PL172945B1 - Sposób wytwarzania nowego konstruktu promotora roślinnego - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowego konstruktu promotora roślinnego związanego operatywnie z genem heterologicznym, znamienny tym, że łączy się gen ,heterologiczny z a) promotorem Brassica hsp 80 o długości 1568 par zasad, którego pełna sekwencja przedstawionajest w tabeli 1, b) jego delecyjną pochodną, zachowującą aktywność promotora, korzystnie wybraną z grupy 602 Δ3-2, posiadającej delecję regionów - 1568 do -1000 i -488 do -134 oraz z grupy 602 Δ4-9 posiadającej delecję regionów -1548 do -830 i -488 do -134 oraz c) funkcjonalnymi odpowiednikami sekwencji wymienionych w (a) i (b), które hybrydyzują z nimi w ostrych warunkach hybrydyzacji.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego konstruktu promotora roślinnego związanego operatywnie z genem heterologicznym. Nowy konstrukt wprowadzony do organizmu gospodarza zwiększa ekspresję genu heterologicznego.

W organizmach eukariotycznych obejmujących drożdże, Drosophila i niektóre gatunki roślin występują geny heat shock zwane dalej genami hsp. Jedna grupa genów hsp ulega ekspresji z wytworzeniem białka tylko w odpowiedzi na stres cieplny. Inna grupa genów hsp ma niski podstawowy poziom aktywności, który jest znacznie podwyższony po indukcji cieplnej.

Przy przetwarzaniu metodami inżymeiii genetycznej genu heterologicznego w roślinach, dobór promotora jest czynnikiem niezwykle ważnym.

Czasem pożądane są promotory służące do ekspresji niektórych tylko genów, czasem reagujące tylko w odpowiedzi na szczególny bodziec lub służące do lokalizacji ekspresji tylko w niektórych tkankach, ale szczególnie korzystne są promotory, które biorą bardziej znaczący udział w ekspresji tzn. w całej roślinie lub w większości jej tkanek i stale.

Do ekspresji genów heterologicznych stosowano promotor 35S z wirusa mozaikowego kalafiora (CaMV). Z różnych względów powinno być korzystne regulowanie ekspresji genu heterologicznego promotorem o pochodzeniu niepatogennym. Ponadto stosowanie promotora roślinnego może zmieniać poziom aktywności w poszczególnych tkankach i może zmieniać spektrum tkanek, w których uzyskano ekspresję w porównaniu z promotorami wirusowymi.

Sposób wytwarzania nowego konstruktu promotora roślinnego związanego operatywnie z genem heterologicznym według wynalazku polega na tym, że łączy się gen heterologiczny z a) promotorem Brassica hsp 80 o długości 1568 par zasad, którego pełna sekwencja przedstawiona jest w tabeli 1, b) jego delecyjną pochodną, zachowującą aktywność promotora, korzystnie wybraną z grupy 602 Δ3-2, posiadającej delecję regionów -1568 do -1000 i -488 do -134 oiaz z grupy 602 Δ4-9 posiadającej delecję regionów -1548 do -830 i -488 do -134 oraz c) funkcjonalnymi odpowiednikami sekwencji wymienionych w (a) i (b), które hybrydyzują z nimi w ostrych warunkach hybrydyzacji.

W sposobie według wynalazku jako gen heterologiczny stosuje się heterologiczną sekwencję kodującą wybraną z grupy obejmującej geny insekcydalne, geny oporności na herbicydy, geny przeciwdrobnoustrojowe, geny przeciwgrzybicze, geny przeciwwirusowe i geny przeciwfidantowe.

W sposobie według wynalazku stosuje się konstytutywny promotor z kalafiora (Brassica oleracea odmiany Delira), to jest taki, który w większości tkanek i organów bierze stały udział

172 945 w ekspresji genów. Promotor ten jest związany z genem heterologicznym w sposób operatywny tzn. w sposób umożliwiający rozłączne połączenie z dowolnym żądanym genem i kierowanie ekspresją lego genu. Od promotorów uprzednio opisanych, opartych na genach hsp różni się tym, ze ma wysoki podstawowy poziom konstytutywnej ekspresji i nieco zwiększoną ekspresję po indukcji cieplnej.

Promotor stosowany w sposobie według wynalazku oznaczono jako promotor hsp80, ponieważ jest konstytutywnym promotorem reagującym na szok cieplny i jest wzięty z genu, który ma podobną homologię do rodziny genów hsp80 w innych gatunkach. Promotor hsp80 bierze udział w ekspresji pod wpływem szoku termicznego z wytworzeniem białek przy wysokim podstawowym poziomie ekspresji w temperaturach normalnych 20 - 25°C i słabo podwyższonej ekspresji pod wpływem wstrząsu cieplnego (35 - 40°C).

Przedmiot wynalazku jest bliżej objaśniony na rysunkach, na których fig. 1 pokazuje plazmid pZ0'217 i budowę plazmidów pZ0601 oraz pZ0601BS; a fig. 2 przedstawia plazmid pZ0602.

Sekwencja promotora jest podana w Tabeli 1 (SEQ.ID. No: 1). Całkowita sekwencja natywna ma 1568 par zasad. Nukleotydy są numerowane w kierunku ujemnym od miejsca rozpoczęcia translacji (ATG) dla natywnego białka wytworzonego pod wpływem szoku cieplnego. W sekwencji są zidentyfikowane następujące obszary.

A) TATA box jest sekwencja TATATATA o ośmiu parach zasad występującą od -97 do -90 zasady włącznie.

B) Jest to sekwencja lidera mRNA o 61 parach zasad, która jest usytuowana w miejscu od -61 do -1.

C) Miejsce kołpakowe jest zidentyfikowane przy -61.

