JP2004534535A - 新規の植物プロモーター - Google Patents
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Abstract
本発明は、Brassica napus 植物から入手可能な優先的にカルス特異的なプロモーターを提供する。本発明によれば、カルス特異的プロモーターを収容するDNA断片が提供され、前記DNA断片は、2001年2月6日にCBS109271号及びCBS109273号の番号でカビ培養物中央管理局(バーン、オランダ)にそれぞれ寄託された、クローンpJB1178−21又はクローンpJB1178−43中に存在している。本発明によるDNA断片は、配列番号1又は配列番号2により表されるヌクレオチド配列、又は、それぞれ配列番号8又は配列番号9に示されるような全長配列又はその一部を含むことをさらに特徴とする。さらに、本発明は、配列番号10及び配列番号11にそれぞれ示されるような Arabidopsis thaliana 中の相同配列を含む。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規の植物プロモーター、より特別には、カルス特異的プロモーターに関する。
【背景技術】
【0002】
本開示の文脈において、用語「プロモーター」又は「プロモーター領域」は、通常,構造遺伝子のコード配列に対して上流(5’)にあり、RNAポリメラーゼ及び/又は他の因子が正確な部位から転写を始めるのに必要とする認識を提供することによってコード領域の発現を制御する、DNAの配列を意味する。
【0003】
一般に、2つの種類のプロモーター、誘導プロモーター及び構成プロモーターが存在する。誘導プロモーターは、インデューサーに応答して1以上のDNA配列若しくは遺伝子の転写を直接的又は間接的に活性化することが可能であるプロモーターである。インデューサーの非存在下では、DNA配列又は遺伝子は転写されない。典型的には、誘導プロモーターへ特異的に結合して転写を活性化するタンパク因子は不活性型で存在し、次いで、それがインデューサーにより直接的又は間接的に活性型へ変換される。インデューサーは、化学薬剤;環境条件により引き起こされる生理学的ストレスであり得るか、又は植物の生育における変化に応答して内因的に産生される化合物であり得る。
【0004】
構成プロモーターは、植物の様々な部分全体で、そして植物の生育にわたって不断に、それが制御するDNA配列(遺伝子)の発現を指令する。しかしながら、本明細書で使用する用語「構成」は、ある遺伝子がすべての細胞種で同一のレベルで発現されることを必ずしも示すものではなくて、発生量においていくらかの変動がしばしば観察されるものの、この遺伝子が広範囲の細胞種において発現されることを示す。
【0005】
植物タンパク質の発現の分野における最も早期の最も重要な発明の1つは、異種遺伝子の強力かつ構成的な発現を提供する(植物)ウイルス及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)由来プロモーターのトランスジェニック植物における使用である。これらプロモーターのいくつかは植物遺伝学の研究にごく集中的に使用されてきて、依然として、迅速、簡略、及び低リスクの発現試験で選択されるプロモーターとなっている。最も有名なのは、すでに1984年(EP 0 131 623)に実践的に有用であることが判明した、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の35S及び19Sプロモーターと、ノパリンシンターゼ(nos)、マンノピンシンターゼ(mas)、及びオクトピンシンターゼ(ocs)のプロモーター(EP 0 122 791,EP 0 126 546,EP 0 145 338)のように、アグロバクテリウムのT−DNAにおいて見出し得るプロモーターである。類似の特徴を有する植物由来プロモーターは、ユビキチンプロモーター(EP 0 342 926)である。
【0006】
誘導プロモーターの特定の群は、組織若しくは生育特異的なプロモーターである。これらのプロモーターは、それが制御する遺伝子の発現を、唯一又は少数の群の組織において優先的に、又は植物のある生育段階の間に優先的に推進するという特性を有する。当然ながら、生育段階特異的である組織特異的なプロモーターも存在するものである。
【0007】
カルス組織において優先的に機能的であるプロモーターは、比較的稀である。こうしたカルス組織特異的プロモーターの貴重な応用は、選択可能マーカー遺伝子の推進にある可能性がある。植物形質転換の間、遺伝子導入(transgenics)の選択は、カルスが形成されてカルスが苗条及び/又は根組織へ分化する組織培養期の間に優先的になされる。従って、この段階で選択可能マーカーの発現が求められる。さらに、植物が成熟植物へ、そして成熟段階そのものにおいて生育しているときには、選択可能マーカーの発現はもはや何の役にも立たず、反生産的とさえみなされる場合がある。このアプローチの1例が、カルス優先性のアスパラガス(Asparagus)Aopr1−プロモーターを使用してnptII遺伝子の発現を推進した、Firek, S. et al. (1993, Plant Molecular Biology 22(1): 129-142) に明示されている。しかしながら、文献から利用可能なこの種の代替プロモーターの数は限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
故に、新規の植物由来カルス特異的プロモーターを提供することが本発明の目的である。
本発明によるプロモーターを含んでなるDNAの断片を提供することが本発明のさらなる目的である。
【0009】
本発明によるプロモーターを含んでなるトランスジェニック植物(又はその部分及び/又は種子)(前記トランスジェニック植物に由来する植物(又は植物の部分)及び種子が含まれる)を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、アブラナ(Brassica napus)植物から入手可能な優先的にカルス特異的なプロモーターを提供する。
本発明によれば、カルス特異的プロモーターを収容するDNA断片が提供され、前記DNA断片は、2001年2月6日にCBS109271号及びCBS109273号の番号でカビ培養物中央管理局(バーン、オランダ)にそれぞれ寄託された、クローンpJB1178−21又はクローンpJB1178−43中に存在している。
【0011】
本発明によるDNA断片は、配列番号1のヌクレオチド1〜678又は配列番号2のヌクレオチド1〜644により表されるヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする。
本発明によるDNA断片は、配列番号8により表されるヌクレオチド配列又は配列番号9により表されるヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする。
【0012】
本発明は、配列番号10により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むこと;又は配列番号11により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片をさらに提供する。
【0013】
より特別には、本発明は、ヌクレオチド1、ヌクレオチド154、ヌクレオチド319、ヌクレオチド638、ヌクレオチド667、ヌクレオチド1402、ヌクレオチド1640、ヌクレオチド1802、ヌクレオチド1887、ヌクレオチド1919、ヌクレオチド1980、ヌクレオチド2203、ヌクレオチド2259、ヌクレオチド2407、ヌクレオチド2576、ヌクレオチド2598、ヌクレオチド2676、ヌクレオチド2871、ヌクレオチド2874、及びヌクレオチド3092からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり;そして、ヌクレオチド154、ヌクレオチド319、ヌクレオチド638、ヌクレオチド667、ヌクレオチド1402、ヌクレオチド1640、ヌクレオチド1802、ヌクレオチド1887、ヌクレオチド1919、ヌクレオチド1980、ヌクレオチド2203、ヌクレオチド2259、ヌクレオチド2407、ヌクレオチド2576、ヌクレオチド2598、ヌクレオチド2676、ヌクレオチド2871、ヌクレオチド2874、ヌクレオチド3092、及びヌクレオチド3108からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号8に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片を提供する。
【0014】
なお別の態様において、本発明は、ヌクレオチド1、ヌクレオチド1720、ヌクレオチド1889、ヌクレオチド1906、ヌクレオチド1991、ヌクレオチド2139、ヌクレオチド2375、ヌクレオチド2524、ヌクレオチド2585、及びヌクレオチド2634からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり;そして、ヌクレオチドヌクレオチド1720、ヌクレオチド1889、ヌクレオチド1906、ヌクレオチド1991、ヌクレオチド2139、ヌクレオチド2375、ヌクレオチド2524、ヌクレオチド2585、及びヌクレオチド2634、及びヌクレオチド2650からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号9に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片を提供する。
【0015】
本発明には、上記に記載されるような少なくとも1つのDNA断片と前記DNA断片の転写制御下に発現される少なくとも1つのDNA配列を転写の方向に含んでなるキメラDNA配列がさらに含まれ、ここで、発現されるDNA配列は、天然では該DNA断片の転写制御下にない。好ましくは、発現されるDNA配列は、選択マーカーをコードする。
【0016】
本発明は、上記のキメラDNA配列を含んでなるレプリコンをさらに提供する。
本発明にまた含まれるのは、こうしたレプリコン、特にpJB1178−21及びpJB1178−43を含有する微生物、上記のようなキメラDNA配列をそのゲノムへ取込んだ植物細胞、並びに前記細胞から本質的になる植物である。こうした植物は、双子葉植物でも単子葉植物でもよい。また、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、及び木部より選択される前記植物の部分も本発明の一部を形成する。
【0017】
本発明のさらなる側面によれば、植物の形質転換におけるキメラDNA配列の使用と、本発明によるDNA断片の一部若しくは変異体の、ハイブリッド調節DNA配列を作製するための使用が提供される。
【0018】
発明の詳細な説明
本発明は、主に、Brassica napus(アブラナ)において天然に存在するプロモーター又は調節配列に関する。これらのプロモーター又は調節配列の調節制御下にある遺伝子は、植物のカルス組織において優先的に発現されることが見出されている。
【0019】
特に、本発明のプロモーターは、2001年2月6日にCBS109271号及びCBS109273号の番号でカビ培養物中央管理局(バーン、オランダ)にそれぞれ寄託された、構築体pJB1178−21及びpJB1178−43中のgus::nptII遺伝子を推進するプロモーターである。
【0020】
はじめに、約600塩基対の配列をそれぞれの系(一本鎖)(pJB1178−21では配列番号1のヌクレオチド1〜678、そしてpJB1178−43では配列番号2のヌクレオチド1〜644)について決定し、BLASTN検索により解析した。これにより、1178−21系から単離した配列について、Arabidopsis(シロイヌナズナ)クローン、BACT22C5(2e-24)及び Brassica napus cDNAクローン、pMB68−4F(3e-19)との有意な相同性が明らかになった。このcDNAは、真菌病原体 L. maculans による感染後の Brassica napus の防御応答に関与している。相同配列の開始部分を図4に示す。1178−43系から単離した配列は、Arabidopsis クローン、BACF15L12(2e-12)と相同性を有し、これは予測されるDOF6ジンクフィンガー様タンパク質のプロモーター領域であることが示された。
【0021】
さらに、両方の構築体においてgus::nptII遺伝子を推進するプロモーターの全配列を配列決定し(配列番号8及び9)、対応する Arabidopsis 配列(それぞれ配列番号10及び11)と並置した。
【0022】
本発明のプロモーターのヌクレオチド配列は、機能性、即ちこのプロモーターの特異性に有意に影響を及ぼすことなく変異を受ける可能性があることが強調される。該プロモーターを変化させる可能性の1つは、その特異性に必要である要素を維持しながら、該プロモーターのある断片を欠失させることである。このことは、該プロモーターのいくつかの欠失突然変異体を作製し、それらを構築体においてレポーター遺伝子(例、gus遺伝子、又は Aequoria のGFP遺伝子のような、蛍光タンパク質をコードする遺伝子)に連結させること、及び前記構築体で形質転換した植物について発現試験を引き続き実施することによって達成することができる。従って、カルス特異的な発現を優先的に推進する、構築体pJB1178−21及びpJB1178−43のプロモーター配列の断片も本発明の一部である。
【0023】
さらに、構築体pJB1178−21及びpJB1178−43のプロモーター配列のヌクレオチドの置換又は付加によるヌクレオチド配列中のわずかな変化により生じるプロモーター配列も本発明に含まれる。他の植物の種にも、本発明の配列と同じ機能性を有する相同配列を見出すことが可能であると想定される。
【0024】
相同性又は同一性の度合いを決定する目的で核酸配列を比較するときには、BESTFIT及びGAP(いずれもウィスコンシン遺伝学コンピュータ・グループ(GCG)のソフトウェア・パッケージ)のようなプログラムが使用可能である。例えば、BESTFITは、2つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適アライメントを産生する。GAPは、配列の全長に沿ってそれを並置することを可能にし、いずれかの配列に適宜スペースを挿入することによって最適アライメントを見出す。好適には、本発明の文脈において核酸配列の相同性について論じる場合、この比較は、配列の全長に沿ったそのアライメントによりなされる。
【0025】
好ましくは、実質的な相同性を有する配列は、前記配列と、好ましさの増加する順に、少なくとも50%の配列相同性、望ましくは少なくとも70%の配列相同性、より望ましくは、少なくとも80%、90%、又は少なくとも95%の配列相同性を有する。ある事例において、配列相同性は99%又はそれより多い場合がある。
【0026】
望ましくは、用語「実質的な同一性」は、前記配列が、本明細書に記載の配列のいずれとも、先行技術の核酸配列より大きい度合いの同一性を有することを意味する。
用語「調節配列」又は「調節領域」及び「プロモーター」は、本明細書において交換可能的に使用される。
【0027】
さらに本発明は、本発明のDNA断片を含んでなるキメラDNA配列を提供する。本明細書において使用されるキメラDNA配列という表現には、天然には見出されないDNA配列を含んでなるどのDNA配列も含まれる。例えば、本明細書において使用されるキメラDNAには、植物ゲノムが通常は調節配列のコピーをその天然の染色体位置において含有するという事実にもかかわらず、前記植物ゲノムの非天然位置において誘導可能である前記調節配列を含んでなるDNAが含まれる。同様に、前記調節領域は、天然には見出されない植物ゲノムの部分の中へ、又は細菌プラスミド若しくはウイルスベクターのような、天然には見出されないレプリコン又はウイルス中に取込むことが可能である。本明細書において使用される用語「キメラDNA」は、宿主において複製可能であるDNA分子に限定されず、例えば特定のアダプター配列によって本発明による調節配列へ物理的に連結したレプリコンの中へ連結されることが可能なDNAも含まれる。調節配列は、その天然の下流オープンリーディングフレームへ連結してもしなくてもよい。
【0028】
その発現が本発明の調節領域により推進される遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゲノムライブラリーから導くことが可能である。この状況において、それは、本明細書によるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成するエクソンを分離する1つ以上のイントロンを含有してもよい。オープンリーディングフレームはまた、1つの中断されないエクソンによるか、又はcDNAにより、本発明によるタンパク質をコードするmRNAへコードされてもよい。本発明によるキメラDNA配列はまた、1つ以上のイントロンが人工的に除去又は付加されたものを含む。これら変異体のそれぞれが本発明に含まれる。
【0029】
本発明のプロモーターは、選択マーカーの発現を推進するのに特に有用である。形質転換実験における選択は主に組織培養の間になされるので、カルス組織における発現を優先的に示す本発明のプロモーターの発現特性は、特に適している。さらに、カルス組織におけるこの特異的な発現だけでなく、他の組織におけるより強くない発現も、選択マーカーを発現させるときに貴重である。なぜなら、形質転換体の選択に関与しない段階及び/又は組織におけるマーカーの発現も望ましいからである。
