JP2006101827A - 雄性不稔形質転換植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】 花粉形成に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、植物の雄性不稔体を生産する技術を提供する。
【解決手段】 花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質が花粉形成に関与する遺伝子の発現を優性に抑制する結果、花粉形成が抑制された、植物の雄性不稔体が生産される。
【選択図】 なし

Description

本発明は、植物の雄性不稔体を生産する技術に関し、より詳細には、花粉形成に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、植物の雄性不稔体を生産する生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。

雄性不稔を示す植物は、様々な局面において利用価値が高い。一例を挙げると、育種面においては、雑種強勢を利用したハイブリッド種子作製のための種子親として利用されている。このようなハイブリッド種子により、植物の優良品種を作出することは、現在、一般的になっている。また、園芸面においては、除雄（雄しべの除去）により花の寿命延長が行われている。また、医療面においては、スギなどの雄性不稔樹木の作出により花粉症対策としての応用が期待できる。さらに、雄性不稔植物は、最近社会問題となっている、遺伝子組換え植物の野外試験における、花粉拡散による環境汚染に対する解決策の一つにも成り得る。

このように、雄性不稔植物は非常に利用価値が高いことから、植物に雄性不稔形質を付与するための遺伝子工学技術の開発が世界中で行われている。

例えば、ベルギーのPlant Genetic Systems社では、花粉形成に必要なタペート層を遺伝学的に除去することにより、雄性不稔を示す植物を作出している。これは、タペート層特異的発現を示すプロモータにＲＮＡ分解酵素（RNase）遺伝子を繋ぎ、このコンストラクトを植物に形質転換し、タペート層を除去することで、雄性不稔形質を付与している。なお、種子・果実を農業産品とする作物のハイブリッド種子作製では、花粉親として稔性回復系統を用いる必要がある。同社では、ＲＮＡ分解酵素インヒビター（RNase inhibitor）遺伝子を用いることにより、この問題を解決している。同社は、キャノーラ、トウモロコシ、イネ、野菜各種をターゲットにしている（例えば、非特許文献１参照）。

また、例えば、ＲＮＡ分解酵素遺伝子の上流にプロモータの断片を結合し、ＲＮＡ分解酵素阻害蛋白遺伝子の上流に前記プロモータと同一又は異なるプロモータを結合し、植物ゲノム中に導入することにより、その植物を実質的に雄性不稔化する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

ここで、花粉の発達に重要な役割を果たすタペート層について説明する。タペート層は、葯壁の最も内側に位置し、胞子形成細胞（花粉細胞）を取り囲んでいる組織である。タペート層は、花粉細胞の支持体としてだけでなく、花粉の発達に必要な栄養の供給を行う。また、四分子（ｔｅｔｒａｄ）を包むカロース層の分解、花粉細胞表面のエキシン層などを構成する化合物の供給など、多様な役割を担っている。また、葯の発達過程において、タペート層の機能の一部でも損なわれると、多くの場合、正常な花粉の発達が阻害されることが知られている。なお、葯の発達は、次の各段階に区分される。すなわち、胞子形成細胞の減数分裂直後にあたる四分子期、四分子からの微小胞子の放出期、花粉細胞の拡大および空胞形成に特徴付けられる一核期、有糸分裂により栄養細胞および生殖細胞への分化が生じる有糸細胞分裂期、その後の二核期である。これらの各段階を経て、最終的に葯が開裂し、成熟した花粉粒が放出される。

上記のように、タペート層は花粉発達に重要な役割を担うため、葯のタペート層で特異的に発現する花粉の発達を制御する転写因子を用いて、内因性の転写因子の発現を抑制することで、植物を雄性不稔化させる技術が開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。

ところで、本発明者らは、シロイヌナズナ（学名 Arabidopsis thaliana）の花粉形成に必須な核内制御因子ＭＳ１タンパク質（例えば、非特許文献２参照）を見出している。ここでは、発明者らは、図９（ａ）に示すシロイヌナズナ雄性不稔変異体の一つであるｍｓ１の原因遺伝子であるＭＳ１遺伝子を単離した。なお、図９（ｂ）は、野生型のシロイヌナズナである。そして、in situ ＲＮＡハイブリッド形成法を用いてＭＳ１ｍＲＮＡの発現を調べたところ、図１０（Ｊ）に示すように四分子期にタペート層特異的に発現していた。図１０（Ａ），（Ｂ），（Ｅ），（Ｆ）に示すように、この変異体ｍｓ１は、四分子期から小胞子が分離する時期にかけては野生型との相違は見られない。しかし、図１０（Ｃ），（Ｇ）に示すように、その後のステージで、野生型で見られる細胞壁の蓄積が見られず、図１０（Ｈ）に示すように、小胞子とタペート層が液胞化する。そして、図１０（Ｉ）に示すように、最終的に成熟花粉が全く形成されない。野生型では、図１０（Ｄ）に示すように、成熟花粉が形成される。そして、図１１に示すように、ＭＳ１タンパク質のＮ末領域とＧＦＰとの融合タンパク質は核へ移行すること、および、Ｃ末領域には一群の転写因子に特徴的なＰＨＤフィンガーモチーフが存在することから、このＭＳ１タンパク質は転写因子であることを見出した。