D) Jest to region od -604 do -488, który zawiera sekwencję aktywującą upstream dla tego promotora. Ten obszar jest oznaczony jako UAS 1. Obserwuje się, że ten obszar nadaje konstytutywną aktywność w próbie przejściowej i uprzednio był oznaczany jako konstytutywny box.

E) jest to region od -1000 do 604, który zawiera dalszą sekwencję aktywującą upstream. Ten obszar jest oznaczany jako UAS 2.

F) Jest to region od -488 do -120, który zawiera dalszą sekwencję aktywującą upstream Obszar jest oznaczony jako UAS 3.

G) Występują dwa proste powtórzenia między -799 do -74^1 i między -740 do -702. Również sekwencja zawierająca część prostego powtórzenia rozciąga się od -701 do -677.

H) Jeden element wywoływany szokiem cieplnym jest usytuo wa ny przy -131 do- 120 i drugi element jest usytuowany przy -244 do -237.

W sposobie według wynalazku stosuje siękonstrukt DNA zawierający promotor Brassica hsp80 przyłączony rozłącznie do genu hetyrplogicznygo. Ponieważ jest oczywiste, że mniejsze zmiany mogą być przeprowadzone w sekwencji DNA bez istotnego wpływu na aktywność promotora, w sposobie według wynalazku stosuje się również sekwencje DNA, które są funkcjonalnym równoważnikiem promotora Brassica hsp80 i konstrukty zawierające takie sekwencje DNA rozłącznie przyłączone do genu hytyrolpgiczn.ygo.

W całym opisie i zastrzeżeniach patentowych stosowano następujące określenia:

Równoważnik funkcjonalny jest dowolną sekwencją DNA, stanowiącą uzupełnienie sekwencji DNA, która w ostrych warunkach hybrydyzacji będzie hybrydyzować z uwzględnieniem sekwencji i ma aktywność promotora podobną do promotora Brassica hsp80.

Ostre warunki hybrydyzacji są to takie warunki, w których hybrydyzację prowadzi się w temperaturze 60°C w 2,5X buforze solankρwpcytrynianowym (bufor SSC) i następnie tylko spłukuje się w temperaturze 00°C buforem o zmniejszonym stężeniu, który nie będzie wpływał na odbywające się hybrydyzacje.

Gen hytyrologlczny jest sekwencją DNA kodującą dla dowolnego peptydu lub białka innego niż białko Brassica hsp80.

Promotor nelecyjnyjystprpmotoremBl·assicahsp80, który ma dekuję i jeszcze pozostaje aktywny

172 945

Funkcjonalny równoważnik promotora delecyjnego jest promotorem delecyjnym, który ma dalsze delecje i jeszcze pozostaje odpowiednio aktywny w porównaniu z promotorem delecyjnym.

Promotor możliwy do regulacji jest to promotor, na którego aktywność można wpłynąć przez czynnik(i) działający(e) cis lub trans.

Promotor konstytutywny jest to każdy promotor, który jest aktywny w większości tkanek lub organów cały czas.

Promotor hsp80 lub jego funkcjonalny równoważnik może być stosowany do konstytutywnej ekspresji każdego żądanego genu heterologicznego. Przykłady odpowiednich genów heterologicznych obejmują bez ograniczeń: owadobójcze toksyny, takie jak pochodzące z Bacillus thurmgiensis, geny nadające oporność na herbicydy, geny nadające oporność na mikroorganizmy, na grzyby, na wirusy i antyfidanty.

Korzystnie jest aby konstrukt genu heterologicznego hsp80 był wprowadzony do wektora i aby wektor był stosowany do transformacji eukariotycznego gospodarza. Eukariotyczny gospodarz jest korzystnie komórką rośliny lub protoplastą rośliny. Korzystne wektory będą oczywiście zmieniać się w zależności od wybranego gospodarza. Dla dwuliściennych wektor może być wprowadzony do protoplasty przez elektroporację lub wektor może być pochodną plazmidu T1 Agrobacterium tumefaciens (A.t.), która infekuje komórkę lub protoplastę i może być stosowana w transformacji, w której pośredniczy A.t., obejmującej tak zwane techniki binarne (patrz np. GasserC.S. et al. 1989, Science 244:1293-1299). Jednoliścienne są korzystnie transformowane z zastosowaniem tak zwanej techniki balistycznej (Gasser et al., supra) mogą być również transformowane z zastosowaniem protoplastów.

W innym przypadku odpowiednie wektory stosowane do transformacji i przebieg transformacji są dobrze znane w tej dziedzinie. Transformowane komórki lub protoplasty hoduje się w odpowiednim medium hodowlanym i regenemje się transformowaną roślinę. Transformowana roślina istotnie bierze udział w ekspresji genu heterologicznego.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że można przeprowadzać w promotorze określone delecje i stwierdza się, ze uzyskany promotor delecyjny ma albo (a) wzmocnioną aktywność, (b) zasadniczo taką samą aktywność jak promotor natywny lub (c) zmienioną aktywność.

Tak więc, zgodnie ze sposobem według wynalazku stosuje się sekwencje DNA zawierające promotor delecyjny promotora Brassica hsp80 i w konsekwencji konstrukty DNA zawierające promotor delecyjny związany w sposób nadający się do usunięcia z genem heterologicznym. Ten aspekt wynalazku obejmuje również funkcjonalne równoważniki promotorów delecyjnych i konstrukty zawierające funkcjonalnie równoważny promotor delecyjny i gen heterologiczny.

Różne promotory delecyjne i hybrydowe sporządzono, jak szczegółowo podano w przykładach. Pierwszy zestaw promotorów delecyjnych jest oznaczony serią 601BS. Te promotory charakteryzują się delecją, która obejmuje pary zasad od -118 do -246. Stwierdzono, że jeden promotor z tej serii, 601BSD 2-3, który zawiera delecję od -493 do -118 zachowuje około 50% - 75% aktywności w porównaniu do promotora nieuszkodzonego.