【0030】
宿主細胞において発現されることが可能であるためには、本発明による調節領域は、通常、転写開始領域(選択される宿主細胞において発現されることが可能などんな遺伝子からも好適に導いてもよい)、並びにリボソームの認識及び付着のための翻訳開始領域を伴って提供される。真核細胞において、発現カセットは、通常、前記オープンリーディングフレームの下流に位置し、転写を終結させ、一次転写物のポリアデニル化を起こさせる、転写終結領域も含む。また、よくあるように、遺伝子発現産物の亜細胞性コンパートメントへの標的化の原因となるシグナル配列をコードしてもよい。選択される宿主細胞においてキメラDNA構築体の発現を支配する原理は、一般に当業者に理解されている。さらに、発現可能なDNA構築体の構築は、原核性であれ真核性であれ、どの種類の宿主細胞でも今や定型的である。
【0031】
キメラDNA配列が宿主細胞において維持されるためには、それは通常、選択された宿主細胞により認識されて複製される、DNAへ連結した(本発明による)前記キメラDNA配列を含んでなるレプリコンの形態で提供される。従って、このレプリコンの選択は、選択される宿主細胞により主に決定される。特別に選択された宿主に適したレプリコンの選択を支配するような原理は、当業者の技術領域内にある。
【0032】
特定の種類のレプリコンは、それ自身、又はその一部を、植物細胞のような別の宿主細胞へ転移し、それによりその植物細胞へオープンリーディングフレームを同時転移することが可能なものである。そのような能力を有するレプリコンを本明細書ではベクターと呼ぶ。そのようなベクターの例はTiプラスミドベクターであり、これは、Agrobacterium tumefaciens(アグロバクテリウム=ツメファシエンス)のような好適な宿主中に存在する場合、それ自身の一部、いわゆるT−領域を植物細胞へ転移することが可能である。今日、様々な種類のTiプラスミドベクター(EP 0 116 718 B1を参照のこと)がキメラDNA配列を植物細胞又はプロトプラストへ転移するのに定型的に使用されていて、それから、前記キメラDNAをそのゲノムに安定的に取込む新規の植物を産生することが可能である。特に好ましいTiプラスミドベクターの形態は、(EP 0 120 516 B1及びUS4,940,838)に特許請求されるような、いわゆるバイナリーベクターである。本発明によるDNAを植物宿主の中へ導入するために使用可能である他の好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば二本鎖の植物ウイルス(例えば、CaMV)及び一本鎖ウイルス、ジェミニ(gemini)ウイルス、等から誘導可能なような非組込み植物ウイルスベクターから選択してもよい。そのようなベクターの使用は、植物宿主を安定的に形質転換することを困難である場合に特に有利であるかもしれない。木本の種、特に低木及びつる植物の場合がそうであるかもしれない。
【0033】
表現「本発明によるキメラDNA配列をそのゲノムに取込む宿主細胞」には、前記キメラDNAをそのゲノム中へ安定的に取込み、それによりキメラDNAを維持し、好ましくはそのようなキメラDNAのコピーを有糸分裂又は減数分裂を介して子孫細胞へ伝播するような細胞を含んでなるか又は本質的にそれからなる細胞及び多細胞生物が含まれる。本発明の好ましい態様によれば、前記キメラDNAの1つ以上のコピーをそのゲノム中へ取込む細胞から本質的になり、そして単数又は複数のコピーをその子孫へ好ましくはメンデル形式で伝播することが可能である植物が提供される。その植物の細胞のいくつか又は全部における本発明のキメラDNAの転写及び翻訳により、前記調節領域を含む細胞は、創傷に対して応答し、この調節領域の制御下にあるオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質を産生する。本発明の特定の態様において、このタンパク質は、病原体感染症への耐性を与えることが可能な抗病原性タンパク質であろう。
【0034】
当業者によく知られているように、植物遺伝子の調節配列は、遺伝子発現に関して興味深い特性を有する別個のサブ領域からなる。そのようなサブ領域の例には、転写のエンハンサーとサイレンサーが含まれる。これらの要素は、一般的な(構成的な)やり方でも、組織特異的な仕方でも作動してもよい。本発明による調節DNA配列において欠失を作製することが可能であり、このサブ断片について関連DNAの発現パターンを試験することが可能である。このように入手される様々なサブ断片、又はその組み合わせさえも、異種DNAの植物中の発現に関わる方法又は応用において有用であるかもしれない。本発明によるDNA配列の、機能性サブ領域、特にカルス組織特異的な発現を与えるサブ領域を同定するための使用と、植物における遺伝子発現を促進又は抑制するためのその後続の使用も本発明に含まれる。
【0035】
さらに、転写ターミネーター領域の使用は、植物細胞における転写の効率だけでなく信頼性を高めると一般に考えられている。故に、そのような領域の使用は、本発明の文脈において好ましい。
【0036】
本発明の応用は、Brassica 及びジャガイモにおける実施例のみを含有するが、その応用は、有利にも、特定の植物種に限定されない。どんな植物種も本発明によるキメラDNA配列で形質転換可能である。
【0037】
例えば、ある植物種は依然として遺伝形質転換へ抵抗するので、本発明の態様のいくつかは当面実施し得ないかもしれないが、そのような植物種における本発明の実施は、単に時間の問題なのであって、原理の問題なのではない。なぜなら、そのような遺伝形質転換に従うかどうかは本発明の根底となる態様に無関係だからである。
【0038】
植物種の形質転換は、今日、双子葉類並びに単子葉類の両方を含む、目覚しい数の植物種について定型的である。原則として、どの形質転換法を使用しても、本発明によるキメラDNAを好適な先祖細胞へ、その細胞が全植物へ再生されることが可能である限りは、導入することが可能である。好適には、方法は、プロトプラストについてのカルシウム/ポリエチレングリコール法(Krens, F. A. et al., Nature 296, 72-74, 1982; Negrutiu I. et al., Plant Mol. Biol. 8, 363-373, 1987)、プロトプラストのエレクトロポレーション(Shillito R. D. et al., Bio/Technol. 3, 1099-1102, 1985)、植物材料へのマイクロインジェクション(Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986)、様々な植物材料のDNA(又はRNA被覆)粒子射撃(Klein T. M. et al., Nature 327, 70, 1987)、(非組込み)ウイルスでの感染、等から選択してもよい。本発明による好ましい方法は、アグロバクテリウム仲介性DNA転移を含む。特に好ましいのは、EP A 120 516及び米国特許第4,940,838号に開示されるようないわゆるバイナリーベクター技術の使用である。さらに好ましい形質転換の方法は、Clough 及び Bent (1998) Plant J. 16: 735-743 により本質的に記載されるような、花浸漬(floral dip)法である。
【0039】
トマトの形質転換は、好ましくは、Van Roekel et al. (Plant Cell Rep. 12, 644-647, 1993) により本質的に記載される通りである。ジャガイモの形質転換は、好ましくは、Hoekema et al. (Hoekema, A. et al., Bio/Technology 7, 273-278, 1989) により本質的に記載される通りである。
【0040】
一般には、形質転換の後で、本発明によるタンパク質をコードする核酸配列と同時転移される、植物発現可能遺伝子によりコードされる1つ以上のマーカーの存在について植物細胞又は細胞群を選択し、その後で、形質転換された材料を全体植物へ再生させる。
【0041】
遺伝形質転換に対してややより抵抗性であるとみなされるものの、単子葉植物は形質転換に従い、形質転換された細胞若しくは胚、又は他の植物材料から、繁殖力のあるトランスジェニック植物を再生することが可能である。今のところ、単子葉植物の形質転換に好ましい方法は、胚、外植片又は懸濁細胞の微小発射体射撃、及び直接のDNA取込み又はエレクトロポレーションである(Shimamoto et al., Nature 338, 274-276, 1989)。トランスジェニックトウモロコシ植物は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(除草剤のホスフィノトリシンを不活性化する酵素)をコードする、Streptomyces hygroscopius のbar遺伝子を、微小発射体射撃によりトウモロコシ懸濁培養物の胚性細胞中へ導入することによって入手された(Gordon-Kamm, Plant Cell, 2, 603-618, 1990)。小麦及び大麦のような他の単子葉作物のアリューロンプロトプラスト中への遺伝物質の導入が報告されている(Lee, Plant Mol. Biol. 13, 21-30, 1989)。加齢した密集性かつ結節性胚性カルス組織だけを胚性懸濁培養物の確立のために選択することによって、胚性懸濁培養から小麦植物が再生された(Vasil, Bio/Technol. 8, 429-434, 1990)。上記作物についての形質転換系と組み合わせることにより、本発明を単子葉植物へ適用することが可能になる。
【0042】
イネやトウモロコシのような商業的に重要な作物を含む単子葉植物も、アグロバクテリウム系によるDNA転移に従う(WO94/00977;EP 0 159 418 B1;Gould J. et al., Plant. Physiol. 95, 426-434, 1991 を参照のこと)。
【0043】
DNA転移と再生に続き、例えば本発明によるキメラDNAの存在、コピー数、及び/又はゲノム組織をモニターするためにサザン分析を使用して、推定的に形質転換された植物を評価してもよい。追加的に、又は代替的に、当業者によく知られた技術であるノーザン及び/又はウェスタン分析を使用して、新規に導入されたDNAの発現レベルを保証してもよい。
【0044】
こうした評価に続き、形質転換植物を直ちに成長させてもよいが、通常は、新たな変異系の品種改良や雑種等の創製における親系としてそれらは使用可能である。
1つ以上のキメラ遺伝子を構成的に発現することが可能なトランスジェニック植物を得るために、以下を含むいくつかの代替法が利用可能である:
A.選択可能マーカー遺伝子へ物理的に共役したいくつかの修飾遺伝子とともに、DNA、例えばT−DNAをバイナリープラスミドで使用すること。この方法の利点は、キメラ遺伝子が物理的に共役しているので、単一メンデル遺伝子座として移動することである。
【0045】
B.好ましくは選択可能マーカー遺伝子へ共役した1つ以上のキメラ遺伝子を発現することがすでに可能なトランスジェニック植物のそれぞれを、別の選択可能マーカーへ共役した1つ以上のキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック植物由来の花粉と交差授粉させること。この交雑により得られる種子は、2つの選択可能マーカーの存在に基づいてか、又はキメラ遺伝子それ自身の存在に基づいて選択可能である。次いで、選択された種子から得られる植物は、さらなる交雑のために使用可能である。原則として、キメラ遺伝子は単一遺伝子座にはないので、この遺伝子は、独立した遺伝子座として分離する場合がある。
【0046】
C.いくつかの複数のキメラDNA分子、例えば、1つ以上のキメラ遺伝子と選択可能マーカーをそれぞれ有するプラスミドの使用。同時形質転換の頻度が高ければ、ただ1つのマーカーに基づいた選択で十分である。他の場合には、1つより多いマーカーに基づいた選択が好ましい。
【0047】
D.第一、第二、等のキメラ遺伝子をすでに含有するトランスジェニックプラスミドを、場合により選択可能マーカー遺伝子を含んでなる新規キメラ遺伝子で連続的に形質転換すること。方法Bと同じように、キメラ遺伝子は、原則として、単一遺伝子座にはなく、故にキメラ遺伝子は、独立した遺伝子座として分離する場合がある。
【0048】
E.上記戦略の組み合わせ。
実際の戦略は、親系の目的(直ちに成長させること、品種改良プログラムにおける使用、雑種を産生するための使用)のような、いくつかの容易に決定される考察に依存する場合がある。実際の戦略は、記載の発明に関して決定的ではない。
【実施例】
【0049】
概論
植物材料
記載するすべての形質転換実験は、Brassica napus 変種「Westar」の胚軸切片を用いて実施した。組織培養条件は、本質的に、Bade 及び Damn(1995年、「植物への遺伝子導入」;Potrykus, I.; Spangenberg, G. 監修、Springer Verlag: ベルリン中、32−38頁)に記載される通りとした。種子の産生又は染色体DNA単離のために、トランスジェニック植物を温室の鉢(直径15cm)において以下の条件で成長させた:21〜24℃,60〜80%の湿度、及び16時間の明期。
【0050】
形質転換実験に使用したジャガイモ材料は、Solanum tuberosum 変種「Desiree」由来の in vitro 茎外植片であった。
菌株
大腸菌(Escherichia coli)株のDH5α(クローンテク)及びDH10B(クローンテク)を菌クローニングに使用した。プラスミドの種類により、カルベニシリン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)、又はスペクチノマイシン(50mg/L)を補充したLB培地において、37℃で菌株を増殖させた。非腫瘍原性ノパリンTi−ヘルパープラスミドをC58染色体バックグラウンド中に収容する Agrobacterium tumefaciens 株のMOG301(Hood et al., 1993, Transgenic Research 2: 208-218)を、カナマイシン(100mg/L)及びリファンピシン(20mg/L)を補充したLB培地において29℃で増殖させた。
【0051】
プラスミド構築
構築体pMOG22は、Goddijn et al. (1993, Plant Journal 4(5): 863-873) により記載された。ベクターpMOG448を2つの工程で作製した。第一の工程において、p35SGUS.INT(Vancanneyt et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 245-250)のHindIII 35S−gusイントロン断片をpMOG22中へクローニングした。次いで、pGH1(Haughn et al., 1988, Molecular and General Genetics 211: 266-271)の5.8kb XbaI断片を、hpt及びgus−イントロン部分の間にクローニングした。この特別な断片は突然変異体の Arabidopsis(シロイヌナズナ)アセト乳酸シンターゼ遺伝子(csr−1)を含有し、これが除草剤クロルスルフロンへの耐性を与える。突然変異体als遺伝子のコード領域には、それ自身の5’(2.5kb)及び3’(1.3kb)調節配列が依然として付随する。
【0052】
タグ付け(tagging)構築体pMOG1178と対照のpMOG964は、プラスミドレスキュー特性を含有する(Koncz et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 8467-8471)が、Brassica napus 形質転換プロトコールにおける適用では特にいくつかの修飾を作製した。アグロバクテリウムを制御するための抗生物質としてのカルベニシリンの定型的な使用により、amp遺伝子の機能性を壊して、その代わりにスペクチノマイシン耐性遺伝子を加えることを決定した。この構築体を以下のように作製した。
【0053】
pUC9(Vieira 及び Messing, 1982, Gene 19: 259-268)中のEcoRI部位を、オリゴLS216(5’AATTAGATCT3’)(配列番号3)から作製したアダプターを挿入することによって修飾した。次いで、このBglII部位を、プラスミドCel369(未公表、ライデン大学)から単離した細菌のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有する3kb BamHI断片の挿入に使用した。amp耐性遺伝子を、AvaIIを用いた部分消化により壊した。スペクチノマイシンへの耐性とカルベニシリンへの感受性で陽性クローンを選択した。
【0054】
p35S−gus::nptII−tnos融合遺伝子(Datla et al., 1991, Gene 101: 239-246)を、pBI426(Charest et al., 1993, Plant Cell Reports 12: 189-193)からのHindIII−BglII断片として単離し、我々のスペクチノマイシンベクターへ導入し、これをHindIII及びBamHIで消化した。この中間ベクターを、HindIIIを用いて線状にし、バイナリーベクターpMOG22中にクローニングし、pMOG964と命名した。
【0055】