また一方で、本発明者らは、転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献５〜１１、非特許文献３〜５参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。

さらに、本発明者らは、種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することを試みている。そして、これにより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することに成功している。
特開２００１−９５４０６号公報（２００１年４月１０日公開） 特開２００１−１４５４２９号公報（２００１年５月２９日公開） 特開２００３−９２９３６号公報（２００３年４月２日） 特開２００４−１９７号公報（２００４年１月８日公開） 特開２００１−２６９１７７号公報（２００１年１０月２日公開） 特開２００１−２６９１７８号公報（２００１年１０月２日公開） 特開２００１−２９２７７６号公報（２００１年１０月２日公開） 特開２００１−２９２７７７号公報（２００１年１０月２３日公開） 特開２００１−２６９１７６号公報（２００１年１０月２日公開） 特開２００１−２６９１７９号公報（２００１年１０月２日公開） 国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（２００３年７月１０日公開） Bijman, J. (1994) Plant Genetic Systems. Biotechnology and Development Monitor, No. 19, p. 19-20. Ito, T. and Shinozaki, K. (2002) The MALE STERILITY1 gene of Arabidopsis, encoding a nuclear protein with a PHD-finger motif, is expressed in tapetal cells and is required for pollen maturation. Plant Cell Physiol. 43, 1285-1292. Hiratsu, K., Matsui, K., Koyama, T. and Ohme-Takagi M. (2003) Dominant repression of target genes by chimeric repressors that include the EAR motif, a repression domain, in Arabidopsis. Plant J. 34, 733-739. Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001 Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters 514(2002)351-354

しかし、従来、花粉形成に関与する遺伝子の発現の転写抑制を生じさせることによって、植物の雄性不稔体を生産する技術は知られていない。特に、花粉の発達に欠かせない重要な組織であるタペート層で転写抑制を生じさせ不稔化を図る発明は、未だなされていない。

よって、本発明の目的は、花粉形成に関与する遺伝子の転写を抑制することによって、植物の雄性不稔体を生産する、雄性不稔形質転換植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用を提供することにある。

本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、シロイヌナズナ花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であるＭＳ１タンパク質を転写抑制因子に転換することによって、花粉形成が抑制された雄性不稔植物体を生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明にかかる植物の雄性不稔体の生産方法は、上記課題を解決すべく、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花粉形成に関与する遺伝子の発現を抑制することを特徴としている。上記生産方法では、植物の雄性不稔体は、少なくとも花粉の細胞壁の形成が阻害されていることが好ましい。

これにより、上記キメラタンパク質は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を効果的に抑制することができる。それゆえ、上記キメラタンパク質が生産された植物体の花粉の形成が抑制され、その植物体を、雄性不稔体とすることができる。

また、上記生産方法では、上記転写因子が、タペート層で特異的に発現するタンパク質であることが好ましい。

また、上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。

また、上記生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいてもよい。

また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。

これらにより、上記キメラタンパク質を形質転換された上記植物細胞内で発現させることができる。それゆえ、該キメラタンパク質が標的遺伝子の転写を抑制し、花粉形成を抑制することができる。

なお、上記生産方法では、上記発現ベクターには、タペート層に特異的なプロモータ活性を示すプロモータが含まれることが好ましい。

上記プロモータとして、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子を用いることが好ましい。（ｃ）配列番号５９によって示される塩基配列を有する遺伝子。（ｄ）配列番号５９によって示される塩基配列の少なくとも一部の配列を有し、タペート層に特異的なプロモータ活性を有する遺伝子。

また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｅ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｆ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。

ここで、上記植物は高等植物であってもよく、シロイヌナズナあるいはイネであってもよい。本発明で用いられる、花粉形成に関わる遺伝子の転写を促進する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられるため、特定のモデル植物で構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に雄性不稔体を生産することができる。