Drugi zestaw promotorów delecyjnych jest oznaczony serią 602. Te wszystkie promotory mają delecję co najmniej od -488 do -134 i mogą mieć delecję końcową 5' o zmieniającej się długości jak zestawiono w przykładzie 3. Nieoczekiwanie niektóre delecje wzmacniają aktywność.

Promotor delecyjny 603 ma zasięg delecji od -1125 do -134. Ten promotor zachowuje tylko około 10%o aktywności promotora nieuszkodzonego. Promotor delecyjny 604 ma delecje od -1568 do -1125 i od -496 do -134, zachowując w przybliżeniu 25% aktywności. Promotor delecyjny 605 ma delecje wszystkich par zasad w górę od -488 i odpowiednio obniżoną aktywność tylko do około 6 - 8%.

Szczególnie ważny obszar dla aktywności leży między -134 do -120. Promotor delecyjny 601BS(BSpH) ma tylko mały obszar usunięty, lecz jego aktywność obniża się tylko do około 50 - 75% aktywności promotora nieuszkodzonego. Dlatego szczególnie korzystne promotory stosowane w sposobie według wynalazku, znajdują się przy co najmniej tej krótkiej sekwencji.

Jak wymieniono wcześniej, uważa się, że region 116 bp rozciągający się od -604 do -488 (UAS 1) lub jego część jest odpowiedzialny za nadawanie konstytutywnej aktywności tkankom. Uważa się, ze UAS 2 i UAS 3 jak opisano powyżej nadają aktywność dalszym tkankom Dlatego

172 945 dalszym aspektem wynalazku jest nadawanie konstytutywnej aktywności niekonstytutywnemu z drugiej strony promotorowi (takiemu jak promotor, który zwykle podlega indukcji lub poza iym regulacji) przez związanie w sposób pozwalający na usunięcie z lub umieszczenie w promotorze podlegającym indukcji lub regulacji jednego lub więcej aktywujących regionów upstream, które same wytwarzają aktywność w większości organów/tkanek i połączone dają tak zwaną aktywność konstytutywną. Wynalazek obejmuje sposób, w którym stosuje się konstrukty DNA zawierające takie promotory o nadanej konstytutywnej aktywności związane w sposób nadający się do usunięcia z genem strukturalnym, sposoby na przykład transformacji komórek i protoplastów rośliny z zastosowaniem konstruktów oraz komórki i protoplasty rośliny transformowane z konstruktów.

Uznaje się, ze możliwe jest aby regiony mniejsze niz regiony UAS 1, 2 i 3 były wystarczające do nadawania konstytutywnej aktywności. Mozna to przebadać przez wykonanie delecji w tych regionach z zastosowaniem metod, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Promotory z delecjami w regionach UAS mozna wówczas oceniać pod względem retencji aktywności konstytutywnej. Takie oceny są również znane fachowcom.

Regiony UAS 1, 2 i 3 same lub razem mogą być również stosowane do odbudowy aktywności promotora, który stał się nieaktywny przez delecje i/lub mutacje. Wchodzi to również w zakres wynalazku Przykładem takiego stosowania może być promotor CaMV 35S, który poddawano usuwaniu aż do zaprzestania funkcjonowania. Wprowadzenie elementów UAS 1,2 i 3 w kombinacji lub samych będzie odbudowywać aktywność promotora w niektórych lub wszystkich tkankach.

Wynalazek jest dalej zilustrowany w następujących przykładach nie ograniczających jego zakresu

Przykład 1. Izolowanie promotora hsp80

Genomową bibliotekę Brassica oleracea (odmiana Delira) sporządza się w fagu Charon 35 Lambda i komórkach K802 stosując metody zasadniczo jak opisano przez Maniatis, et al. 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 282-283. Bibliotekę przeszukuje się fragmentem Pvul-Stul z genu Drosophila hsp83 [Hackett, R.W. et al. 1983, Nucl.Acids Res. 11(20):7011-7030] Dwadzieścia rekombinantów z widoczną homologią do genu Drosophila odkrywa się i przeprowadza analizę plamienia stosując fragment genu Drosophila hsp83 jako próbę. Fragment 5.8 kb HintIII dobiera się dla subklonowania w wektorze pUC9 i określa jako pZ0217. Plazmid jest zilustrowany na fig 1.

Następnie, gen transferazę acetylową chloramfenikolu (CAT) (Pharmacia) wprowadza się do miejsca Pstl znanego wektora pUC19. Z kolei terminator NOS [Bevan, M. et al. 1983. Structure and Transcription of the Nopaline Synthase Gene Region of T-DNA Nuci Acids Res. 11(2)] wprowadza się w miejscu Pstl-Hindll^. Uzyskany plazmid jest oznaczony jako pZ030 Fragment Bglll z pZ0217 wydziela się i subklonuje do miejsca BamHI plazmidu pZ030. Taki wynik uzyskuje się w konstrukcie promotor-CAT gen-NOS promotora, który jest przenoszony jako fragment EcoRI-Hindlll do dostępnego w handlu wektora pTZ18R (Pharmacia), tworząc pZ0601, jak zilustrowano na fig. 1.

Przykład 2. Konstrukcje plazmidu

Mutagenezę in vitro promotora hsp80 w pZ0601 prowadzi się stosując the Oligonucleotide Directed In V itro Mutagenesis System supplied by Amersham. Dwa ol i gonukleoty dy sy ntetyzuje się według instrukcji wytwórcy aby stworzyć dwa jedyne miejsca restrykcji w promotorze w górę od TATA box, BamHI przy -1341 Sphl przy -120 (Wszystkie pozycje nukleotydu są podane względem miejsca rozpoczęcia translacji). Nowy plazmid jest oznaczony jako pZ0601BS i jest również pokazany na fig. 1.