上記中間ベクターのHindIII部位を、プライマーのSV5(5’−AGCTCACGAATTCTCAGG−3’)(配列番号4)及びSV6(5’−AGCTCCTGAGAATTCGTG−3’)(配列番号5)から作製したアダプターを使用してEcoRIへ変化させた。生じたベクターをBstBI及びEcoRIで消化し、同様に消化したタグ付けベクターpMOG553(Goddijn et al., 1993; EMBLデータベース、寄託番号X84105)へ連結した。このようにして、pMOG553中の1038塩基対のストレッチを、右境界配置(gus−イントロン及びオクトピン境界)を改変することなく、約8kbの新規配列に置き換えた。この新規ベクターpMOG1178は、大腸菌において、所望される配向では不安定に見えた。そこで、最終のクローニング工程は、アグロバクテリウムにおいて実施した。
【0056】
トランスジェニック系の1178−21、29、及び43から、プラスミドレスキュー(以下参照)により構築体pJB1178−21、pJB1178−29、及びpJB1178−43をそれぞれ入手した。これらのマルチコピープラスミドを線状にし(EcoRI)、pMOG22中の断片としてクローニングし、バイナリーベクターのpJBbin1178−21、pJB1178−29、及びpJBbin1178−43をそれぞれ生じた。エレクトロポレーション(プロトコール、ギブコBRL)を使用して、バイナリーベクターをアグロバクテリウム株のMOG301に導入した。
【0057】
植物形質転換
Bade 及び Damn(1995年、「植物への遺伝子導入」;Potrykus, I.; Spangenberg, G. 監修、Springer Verlag: ベルリン中、32−38頁)により記載される方法に従って、胚軸切片を形質転換した。以下のようにわずかな変更を含めた。カルス誘導培地(CIM)からキネチンを割愛し、再生培地(SIM)へNAA(0.1mg/L)を加えた。選択剤としてのカナマイシンの濃度は15mg/Lであった。再生培地のスクロースレベルを10g/Lまで下げ、野生型とトランスジェニックカルスとの可視コントラストを高めた。苗条の伸長は非選択培地(SEM)で行った。産生された植物のトランスジェニック性は、ヒグロマイシン(5mg/L)含有培地(SEM)に根付かせることによって確かめた。
【0058】
ジャガイモの in vitro 茎外植片を、アグロバクテリウム接種の1日前に単離した。液体カルス誘導培地(MS塩、B5ビタミン群、スクロース 30g/l、ゼアチンリボシド 0.5mg/l、及び2,4−D 1.0mg/l)中でそれらを培養した。アグロバクテリウム接種(OD600 0.2,20分)の後で、固化したカルス誘導培地(寒天 8g/l)で外植片を2日間共培養し、引き続き、再生培地(MS塩、B5ビタミン群、スクロース 30g/l、セフォタキシム 200mg/l、バンコマイシン 100mg/l、及びゼアチンリボシド 3.0mg/l)へ移した。形質転換から約1週後、ヒグロマイシン(10mg/l)又はカナマイシン(100mg/l)を補充した新鮮な再生培地へ外植片を移した。この培地は、2週ごとに補給した。8週後に苗条を採取し、選択根付け培地(1/2濃度のMS塩、1/2濃度のB5ビタミン群、スクロース 10g/l、IBA 0.1mg/l、及びヒグロマイシン 5mg/l)に置いた。
【0059】
gus組織化学アッセイ
Jefferson et al. (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405) により記載されるような組織化学分析を使用して、トランスジェニック系の異なる植物部分のGUS活性を検討した。in vitro 及び in vivo 植物のサンプルを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸−シクロヘキシルアンモニウム塩(0.5mg/l);Na−P−緩衝液(50mM pH7);Na2−EDTA(5mM pH8.0);Triton X−100(0.05% v/v);フェロシアン化カリウム(0.5mM);フェリシアン化カリウム(0.5mM)を含有する溶液において5分間真空濾過した。サンプルを37℃で3時間インキュベートし、引き続き、エタノール(70%)で洗浄することによって葉緑素を取り除いた。青い染色の強度に基づいて、GUS活性の分類(0〜5=なし〜非常に高い)を行った。
【0060】
カルス誘導アッセイ
in vitro 植物の小葉ディスク(5*5mm)を、2,4−D(1mg/l)を補充した再生培地(SIM)上に、軸側を上にして置いた。培地中のスクロースレベルは10g/Lに保った。3週間の培養の後で、切断先端に新たな緑のカルスが生じ、完全な外植片をGUS活性について組織化学的に染色した。
【0061】
オーキシン誘導アッセイ
in vitro 植物の節切片を、NAA(0.1mg/L)を補充するか又は補充しないホルモンフリー培地(SEM)で二次培養した。3週間の後で新たな葉と根が生じた。この時点で、完全な植物をGUS活性について組織化学的に染色した。
【0062】
PCR分析
Thompson 及び Henry (1995) により記載されるようなDNAサンプル調製法を使用するPCRにより、トランスジェニック植物を分析した。in vitro 成長させた苗木から小葉切片(±2mm2)を取り、ミクロ遠心分離管(1.5mL)に密封し、液体窒素中で凍結させた。20マイクロリットルの抽出緩衝液(100mM TrisHCl pH9.5;1M KCl;10mM EDTA)を加え、サンプルを95℃で10分間加熱した。氷上で冷やした後で、サンプルは直に使用するか、又は使用まで4℃で保存した。PCRプライマーは:5’−GTGACATCTCCACTGACGTAAG−3’(35S−P4)(配列番号6)及び5’−CGAACTGATCGTTAAAACTGCC−3’(SQ−GUS−192)(配列番号7)であった。プライマーアニーリング部位を図1に示す。5’95℃,5’55℃,5’72℃の1回のPCRサイクルの後に、1’95℃,1’55℃,1’72℃の30サイクルを続けた。最終サイクルは、1’95℃,1’55℃,10’72℃で行った。反応量は50μlであり、1μlのDNAサンプル、Taq緩衝液、1.5mM MgCl2、2*25ピコモルのプライマー、200μM dNTP、及び2.5ユニットの白金Taqポリメラーゼを含有した。アガロースゲルでの電気泳動を使用してPCRサンプルを分析した。
【0063】
プラスミドレスキュー
個別トランスジェニック系の約5μgのEcoRI消化ゲノムDNAを25μlのH2Oに溶かした。5μlのT4リガーゼ(ギブコBRL)、60μlのT4リガーゼ緩衝液、及び210μlのH2Oを加え、この混合物を14℃で20時間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出法(Sambrook et al. 1989,「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular cloning: A laboratory manual)」第2版;コールドスプリングハーバーラボラトリープレス:ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)を使用して連結DNAを1回洗浄し、その後で10μlのTEに溶かした。この溶液の1μlを、Cellポレーター(porator)システム(ギブコBRL)を使用する1つのサンプルのDH10Bエレクトロマックス(electromax)(ギブコBRL)コンピテント細胞のエレクトロポレーションに使用した。製造業者により提案されるような設定を使用した。SOC培地での1時間の回復の後で、細胞をスピンダウンさせ、100μl LBに溶かし、スペクチノマイシン(50mg/L)を含有するLBプレートでプレート培養した。37℃で24〜48時間のインキュベーションの後で、コロニーが見えるようになった。プレート上と液体LB(スペクチノマイシン 50mg/L)中での個別コロニーの二次培養を使用して、レスキューしたクローンの真の耐性を確認した。
【0064】
配列決定
gus::nptII遺伝子から植物ゲノムへの遷移ゾーンを、ABI配列決定キット(Prism BigDye Terminator Cycle)と単一プライマーとしての5’−CGAACTGATCGTTAAAACTGCC−3’(SQ−GUS−192)(配列番号7)を使用して配列決定した。レスキューされたプラスミド若しくはバイナリーベクターを鋳型DNAとして使用した。製造業者により提案される条件を適用した。約500〜600bpの配列を決定した。BLASTNコンピュータ検索を使用して配列データを解析した。
【0065】
実施例1 タグ付け構築体を用いた Brassica の形質転換
Brassica napus の胚軸外植片をタグ付け構築体pMOG1178(図1)で形質転換し、耐性細胞クラスターと非トランスジェニック組織とを区別する最低濃度である15mg/Lのカナマイシンを含有する培地に置いた。形質転換実験においては、この外植片の部分をヒグロマイシン含有培地に置いて、35S−hptカセットの発現について選択した。ヒグロマイシン耐性カルスが得られる頻度を、特定の実験におけるT−DNA組込みの効力の尺度として使用した。構築体pMOG448(図1)を、カナマイシン選択の陰性対照として使用した。同一の構築体と構築体pMOG964(図1)を、ヒグロマイシン選択の陽性対照として使用した。後者の構築体はまた、カナマイシン選択の陽性対照としても使用した。
【0066】
一連の15回の形質転換実験から、3回の典型的なタグ付け実験の結果を表1に示す。pMOG1178を用いた形質転換の後でヒグロマイシン耐性カルスが生じる頻度(耐性カルスの数/外植片*100%)は、55〜99パーセントに及んだ。陽性対照のpMOG448及びpMOG964のカルス頻度は、37〜66%に及んだ。カナマイシン選択の後で、陰性対照のpMOG448のカルス頻度は0であった。陽性対照pMOG964で得られる頻度は81〜119%であった。タグ付け構築体pMOG1178で形質転換した外植片では、低いがかなりの数(1.4〜3.5%)のカナマイシン耐性カルスが産生された。
【0067】
相対タグ付け頻度は、あるタグ付け実験内でのカナマイシン及びヒグロマイシン耐性カルス形成間の比率である。この数は、カルス組織において活性であるゲノムプロモーター配列の後方に組込まれたT−DNAインサートの画分(fraction)を表す。相対タグ付け頻度は、異なる実験の間で2.6〜3.8%に及んだ。
【0068】
【表1】
【0069】
すべてのタグ付け実験から87のカナマイシン耐性カルスを得た。全部で36のカルスが上首尾に再生した。このカルス再生頻度(41%)は、通常得られる範囲内にある。苗条原基を単離し、カナマイシンのない培地で二次培養した。この非選択工程を使用して、分化の後でnptIIの発現が制限されているか又は皆無であるタグ系を生育させた。36の再生植物のうち20が、ヒグロマイシン(5mg/l)含有培地で正常な根形成を示したが、このことは、35S−hptカセットの根における発現を示した。この観察により、プロモーターのないgus::nptIIタグ付け構築体がカナマイシン選択を介して上首尾に導入されることが確かめられた。ヒグロマイシン感受系は以降の分析から除外した。
【0070】
実施例2 分化した植物組織におけるGUS活性
35S−gus::nptII構築体(pMOG964)を含有するカナマイシン耐性の対照植物は、高レベルの構成的GUS活性を示した(データ示さず)。従って、このトランスジェニックgus::nptIIタグ系は、タグ付き(tagged)ゲノムプロモーターがある植物組織においてまだ活性であるときにGUS染色を示すと予測された。in vitro と温室で成長させた植物の葉、茎、及び根の組織を組織化学的にアッセイした(表2)。20系のうち15が、温室又は in vitro のいずれかの植物の1以上の部分において検出可能レベルの発現を示した。この青い染色は、通常非常に弱く、葉及び茎の葉脈組織にしばしば限定された。一般に、温室条件下での発現は in vitro 条件に比べて低かった。
【0071】
4つの系(1178−1、26、29、及び45)が葉、茎、及び根に中位〜高いレベルのGUS活性を示した。1つの系(1178−26)だけが土壌へ移した後でも高い構成的な発現パターンを示した。一部の苗条(1178−2及び30)又は根の分裂組織(1178−21、29、33、43、及び45)において亢進された発現が観察された。
【0072】
再誘導カルスにおけるGUS活性
対照として、一組の分析を行って、再誘導カルスにおけるGUS酵素活性を検討した。元のプロモーターのないgus::nptII挿入がカナマイシン耐性カルスをもたらしたので、この相においてほとんどの系があるレベルのGUS活性を示すと予測された。2,4−D(1mg/l)を補充した苗条誘導培地にすべての系の葉ディスクを置くと、この外植片の先端に緑色の非再生性カルスの形成が生じた。20系のうち18が、この2,4−D含有培地での14日間の培養の後で、検出可能レベルのGUS活性を示した。発現は、外植片の先端に新たに生じたカルス組織に主に局在化していた(図2a+b)。12の系(1178−2、5、10、11、18、21、22、30、37、40、43、及び45)で、外植片の残り部分に比べて、カルスにおいて相対的にアップレギュレートされた発現を見出した。検討した他の植物組織においては、検出可能な酵素レベルを見出さなかった(以下参照)。
【0073】
タグ系のT1胚軸切片を再生培地に置いたときも、カルスにおいてアップレギュレートされた発現を観察した(図2c+d)。
【0074】
【表2】
【0075】
オーキシン処置によりアップレギュレートされるGUS活性
T−DNA組込みは活発に転写されるゲノムの領域で起こると考えられ(Koncz et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 8467-8471)、今回の場合では、プロモーターのないgus::nptIIタグ付け構築体の組込みがオーキシン含有培地での培養(2,4−Dとの共培養とNAAでの選択)の間に起きたので、我々は、タグ付きプロモーターのオーキシンによるアップレギュレーションをチェックすることを望んだ。それぞれの系の少なくとも1つの節切片は、NAA(0.1mg/l)含有培地で増殖した。この培地で成長した苗木は、ホルモンフリー培地で成長した対照クローンと比べて、有意により多くてより太い根を生育させたが、他の点ではそれと同等であった。二次培養から4週後に組織化学GUSアッセイを実施した。6つの系(1178−5、18、21、33、43、及び45)が葉においてNAA誘導GUS活性を示した。このGUS発現データの概略を表2に提示する。2つのトランスジェニック系(1178−34及び1178−42)では、GUS染色が観察されなかった。
【0076】
実施例3 ゲノム「プロモーター」配列の単離
タグ付け構築体の上流にあるゲノム配列を実際に単離する前に、すべての系をPCRによりスクリーニングし、あり得るスクランブル状態のT−DNA挿入を検出した。35S−gusプライマーセットを使用して、2つの系(1178−1及び26)が、プロモーターのないgus::nptII遺伝子の上流に、おそらくは35S−hptカセットに由来する、35Sプロモーターの少なくとも一部を含有することを見出した。このことは、増幅した断片を配列決定することによって確認した(データ示さず)。これらの系は以降の分析から除外した。
【0077】
残る系のゲノムDNAをEcoRIで消化し(図1)、サザンブロッティング分析に使用した。単一のT−DNA挿入を1178−21、29、及び43の系に検出した。T−DNAの右境界断片は約12kbのサイズであったが(データ示さず)、このことはT−DNAとEcoRI制限部位との間に±3kbのゲノム配列が存在することを示す。他の系の結果は、EcoRI断片のサイズが非常に大きいために解釈することが困難であった。
【0078】
プラスミドレスキュー実験にも、消化したDNAを使用した。サザンブロットで観察された大きな断片サイズにもかかわらず、スペクチノマイシン耐性コロニーは容易に入手された。レスキューされたプラスミドを制限酵素解析によりチェックした。これらの解析は、プラスミドを線状化すると予測されるEcoRIを使用して行った。EcoRI+BamHIの二重消化を使用して、新たに単離したゲノム配列から元の9kbのT−DNA(ベクター)を分離した(図1)。単一コピーT−DNA系(1178−21、29、及び43)からのプラスミドレスキューは系内で同一のクローンを生じたが、他の系は2以上の異なる制限パターンを示した(データ示さず)。これらの異なる制限パターンは、異なるT−DNA挿入物のレスキュー断片を表した可能性がある。酵素の組み合わせで消化したレスキュープラスミドのいくつかの例を図3に示す。単一コピー系(1178−21、1178−29、及び1178−43)からレスキューしたプラスミドを示し、起源となるタグ系に従って命名する(pJB1178−21(=pMOG2001)、pJB1178−29(=pMOG2002)、及びpJB1178−43(=pMOG2003))。
【0079】
線状の断片(EcoRI)は、±11kb(クローン1)〜±40kb(クローン4及び5)のサイズに及ぶ。単一コピーT−DNA系(pJB1178−21、pJB1178−29、及びpJB1178−43)からのプラスミドの断片サイズ(±12kb)は、サザンブロッティングにより得られた結果(上記参照)に一致する。ある事例では(クローン7、9、及び11)、レスキューされたプラスミドをEcoRI消化により線状化することが不可能であると見られた。明らかに、EcoRI部位が壊れていた。二重消化を用いたレーンから、ほとんどのクローンが予測される9kbベクターのバンドを示すことが見られる(図3)。例外は、上記のようなEcoRI部位のないクローンとpJB1178−43である。他のクローンはいずれも、この9kb断片以外に、単離された植物DNAに由来する1〜3の他のバンドを含有する。