上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。

また、上記機能性ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。

また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載のペプチドであってもよい。（ｇ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｈ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。

また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。

また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。

また、上記機能性ペプチドは、配列番号２２〜４１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。

また、上記機能性ペプチドは、配列番号４２又は４３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。

上記機能性ペプチドが、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド又は上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の転写（発現）を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。

また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、花粉形成が抑制されていることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。

また、本発明にかかる植物の雄性不稔体生産キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモータとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記植物の雄性不稔体生産キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。

このようなキットにより、簡便に花粉形成が抑制された植物の雄性不稔体を生産することができる。

本発明にかかる植物の雄性不稔体の生産方法では、以上のように、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花粉形成に関与する遺伝子の発現を抑制することによって、植物の雄性不稔体を生産する。したがって、上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子で目的の植物を形質転換すれば雄性不稔植物を生産することができ、複雑な遺伝子組換え技術を利用することなく、非常に簡便に目的の植物を雄性不稔化することができるという効果を奏する。

また、本発明で用いられる、花粉形成に関わる遺伝子の転写を促進する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられるため、特定のモデル植物で構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に雄性不稔体を生産することができる。

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本発明は、植物の雄性不稔体を生産する技術であって、花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させるものである。これによって得られる植物体では、花粉形成に関与する遺伝子の転写が抑制され、花粉形成が抑制される。よって、本発明により、雄性不稔植物体を生産することができる。

ここで、正常な花粉形成ができなくなることは、次のようにして起こる。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花粉形成に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。上記転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより、花粉形成に関与すると推定されるタンパク質の生成が減少し、その結果、得られる植物体の花粉形成を抑制することができる。

本発明の生産方法で生産される植物の雄性不稔体（本雄性不稔体）は、花粉形成が抑制されたものである。例えば、本雄性不稔体として、花粉の細胞壁の形成が阻害され、花粉が形成されないものなどがある。

なお、本雄性不稔体では、雌ずいは稔性を有している。このため、本雄性不稔体に他種の花粉を授粉できる。したがって、雑種強勢を利用した交配により、一代雑種を得ることが出来る。

また、本雄性不稔体では、花粉形成が抑制されることに加えて、他の組織の形成が正常に行われなくなっていてもよい。例えば、本雄性不稔体は、花弁や萼などが通常とは異なる形に形成されるものや、あるいは全く形成されていないものでもよい。例えば、花弁や萼がまったく形成されなければ、雌ずいが露出するため、他種の花粉を授粉する際の手間（萼や花弁を除去する等）を簡略化できる。

以降の説明では、本発明にかかる雄性不稔植物体の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用について、それぞれ説明する。

（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。

また、本発明で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して、優性に作用するものである。すなわち、本発明にかかるキメラタンパク質は、植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、該当する転写因子が制御する、花粉形成に関わる遺伝子の発現を、一様に抑制できる。そのため、遺伝子導入可能なあらゆる植物を、雄性不稔体に容易に形質転換できる。

以下では、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。

（Ｉ−１）花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であれば特に限定されるものではない。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有するタンパク質が含まれる。

本発明で用いられる転写因子は、タペート層で特異的に発現するタンパク質であることが好ましい。

このような転写因子としては、例えば、シロイヌナズナＭＳ１タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＭＳ１タンパク質は、シロイヌナズナ雄性不稔体の一つであるｍｓ１の原因遺伝子であるＭＳ１遺伝子がコードするタンパク質である。ＭＳ１タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、本発明者らは、上述したように、花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であり、ターペスト層に特異的に発現することを見出した（非特許文献２参照）。本実施形態では、例えば、このＭＳ１タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＭＳ１タンパク質を転写抑制因子に転換させることができる。

なお、ＭＳ１タンパク質をコードする遺伝子のホモログはイネで見出されている。進化系統的に離れた双子葉類であるシロイヌナズナと単子葉類であるイネとの両者にＭＳ１が存在することは、少なくとも単子葉類と双子葉類との分岐以前にＭＳ１遺伝子が存在していたこを示しており、すなわち、ＭＳ１は高等植物に広く存在することが示唆されている。

本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＭＳ１タンパク質に限定されるものではなく、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する機能を有する転写因子であればよい。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。

また上記転写因子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％または７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、且つ、花粉形成に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質も含まれる。なおここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。