Plazmid pŻ0602 i pZ0603

Etap A) pZ060 1BS roztwarza się z BamHI i końce wypełnia się stosując fragment Klenowa polimerazy DNA. Następnie DNA roztwarza się z KpnI i uzyskany fragment bezpromotorowy oddziela się na żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia

Etap B) pZ0601BS roztwarza się z BamHI i KpnI i promotor hsp80 oddziela się na zelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia. Ten fragment oczyszcza się stosując ELUTIP (Schleicher i Schnell) i roztwarza albo z DraI lub z FnuDII.

172 945

Etap C) Fragment -1568 do -488 Dral z Etapu B wiąże się z bezpromotorowym fragmentem z Etapu A. Uzyskany plazmid jest oznaczony jako pZ0602 i jest pokazany na fig. 2.

Etap D) Fragment -1568 do - i 125 FnuDII wiąże się z bezpromotorowym fragmentem z Etapu A. Uzyskany plazmid jest oznaczony jako pZ0603.

Plazmid pZ0604

Etap A) pZ0601BS roztwarza się zBamHI i SmaI i miejsce BamHI wypełnia się polimerazą T4 DNA i deoksynukleotydami. Uzyskany fragment bezpromotorowy oddziela się na żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia.

Etap B) pZ0601BS roztwarza się z FnuDII. Fragment -1125 do -496 FnuDII łączy się z bezpromotorowym fragmentem z Etapu A otrzymując pZ0604.

Plazmid pZ0605

Etap A) pZ0601BS roztwarza się z BamHI i Smal i uzyskany fragment bezpromotorowy oddziela się na zelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia.

Etap B) pZ0601BS roztwarza się z Dral. Fragment Dral w -488 do -134 wiąże się z bezpromotorowym fragmentem z Etapu A do konstrukcji pZ0605.

Mutanty delecyjne

Szereg delecji 5' w promotorze hsp80 wytwarza się z plazmidu pZ0602. Plazmid pZ0602 roztwarza się z Sacl i Smal do stworzenia substratu dla roztwarzania Exonucleasy III (Stratagenu). Po traktowaniu Exonucleasą III w zmieniającym się czasie uzyskane DNAs stępia się Mung Bean Nuclease (Boehringer, Mannheim). DNAs oddziela się z zastosowaniem elektroforezy na żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia. Wystające pasmaodcinasię, rozcieńcza i wiąże. Po transformacji wybiera się mutanty delecyjne i poddaje sekwencji w punkcie łączenia.

Szereg delecji 3' w promotorze hsp80 wytwarza się z pZ060 IBS przez roztwarzanie z BamHI i Sphl, po czym przeprowadza się taką samą procedurę jak opisano w przypadku tworzenia delecji 5'.

Przykład 3. Biopróby

Utrzymanie linii komórkowej marchwi

Hodowlę zawiesiny Redwood City Wild Carrot (RCWC) (otrzymaną z Stanford University) utrzymuje się z następującym Carrot Suspension Medium: 1 x MS sole, 1 rng/J kwasu nikotynowego. 1 mg/l chlorowodorku pirydoksyny, 1 mg/l tiaminy, 100 mg/l mozitolu, 0,1 mg/l 2,4-D, 30 g/l sacharozy i doprowadza się do końcowego pH 5,8 za pomocą KOH. Hodowlę utrzymuje się przez rozcieńczanie 1 do 10 do świeżego medium po każdych siedmiu dniach.

Tworzenie protoplasty

Hodowlę zawiesinową RCWC rozcieńcza się 1 do 10 na 4 dni przed użyciem. 50 ml hodowli (w przybliżeniu objętość 5 ml upakowanych komórek) wiruje się przez 10 minut przy 500 g. Następnie komórki ponownie zawiesza się w 50 ml następującego filtrowanego roztworu enzymu marchwi: 10 g/l Cellulizyny (Calbiochem), 5 g/l Rhozyme (Genecor), 0,4 M mannitolu, 50 mM CaCl2, 10 mM NaOAc, pH 5,8. Komórki kołysze się łagodnie do przez 2 godziny do roztworzenia. Protoplasty przemywa się dwa razy i ponownie zawiesza w Carrrnt Culture Medium (CCM), które jest takie samo jak zawiesinowe medium marchwi opisane powyżej z dodatkiem 0,4 M mannitolu. Protoplasty zlicza się na hemacytometrze przy rozcieńczeniu 1 do 10 w celu oznaczenia stężenia.

Elektroporacja

Do wszystkich elektroporacji stosuje się PG200 Progenitor II (Hoefer) z elektrodą krążkową. Próbki poddaje się elektroporacji w 24-dołkowych sterylnych płytkach z mikromianem przy 250 V przez 100 ms.

Każdy plazmid zawierający konstrukt CAT (Pharmacia) testuje się w trzech lub czterech replikach w wielokrotnych eksperymentach. W każdym eksperymencie stosuje się 30 do 50 mg plazmidu pZ0601BS jako próbę kontrolną. Wszystkie inne plazmidy testuje się stosując równoważną ilość molową DNA w porównaniu z pZ0601BS.

W przybliżeniu 10° protoplastów umieszcza się w 1,5 ml rurkach, wiruje przez 2 minuty przy 50 g i usuwa większość nadsączu. Każdy DNA dodaje się do 75 pl 2M KCl. Objętość doprowadza się do 1 ml przez dodanie CCM (pH doprowadzone do 8,0) i tę mieszaninę poddaje się elektroporacji i nat^ta^lnmiO^t ro^i^do 5 ml CCM, pH 5,8 w szalce Petn'ego. Rozcieńczone próbki przechowuje się w ciemnym kredensie przez 1-2 dni przed zebraniem dla prób CAT.