【0080】
3つの単一コピー系(1178−21、1178−29、及び1178−43)のそれぞれについて、gus::nptII遺伝子の上流にあるDNA配列を決定した。pMOG1178の元の右境界及びHindIII部位(図1)は、3つの系でいずれも存在していなかった(図4)。1178−43系では、BamHI部位(図1)ももはや存在していなかったが、このことは、EcoRI*BamHI消化の後で予測される9kb断片が非存在であることを説明する(上記参照)。
【0081】
タグ付き Brassica napus プロモーター配列の解析
1178−21系及び1178−43系のレスキューされた Brassica napus プロモーター配列(それぞれ、配列番号7及び配列番号8)を、Arabidopsis ゲノム配列(TIGR:www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/)に対するBLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402)検索に使用した。いずれの Brassica napus 配列にも、Arabidopsis ゲノムの特定部分に対する広範な相同性を見出した。タグ付け系の1178−21由来の3078bpの Brassica 配列は、Arabidopsis 第1染色体のBAC T22C5の領域と高い相同性を示す。この相同性は、9つのエクソンを有する予想(predicted)ORF T22C5.22(未知のタンパク質)を表す Arabidopsis BAC T22C5のほぼ全域をカバーする。Brassica 配列との相同性は、予想エクソンが位置する領域で最も強いが、相同性は、より限定されているが、(予想)イントロン領域でも存在する。Brassica 1178−21配列に相同な Arabidopsis 配列を配列番号9として収載する。Brassica タグ付け系の1178−43から単離した配列は、Arabidopsis 第5染色体のBAC F15L12に位置する領域に対して高い相同性を示す。この領域では、予想ORF F15L12.8(推定タンパク質)と予想ORF F15L12.10(ジンクフィンガー様タンパク質)との間で、単離された Brassica 配列全体の長さにわたり相同性が見出される。この領域は、Arabidopsis 第5染色体のORF F15L12.10のプロモーター領域に類似する。Brassica napus プロモーター1178−43に相同なこの Arabidopsis 配列を配列番号10として収載する。予想F15L12.10の遺伝子は、Dof6ジンクフィンガー様転写因子に類似したジンクフィンガー様タンパク質を表す。
【0082】
Arabidopsis thaliana 生態型 Columbia と Brassica napus 変種 Westar の染色体領域間に見出される広範な相同性は、これらの近縁植物種間に高いレベルのゲノム共直線性があることを示す。
【0083】
両方のプロモーター配列を、オーキシン誘導性、病原体誘導性(植物防御ホルモン応答性)、及び構成的な遺伝子発現において調節的な役割を担うことが知られているプロモーターモチーフの存在について解析した。いずれのプロモーターもカルス組織において非常に活性であり、オーキシン処置へ応答する。この証明されたプロモーター活性の近くには、これら2つのプロモーター配列により推進される遺伝子発現の調節において病原体及び創傷への応答要素が関与する部分が存在している可能性がある。なぜなら、プロモーター捕捉実験において、創傷と A. tumefaciens 感染への曝露の間にそれらが同定されたからである。両方のプロモーターにおいて同定されたプロモーター要素を図6及び7に示す。ダイズGH3プロモーター(Ulmasov et al., Plant Cell 1995 Oct; 7(10): 1611-1623)のオーキシン応答性に必要とされるオーキシン応答要素(AuxREs)のコア配列(TGTCTC)を含有する要素が見出された。これらオーキシン応答要素の存在の近くには、RolB腫瘍遺伝子プロモーターに見出されるタバコDofタンパク質NtBBF1結合部位に同一の配列が、いずれのプロモーターにも存在する。NtBBF1は、おそらく、植物における組織特異的でオーキシン誘導性のRolB発現を仲介することに関わるタンパク質である(Baumann et al., Plant Cell 1999 March; 11(3):323-334)。Dofジンクフィンガータンパク質もオーキシン誘導性であると考えられている(Kang 及び Singh, Plant J. 2000; 21: 329-339)。病原体及び/又はストレス誘導性である遺伝子中に高頻度で存在する要素も両方のプロモーター配列において同定された。植物の転写因子のWRKYファミリーのメンバーへ結合することが可能であるW−ボックスモチーフが両方のプロモーター配列に存在する(それぞれ、8コピーと4コピー)。高頻度のW−ボックス配列(TTGACn)の存在は、病原体、エリシター(elicitor)、及びサリチル酸への応答性に関連している(Eulgem et al., Trends Plant Sci. 2000; 5(5): 199-206)。Lois et al. (EMBO J. 1989; 8(6): 1641-1648) 及び Fischer(学位論文、ホーヘンハイム大学、1994年)により記載されるようなH−ボックスコンセンサス(CCTAnC)に非常に似た配列が見出され、これらのボックスは、植物の最小プロモーターへマルチマーとして融合されると、真菌エリシター及び創傷に誘導される発現をもたらすことが知られている(Takeda et al., Plant J. 1999; 18(4): 383-393)。また、いわゆるG−ボックス調節モチーフ(CAmGTG,Loake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 9230-9234)と、植物ホルモンのエチレン(ethylene)(Ohme-Takagi 及び Shinshi, Plant Cell 1995 Feb; 77(2): 173-182)によりアップレギュレートされる遺伝子の5’上流領域に主に見出されるGCC−ボックス(AGCCGCC)に類似したボックスも同定された。S−ボックスは、非常に強いエリシター応答要素であり、非常に強い誘導能を与えることが可能である(WO00/29592)。両方のプロモーター融合物における転写開始部位をマップしなかったので、これらプロモーター中の推定TATAボックスの位置を予想することは依然として困難である。それでも、RNAポリメラーゼII結合部位として機能する可能性が非常に高い配列が存在している。
【0084】
実施例4 単離「プロモーター」−gus::nptIIプラスミドの評価
単一コピーT−DNA系(1178−21、29、及び43)からレスキューした3つのプラスミドをプロモーター活性のさらなる解析のために選択した。二重選択戦略を使用することによってバイナリーベクターを構築した。レスキュープラスミドの線状断片(EcoRI)を、バイナリーベクターのpMOG22(図1)の線状断片(EcoRI)と連結し、大腸菌へ形質転換した。カナマイシン及びスペクチノマイシン耐性についてコロニーを選択したところ、連結が成功したことを示した。しかしながら、ほとんどのバイナリーコロニーは、元の9kb EcoRI/BamHIベクター断片のサイズが低下したことで裏付けられるように(データ示さず)、ある欠失部分を含有するようであった。この新規バイナリーベクターのプロモーター−gus融合物の配列解析は、gus::nptII遺伝子のすぐ上流にゲノム配列が改変されずに存在していることを示した。
【0085】
レスキュープラスミドあたり3〜5のバイナリーベクターを選択した。この選択は、EcoRI及びBamHIを使用する予測制限パターンと最も似ていることに基づいた(データ示さず)。12のクローン(4*pJBBIN1178−21、5*pJBBIN1178−29、及び3*pJBBIN1178−43)をアグロバクテリウム株のMOG301へ導入し、引き続き、Brassica napus へ形質転換した。形質転換はいずれもそれぞれ±100の胚軸外植片を使用して同一2検体で行った。pMOG964及びpMOG1178(図1)での形質転換は、これらの実験において対照として役立った。形質転換から5日後、構築体につき約20の外植片を一過性GUS活性について評価した。12クローンのうち5つがヒグロマイシン耐性カルスにおいてGUS活性を示した。形質転換から3週後、1つの1178−43バイナリークローンを除くすべての形質転換体において、ヒグロマイシン耐性カルスが産生した。この時点で12クローンのうち8つがヒグロマイシン耐性カルスにおいてGUS活性を示した(図5)。特に、タグ系1178−21及び29由来のクローンは、組織化学GUSアッセイにおいて、暗青色の染色を示した。
【0086】
6つのバイナリーベクター(2*pJBBIN1178−21、2*pJBBIN1178−29、及び2*pJBBIN1178−43)をジャガイモの形質転換にも使用した。このうち4つが形質転換の後で早期に一過性のGUS活性を示した。6つのベクターのうち5つは、成長するヒグロマイシン耐性カルスにおいて安定したGUS活性を明らかにした。選択剤としてカナマイシンを使用する形質転換実験のために構築体につき約50のジャガイモ外植片を使用した。推定トランスジェニック苗条を採取し、ヒグロマイシン含有根付け培地にそれを置くことによってその真のトランスジェニック性を試験した。活性のある35S−hptカセットをゲノムに組込んだ苗条だけが正常な根系を産生するはずであった。形質転換した6つの構築体のうち5つが1以上のトランスジェニックジャガイモ系を産生した。形質転換頻度(トランスジェニック植物の数/外植片*100%)は、2〜11パーセントに及んだが、これは、陽性対照の構築体pMOG964で得られるレベル(5%)と同等である。
【0087】
初期の結果は、トランスジェニックジャガイモ系の葉サンプル中のGUS活性が0〜「相対的に高い」まで変動することを示した。トランスジェニック系の中には葉において低いGUS活性しか示さないものがあるが、このレベルは、葉外植片をカルス誘導培地に置くとアップレギュレートされる可能性があった(図5)。Brassica 及びジャガイモの形質転換結果の概略を表3に示す。
【0088】
【表3】
【0089】
【表4】
【0090】
【表5】
【0091】
【表6】
【0092】
【表7】
【0093】
【表8】
【0094】
【表9】
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】Brassica napus におけるプロモータータグ付けに使用する構築体中のT−DNA構造の概略図。どのバイナリーベクターも、pMOG22にあるように35S−hpt−nosカセットを含有する(Goddijn et al., 1993)。選択制御(+ヒグロマイシン、−カナマイシン)として、構築体pMOG448(3章)を使用した。構築体pMOG964が二重増強35Sプロモーターと組み合ったgus::nptII融合遺伝子(Datla et al., 1991)を含有するのに対し、タグ付け構築体pMOG1178は、同じコード領域のプロモーターのないバージョンを有する。gus::nptII遺伝子は、Vancanneyt et al. (1990) により記載されるようにgus部分にイントロンを含有する。プラスミドレスキュー特性としてスペクチノマイシン耐性とColE1複製起点を含める。アグロバクテリウムのカルベニシリンへの耐性を避けるために、アンピシリン遺伝子を壊す(Δ)。サザンブロット解析とプラスミドレスキュー実験に使用する制限部位(HindIII、EcoRI、及びBamHI)をマップする。波線は、右境界に隣接する植物ゲノムDNAを表す。LB:左境界、RB:右境界、p:プロモーター、t:転写終結配列、hpt:ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、als:アセト乳酸シンターゼ遺伝子、gus−1:GUSレポーター遺伝子+イントロン、nptII:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、spec:スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む3kb断片、Δamp:アンピシリン耐性遺伝子(非機能性)、ColE1:ColE1複製起点。
【図2】タグ付け構築体pMOG1178を含有するトランスジェニック Brassica napus 系の植物部分におけるGUSパターン。in vitro 葉切片又はT1胚軸外植片の上で誘導したカルスにおける高いGUS活性(A+B:1178−21系;C+D:1178−43系)。
【図3】レスキューされたプラスミドの制限解析。gus::nptIIタグ付け領域の上流にあるゲノム配列の11種の異なる断片を、プラスミドレスキューにより単離した(図1を参照のこと)。細菌培養物からDNAを単離し、EcoRI又はEcoRI+BamHIで消化し、アガロースゲルで分離した(1〜11のセット)。1kbマーカー(ギブコ−BRM)の位置を示す。3つの単一コピー系(1178−21、1178−29、及び1178−43)から単離したゲノム断片を、配列解析、バイナリーベクターの構築、及び野生型 Brassica napus への再形質転換に使用した。
【図4】タグ付け構築体pMOG1178と3つのトランスジェニック系(1178−21、1178−29、及び1178−43)中のgus::nptIIコード領域の上流にあるヌクレオチド配列の比較。T−DNA右境界、制限部位(HindIII及びBamHI)、及びgus::npyIIの開始コドン(ATG)に下線を施す。それぞれの系(一本鎖)について約600塩基対の配列を決定し、BLASTN検索により解析した。Arabidopsis の3つのBACクローンと Arabidopsis 及び B. napus のcDNAクローンとの相同性を見出した。相同配列の開始を示す(ダッシュ線)。
【図5】プロモーター活性を有する新規ゲノム配列により推進された、若いカルスのGUS活性。Brassica napus のゲノムに組込まれたgus::nptタグ付け遺伝子(pMOG1178,図1)の上流の断片をプラスミドレスキューにより単離し、バイナリーベクターpMOG22(35S−hpt−nos,図1)中でクローニングし、Brassica napus 胚軸外植片へ再形質転換させた(表3)。ヒグロマイシン含有培地での3週間の培養後に組織化学XGlu染色(24時間)を実施した。A:35S−gus::nptII対照構築体pMOG964の非常に高い発現;B:良好な発現(pJBBIN1178−21);C:良好な発現(pJBBIN1178−29);D:適度の発現(pJBBIN1178−43)。
【図6】1178−21プロモーターとプロモーター要素を含有する配列ボックスの略図。このボックスの説明については、実施例7を参照のこと。
【図7】1178−43プロモーターとプロモーター要素を含有する配列ボックスの略図。このボックスの説明については、実施例7を参照のこと。
【0001】
本発明は、新規の植物プロモーター、より特別には、カルス特異的プロモーターに関する。
【背景技術】
【0002】
本開示の文脈において、用語「プロモーター」又は「プロモーター領域」は、通常,構造遺伝子のコード配列に対して上流(5’)にあり、RNAポリメラーゼ及び/又は他の因子が正確な部位から転写を始めるのに必要とする認識を提供することによってコード領域の発現を制御する、DNAの配列を意味する。
【0003】
一般に、2つの種類のプロモーター、誘導プロモーター及び構成プロモーターが存在する。誘導プロモーターは、インデューサーに応答して1以上のDNA配列若しくは遺伝子の転写を直接的又は間接的に活性化することが可能であるプロモーターである。インデューサーの非存在下では、DNA配列又は遺伝子は転写されない。典型的には、誘導プロモーターへ特異的に結合して転写を活性化するタンパク因子は不活性型で存在し、次いで、それがインデューサーにより直接的又は間接的に活性型へ変換される。インデューサーは、化学薬剤;環境条件により引き起こされる生理学的ストレスであり得るか、又は植物の生育における変化に応答して内因的に産生される化合物であり得る。
【0004】
構成プロモーターは、植物の様々な部分全体で、そして植物の生育にわたって不断に、それが制御するDNA配列(遺伝子)の発現を指令する。しかしながら、本明細書で使用する用語「構成」は、ある遺伝子がすべての細胞種で同一のレベルで発現されることを必ずしも示すものではなくて、発生量においていくらかの変動がしばしば観察されるものの、この遺伝子が広範囲の細胞種において発現されることを示す。
【0005】
植物タンパク質の発現の分野における最も早期の最も重要な発明の1つは、異種遺伝子の強力かつ構成的な発現を提供する(植物)ウイルス及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)由来プロモーターのトランスジェニック植物における使用である。これらプロモーターのいくつかは植物遺伝学の研究にごく集中的に使用されてきて、依然として、迅速、簡略、及び低リスクの発現試験で選択されるプロモーターとなっている。最も有名なのは、すでに1984年(EP 0 131 623)に実践的に有用であることが判明した、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の35S及び19Sプロモーターと、ノパリンシンターゼ(nos)、マンノピンシンターゼ(mas)、及びオクトピンシンターゼ(ocs)のプロモーター(EP 0 122 791,EP 0 126 546,EP 0 145 338)のように、アグロバクテリウムのT−DNAにおいて見出し得るプロモーターである。類似の特徴を有する植物由来プロモーターは、ユビキチンプロモーター(EP 0 342 926)である。