また、本発明で用いられる、花粉形成に関わる遺伝子の転写を促進する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。そのため、雄性不稔体を生産したい個々の植物体において、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する固有の転写因子やその遺伝子を、必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナで構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に雄性不稔体を生産できると考えられる。

本発明で用いられるキメラタンパク質を生産させる際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。

上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＭＳ１タンパク質を用いる場合には、このＭＳ１遺伝子を挙げることができる。ＭＳ１遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。

もちろん、本発明で用いられるＭＳ１遺伝子、または、転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号２に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。

上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。

上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。

（Ｉ−２）転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献５〜１１、非特許文献３〜５等参照）を挙げることができる。

本発明者らは、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子およびこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献５〜８参照）。また、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献９参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献１０参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。

また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。

したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。

上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。

このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。

同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。

上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４４、４５に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４５に示すアミノ酸配列である。

（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。

このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。

同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。

上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４６、４７に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４７に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４８に示す。

（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。

一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。

このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。

また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。

上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４９〜５７に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４９、５０または５１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５２、５３または５４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５５、５６または５７に示すアミノ酸配列である。

（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５８に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５８に示すアミノ酸配列である。

特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者らが新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。

（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者らが上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献１１参照）。

さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｇ）又は（ｈ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｇ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｈ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。

上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。

上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。

また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。

その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。

（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。

なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。

上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２〜４１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２９、３０、３２又は３４のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６又は３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１、又は３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３又は２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。

また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号４２または４３で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。

（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。

具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。

上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。

上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７又は１３９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４，１３６，１３８，１４０に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜４３に示されるアミノ酸配列に対応するものである。

本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。

（ＩＩ）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、花粉形成に関与する遺伝子の発現を抑制する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。

（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモータとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。

上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、ｐＳＲＤＸＧ等が挙げられる。また、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１等を挙げることができる。

上記プロモータは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能な、つまり、上記転写因子が発現している時（発生時期）と場所（組織等）とを含む発現パターンを示すプロモータであれば、特に限定されるものではなく、公知のプロモータを好適に用いることができる。

また、上記プロモータは、タペート層に特異的なプロモータ活性を示すプロモータであってもよい。このようなプロモータとして、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子を用いてもよい。（ｃ）配列番号５９によって示される塩基配列を有する遺伝子。（ｄ）配列番号５９によって示される塩基配列の一部の配列を有し、タペート層に特異的なプロモータ活性を有する遺伝子。

例えば、上記転写因子がＭＳ１タンパク質であれば、転写因子が発現している時（＝発生時期：四分子期）と場所（＝組織：タペート層）とを含む発現パターンを示すプロモータであればよく、（ｃ）のプロモータ、すなわち、ＭＳ１遺伝子のプロモータを好ましく用いることができる。

ＭＳ１遺伝子のプロモータ領域の、組識特異的な発現活性に必須でない配列を除去して得ることができる、タペート層に特異的なプロモータ活性を有する配列は、本発明の範囲内にある。このような配列は、常法に従ってプロモータのデリーション実験を行うことによって取得することができる。例えば、ＭＳ１遺伝子のプロモータ領域の様々な欠失変異体（例えば、ＭＳ１遺伝子のプロモータ領域を、５'上流側から種々の長さに欠失させた変異体）と、適切なレポーター遺伝子とを融合したプラスミドとを用いて、欠失変異体の組識特異的プロモータ活性を測定することによって、その活性に必須な領域を特定することができる。

いったんプロモータ活性に必須の領域が特定されると、さらにその領域内の配列または隣接配列を改変して、プロモータの発現活性の程度を高めることも可能である。このようにして得られる改変体もまた、タペート層に特異的なプロモータ活性を示す限り、本発明の範囲内にある。

本発明において、「タペート層に特異的なプロモータ活性を示す」とは、プロモータが、野生型の植物中で、または任意の構造遺伝子に連結させた発現カセットとして植物に導入されたときに、ＤＮＡの転写を開始させることにより遺伝子の発現を指示する能力を、タペート層において特異的に示すことを意味する。ここで「特異的」とは、同じ植物体の花の、他のすべての組織（花粉、花糸、花柱、花頭、花弁、萼などを含む）よりも、プロモータの発現活性が高いことをいう。上記特異的なプロモータは、同じ植物体の花の他のすべての組織および花以外の部分（根、葉、茎など）よりも、プロモータの発現活性が高いものが好ましい。上記特異的なプロモータは、さらに、同じ植物体の花の他のすべての組織および花以外の部分において実質的に活性を示さないものがより好ましい。発現活性の程度は、常法に従って、タペート層におけるプロモータの発現レベルと、花の他の組識における同じプロモータの発現レベルとを比較することによって、評価することができる。プロモータの発現レベルは、通常、そのプロモータの制御下で発現される遺伝子産物の産生量によって決定することができる。