172 945

Promotor	Regiony delecji	Aktywność względna
60 1BS	nie ma	100%
6ΟΎΔ 3-2	1 568 do - 1 000 i -488 - 134	125-175%
602 A3-3	-1568 do -948 i -488 do-134	75-125%
602 A4-9	-1548 do -830 i -488 do -134	100-150%
602 A4-6	-1548 do -6281-488 do-134	75-100%
601BS Δ2-3	-493 do-118	50-75%
603	-1125 do-134	w przybliżeniu 10%
604	-1568 do-1125 1-496 do-134	w przybliżeniu 25%
605	-1568 do -488
601BS(BSph)	-134 do -120	6-8% 50-75%

Przykład 4. Konstytutywna ekspresja w całej roślinie

Tytoń przekształca się w sposób następujący:

Tkanka roślinna

Przeszczepy liści tytoniu otrzymuje się ze sterylnie rosnących roślin tytoniu. Sterylne rośliny tytoniu rozmnaża się wegetatywnie w odstępach czasu okołojednomiesięcznych przez usuwanie węzłów wierzchołkowych istniejącej rośliny i ponowne hodowanie ich w słoju z gąbką, zawierającym 75 ml medium zestalownego agaru lub hormonu (medium 0/0) zawierającym sole Murashige-Skoog. 1 ml/l z 100 mg/l myoinozitolu. 5 ml/l vitamix (która dostarcza 0.5 mg/l chlorowodorku pirydoksyny. 0.5 mg! kwasu nikotynowego i 1,0 mg/l tianiny) 13% sacharozy. Rośliny tytoniu są utrzymywane przy ciągłym świetle. Słoje uszczelnia się taśmą z zielonego papieru lub mogą być nieuszczelnione. aby pozwolić na wymianę gazu.

Wektor Agrobacterium

Binarny system wektora stosuje się do przekształcenia Agrobacterium tumefaciens. a następnie bakterie stosuje się do przekształcenia komórek tytoniowych.

Postępowanie ogólne.

Wektory Agrobacterium przechowuje się' w temperaturze -70°C. W przybliżeniu 18 godzin przed transformacją. 25 ml sterylizowanego ciekłego medium LB3 (poniżej) zawierającego odpowiednie antybiotyki zaszczepia się 100 - 500 ml kultury Agrobacterium. Hodowla wzrasta na wstrząsarce w temperaturze 28°C przy 250 obrotach na minutę przez noc.

LB3 Medium (dla 1 litra)

Trypton 10 g

Ekstrakt drożdżowy 5 g

NaCl 4 g

KCl 1 g

MgSO47H2O 3 g

Dodaje się wodę do 1 1i dozuje w 25 ml porcje na kolbę.

Jako antybiotyki stosuje się 25 pg/ml streptomycyny i 50 pg/ml kanamycyny Transformację zwykle przeprowadza się gdy komórki są w swojej fazie log; O.D. przy 600 nm korzystnie powinno być 0.50 - 1,0. Kulturę należy rozcieńczyć do stężenia 108 komórek na mililitr w 50 ml ciekłego medium 0/0 nie zawierającego hormonu.

Przeszczepy liści tytoniowych moczy się przez 3 minuty w transformowanych Agrobacterium. jak wytwarzano powyżej o rozcieńczeniu 10' komórek/ml.

Przeszczepy usuwa się i osusza się na bibule filtracyjnej Whatman'a. Następnie umieszcza się na medium regeneracyjnym bez antybiotyków na 2 dni. Trzeciego dnia traktowane przeszczepy przenosi się do medium regeneracyjnego zawierającego odpowiednie antybiotyki. Przeszczepy pozostają na tych płytkach przez 3 - 4 tygodnie lub aż pr/ypuszc/aJnic transformowane pędy są dość duże aby przejść do medium ukorzeniającego. Medium ukorzeniające jest to medium 0/0 o połowie mocy. które zawiera

172 945

250 mg/l karbenicyliny i/albo 100 mg/l kanamycyny lub 50 mg/l hygromycyny w zależności od konstruktu. Po koło dwóch tygodniach pędy będą ukorzenione i zielone Przenosi się je następnie

Następnie przeprowadza się lumer identyfikacyjny r-ł o} z·'» t i ,, » U o <1 «· OlUjuYY 1 IKU-Z^LlC próby na różnych tkankach w celu przedstawienia konstytutywnej aktywności promotora.

Wektory transformacji pZ0639 '

Plazmid jest wytworzony podobnie do pZ0601, z tą różnicą, ze zamiast hsp80-CAT gen

NOS terminator zawiera hsp-80-GUS-NOS kasetę terminatora. Plazmid jest oznaczony pZ0612. Plazmid pBin19 (Clonetech) tnie się z EcoRI i Hindlll. Plazmid pZ0612 tnie się z Scal,

EcoRI i Hindin. Oba ekstrakty oddziela się na niskotopliwej agarozie. Fragment wektora 12 Kb-pBin19 i fragment -3.6 Kb hsp80-GUS-NOS izoluje się i następnie wiąże razem. Uzyskany plazmid oznaczony jako pZ0639 może być identyfikowany z ekstraktem Pstl.

pZ0640

Według procedury opisanej powyżej wytworzono pZ0640. Różni się on od pZ0639 posiadaniem odciętego fragmentu hsp80 (0,624 Kb względnie pełny promotor 1,56).

pZ0641

Według procedury opisanej powyżej wytworzono pZ0641. pZ0641 zawiera 0,252 Kb hsp80, a nie pełną długość promotora.

pZ0642

Według procedury opisanej powyżej wytworzono pZ0642. pZ0642 zawiera fragment CaMV 35S promotor-GUS-NOS, a nie hsp80 lub pochodną promotora.