【0006】
誘導プロモーターの特定の群は、組織若しくは生育特異的なプロモーターである。これらのプロモーターは、それが制御する遺伝子の発現を、唯一又は少数の群の組織において優先的に、又は植物のある生育段階の間に優先的に推進するという特性を有する。当然ながら、生育段階特異的である組織特異的なプロモーターも存在するものである。
【0007】
カルス組織において優先的に機能的であるプロモーターは、比較的稀である。こうしたカルス組織特異的プロモーターの貴重な応用は、選択可能マーカー遺伝子の推進にある可能性がある。植物形質転換の間、遺伝子導入(transgenics)の選択は、カルスが形成されてカルスが苗条及び/又は根組織へ分化する組織培養期の間に優先的になされる。従って、この段階で選択可能マーカーの発現が求められる。さらに、植物が成熟植物へ、そして成熟段階そのものにおいて生育しているときには、選択可能マーカーの発現はもはや何の役にも立たず、反生産的とさえみなされる場合がある。このアプローチの1例が、カルス優先性のアスパラガス(Asparagus)Aopr1−プロモーターを使用してnptII遺伝子の発現を推進した、Firek, S. et al. (1993, Plant Molecular Biology 22(1): 129-142) に明示されている。しかしながら、文献から利用可能なこの種の代替プロモーターの数は限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
故に、新規の植物由来カルス特異的プロモーターを提供することが本発明の目的である。
本発明によるプロモーターを含んでなるDNAの断片を提供することが本発明のさらなる目的である。
【0009】
本発明によるプロモーターを含んでなるトランスジェニック植物(又はその部分及び/又は種子)(前記トランスジェニック植物に由来する植物(又は植物の部分)及び種子が含まれる)を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、アブラナ(Brassica napus)植物から入手可能な優先的にカルス特異的なプロモーターを提供する。
本発明によれば、カルス特異的プロモーターを収容するDNA断片が提供され、前記DNA断片は、2001年2月6日にCBS109271号及びCBS109273号の番号でカビ培養物中央管理局(バーン、オランダ)にそれぞれ寄託された、クローンpJB1178−21又はクローンpJB1178−43中に存在している。
【0011】
本発明によるDNA断片は、配列番号1のヌクレオチド1〜678又は配列番号2のヌクレオチド1〜644により表されるヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする。
本発明によるDNA断片は、配列番号8により表されるヌクレオチド配列又は配列番号9により表されるヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする。
【0012】
本発明は、配列番号10により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むこと;又は配列番号11により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片をさらに提供する。
【0013】
より特別には、本発明は、ヌクレオチド1、ヌクレオチド154、ヌクレオチド319、ヌクレオチド638、ヌクレオチド667、ヌクレオチド1402、ヌクレオチド1640、ヌクレオチド1802、ヌクレオチド1887、ヌクレオチド1919、ヌクレオチド1980、ヌクレオチド2203、ヌクレオチド2259、ヌクレオチド2407、ヌクレオチド2576、ヌクレオチド2598、ヌクレオチド2676、ヌクレオチド2871、ヌクレオチド2874、及びヌクレオチド3092からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり;そして、ヌクレオチド154、ヌクレオチド319、ヌクレオチド638、ヌクレオチド667、ヌクレオチド1402、ヌクレオチド1640、ヌクレオチド1802、ヌクレオチド1887、ヌクレオチド1919、ヌクレオチド1980、ヌクレオチド2203、ヌクレオチド2259、ヌクレオチド2407、ヌクレオチド2576、ヌクレオチド2598、ヌクレオチド2676、ヌクレオチド2871、ヌクレオチド2874、ヌクレオチド3092、及びヌクレオチド3108からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号8に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片を提供する。
【0014】
なお別の態様において、本発明は、ヌクレオチド1、ヌクレオチド1720、ヌクレオチド1889、ヌクレオチド1906、ヌクレオチド1991、ヌクレオチド2139、ヌクレオチド2375、ヌクレオチド2524、ヌクレオチド2585、及びヌクレオチド2634からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり;そして、ヌクレオチドヌクレオチド1720、ヌクレオチド1889、ヌクレオチド1906、ヌクレオチド1991、ヌクレオチド2139、ヌクレオチド2375、ヌクレオチド2524、ヌクレオチド2585、及びヌクレオチド2634、及びヌクレオチド2650からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号9に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片を提供する。
【0015】
本発明には、上記に記載されるような少なくとも1つのDNA断片と前記DNA断片の転写制御下に発現される少なくとも1つのDNA配列を転写の方向に含んでなるキメラDNA配列がさらに含まれ、ここで、発現されるDNA配列は、天然では該DNA断片の転写制御下にない。好ましくは、発現されるDNA配列は、選択マーカーをコードする。
【0016】
本発明は、上記のキメラDNA配列を含んでなるレプリコンをさらに提供する。
本発明にまた含まれるのは、こうしたレプリコン、特にpJB1178−21及びpJB1178−43を含有する微生物、上記のようなキメラDNA配列をそのゲノムへ取込んだ植物細胞、並びに前記細胞から本質的になる植物である。こうした植物は、双子葉植物でも単子葉植物でもよい。また、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、及び木部より選択される前記植物の部分も本発明の一部を形成する。
【0017】
本発明のさらなる側面によれば、植物の形質転換におけるキメラDNA配列の使用と、本発明によるDNA断片の一部若しくは変異体の、ハイブリッド調節DNA配列を作製するための使用が提供される。
【0018】
発明の詳細な説明
本発明は、主に、Brassica napus(アブラナ)において天然に存在するプロモーター又は調節配列に関する。これらのプロモーター又は調節配列の調節制御下にある遺伝子は、植物のカルス組織において優先的に発現されることが見出されている。
【0019】
特に、本発明のプロモーターは、2001年2月6日にCBS109271号及びCBS109273号の番号でカビ培養物中央管理局(バーン、オランダ)にそれぞれ寄託された、構築体pJB1178−21及びpJB1178−43中のgus::nptII遺伝子を推進するプロモーターである。
【0020】
はじめに、約600塩基対の配列をそれぞれの系(一本鎖)(pJB1178−21では配列番号1のヌクレオチド1〜678、そしてpJB1178−43では配列番号2のヌクレオチド1〜644)について決定し、BLASTN検索により解析した。これにより、1178−21系から単離した配列について、Arabidopsis(シロイヌナズナ)クローン、BACT22C5(2e-24)及び Brassica napus cDNAクローン、pMB68−4F(3e-19)との有意な相同性が明らかになった。このcDNAは、真菌病原体 L. maculans による感染後の Brassica napus の防御応答に関与している。相同配列の開始部分を図4に示す。1178−43系から単離した配列は、Arabidopsis クローン、BACF15L12(2e-12)と相同性を有し、これは予測されるDOF6ジンクフィンガー様タンパク質のプロモーター領域であることが示された。
【0021】
さらに、両方の構築体においてgus::nptII遺伝子を推進するプロモーターの全配列を配列決定し(配列番号8及び9)、対応する Arabidopsis 配列(それぞれ配列番号10及び11)と並置した。
【0022】
本発明のプロモーターのヌクレオチド配列は、機能性、即ちこのプロモーターの特異性に有意に影響を及ぼすことなく変異を受ける可能性があることが強調される。該プロモーターを変化させる可能性の1つは、その特異性に必要である要素を維持しながら、該プロモーターのある断片を欠失させることである。このことは、該プロモーターのいくつかの欠失突然変異体を作製し、それらを構築体においてレポーター遺伝子(例、gus遺伝子、又は Aequoria のGFP遺伝子のような、蛍光タンパク質をコードする遺伝子)に連結させること、及び前記構築体で形質転換した植物について発現試験を引き続き実施することによって達成することができる。従って、カルス特異的な発現を優先的に推進する、構築体pJB1178−21及びpJB1178−43のプロモーター配列の断片も本発明の一部である。
【0023】
さらに、構築体pJB1178−21及びpJB1178−43のプロモーター配列のヌクレオチドの置換又は付加によるヌクレオチド配列中のわずかな変化により生じるプロモーター配列も本発明に含まれる。他の植物の種にも、本発明の配列と同じ機能性を有する相同配列を見出すことが可能であると想定される。
【0024】
相同性又は同一性の度合いを決定する目的で核酸配列を比較するときには、BESTFIT及びGAP(いずれもウィスコンシン遺伝学コンピュータ・グループ(GCG)のソフトウェア・パッケージ)のようなプログラムが使用可能である。例えば、BESTFITは、2つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適アライメントを産生する。GAPは、配列の全長に沿ってそれを並置することを可能にし、いずれかの配列に適宜スペースを挿入することによって最適アライメントを見出す。好適には、本発明の文脈において核酸配列の相同性について論じる場合、この比較は、配列の全長に沿ったそのアライメントによりなされる。
【0025】
好ましくは、実質的な相同性を有する配列は、前記配列と、好ましさの増加する順に、少なくとも50%の配列相同性、望ましくは少なくとも70%の配列相同性、より望ましくは、少なくとも80%、90%、又は少なくとも95%の配列相同性を有する。ある事例において、配列相同性は99%又はそれより多い場合がある。
【0026】
望ましくは、用語「実質的な同一性」は、前記配列が、本明細書に記載の配列のいずれとも、先行技術の核酸配列より大きい度合いの同一性を有することを意味する。
用語「調節配列」又は「調節領域」及び「プロモーター」は、本明細書において交換可能的に使用される。
【0027】
さらに本発明は、本発明のDNA断片を含んでなるキメラDNA配列を提供する。本明細書において使用されるキメラDNA配列という表現には、天然には見出されないDNA配列を含んでなるどのDNA配列も含まれる。例えば、本明細書において使用されるキメラDNAには、植物ゲノムが通常は調節配列のコピーをその天然の染色体位置において含有するという事実にもかかわらず、前記植物ゲノムの非天然位置において誘導可能である前記調節配列を含んでなるDNAが含まれる。同様に、前記調節領域は、天然には見出されない植物ゲノムの部分の中へ、又は細菌プラスミド若しくはウイルスベクターのような、天然には見出されないレプリコン又はウイルス中に取込むことが可能である。本明細書において使用される用語「キメラDNA」は、宿主において複製可能であるDNA分子に限定されず、例えば特定のアダプター配列によって本発明による調節配列へ物理的に連結したレプリコンの中へ連結されることが可能なDNAも含まれる。調節配列は、その天然の下流オープンリーディングフレームへ連結してもしなくてもよい。
【0028】
その発現が本発明の調節領域により推進される遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゲノムライブラリーから導くことが可能である。この状況において、それは、本明細書によるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成するエクソンを分離する1つ以上のイントロンを含有してもよい。オープンリーディングフレームはまた、1つの中断されないエクソンによるか、又はcDNAにより、本発明によるタンパク質をコードするmRNAへコードされてもよい。本発明によるキメラDNA配列はまた、1つ以上のイントロンが人工的に除去又は付加されたものを含む。これら変異体のそれぞれが本発明に含まれる。
【0029】
本発明のプロモーターは、選択マーカーの発現を推進するのに特に有用である。形質転換実験における選択は主に組織培養の間になされるので、カルス組織における発現を優先的に示す本発明のプロモーターの発現特性は、特に適している。さらに、カルス組織におけるこの特異的な発現だけでなく、他の組織におけるより強くない発現も、選択マーカーを発現させるときに貴重である。なぜなら、形質転換体の選択に関与しない段階及び/又は組織におけるマーカーの発現も望ましいからである。
【0030】
宿主細胞において発現されることが可能であるためには、本発明による調節領域は、通常、転写開始領域(選択される宿主細胞において発現されることが可能などんな遺伝子からも好適に導いてもよい)、並びにリボソームの認識及び付着のための翻訳開始領域を伴って提供される。真核細胞において、発現カセットは、通常、前記オープンリーディングフレームの下流に位置し、転写を終結させ、一次転写物のポリアデニル化を起こさせる、転写終結領域も含む。また、よくあるように、遺伝子発現産物の亜細胞性コンパートメントへの標的化の原因となるシグナル配列をコードしてもよい。選択される宿主細胞においてキメラDNA構築体の発現を支配する原理は、一般に当業者に理解されている。さらに、発現可能なDNA構築体の構築は、原核性であれ真核性であれ、どの種類の宿主細胞でも今や定型的である。
【0031】
キメラDNA配列が宿主細胞において維持されるためには、それは通常、選択された宿主細胞により認識されて複製される、DNAへ連結した(本発明による)前記キメラDNA配列を含んでなるレプリコンの形態で提供される。従って、このレプリコンの選択は、選択される宿主細胞により主に決定される。特別に選択された宿主に適したレプリコンの選択を支配するような原理は、当業者の技術領域内にある。
【0032】
特定の種類のレプリコンは、それ自身、又はその一部を、植物細胞のような別の宿主細胞へ転移し、それによりその植物細胞へオープンリーディングフレームを同時転移することが可能なものである。そのような能力を有するレプリコンを本明細書ではベクターと呼ぶ。そのようなベクターの例はTiプラスミドベクターであり、これは、Agrobacterium tumefaciens(アグロバクテリウム=ツメファシエンス)のような好適な宿主中に存在する場合、それ自身の一部、いわゆるT−領域を植物細胞へ転移することが可能である。今日、様々な種類のTiプラスミドベクター(EP 0 116 718 B1を参照のこと)がキメラDNA配列を植物細胞又はプロトプラストへ転移するのに定型的に使用されていて、それから、前記キメラDNAをそのゲノムに安定的に取込む新規の植物を産生することが可能である。特に好ましいTiプラスミドベクターの形態は、(EP 0 120 516 B1及びUS4,940,838)に特許請求されるような、いわゆるバイナリーベクターである。本発明によるDNAを植物宿主の中へ導入するために使用可能である他の好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば二本鎖の植物ウイルス(例えば、CaMV)及び一本鎖ウイルス、ジェミニ(gemini)ウイルス、等から誘導可能なような非組込み植物ウイルスベクターから選択してもよい。そのようなベクターの使用は、植物宿主を安定的に形質転換することを困難である場合に特に有利であるかもしれない。木本の種、特に低木及びつる植物の場合がそうであるかもしれない。
【0033】