上記の特異的なプロモータを利用する植物への雄性不稔性の付与は、本発明にかかるプロモータに作動可能に連結された遺伝子が、この遺伝子を導入された形質転換植物において、プロモータの制御下でタペート層に特異的に発現される結果として生じ得る。多くの組織特異的プロモータにおいて、その組織特異性が種間を越えて保存されていることは周知であるので、本発明にかかるプロモータもまた幅広い植物種に適用できることが容易に理解される。

本発明にかかるプロモータは、例えば、公知のｃＤＮＡをプローブとして用いて、植物のゲノミックライブラリーをスクリーニングし、そして対応のゲノミッククローンからコード領域の上流配列を単離することにより得ることができる。ｃＤＮＡの例として、上述したシロイヌナズナの変異体ｍｓ１由来の転写因子であるＭＳ１タンパク質のｃＤＮＡが挙げられる。

本発明にかかるプロモータは、天然から単離されたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含まれる。合成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のようにして配列決定されたプロモータの配列またはその活性領域を、当業者に周知の手法によって合成または改変することにより取得することができる。

上記のようなプロモータを用いることにより、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子をタペート層のみで発現させて、他の組織に影響を与えることなく、花粉形成を抑制することが可能となる。かかるプロモータを用いることにより、当該遺伝子の発現の時期及び組織に特異的に遺伝子を発現させることが可能となり、花粉形成をより効果的に抑制することができる。

上記各プロモータを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。

上記プロモータは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。

上記組換え発現ベクターは、上記プロモータおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。

ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。

上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモータがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。

上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。

上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモータの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。

上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモータ、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモータと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。

キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモータ、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。

また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。

（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。

上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接、植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。

組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。

上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。

ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。

（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。

選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、カナマイシン耐性やハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜し、さらに、形質転換体を育成した後に、成長した植物体において、花粉形成が抑制されていることを基準として選抜するのがよい。花粉形成の抑制を基準にする選抜としては、例えば、花粉発生ステージを追って、顕微鏡等を用いて観察する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により、花粉形成に関与する遺伝子の発現が抑制された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。

なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。

また、本発明にかかる植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記キメラタンパク質そのものを植物体に投与してもよい。その際、キメラタンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。

（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花粉形成に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより、花粉形成に変異が生じ、花粉形成が正常に行われなくなる雄性不稔性の植物体を得ることができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる雄性不稔植物体（雄性不稔形質転換植物体）も含まれる。

（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
本発明にかかる雄性不稔植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、雄性不稔性を獲得することによりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は広く高等植物であってもよい。被子植物であってもよいし裸子植物であっても、双子葉植物であってもよく単子葉植物であってもよい。裸子植物としては、例えば、スギ目のスギ科、マツ科、ヒノキ科の植物やマキ科の植物を挙げることができる。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科、マメ科、チャ等のツバキ科等の植物を挙げることができる。また、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ムギ等のイネ科、ホシクサ科等の植物を挙げることができる。

また、本発明にかかる雄性不稔植物体は、果実や種子を商品とする植物、花や植物体そのものを商品とする観葉植物（花卉植物）であってもよい。したがって、本発明にかかる雄性不稔植物体の具体例をさらに挙げると、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、めかぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウなどの各種の食用植物、あるいはバラ、キク、あじさい、カーネーションなどの観葉植物がある。

（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明は、植物体の花粉形成を抑制することにより一定の効果がある分野に有用性がある。本発明は、単子葉類、双子葉類問うことなく、広く高等植物に有用性がある。
具体例を以下にいくつか挙げるが、本発明の有用性は、これらに限定されるものではない。

まず、本発明の技術により、花粉形成が抑制された雄性不稔植物体を作出でき、雑種強勢を利用した交配による品種改良に利用できる。本発明の雄性不稔植物体では、花粉形成が抑制されるため、イネ等の自殖性植物であっても、自家受粉が行われない。そのため、他種の花粉を授粉することで、種間の交配を簡便に行える。これにより、雑種強勢を利用した、優良品種の一代雑種の探索を簡便かつ効率的に行うことができる。