Przykład 5. Aktywność promotora

Rośliny otrzymane według procedury z przykładu IV bada się pod względem ekspresji genu heterologicznego, GUS. Bierze się próbki tkanki i bada na obecność GUS. Aktywność GUS wykrywa się we wszystkich próbkach tkanki. Tkanki kontrolne otrzymane z roślin nietransformowanych, które poddawano takiej samej procedurze hodowli i regeneracji również ocenia się na aktywność GUS; nie mierzy sięjej. Liczba w nawiasach jest całkowitą liczbą stosowanych w próbce roślin. Wyniki są podane jako liczby dodatnie (obserwuje się barwę niebieską). Określenie NT oznacza - nie badano; NA - nie jest dostępny; M - jest mutantem.

Plazmid Konstmkt (plus GUS t NOS temriinator) pZO639 pełna dUigość hsp80 pZO640 1000 do 4888 +-1 34 do -23 hsp80 (zawiera

UAS1+UAS2 + TATA region) (ZO641 -628 do -488 + -134 do -23 hsp80 (zawiera

UAS1+TATA region) pZO642 35S promotor

tkanka	(ZO639	(ZO640	pZO641	pZO642(7)
mezofil liścia	1/7	1/5; 1NT	1/5	5/7
żyła liścia	5/7	1/6	2/5	3/7
ttichomes liścia	4/7	1/6	2/5	1/7
merystem boczny	2/7	0/5; 1NT	1/5	4/7
ttichomts boczny	1/7	0/6	0/5	1/7
żyłki listka	3/7	3/6	2/4; 1NA	3/7; 1NA
trichomes listka	4/7	1/6	0/4	0/6; 1NA

172 945

słupek	2/7	4/6	0/4; INA	4/6; INA
rurka kwiatowa/ żyłki płatka	1/7	1/6'	1/4· INA < j · i «* «	3/6; INI T 1 I.W 1
rurka kwiatowa/ trichomes płatka	4/7	2/6	0/4	3/6; 1NT
niedojrzały pylnik	4/7	5/6	2/3; INA; IM	3/5; INA; 1NT
pyłek	5/5; 2NA	5/6	3/3; INA; IM	0/6; INA
korzenie	6/7; 1NT	1/4; 2NT	0/4; 1NT	3/6; 1NT
łodyga	2/2; 6NT	0/2; 4NT	0/1 ; 4NT	1/1; 6NT

Dane te wskazują, ze promotor hsp80 jest aktywny w pewnym zakresie we wszystkich badanych tkankach, chociaż intensywność plamienia była mniejsza niż promotora 35S w większości przypadków. Na ogół mezofile nie plamią aż do infiltracji próżniowej, lecz wówczas duża liczba komórek robi plamy, chociaż ich wygląd przypomina raczej trichomes niż typowe komórki mezofilu.

Przykład 6. Promotory hybrydowe

Różne regiony upstream promotora hsp80 wiąże się do nieaktywnego heterologicznego minimalnego promotora w celu określenia czy region upstream jest odpowiedzialny za nadawanie aktywności. Fragmenty wskazane poniżej klonuje się upstream odciętego promotora CaMV 35S rozciągającego się od -46 w stosunku do miejsca startu transkrypcji CaMV do +131 (TATAAAboxjest od-31 do-25), określanego dalej jako -46 35S promotor, [numeracja NB stosowana tutaj do identyfikacji odciętego CaMV 35S odnosi się do samego CaMV 35S i nie jest taka sama jak numeracja stosowana gdzie indziej dla hsp80 i jego fragmentów]. Plazmid pZ0625 składa się z promotora -46 35S, intronu 6 z genu kukurydzy ADH1S regionu kodującego β-giukuiomdazy (GUS) i NOS terminatora w pT7T3 18U (dostępny z Pharmacia). Następujące fragmenty Brassica hsp80 są wiązane upstream promotora -46 35S.

Fragment promotora:

Fragment (numeracja według Tabeli 1) Plazmid

-628	do	-488	plus	-134	do	-120	pZO670
-1000	do	-488	plus	-	do	-120	pZO681
				134
-1000	do	-604					pZO682
-488	do	-120					pZO683
-1548	do	-488	plus	-134	do	-120	pZO689

Promotory hybrydowe znajdujące się w powyższych plazmidach odnoszą się odpowiednio do promotorów hybrydowych 670, 681, 682, 683 i 689.

Badany jest również pZ0612, który jest taki sam jak pZ0610, z tą różnicą, że gen CAT jest zastąpiony genem GUS, i składa się z promotora hsp80 o pełnej długości sterującego GUS z terminatorem NOS (lecz bez intronu) w pTZ 18R.

Protoplasty wytwarza się z marchwi jak opisano uprzednio, kukurydzy Black Mexican Sweet (BMS) i tytoniu. Protoplasty elektroporujc się żądanym plazmidem, pozostawia do odzyskania przez dzień i następnie ekstrahuje, a ekstrakty ocenia się na aktywność GUS.

172 945

Aktywność GUS mierzy się spyktrofotρmytryczmy. Wyniki są pokazane jako średnie, znormalizowane do konstruktu promotora 35S o pełnej długości, pZ0663 (05S z -366 do +131, intron 6, GUS, NOS terminator). Promotor 35S o pełnej długości jest opisany w Franek et al. Cell., Vol. 21, 285-294 (1980).