表現「本発明によるキメラDNA配列をそのゲノムに取込む宿主細胞」には、前記キメラDNAをそのゲノム中へ安定的に取込み、それによりキメラDNAを維持し、好ましくはそのようなキメラDNAのコピーを有糸分裂又は減数分裂を介して子孫細胞へ伝播するような細胞を含んでなるか又は本質的にそれからなる細胞及び多細胞生物が含まれる。本発明の好ましい態様によれば、前記キメラDNAの1つ以上のコピーをそのゲノム中へ取込む細胞から本質的になり、そして単数又は複数のコピーをその子孫へ好ましくはメンデル形式で伝播することが可能である植物が提供される。その植物の細胞のいくつか又は全部における本発明のキメラDNAの転写及び翻訳により、前記調節領域を含む細胞は、創傷に対して応答し、この調節領域の制御下にあるオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質を産生する。本発明の特定の態様において、このタンパク質は、病原体感染症への耐性を与えることが可能な抗病原性タンパク質であろう。
【0034】
当業者によく知られているように、植物遺伝子の調節配列は、遺伝子発現に関して興味深い特性を有する別個のサブ領域からなる。そのようなサブ領域の例には、転写のエンハンサーとサイレンサーが含まれる。これらの要素は、一般的な(構成的な)やり方でも、組織特異的な仕方でも作動してもよい。本発明による調節DNA配列において欠失を作製することが可能であり、このサブ断片について関連DNAの発現パターンを試験することが可能である。このように入手される様々なサブ断片、又はその組み合わせさえも、異種DNAの植物中の発現に関わる方法又は応用において有用であるかもしれない。本発明によるDNA配列の、機能性サブ領域、特にカルス組織特異的な発現を与えるサブ領域を同定するための使用と、植物における遺伝子発現を促進又は抑制するためのその後続の使用も本発明に含まれる。
【0035】
さらに、転写ターミネーター領域の使用は、植物細胞における転写の効率だけでなく信頼性を高めると一般に考えられている。故に、そのような領域の使用は、本発明の文脈において好ましい。
【0036】
本発明の応用は、Brassica 及びジャガイモにおける実施例のみを含有するが、その応用は、有利にも、特定の植物種に限定されない。どんな植物種も本発明によるキメラDNA配列で形質転換可能である。
【0037】
例えば、ある植物種は依然として遺伝形質転換へ抵抗するので、本発明の態様のいくつかは当面実施し得ないかもしれないが、そのような植物種における本発明の実施は、単に時間の問題なのであって、原理の問題なのではない。なぜなら、そのような遺伝形質転換に従うかどうかは本発明の根底となる態様に無関係だからである。
【0038】
植物種の形質転換は、今日、双子葉類並びに単子葉類の両方を含む、目覚しい数の植物種について定型的である。原則として、どの形質転換法を使用しても、本発明によるキメラDNAを好適な先祖細胞へ、その細胞が全植物へ再生されることが可能である限りは、導入することが可能である。好適には、方法は、プロトプラストについてのカルシウム/ポリエチレングリコール法(Krens, F. A. et al., Nature 296, 72-74, 1982; Negrutiu I. et al., Plant Mol. Biol. 8, 363-373, 1987)、プロトプラストのエレクトロポレーション(Shillito R. D. et al., Bio/Technol. 3, 1099-1102, 1985)、植物材料へのマイクロインジェクション(Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986)、様々な植物材料のDNA(又はRNA被覆)粒子射撃(Klein T. M. et al., Nature 327, 70, 1987)、(非組込み)ウイルスでの感染、等から選択してもよい。本発明による好ましい方法は、アグロバクテリウム仲介性DNA転移を含む。特に好ましいのは、EP A 120 516及び米国特許第4,940,838号に開示されるようないわゆるバイナリーベクター技術の使用である。さらに好ましい形質転換の方法は、Clough 及び Bent (1998) Plant J. 16: 735-743 により本質的に記載されるような、花浸漬(floral dip)法である。
【0039】
トマトの形質転換は、好ましくは、Van Roekel et al. (Plant Cell Rep. 12, 644-647, 1993) により本質的に記載される通りである。ジャガイモの形質転換は、好ましくは、Hoekema et al. (Hoekema, A. et al., Bio/Technology 7, 273-278, 1989) により本質的に記載される通りである。
【0040】
一般には、形質転換の後で、本発明によるタンパク質をコードする核酸配列と同時転移される、植物発現可能遺伝子によりコードされる1つ以上のマーカーの存在について植物細胞又は細胞群を選択し、その後で、形質転換された材料を全体植物へ再生させる。
【0041】
遺伝形質転換に対してややより抵抗性であるとみなされるものの、単子葉植物は形質転換に従い、形質転換された細胞若しくは胚、又は他の植物材料から、繁殖力のあるトランスジェニック植物を再生することが可能である。今のところ、単子葉植物の形質転換に好ましい方法は、胚、外植片又は懸濁細胞の微小発射体射撃、及び直接のDNA取込み又はエレクトロポレーションである(Shimamoto et al., Nature 338, 274-276, 1989)。トランスジェニックトウモロコシ植物は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(除草剤のホスフィノトリシンを不活性化する酵素)をコードする、Streptomyces hygroscopius のbar遺伝子を、微小発射体射撃によりトウモロコシ懸濁培養物の胚性細胞中へ導入することによって入手された(Gordon-Kamm, Plant Cell, 2, 603-618, 1990)。小麦及び大麦のような他の単子葉作物のアリューロンプロトプラスト中への遺伝物質の導入が報告されている(Lee, Plant Mol. Biol. 13, 21-30, 1989)。加齢した密集性かつ結節性胚性カルス組織だけを胚性懸濁培養物の確立のために選択することによって、胚性懸濁培養から小麦植物が再生された(Vasil, Bio/Technol. 8, 429-434, 1990)。上記作物についての形質転換系と組み合わせることにより、本発明を単子葉植物へ適用することが可能になる。
【0042】
イネやトウモロコシのような商業的に重要な作物を含む単子葉植物も、アグロバクテリウム系によるDNA転移に従う(WO94/00977;EP 0 159 418 B1;Gould J. et al., Plant. Physiol. 95, 426-434, 1991 を参照のこと)。
【0043】
DNA転移と再生に続き、例えば本発明によるキメラDNAの存在、コピー数、及び/又はゲノム組織をモニターするためにサザン分析を使用して、推定的に形質転換された植物を評価してもよい。追加的に、又は代替的に、当業者によく知られた技術であるノーザン及び/又はウェスタン分析を使用して、新規に導入されたDNAの発現レベルを保証してもよい。
【0044】
こうした評価に続き、形質転換植物を直ちに成長させてもよいが、通常は、新たな変異系の品種改良や雑種等の創製における親系としてそれらは使用可能である。
1つ以上のキメラ遺伝子を構成的に発現することが可能なトランスジェニック植物を得るために、以下を含むいくつかの代替法が利用可能である:
A.選択可能マーカー遺伝子へ物理的に共役したいくつかの修飾遺伝子とともに、DNA、例えばT−DNAをバイナリープラスミドで使用すること。この方法の利点は、キメラ遺伝子が物理的に共役しているので、単一メンデル遺伝子座として移動することである。
【0045】
B.好ましくは選択可能マーカー遺伝子へ共役した1つ以上のキメラ遺伝子を発現することがすでに可能なトランスジェニック植物のそれぞれを、別の選択可能マーカーへ共役した1つ以上のキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック植物由来の花粉と交差授粉させること。この交雑により得られる種子は、2つの選択可能マーカーの存在に基づいてか、又はキメラ遺伝子それ自身の存在に基づいて選択可能である。次いで、選択された種子から得られる植物は、さらなる交雑のために使用可能である。原則として、キメラ遺伝子は単一遺伝子座にはないので、この遺伝子は、独立した遺伝子座として分離する場合がある。
【0046】
C.いくつかの複数のキメラDNA分子、例えば、1つ以上のキメラ遺伝子と選択可能マーカーをそれぞれ有するプラスミドの使用。同時形質転換の頻度が高ければ、ただ1つのマーカーに基づいた選択で十分である。他の場合には、1つより多いマーカーに基づいた選択が好ましい。
【0047】
D.第一、第二、等のキメラ遺伝子をすでに含有するトランスジェニックプラスミドを、場合により選択可能マーカー遺伝子を含んでなる新規キメラ遺伝子で連続的に形質転換すること。方法Bと同じように、キメラ遺伝子は、原則として、単一遺伝子座にはなく、故にキメラ遺伝子は、独立した遺伝子座として分離する場合がある。
【0048】
E.上記戦略の組み合わせ。
実際の戦略は、親系の目的(直ちに成長させること、品種改良プログラムにおける使用、雑種を産生するための使用)のような、いくつかの容易に決定される考察に依存する場合がある。実際の戦略は、記載の発明に関して決定的ではない。
【実施例】
【0049】
概論
植物材料
記載するすべての形質転換実験は、Brassica napus 変種「Westar」の胚軸切片を用いて実施した。組織培養条件は、本質的に、Bade 及び Damn(1995年、「植物への遺伝子導入」;Potrykus, I.; Spangenberg, G. 監修、Springer Verlag: ベルリン中、32−38頁)に記載される通りとした。種子の産生又は染色体DNA単離のために、トランスジェニック植物を温室の鉢(直径15cm)において以下の条件で成長させた:21〜24℃,60〜80%の湿度、及び16時間の明期。
【0050】
形質転換実験に使用したジャガイモ材料は、Solanum tuberosum 変種「Desiree」由来の in vitro 茎外植片であった。
菌株
大腸菌(Escherichia coli)株のDH5α(クローンテク)及びDH10B(クローンテク)を菌クローニングに使用した。プラスミドの種類により、カルベニシリン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)、又はスペクチノマイシン(50mg/L)を補充したLB培地において、37℃で菌株を増殖させた。非腫瘍原性ノパリンTi−ヘルパープラスミドをC58染色体バックグラウンド中に収容する Agrobacterium tumefaciens 株のMOG301(Hood et al., 1993, Transgenic Research 2: 208-218)を、カナマイシン(100mg/L)及びリファンピシン(20mg/L)を補充したLB培地において29℃で増殖させた。
【0051】
プラスミド構築
構築体pMOG22は、Goddijn et al. (1993, Plant Journal 4(5): 863-873) により記載された。ベクターpMOG448を2つの工程で作製した。第一の工程において、p35SGUS.INT(Vancanneyt et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 245-250)のHindIII 35S−gusイントロン断片をpMOG22中へクローニングした。次いで、pGH1(Haughn et al., 1988, Molecular and General Genetics 211: 266-271)の5.8kb XbaI断片を、hpt及びgus−イントロン部分の間にクローニングした。この特別な断片は突然変異体の Arabidopsis(シロイヌナズナ)アセト乳酸シンターゼ遺伝子(csr−1)を含有し、これが除草剤クロルスルフロンへの耐性を与える。突然変異体als遺伝子のコード領域には、それ自身の5’(2.5kb)及び3’(1.3kb)調節配列が依然として付随する。
【0052】
タグ付け(tagging)構築体pMOG1178と対照のpMOG964は、プラスミドレスキュー特性を含有する(Koncz et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 8467-8471)が、Brassica napus 形質転換プロトコールにおける適用では特にいくつかの修飾を作製した。アグロバクテリウムを制御するための抗生物質としてのカルベニシリンの定型的な使用により、amp遺伝子の機能性を壊して、その代わりにスペクチノマイシン耐性遺伝子を加えることを決定した。この構築体を以下のように作製した。
【0053】
pUC9(Vieira 及び Messing, 1982, Gene 19: 259-268)中のEcoRI部位を、オリゴLS216(5’AATTAGATCT3’)(配列番号3)から作製したアダプターを挿入することによって修飾した。次いで、このBglII部位を、プラスミドCel369(未公表、ライデン大学)から単離した細菌のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有する3kb BamHI断片の挿入に使用した。amp耐性遺伝子を、AvaIIを用いた部分消化により壊した。スペクチノマイシンへの耐性とカルベニシリンへの感受性で陽性クローンを選択した。
【0054】
p35S−gus::nptII−tnos融合遺伝子(Datla et al., 1991, Gene 101: 239-246)を、pBI426(Charest et al., 1993, Plant Cell Reports 12: 189-193)からのHindIII−BglII断片として単離し、我々のスペクチノマイシンベクターへ導入し、これをHindIII及びBamHIで消化した。この中間ベクターを、HindIIIを用いて線状にし、バイナリーベクターpMOG22中にクローニングし、pMOG964と命名した。
【0055】
上記中間ベクターのHindIII部位を、プライマーのSV5(5’−AGCTCACGAATTCTCAGG−3’)(配列番号4)及びSV6(5’−AGCTCCTGAGAATTCGTG−3’)(配列番号5)から作製したアダプターを使用してEcoRIへ変化させた。生じたベクターをBstBI及びEcoRIで消化し、同様に消化したタグ付けベクターpMOG553(Goddijn et al., 1993; EMBLデータベース、寄託番号X84105)へ連結した。このようにして、pMOG553中の1038塩基対のストレッチを、右境界配置(gus−イントロン及びオクトピン境界)を改変することなく、約8kbの新規配列に置き換えた。この新規ベクターpMOG1178は、大腸菌において、所望される配向では不安定に見えた。そこで、最終のクローニング工程は、アグロバクテリウムにおいて実施した。
【0056】
トランスジェニック系の1178−21、29、及び43から、プラスミドレスキュー(以下参照)により構築体pJB1178−21、pJB1178−29、及びpJB1178−43をそれぞれ入手した。これらのマルチコピープラスミドを線状にし(EcoRI)、pMOG22中の断片としてクローニングし、バイナリーベクターのpJBbin1178−21、pJB1178−29、及びpJBbin1178−43をそれぞれ生じた。エレクトロポレーション(プロトコール、ギブコBRL)を使用して、バイナリーベクターをアグロバクテリウム株のMOG301に導入した。
【0057】
植物形質転換
Bade 及び Damn(1995年、「植物への遺伝子導入」;Potrykus, I.; Spangenberg, G. 監修、Springer Verlag: ベルリン中、32−38頁)により記載される方法に従って、胚軸切片を形質転換した。以下のようにわずかな変更を含めた。カルス誘導培地(CIM)からキネチンを割愛し、再生培地(SIM)へNAA(0.1mg/L)を加えた。選択剤としてのカナマイシンの濃度は15mg/Lであった。再生培地のスクロースレベルを10g/Lまで下げ、野生型とトランスジェニックカルスとの可視コントラストを高めた。苗条の伸長は非選択培地(SEM)で行った。産生された植物のトランスジェニック性は、ヒグロマイシン(5mg/L)含有培地(SEM)に根付かせることによって確かめた。
【0058】
ジャガイモの in vitro 茎外植片を、アグロバクテリウム接種の1日前に単離した。液体カルス誘導培地(MS塩、B5ビタミン群、スクロース 30g/l、ゼアチンリボシド 0.5mg/l、及び2,4−D 1.0mg/l)中でそれらを培養した。アグロバクテリウム接種(OD600 0.2,20分)の後で、固化したカルス誘導培地(寒天 8g/l)で外植片を2日間共培養し、引き続き、再生培地(MS塩、B5ビタミン群、スクロース 30g/l、セフォタキシム 200mg/l、バンコマイシン 100mg/l、及びゼアチンリボシド 3.0mg/l)へ移した。形質転換から約1週後、ヒグロマイシン(10mg/l)又はカナマイシン(100mg/l)を補充した新鮮な再生培地へ外植片を移した。この培地は、2週ごとに補給した。8週後に苗条を採取し、選択根付け培地(1/2濃度のMS塩、1/2濃度のB5ビタミン群、スクロース 10g/l、IBA 0.1mg/l、及びヒグロマイシン 5mg/l)に置いた。
【0059】
gus組織化学アッセイ