また、本発明の技術は、トウモロコシ等の他殖性植物にも適用できる。他殖性植物では、現在、人力で雄しべを刈り取る作業（除雄作業）により自家受粉を回避し、他品種の花粉を授粉して品種改良を行っている。これに対し、本発明の技術で雄性不稔植物体を生産すれば、このような労力を必要としなくなるため、品種改良に必要な時間やコスト、あるいは優良品種の栽培に必要な手間を、現状に比較して大幅に低減することができる。

また、本発明の技術は、タマネギやジャガイモなど、地下茎を商品とする植物にも応用できる。この種の植物では、受粉が起こると、地下茎の成長が著しく阻害され、商品価値が下がることが知られている。そのため、現在、受粉を回避するために除雄作業が必要となり、そのための手間やコストが非常に大きい。本発明の技術により、地下茎を商品とする植物の雄性不稔体が得られるため、除雄作業を必要とせず、受粉を回避できる。そのため、植物体を育成して商品を生産する際のコストや時間を、現状に比較して大幅に低減できる。

本発明の技術は、果実や花を商品としない植物体にも好適に応用できる。その一例を挙げると、花粉症の予防がある。すなわち、花粉症の原因となる花粉を大量に撒き散らす植物、例えば、スギ、ヒノキ、サワラなどの樹木、カモガヤ、オオアワガエリ、ナガハグサなどのイネ科植物、ブタクサ、ヨモギ、カナムグラなどの雑草類において、本発明の技術により雄性不稔体を生産すれば、正常な花粉形成ができないため、これらの植物体から花粉が飛散する恐れがない。そのため、これらの雄性不稔体を、自然界の野生型植物体と置き換えてやれば、花粉症の原因となる花粉の飛散が抑えられるため、花粉症を予防できる。

また、本発明の技術により、花粉を経由するウイルスの感染が原因となる、植物の病気を予防できる。ある種の植物ウイルスは、病的植物の花粉内に存在し、健全植物に伝染して病気を引き起こすことが知られている。本発明の技術により、花粉形成が抑制された植物体を生産すれば、花粉を媒介するウイルス感染が行われないため、かかる植物の病気を予防できる。

本発明の技術により、遺伝子改変植物体の自然界への望ましくない拡散を防止できる。一例を挙げると、パルプの原料であるユーカリでは、遺伝子操作により、耐塩性や耐寒性に優れ、樹木が巨大化するなどの、より優れた形質を導入された遺伝子改変植物体が創出され、野外環境下における導入形質の検証実験が行われている。しかし、このような遺伝子改変植物体を野外環境下で育てると、風や昆虫等を媒体とした花粉の拡散を通じて、遺伝子改変植物体が自然界へ広く拡散していき、自然環境が改変される恐れがある。そのため、かかる問題に対処するために、遺伝子改変植物の検証実験を、外界から完全に隔離された、特殊な環境下で行う必要がある。

しかし、本発明の技術を用いて、遺伝子改変植物体を、花粉形成が抑制された雄性不稔体に形質転換させておけば、花粉の撒布による遺伝子改変植物体の自然界への拡散は起こらない。そのため、現状に比較して、実際の野外環境下により近い条件で、遺伝子改変植物体の検証試験を行うことができる。これにより、遺伝子改変植物体に導入した形質を、より自然な環境下で検証することができる。

（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち植物の雄性不稔体化キットを挙げることができる。

この雄性不稔体化キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明を実施例及び図１〜８に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本実施例においては、図１に示すように、シロイヌナズナ雄性不稔変異体の一つであるｍｓ１の原因遺伝子であるＭＳ１遺伝子のプロモータと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドの一つである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドをＭＳ１遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築した。そしてこの発現ベクターを野生型シロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。

（１）ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトの作製
初めに、以下に示すプライマー１およびプライマー２と、鋳型としてシロイヌナズナ野生型（Ｌ−ｅｒ）ゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲを行い、ＭＳ１プロモータの増幅を行った。

ここで用いたプライマーは、
プライマー１：5'-atttgaagctttgaagtgactgtaagtacccaaag-3'（下線はＨｉｎｄIII制限酵素部位である）（配列番号６０）
プライマ−２：5'-agattggatcccgaatcagaaatttggtttgatct-3'（下線はＢａｍＨI制限酵素部位）（配列番号１４１）
そして、ＰＣＲ増幅産物をＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨIで切断し、ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨI断片を得た。