Próba przejściowa GUS ASSAY

Plazmid	Tytoń	Marchew	BMS
pZO663	1,0	1,0	1,0
pZO625	0,03	0,01	0,03
pZO670	0,16	0,28	0,02
pZO681	0,13
pZO682	0,24
pZO683	0,17	0,23	0,08
pZO689	0,16	0,32	0,03
pZO612	0,65

Próba przejściowa CAT ASSAY Plazmid Marchew pZO602 D4-6 0,75-1,0 pZO602 D3-2 1,25-1,75 pZO605 0,06-0,08 pZO601 BSD2-3 0,05-0,75 pZO601 BS 1,0

Jak można zobaczyć z powyższych wyników, wszystkie regiony upstream dają zasadniczo taką samą aktywność, gdy skondensowane są z promotorem 35S -46 i uważa się to za niewielki efekt dodatkowy.

172 945

Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne:

(i) Zgłasaajecy: Sandoz Limited (ii) Tytuł wynalazku: Nowy promotor roślirziy (iii) Numer sekwencji: 1 (2) Informacja dla SEQ ID NO: 1:

(i) Charakterystyka sekwnccji:

(A) Długość: 2042 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ molkUuł:: DNA (genomowa) (iii) ΗίρτΙτΥ^ΖΑ: : nie (iv) ΝζηιζηΞΟΖΑ:: nie

172 945 xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:

ATCGATAACC	ACGACCACGA	CCAAAACCAC	GATTGTGACC	ACGGCCACGA	CCA.CGCCCAC	60
GATAGGAATA	ATTTCCTTTT	TCCGGATTTT	TTATATCCGT	TGCATTTACC	TCAGGAAATG	120
CTTTGGTTCC	CGTGGGTCGG	GCATTGTGGT	TTTTAATGAG	GAGTTCATTA	TTTCTCTCCG	180
CTATTATAAG	CGCCACAGCG	AGTTCAGAGA	ACCTCGTATA	CCCACAATTT	CTATATTGTT	240
CTTGTAGAAC	ATAATGATTT	TTGTGGAACG	TTTGGTAAGT	TTTCTCGAGC	ATTTCCGCTT	300
CCGAGACAGG	CTTACCGCAA	TAATCTAATT	GCGCCGCTAT	TCTCAATATA	GCGGAATTGT	360
ACGTTTCCAC	TTTTTCAAAA	TCTTGAAATC	GTAGATTTTT	CCACTCATCG	AGTGCATGGG	420
GGAGAGTAAT	TTTCTTTTGG	TTATCAAACC	TCTCCTTCAG	AGCTTTCCAA	AGATCTAAGG	480
GATCTTTGGT	TCTCGCATAA	TCATGCGTAA	gattttcatc	TAGATGTCTT	CTCAGAAATA	540
TnACGGRCTT	AGCGTTTTGA	TGAGAGGTTG	ATATATTGCC	TTCTCTTATT	GTTTCGAGTA	600
TTTTCTCGGA	ATCTAGATGA	AGCTCCATGT	TTGTAACCCA	TGCCGTGTAG	TTTGTCCCAG	660
TTACTTCCAA	TGCCGGAAAC	TGAAGTTTCT	CGATTTTTGC	CATTTGTATT	TCTAAAGAAC	720
ATAAATAAAA	ATTATTAGAA	TATTATTCAT	ATTAAAAGAA	ACCGTTTACA	TTGATCATGC	780
AAGCAATTAC	AAGGAGAAGC	GATGTAAAGA	AAAGTAAACC	GATATTCATC	CTAAATTCTC	840
TTGGAGTAAA	TTCTCCAACG	GATAAACCAT	AAATAGAAAC	ACAAATAAAA	ATGGCACATA	900
AAAACAAAAG	TGCGCGAATC	ATCTTTCTTG	AAAAAAAAAA	TCGGAAGAGA	GCGATTTGAA	960
ATTTTTGAGA	GAAGATGAAA	tattttggat	GATGAAATGG	AGTGAAAATG	AGTTGTATTT	1020
ATAGATGAAA	AACACTGTTC	ATAACCGTTG	GAGAAAGGGG	AAATTTTGAA	AAAATTTCTT	1080
TGTGACCGTT	GGGGTTAAAT	CGAGTGCACT	AAAAATCAGT	CTGAGAATAT	CGTATTAAAC	1140
AGTCAATCAA	ATCTATAAAA	TTTCATAAAA	GTAAAAATTA	TGGCAATGAA	ATATTTATGT	1200
TATGACAACA	AATCATGCGA	CGGCTCAGCC	GATCAATGCA	GAGTAATAAA	TAAATTATAC	1260
GGCGGCTCGG	CCGACCAATT	AATAATAAAC	AGAATATAAG	GCGGCTCGGC	CGACCAATAA	1320
ATAATAAACA	GAATATAAGG	CGGCTCGGCC	GACCATTAAT	AAATTAAATT	ATTAGTAAAT	1380
AATATAGGCG	GTATTCCGGC	CATTATAACA	TAATATAAAT	AATAGTAGAG	GCGGTATACC	1440
GACCATTATA	ACAGGGTATA	AATGATACAA	ATAAATTTTA	CCGAATCGCA	GAGTGATCGT	1500
GCTGATAACG	TGTTATGAAA	ATAACTGAAA	TTTTATTATA	TCGCGGGAAT	TTAAATAAGG	1560
GCAAAATTTT	ATACCCGTAA	AAATTATAAC	ACTGAAAGAA	AGTGTTTATC	TGAGAGAGAA	1620
GGGAAGAGTG	AAGTGTGTTC	TTGAAACGAT	CGAACTTGAT	CGTATATATA	AAGAAAAAAT	1680
CTACTGTGCA	AATAGTGCAG	CGGGCCCCAC	atcatttata	ATTTCAACTT	ATGCGGCGCT	1740
GTGTTCTCTG	ACTTTCATAA	CAAAATTATG	TTATTTGTTT	TAACACAAAA	AAGTAGAAAA	1800
TTATAAAGAA	GAAGAAAATA	ACACATTGAC	CAAAAAGAAG	taaattagtt	ACACCCCAAG	1860
ATTATTGGGC	CCAACTTGTC	TCAAACTAAC	AAGTTAAGCA	TAATGGATCT	CAGAAGGATC	1920
TAGAAACCCT	ATAACGTTTG	TGTATATATA	CGTAACTTGT	CTCTTCACTA	CCTCGCATCT	1980
GCTCTCTCTA	TTATCGTACC	TCCTTGATAA	ACCCTAGATC	TCCCCGATTC	TCAGCAACGA	2040