Jefferson et al. (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405) により記載されるような組織化学分析を使用して、トランスジェニック系の異なる植物部分のGUS活性を検討した。in vitro 及び in vivo 植物のサンプルを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸−シクロヘキシルアンモニウム塩(0.5mg/l);Na−P−緩衝液(50mM pH7);Na2−EDTA(5mM pH8.0);Triton X−100(0.05% v/v);フェロシアン化カリウム(0.5mM);フェリシアン化カリウム(0.5mM)を含有する溶液において5分間真空濾過した。サンプルを37℃で3時間インキュベートし、引き続き、エタノール(70%)で洗浄することによって葉緑素を取り除いた。青い染色の強度に基づいて、GUS活性の分類(0〜5=なし〜非常に高い)を行った。
【0060】
カルス誘導アッセイ
in vitro 植物の小葉ディスク(5*5mm)を、2,4−D(1mg/l)を補充した再生培地(SIM)上に、軸側を上にして置いた。培地中のスクロースレベルは10g/Lに保った。3週間の培養の後で、切断先端に新たな緑のカルスが生じ、完全な外植片をGUS活性について組織化学的に染色した。
【0061】
オーキシン誘導アッセイ
in vitro 植物の節切片を、NAA(0.1mg/L)を補充するか又は補充しないホルモンフリー培地(SEM)で二次培養した。3週間の後で新たな葉と根が生じた。この時点で、完全な植物をGUS活性について組織化学的に染色した。
【0062】
PCR分析
Thompson 及び Henry (1995) により記載されるようなDNAサンプル調製法を使用するPCRにより、トランスジェニック植物を分析した。in vitro 成長させた苗木から小葉切片(±2mm2)を取り、ミクロ遠心分離管(1.5mL)に密封し、液体窒素中で凍結させた。20マイクロリットルの抽出緩衝液(100mM TrisHCl pH9.5;1M KCl;10mM EDTA)を加え、サンプルを95℃で10分間加熱した。氷上で冷やした後で、サンプルは直に使用するか、又は使用まで4℃で保存した。PCRプライマーは:5’−GTGACATCTCCACTGACGTAAG−3’(35S−P4)(配列番号6)及び5’−CGAACTGATCGTTAAAACTGCC−3’(SQ−GUS−192)(配列番号7)であった。プライマーアニーリング部位を図1に示す。5’95℃,5’55℃,5’72℃の1回のPCRサイクルの後に、1’95℃,1’55℃,1’72℃の30サイクルを続けた。最終サイクルは、1’95℃,1’55℃,10’72℃で行った。反応量は50μlであり、1μlのDNAサンプル、Taq緩衝液、1.5mM MgCl2、2*25ピコモルのプライマー、200μM dNTP、及び2.5ユニットの白金Taqポリメラーゼを含有した。アガロースゲルでの電気泳動を使用してPCRサンプルを分析した。
【0063】
プラスミドレスキュー
個別トランスジェニック系の約5μgのEcoRI消化ゲノムDNAを25μlのH2Oに溶かした。5μlのT4リガーゼ(ギブコBRL)、60μlのT4リガーゼ緩衝液、及び210μlのH2Oを加え、この混合物を14℃で20時間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出法(Sambrook et al. 1989,「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular cloning: A laboratory manual)」第2版;コールドスプリングハーバーラボラトリープレス:ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)を使用して連結DNAを1回洗浄し、その後で10μlのTEに溶かした。この溶液の1μlを、Cellポレーター(porator)システム(ギブコBRL)を使用する1つのサンプルのDH10Bエレクトロマックス(electromax)(ギブコBRL)コンピテント細胞のエレクトロポレーションに使用した。製造業者により提案されるような設定を使用した。SOC培地での1時間の回復の後で、細胞をスピンダウンさせ、100μl LBに溶かし、スペクチノマイシン(50mg/L)を含有するLBプレートでプレート培養した。37℃で24〜48時間のインキュベーションの後で、コロニーが見えるようになった。プレート上と液体LB(スペクチノマイシン 50mg/L)中での個別コロニーの二次培養を使用して、レスキューしたクローンの真の耐性を確認した。
【0064】
配列決定
gus::nptII遺伝子から植物ゲノムへの遷移ゾーンを、ABI配列決定キット(Prism BigDye Terminator Cycle)と単一プライマーとしての5’−CGAACTGATCGTTAAAACTGCC−3’(SQ−GUS−192)(配列番号7)を使用して配列決定した。レスキューされたプラスミド若しくはバイナリーベクターを鋳型DNAとして使用した。製造業者により提案される条件を適用した。約500〜600bpの配列を決定した。BLASTNコンピュータ検索を使用して配列データを解析した。
【0065】
実施例1 タグ付け構築体を用いた Brassica の形質転換
Brassica napus の胚軸外植片をタグ付け構築体pMOG1178(図1)で形質転換し、耐性細胞クラスターと非トランスジェニック組織とを区別する最低濃度である15mg/Lのカナマイシンを含有する培地に置いた。形質転換実験においては、この外植片の部分をヒグロマイシン含有培地に置いて、35S−hptカセットの発現について選択した。ヒグロマイシン耐性カルスが得られる頻度を、特定の実験におけるT−DNA組込みの効力の尺度として使用した。構築体pMOG448(図1)を、カナマイシン選択の陰性対照として使用した。同一の構築体と構築体pMOG964(図1)を、ヒグロマイシン選択の陽性対照として使用した。後者の構築体はまた、カナマイシン選択の陽性対照としても使用した。
【0066】
一連の15回の形質転換実験から、3回の典型的なタグ付け実験の結果を表1に示す。pMOG1178を用いた形質転換の後でヒグロマイシン耐性カルスが生じる頻度(耐性カルスの数/外植片*100%)は、55〜99パーセントに及んだ。陽性対照のpMOG448及びpMOG964のカルス頻度は、37〜66%に及んだ。カナマイシン選択の後で、陰性対照のpMOG448のカルス頻度は0であった。陽性対照pMOG964で得られる頻度は81〜119%であった。タグ付け構築体pMOG1178で形質転換した外植片では、低いがかなりの数(1.4〜3.5%)のカナマイシン耐性カルスが産生された。
【0067】
相対タグ付け頻度は、あるタグ付け実験内でのカナマイシン及びヒグロマイシン耐性カルス形成間の比率である。この数は、カルス組織において活性であるゲノムプロモーター配列の後方に組込まれたT−DNAインサートの画分(fraction)を表す。相対タグ付け頻度は、異なる実験の間で2.6〜3.8%に及んだ。
【0068】
【表1】
【0069】
すべてのタグ付け実験から87のカナマイシン耐性カルスを得た。全部で36のカルスが上首尾に再生した。このカルス再生頻度(41%)は、通常得られる範囲内にある。苗条原基を単離し、カナマイシンのない培地で二次培養した。この非選択工程を使用して、分化の後でnptIIの発現が制限されているか又は皆無であるタグ系を生育させた。36の再生植物のうち20が、ヒグロマイシン(5mg/l)含有培地で正常な根形成を示したが、このことは、35S−hptカセットの根における発現を示した。この観察により、プロモーターのないgus::nptIIタグ付け構築体がカナマイシン選択を介して上首尾に導入されることが確かめられた。ヒグロマイシン感受系は以降の分析から除外した。
【0070】
実施例2 分化した植物組織におけるGUS活性
35S−gus::nptII構築体(pMOG964)を含有するカナマイシン耐性の対照植物は、高レベルの構成的GUS活性を示した(データ示さず)。従って、このトランスジェニックgus::nptIIタグ系は、タグ付き(tagged)ゲノムプロモーターがある植物組織においてまだ活性であるときにGUS染色を示すと予測された。in vitro と温室で成長させた植物の葉、茎、及び根の組織を組織化学的にアッセイした(表2)。20系のうち15が、温室又は in vitro のいずれかの植物の1以上の部分において検出可能レベルの発現を示した。この青い染色は、通常非常に弱く、葉及び茎の葉脈組織にしばしば限定された。一般に、温室条件下での発現は in vitro 条件に比べて低かった。
【0071】
4つの系(1178−1、26、29、及び45)が葉、茎、及び根に中位〜高いレベルのGUS活性を示した。1つの系(1178−26)だけが土壌へ移した後でも高い構成的な発現パターンを示した。一部の苗条(1178−2及び30)又は根の分裂組織(1178−21、29、33、43、及び45)において亢進された発現が観察された。
【0072】
再誘導カルスにおけるGUS活性
対照として、一組の分析を行って、再誘導カルスにおけるGUS酵素活性を検討した。元のプロモーターのないgus::nptII挿入がカナマイシン耐性カルスをもたらしたので、この相においてほとんどの系があるレベルのGUS活性を示すと予測された。2,4−D(1mg/l)を補充した苗条誘導培地にすべての系の葉ディスクを置くと、この外植片の先端に緑色の非再生性カルスの形成が生じた。20系のうち18が、この2,4−D含有培地での14日間の培養の後で、検出可能レベルのGUS活性を示した。発現は、外植片の先端に新たに生じたカルス組織に主に局在化していた(図2a+b)。12の系(1178−2、5、10、11、18、21、22、30、37、40、43、及び45)で、外植片の残り部分に比べて、カルスにおいて相対的にアップレギュレートされた発現を見出した。検討した他の植物組織においては、検出可能な酵素レベルを見出さなかった(以下参照)。
【0073】
タグ系のT1胚軸切片を再生培地に置いたときも、カルスにおいてアップレギュレートされた発現を観察した(図2c+d)。
【0074】
【表2】
【0075】
オーキシン処置によりアップレギュレートされるGUS活性
T−DNA組込みは活発に転写されるゲノムの領域で起こると考えられ(Koncz et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 8467-8471)、今回の場合では、プロモーターのないgus::nptIIタグ付け構築体の組込みがオーキシン含有培地での培養(2,4−Dとの共培養とNAAでの選択)の間に起きたので、我々は、タグ付きプロモーターのオーキシンによるアップレギュレーションをチェックすることを望んだ。それぞれの系の少なくとも1つの節切片は、NAA(0.1mg/l)含有培地で増殖した。この培地で成長した苗木は、ホルモンフリー培地で成長した対照クローンと比べて、有意により多くてより太い根を生育させたが、他の点ではそれと同等であった。二次培養から4週後に組織化学GUSアッセイを実施した。6つの系(1178−5、18、21、33、43、及び45)が葉においてNAA誘導GUS活性を示した。このGUS発現データの概略を表2に提示する。2つのトランスジェニック系(1178−34及び1178−42)では、GUS染色が観察されなかった。
【0076】
実施例3 ゲノム「プロモーター」配列の単離
タグ付け構築体の上流にあるゲノム配列を実際に単離する前に、すべての系をPCRによりスクリーニングし、あり得るスクランブル状態のT−DNA挿入を検出した。35S−gusプライマーセットを使用して、2つの系(1178−1及び26)が、プロモーターのないgus::nptII遺伝子の上流に、おそらくは35S−hptカセットに由来する、35Sプロモーターの少なくとも一部を含有することを見出した。このことは、増幅した断片を配列決定することによって確認した(データ示さず)。これらの系は以降の分析から除外した。
【0077】
残る系のゲノムDNAをEcoRIで消化し(図1)、サザンブロッティング分析に使用した。単一のT−DNA挿入を1178−21、29、及び43の系に検出した。T−DNAの右境界断片は約12kbのサイズであったが(データ示さず)、このことはT−DNAとEcoRI制限部位との間に±3kbのゲノム配列が存在することを示す。他の系の結果は、EcoRI断片のサイズが非常に大きいために解釈することが困難であった。
【0078】
プラスミドレスキュー実験にも、消化したDNAを使用した。サザンブロットで観察された大きな断片サイズにもかかわらず、スペクチノマイシン耐性コロニーは容易に入手された。レスキューされたプラスミドを制限酵素解析によりチェックした。これらの解析は、プラスミドを線状化すると予測されるEcoRIを使用して行った。EcoRI+BamHIの二重消化を使用して、新たに単離したゲノム配列から元の9kbのT−DNA(ベクター)を分離した(図1)。単一コピーT−DNA系(1178−21、29、及び43)からのプラスミドレスキューは系内で同一のクローンを生じたが、他の系は2以上の異なる制限パターンを示した(データ示さず)。これらの異なる制限パターンは、異なるT−DNA挿入物のレスキュー断片を表した可能性がある。酵素の組み合わせで消化したレスキュープラスミドのいくつかの例を図3に示す。単一コピー系(1178−21、1178−29、及び1178−43)からレスキューしたプラスミドを示し、起源となるタグ系に従って命名する(pJB1178−21(=pMOG2001)、pJB1178−29(=pMOG2002)、及びpJB1178−43(=pMOG2003))。
【0079】
線状の断片(EcoRI)は、±11kb(クローン1)〜±40kb(クローン4及び5)のサイズに及ぶ。単一コピーT−DNA系(pJB1178−21、pJB1178−29、及びpJB1178−43)からのプラスミドの断片サイズ(±12kb)は、サザンブロッティングにより得られた結果(上記参照)に一致する。ある事例では(クローン7、9、及び11)、レスキューされたプラスミドをEcoRI消化により線状化することが不可能であると見られた。明らかに、EcoRI部位が壊れていた。二重消化を用いたレーンから、ほとんどのクローンが予測される9kbベクターのバンドを示すことが見られる(図3)。例外は、上記のようなEcoRI部位のないクローンとpJB1178−43である。他のクローンはいずれも、この9kb断片以外に、単離された植物DNAに由来する1〜3の他のバンドを含有する。
【0080】
3つの単一コピー系(1178−21、1178−29、及び1178−43)のそれぞれについて、gus::nptII遺伝子の上流にあるDNA配列を決定した。pMOG1178の元の右境界及びHindIII部位(図1)は、3つの系でいずれも存在していなかった(図4)。1178−43系では、BamHI部位(図1)ももはや存在していなかったが、このことは、EcoRI*BamHI消化の後で予測される9kb断片が非存在であることを説明する(上記参照)。
【0081】
タグ付き Brassica napus プロモーター配列の解析
1178−21系及び1178−43系のレスキューされた Brassica napus プロモーター配列(それぞれ、配列番号7及び配列番号8)を、Arabidopsis ゲノム配列(TIGR:www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/)に対するBLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402)検索に使用した。いずれの Brassica napus 配列にも、Arabidopsis ゲノムの特定部分に対する広範な相同性を見出した。タグ付け系の1178−21由来の3078bpの Brassica 配列は、Arabidopsis 第1染色体のBAC T22C5の領域と高い相同性を示す。この相同性は、9つのエクソンを有する予想(predicted)ORF T22C5.22(未知のタンパク質)を表す Arabidopsis BAC T22C5のほぼ全域をカバーする。Brassica 配列との相同性は、予想エクソンが位置する領域で最も強いが、相同性は、より限定されているが、(予想)イントロン領域でも存在する。Brassica 1178−21配列に相同な Arabidopsis 配列を配列番号9として収載する。Brassica タグ付け系の1178−43から単離した配列は、Arabidopsis 第5染色体のBAC F15L12に位置する領域に対して高い相同性を示す。この領域では、予想ORF F15L12.8(推定タンパク質)と予想ORF F15L12.10(ジンクフィンガー様タンパク質)との間で、単離された Brassica 配列全体の長さにわたり相同性が見出される。この領域は、Arabidopsis 第5染色体のORF F15L12.10のプロモーター領域に類似する。Brassica napus プロモーター1178−43に相同なこの Arabidopsis 配列を配列番号10として収載する。予想F15L12.10の遺伝子は、Dof6ジンクフィンガー様転写因子に類似したジンクフィンガー様タンパク質を表す。
【0082】
Arabidopsis thaliana 生態型 Columbia と Brassica napus 変種 Westar の染色体領域間に見出される広範な相同性は、これらの近縁植物種間に高いレベルのゲノム共直線性があることを示す。
【0083】