次に、ベクターｐＳＲＤＸＧ♯２をＢａｍＨIおよびＥｃｏＲIで消化し、TMV omega-SRDX-NOS terminatorを含むＢａｍＨI−ＥｃｏＲI断片を得た。

その後、ｐＢＩ１０１形質転換ベクター（Jefferson 1987）をＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲIで消化し、ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲIベクター断片を得た。このベクター断片に上記ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨI断片とＢａｍＨI−ＥｃｏＲI断片をライゲーションし、ｐＭＳ１ｐｒｏ：：ＳＲＤＸを得た。

次に、以下に示すプライマー３およびプライマー４と、鋳型としてＭＳ１ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＭＳ１遺伝子の増幅を行った。

ここで用いたプライマーは、
プライマー３：5'-atggcgaatctgattcgaacagac-3'（配列番号１４２）
プライマー４：5'-gggtaaaaaagagagaggaataag-3'（配列番号１４３）
である。

そして、ＰＣＲ増幅産物を、ＳｍａIで消化したｐＭＳ１ｐｒｏ：：ＳＲＤＸとライゲーションしてＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトを得た。

また、図２に示すプロモータを選択する実験のために、ＭＳ１プロモータとＭＳ１ ｃＤＮＡをｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩベクター断片にライゲーションしたＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１を得た。また、ＭＳ１プロモータの代わりにカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータを用いた３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１も得た。

図２に示すように、３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１コンストラクトをｍｓ１変異体に導入して不稔形質が相補されるか否かを検出したところ、全く相補されていなかった。形質転換した１５固体中表現型相補した個数は０個だった。このことは、ＭＳ１タンパク質の発現ステージ、発現場所で、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータは、機能していないことが示される。すなわち、ＳＲＤＸ等を用いた従来技術において使用したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータは、本実施例では利用できないことが判明した。一方、ＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１コンストラクトをｍｓ１変異体に導入すると、不稔形質が相補された。形質転換した２固体中表現型相補した個数は２個だった。そのため、ＭＳ１プロモータを用い、ＭＳ１−ＳＲＤＸを発現させることにした。
（２）形質転換した植物体の生産
まず、得られたＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトを、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell １９８６)）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地に懸濁し菌体懸濁溶液を得た。この感染用培地の組成は、１／２×ＭＳ塩、０．１１２×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、５％ショ糖、１０μｇ／Ｌベンジルアデニン、０．０２％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７である。

この菌体懸濁溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを、１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を１％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液で１０分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したカナマイシン選択培地に蒔種した。なお、カナマイシン選択培地の組成は、１×ＭＳ塩、３％ショ糖、０．０５％ＭＥＳ（ｐＨ＝５．７）、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、３０μｇ／Ｌカナマイシン、２００μｇ／Ｌクラフォラン、０．８％寒天である。

蒔種した種子からカナマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物体から全ゲノムＤＮＡを調整し、ＰＣＲを用いてＭＳ１−ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
（３）顕微鏡解析
ＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトで形質転換された植物体と、野生型の植物体とを滅菌した市販の園芸用土壌、約５０μＥ／ｓ／ｍ²の光条件で育成した。その結果、弱い表現型を示す植物体から強い表現型を示す植物体までの様々な強さの表現型を示す植物体が得られた。代表的な植物体の例を図３に示す。ここで、図３（ａ）は野生型の植物体、図３（ｂ）は、中間の表現型を示す形質転換植物体、図３（ｃ）は、強い表現型を示す形質転換植物体である。

形質転換植物体および野生型の植物体について、花粉発生ステージを追って顕微鏡解析を行った。それぞれのステージで、花序を含むサンプルをＦＡＡ（１％ホルムアルデヒド、２．５％酢酸、４５％エタノール）で一晩固定し、テクノビット７１００樹脂（Kulzer, GmbH）に包埋した。薄切片（４μｍ厚）をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察した（参考文献：Ito, T. and Shinozaki, K. (2002) The MALE STERILITY1 gene of Arabidopsis, encoding a nuclear protein with a PHD-finger motif, is expressed in tapetal cells and is required for pollen maturation. Plant Cell Physiol. 43: 1285-1292.）。その結果、図４〜図８に示すように、形質転換植物体において、ｍｓ１変異体の表現型と同様な表現型が観察された。図４は四分子期であり、図５は小胞子が分離する時期、図６は小胞子に細胞壁が蓄積し始める時期、図７は花粉成熟の途中の時期、図８は成熟花粉時期、である。図４〜図８において、（ａ）は野生型の植物体、（ｂ）は中間の表現型を示す形質転換植物体、（ｃ）は強い表現型を示す形質転換植物体、から得られたサンプルである。

