ／Ｔ］［Ｈ／Ｒ］ＬＰＧＲＴＤＮＥＩＫＮＦＷＮＳＣＬＫＫＫＬＲ［Ｑ／Ｒ］［Ｋ／Ｒ］Ｇ［Ｉ／Ｌ］ＤＰ［Ａ／Ｔ］ＴＨＫＰ［Ｉ／Ｌ］
   ・・・（Ｉａ）
   ＥＲＫＫＧＶＰＷＴＥ［Ｅ／Ｄ］ＥＨ［Ｒ／Ｋ／Ｌ］［Ｑ／Ｌ／Ｒ／Ｓ］ＦＬ［Ｍ／Ｌ］ＧＬＫＫＹＧ［Ｋ／Ｒ］ＧＤＷＲＮＩ［Ａ／Ｓ］［Ｒ／Ｋ］［Ｎ／Ｓ／Ｙ］ＦＶ［Ｔ／Ｉ／Ｑ］［Ｔ／Ｓ］ＲＴＰＴＱＶＡＳＨＡＱＫＹＦ［Ｉ／Ｌ］Ｒ［Ｑ／Ｌ］［Ｖ／Ｌ／Ｎ］［Ｎ／Ｓ／Ｔ］［Ｇ／Ｄ］ＧＫＤＫＲＲ［Ｓ／Ａ］ＳＩＨＤＩＴＴＶＮ［Ｉ／Ｌ］
   ・・・（Ｉｂ）
3. 胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、及び配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、及び、配列番号２０からなる群より選択される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
5. 前記核酸分子が更に、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、インフレームで連結されている、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
6. 転写抑制機能を有するポリペプチドが、下記式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、又は、（IIｄ）で表されるアミノ酸配列を有するモチーフを含むポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
   ［Ｌ／Ｆ］ＤＬＮ［Ｌ／Ｆ］［Ｘ］Ｐ ・・・（IIａ）
   ［Ｌ／Ｖ］［Ｒ／Ｋ］ＬＦＧＶＸ［Ｍ／Ｖ／Ｌ］ ・・・（IIｂ）
   ＴＬＸＬＦＰ ・・・（IIｃ）
   ＴＬＸＬＦＲ ・・・（IIｄ）
   （但し、上記式（IIａ）～（IIｄ）中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
7. 転写抑制機能を有するポリペプチドが、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項５又は６に記載の方法。
8. 転写抑制機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８からなる群より選択される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する、請求項５～７の何れか一項に記載の方法。
9. 前記核酸分子が更に、プロモーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、プロモーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、請求項１～８の何れか一項に記載の方法。
10. 前記核酸分子が更に、ターミネーター領域の塩基配列を含み、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、ターミネーター領域の塩基配列と機能的に連結されている、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
11. 前記ベクターが、植物ウイルスベクター又はアグロバクテリウムベクターである、請求項１～１０の何れか一項に記載の方法。
12. 種子植物のゲノム内に導入して発現させることにより、受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導するための核酸分子であって、胚乳発生誘導機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、又は、前記核酸分子を担持するベクターが、細胞内に組み込まれている、受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物。

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