両方のプロモーター配列を、オーキシン誘導性、病原体誘導性(植物防御ホルモン応答性)、及び構成的な遺伝子発現において調節的な役割を担うことが知られているプロモーターモチーフの存在について解析した。いずれのプロモーターもカルス組織において非常に活性であり、オーキシン処置へ応答する。この証明されたプロモーター活性の近くには、これら2つのプロモーター配列により推進される遺伝子発現の調節において病原体及び創傷への応答要素が関与する部分が存在している可能性がある。なぜなら、プロモーター捕捉実験において、創傷と A. tumefaciens 感染への曝露の間にそれらが同定されたからである。両方のプロモーターにおいて同定されたプロモーター要素を図6及び7に示す。ダイズGH3プロモーター(Ulmasov et al., Plant Cell 1995 Oct; 7(10): 1611-1623)のオーキシン応答性に必要とされるオーキシン応答要素(AuxREs)のコア配列(TGTCTC)を含有する要素が見出された。これらオーキシン応答要素の存在の近くには、RolB腫瘍遺伝子プロモーターに見出されるタバコDofタンパク質NtBBF1結合部位に同一の配列が、いずれのプロモーターにも存在する。NtBBF1は、おそらく、植物における組織特異的でオーキシン誘導性のRolB発現を仲介することに関わるタンパク質である(Baumann et al., Plant Cell 1999 March; 11(3):323-334)。Dofジンクフィンガータンパク質もオーキシン誘導性であると考えられている(Kang 及び Singh, Plant J. 2000; 21: 329-339)。病原体及び/又はストレス誘導性である遺伝子中に高頻度で存在する要素も両方のプロモーター配列において同定された。植物の転写因子のWRKYファミリーのメンバーへ結合することが可能であるW−ボックスモチーフが両方のプロモーター配列に存在する(それぞれ、8コピーと4コピー)。高頻度のW−ボックス配列(TTGACn)の存在は、病原体、エリシター(elicitor)、及びサリチル酸への応答性に関連している(Eulgem et al., Trends Plant Sci. 2000; 5(5): 199-206)。Lois et al. (EMBO J. 1989; 8(6): 1641-1648) 及び Fischer(学位論文、ホーヘンハイム大学、1994年)により記載されるようなH−ボックスコンセンサス(CCTAnC)に非常に似た配列が見出され、これらのボックスは、植物の最小プロモーターへマルチマーとして融合されると、真菌エリシター及び創傷に誘導される発現をもたらすことが知られている(Takeda et al., Plant J. 1999; 18(4): 383-393)。また、いわゆるG−ボックス調節モチーフ(CAmGTG,Loake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 9230-9234)と、植物ホルモンのエチレン(ethylene)(Ohme-Takagi 及び Shinshi, Plant Cell 1995 Feb; 77(2): 173-182)によりアップレギュレートされる遺伝子の5’上流領域に主に見出されるGCC−ボックス(AGCCGCC)に類似したボックスも同定された。S−ボックスは、非常に強いエリシター応答要素であり、非常に強い誘導能を与えることが可能である(WO00/29592)。両方のプロモーター融合物における転写開始部位をマップしなかったので、これらプロモーター中の推定TATAボックスの位置を予想することは依然として困難である。それでも、RNAポリメラーゼII結合部位として機能する可能性が非常に高い配列が存在している。
【0084】
実施例4 単離「プロモーター」−gus::nptIIプラスミドの評価
単一コピーT−DNA系(1178−21、29、及び43)からレスキューした3つのプラスミドをプロモーター活性のさらなる解析のために選択した。二重選択戦略を使用することによってバイナリーベクターを構築した。レスキュープラスミドの線状断片(EcoRI)を、バイナリーベクターのpMOG22(図1)の線状断片(EcoRI)と連結し、大腸菌へ形質転換した。カナマイシン及びスペクチノマイシン耐性についてコロニーを選択したところ、連結が成功したことを示した。しかしながら、ほとんどのバイナリーコロニーは、元の9kb EcoRI/BamHIベクター断片のサイズが低下したことで裏付けられるように(データ示さず)、ある欠失部分を含有するようであった。この新規バイナリーベクターのプロモーター−gus融合物の配列解析は、gus::nptII遺伝子のすぐ上流にゲノム配列が改変されずに存在していることを示した。
【0085】
レスキュープラスミドあたり3〜5のバイナリーベクターを選択した。この選択は、EcoRI及びBamHIを使用する予測制限パターンと最も似ていることに基づいた(データ示さず)。12のクローン(4*pJBBIN1178−21、5*pJBBIN1178−29、及び3*pJBBIN1178−43)をアグロバクテリウム株のMOG301へ導入し、引き続き、Brassica napus へ形質転換した。形質転換はいずれもそれぞれ±100の胚軸外植片を使用して同一2検体で行った。pMOG964及びpMOG1178(図1)での形質転換は、これらの実験において対照として役立った。形質転換から5日後、構築体につき約20の外植片を一過性GUS活性について評価した。12クローンのうち5つがヒグロマイシン耐性カルスにおいてGUS活性を示した。形質転換から3週後、1つの1178−43バイナリークローンを除くすべての形質転換体において、ヒグロマイシン耐性カルスが産生した。この時点で12クローンのうち8つがヒグロマイシン耐性カルスにおいてGUS活性を示した(図5)。特に、タグ系1178−21及び29由来のクローンは、組織化学GUSアッセイにおいて、暗青色の染色を示した。
【0086】
6つのバイナリーベクター(2*pJBBIN1178−21、2*pJBBIN1178−29、及び2*pJBBIN1178−43)をジャガイモの形質転換にも使用した。このうち4つが形質転換の後で早期に一過性のGUS活性を示した。6つのベクターのうち5つは、成長するヒグロマイシン耐性カルスにおいて安定したGUS活性を明らかにした。選択剤としてカナマイシンを使用する形質転換実験のために構築体につき約50のジャガイモ外植片を使用した。推定トランスジェニック苗条を採取し、ヒグロマイシン含有根付け培地にそれを置くことによってその真のトランスジェニック性を試験した。活性のある35S−hptカセットをゲノムに組込んだ苗条だけが正常な根系を産生するはずであった。形質転換した6つの構築体のうち5つが1以上のトランスジェニックジャガイモ系を産生した。形質転換頻度(トランスジェニック植物の数/外植片*100%)は、2〜11パーセントに及んだが、これは、陽性対照の構築体pMOG964で得られるレベル(5%)と同等である。
【0087】
初期の結果は、トランスジェニックジャガイモ系の葉サンプル中のGUS活性が0〜「相対的に高い」まで変動することを示した。トランスジェニック系の中には葉において低いGUS活性しか示さないものがあるが、このレベルは、葉外植片をカルス誘導培地に置くとアップレギュレートされる可能性があった(図5)。Brassica 及びジャガイモの形質転換結果の概略を表3に示す。
【0088】
【表3】
【0089】
【表4】
【0090】
【表5】
【0091】
【表6】
【0092】
【表7】
【0093】
【表8】
【0094】
【表9】
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】Brassica napus におけるプロモータータグ付けに使用する構築体中のT−DNA構造の概略図。どのバイナリーベクターも、pMOG22にあるように35S−hpt−nosカセットを含有する(Goddijn et al., 1993)。選択制御(+ヒグロマイシン、−カナマイシン)として、構築体pMOG448(3章)を使用した。構築体pMOG964が二重増強35Sプロモーターと組み合ったgus::nptII融合遺伝子(Datla et al., 1991)を含有するのに対し、タグ付け構築体pMOG1178は、同じコード領域のプロモーターのないバージョンを有する。gus::nptII遺伝子は、Vancanneyt et al. (1990) により記載されるようにgus部分にイントロンを含有する。プラスミドレスキュー特性としてスペクチノマイシン耐性とColE1複製起点を含める。アグロバクテリウムのカルベニシリンへの耐性を避けるために、アンピシリン遺伝子を壊す(Δ)。サザンブロット解析とプラスミドレスキュー実験に使用する制限部位(HindIII、EcoRI、及びBamHI)をマップする。波線は、右境界に隣接する植物ゲノムDNAを表す。LB:左境界、RB:右境界、p:プロモーター、t:転写終結配列、hpt:ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、als:アセト乳酸シンターゼ遺伝子、gus−1:GUSレポーター遺伝子+イントロン、nptII:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、spec:スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む3kb断片、Δamp:アンピシリン耐性遺伝子(非機能性)、ColE1:ColE1複製起点。
【図2】タグ付け構築体pMOG1178を含有するトランスジェニック Brassica napus 系の植物部分におけるGUSパターン。in vitro 葉切片又はT1胚軸外植片の上で誘導したカルスにおける高いGUS活性(A+B:1178−21系;C+D:1178−43系)。
【図3】レスキューされたプラスミドの制限解析。gus::nptIIタグ付け領域の上流にあるゲノム配列の11種の異なる断片を、プラスミドレスキューにより単離した(図1を参照のこと)。細菌培養物からDNAを単離し、EcoRI又はEcoRI+BamHIで消化し、アガロースゲルで分離した(1〜11のセット)。1kbマーカー(ギブコ−BRM)の位置を示す。3つの単一コピー系(1178−21、1178−29、及び1178−43)から単離したゲノム断片を、配列解析、バイナリーベクターの構築、及び野生型 Brassica napus への再形質転換に使用した。
【図4】タグ付け構築体pMOG1178と3つのトランスジェニック系(1178−21、1178−29、及び1178−43)中のgus::nptIIコード領域の上流にあるヌクレオチド配列の比較。T−DNA右境界、制限部位(HindIII及びBamHI)、及びgus::npyIIの開始コドン(ATG)に下線を施す。それぞれの系(一本鎖)について約600塩基対の配列を決定し、BLASTN検索により解析した。Arabidopsis の3つのBACクローンと Arabidopsis 及び B. napus のcDNAクローンとの相同性を見出した。相同配列の開始を示す(ダッシュ線)。
【図5】プロモーター活性を有する新規ゲノム配列により推進された、若いカルスのGUS活性。Brassica napus のゲノムに組込まれたgus::nptタグ付け遺伝子(pMOG1178,図1)の上流の断片をプラスミドレスキューにより単離し、バイナリーベクターpMOG22(35S−hpt−nos,図1)中でクローニングし、Brassica napus 胚軸外植片へ再形質転換させた(表3)。ヒグロマイシン含有培地での3週間の培養後に組織化学XGlu染色(24時間)を実施した。A:35S−gus::nptII対照構築体pMOG964の非常に高い発現;B:良好な発現(pJBBIN1178−21);C:良好な発現(pJBBIN1178−29);D:適度の発現(pJBBIN1178−43)。
【図6】1178−21プロモーターとプロモーター要素を含有する配列ボックスの略図。このボックスの説明については、実施例7を参照のこと。
【図7】1178−43プロモーターとプロモーター要素を含有する配列ボックスの略図。このボックスの説明については、実施例7を参照のこと。
Claims (20)
- 2001年2月6日にCBS109271号の番号でカビ培養物中央管理局(Centraal Bureau of Schimmelcultures)(バーン、オランダ)に寄託された、クローンpJB1178−21のEcoRI断片内に存在するDNA断片であって、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に(predominantly)促進することが可能である、前記DNA断片。
- 2001年2月6日にCBS109273号の番号でカビ培養物中央管理局(バーン、オランダ)に寄託された、クローンpJB1178−43のEcoRI断片内に存在するDNA断片であって、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能である、前記DNA断片。
- 配列番号1により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載のDNA断片。
- 配列番号2により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項2に記載のDNA断片。
- 配列番号8により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載のDNA断片。
- 配列番号9により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項2に記載のDNA断片。
- 配列番号10により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片。
- 配列番号11により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片。
- ヌクレオチド1、ヌクレオチド154、ヌクレオチド319、ヌクレオチド638、ヌクレオチド667、ヌクレオチド1402、ヌクレオチド1640、ヌクレオチド1802、ヌクレオチド1887、ヌクレオチド1919、ヌクレオチド1980、ヌクレオチド2203、ヌクレオチド2259、ヌクレオチド2407、ヌクレオチド2576、ヌクレオチド2598、ヌクレオチド2676、ヌクレオチド2871、ヌクレオチド2874、及びヌクレオチド3092からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり;そして、ヌクレオチド154、ヌクレオチド319、ヌクレオチド638、ヌクレオチド667、ヌクレオチド1402、ヌクレオチド1640、ヌクレオチド1802、ヌクレオチド1887、ヌクレオチド1919、ヌクレオチド1980、ヌクレオチド2203、ヌクレオチド2259、ヌクレオチド2407、ヌクレオチド2576、ヌクレオチド2598、ヌクレオチド2676、ヌクレオチド2871、ヌクレオチド2874、ヌクレオチド3092、及びヌクレオチド3108からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号8に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片。
- ヌクレオチド1、ヌクレオチド1720、ヌクレオチド1889、ヌクレオチド1906、ヌクレオチド1991、ヌクレオチド2139、ヌクレオチド2375、ヌクレオチド2524、ヌクレオチド2585、及びヌクレオチド2634からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり;そして、ヌクレオチド1720、ヌクレオチド1889、ヌクレオチド1906、ヌクレオチド1991、ヌクレオチド2139、ヌクレオチド2375、ヌクレオチド2524、ヌクレオチド2585、ヌクレオチド2634、及びヌクレオチド2650からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号9に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連DNA配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なDNA断片。
- a)請求項1〜10のいずれか1項に記載のDNA断片;及び、
b)前記DNAの転写制御下に発現されるDNA配列であって、天然では前記DNA断片の転写制御下にない該DNA配列:
を転写の方向に含んでなる、キメラDNA配列。 - 請求項11に記載のキメラDNA配列を含んでなるレプリコン。
- 請求項12に記載のレプリコンを含有する微生物。
- 請求項11に記載のキメラDNA配列を含んでなる植物細胞。
- 請求項14に記載の細胞を含んでなる植物。
- 請求項15に記載の植物から入手される、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、及び木部より選択される植物の部分。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のDNA断片の、植物においてカルス特異的な発現を促進することが可能な相同体を同定することにおける使用。
- 請求項11に記載のキメラDNA配列を使用する、植物を形質転換する方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のDNA断片が選択可能マーカー遺伝子の発現を推進していることを特徴とする、植物を形質転換する方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の前記DNA断片の断片又は相同体を使用する、ハイブリッド調節DNA配列を産生する方法。
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