なお、形質転換された８０個体中、ｍｓ１変異体の様に成熟花粉形成が完全に抑制された形質転換体は得られなかった。

本発明によれば、花粉形成が抑制された雄性不稔植物体を、広範囲の植物で生産することができる。それゆえ、本発明は、各種農業や林業、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。

実施例において用いるベクターであるＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトを示す図である。 実施例において、３５Ｓプロモータが利用できるかどうか検討した実験を示す図であり、ＭＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１コンストラクトおよび３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＭＳ１コンストラクトを示す図である。 （ａ）は野生型のシロイヌナズナの生長した植物体、（ｂ）はＭＳ１ｐｒｐｍｏｔｅｒ−ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトにより形質転換されたシロイヌナズナの成長した植物体であり中間の表現型を示す植物体、（ｃ）はＭＳ１ｐｒｐｍｏｔｅｒ−ＭＳ１−ＳＲＤＸコンストラクトにより形質転換されたシロイヌナズナの成長した植物体であり、強い表現型を示す植物体、の画像を示す図である。 四分子期の画像を示す図であり、（ａ）は野生型の植物体、（ｂ）は中間の表現型を示す形質転換植物体、（ｃ）は強い表現型を示す形質転換植物体、の画像を示す図である。 小胞子が分離する時期の画像を示す図であり、（ａ）は野生型の植物体、（ｂ）は中間の表現型を示す形質転換植物体、（ｃ）は強い表現型を示す形質転換植物体、の画像を示す図である。 小胞子に細胞壁が蓄積し始める時期の画像を示す図であり、（ａ）は野生型の植物体、（ｂ）は中間の表現型を示す形質転換植物体、（ｃ）は強い表現型を示す形質転換植物体、の画像を示す図である。 花粉成熟の途中の時期の画像を示す図であり、（ａ）は野生型の植物体、（ｂ）は中間の表現型を示す形質転換植物体、（ｃ）は強い表現型を示す形質転換植物体、の画像を示す図である。 成熟花粉時期の画像を示す図であり、（ａ）は野生型の植物体、（ｂ）は中間の表現型を示す形質転換植物体、（ｃ）は強い表現型を示す形質転換植物体、の画像を示す図である。 （ａ）はシロイヌナズナの雄性不稔ｍｓ１変異体の生長した植物体、（ｂ）は野生型のシロイヌナズナの生長した植物体、の画像を示す図である。 野生型シロイヌナズナおよびシロイヌナズナのｍｓ１変異体について、顕微鏡解析における画像を示す図である。 ＭＳ１タンパク質の一次構造を示す図である。

Claims (22)

1. 花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花粉形成に関与する遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物の雄性不稔体の生産方法。
2. 上記植物の雄性不稔体は、少なくとも花粉の細胞壁の形成が阻害されていることを特徴とする、請求項１に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
3. 上記転写因子が、タペート層で特異的に発現するタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
4. 上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
5. 上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
6. さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
7. 上記発現ベクターには、タペート層に特異的なプロモータ活性を示すプロモータが含まれることを特徴とする請求項５または６に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
8. 上記プロモータとして、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子を用いることを特徴とする請求項７に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
   （ｃ）配列番号５９によって示される塩基配列を有する遺伝子。
   （ｄ）配列番号５９によって示される塩基配列の少なくとも一部の配列を有し、タペート層に特異的なプロモータ活性を示す遺伝子。
9. 上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載の遺伝子を用いることを特徴とする請求項４〜８の何れか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
   （ｅ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
   （ｆ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
10. 上記植物は高等植物であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
11. 上記植物はシロイヌナズナあるいはイネであることを特徴とする請求項１〜９に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
12. 上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
    （１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
    （但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
    （２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
    （但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
    （３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
    （但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
    （４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
    （但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
13. 上記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
14. 上記機能性ペプチドが、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
    （ｇ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
    （ｈ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
15. 上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
    （５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
    （但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
    で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
16. 上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
    （６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
    （７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
    （８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
    （但し、各式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
17. 上記機能性ペプチドが、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
18. 上記機能性ペプチドが、配列番号４２又は４３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、花粉形成が抑制された植物体。
20. 上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１９に記載の植物体。
21. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
    花粉形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモータとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物の雄性不稔体生産キット。
22. さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項２１に記載の植物の雄性不稔体生産キット。

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