TG 2042

172 945

Tabela 1

Region promotora HSP80: Końcowe A oznacza początkowe ATG

-2030	-2020	-2010	-2000	-1990	-1980
ATCGATAACC	ACGACCACGA	CCAAAACCAC	GATTGTGACC	ACGGCCACGA	CCACGCCCAC
-1970	-1960	-1950	-1940	-1930	-1920
GATAGGAATA	ATTTCCTTTT	TCCGGATTTT	TTATATCCGT	TGCATTTACC	TCAGGAAATG
-1910	-1900	-1890	-1880	-1870	-1860
CTTTGGTTCC	CGTGGGTCGG	GCATTGTGGT	TTTTAATGAG	GAGTTCATTA	TTTCTCTCCG
-1850	-1840	-1830	-1820	-1810	-1800
CTATTATAAG	cgcca.cagcg	AGTTCAGAGA	acctcgtata	cccacaattt	CTATA.TTGTT
-1790	-1780	-1770	-1760	-1750	-1740
CTTGTAGAAC	ATAATGATTT	TTGTGGAACG	TTTGGTAAGT	TTTCTCGAGC	ATTTCCGCTT
-1730	-1720	-1710	-1700	-1690	-1680
CCGAGACAGG	CTTACCGCAA	TAATCTAATT	GCGCCGCTAT	TCTCAATATA	GCGGAATTGT
-1670	-1660	-1650	-1640	-1630	-1620
ACGTTTCCAC	TTTTTCAAAA	TCTTGAAATC	GTAGATTTTT	CCACTCATCG	AGTGCATGGG
-1610	-1600	-1590	-1580	-1570	-1560
GGAGAGTAAT	TTTCTTTTGG	TTATCAAACC	TCTCCTTCAG	AGCTTTCCAA	AGATCTAAGG
-1550	-1540	-1530	-1520	-1510	-1500
GATCTTTGGT	TCTCGCATAA	TCATGCGTAA	GATTTTCATC	TAGATGTCTT	CTCAGAAATA
-1490	-1480	-1470	-1460	-1450	-1440
TCACGGCCTT	AGCCTTTTCA	TGAGAGGTTG	ATATATTGCC	TTCTCTTATT	GTTTCGAGTA
-1430	-1420	-1410	-1400	-1390	-1380
TTTTCTCGGA	ATCTAGATGA	AGCTCCATGT	TTGTAACCCA	TGCCGTGTAG	TTTGTCCCAG
-1370	-1360	-1350	-1340	-1330	-1320
TTACTTCCAA	TGCCGGAAAC	TGAAGTTTCT	CGATTTTTGC	CATTTGTATT	TCTAAAGAAC
-1310	-1300	-1290	-1280	-1270	-1260
ATAAATAAAA	ATTATTAGAA	TATTATTCAT	ATTAAAAGAA	ACCGTTTACA	TTGATCATGC
-1250	-1240	-1230	-1220	-1210	-1200
AAGCAATTAC	AAGGAGAAGC	GATGTAAAGA	AAAGTAAACC	GATATTCATC	CTAAATTCTC
-1190	-1180	-1170	-1160	-1150	-1140
TTGGAGTAAA	TTCTCCAACG	GATAAACCAT	AAATAGAAAC	ACAAATAAAA	ATGGCACATA
-1130	-1120	-1110	-1100	-1090	-1080
AAAACAAAAG	TGCGCGAATC	ATCTTTCTTG	AAAAAAAAAA	TCGGAAGAGA	GCGATTTGAA

172 945

-1070	-1060	-1050	-1040	-1030	-1020
atttttgaga	GAAGATGAAA	TATTTTGGAT	GATGAAATGG	AGTGAAAATG	AGTTGTATTT
-1010	-1000	-990	-980	-970	-960
ATAGATGAAA	AACACTGTTC	ATAACCGTTG	GAGAAAGGGG	AAATTTTGAA	AAAATTTCTT
-950	-940	-930	-920	-910	-900
TGTGACCGTT	GGGGTTAAAT	CGAGTGCACT	AAAAATCAGT	CTGAGAATAT	CGTATTAAAC
-890	-880	-870	-860	-850	-840
AGTCAATCAA	ATCTATAAAA	TTTCATAAAA	GTAAAAATTA	TGGCAATGAA	ATATTTATGT
-830	-820	-810	-800	-790	-780
TATGACAACA	AATCATGCGA	CGGCTCAGCC	GATCAATGCA	GAGTAATAAA	TAAATTATAC
-770	-760	-750	-740	-730	-720
GGCGGCTCGG	CCGACCAATT	AATAATAAAC	AGAATATAAG	GCGGCTCGGC	CGACCAATAA
-710	-700	-690	-680	-670	-660
ATAATAAACA	GAATATAAGG	CGGCTCGGCC	GACCATTAAT	AAATTAAATT	ATTAGTAAAT
-650	-640	-630	-620	-610	-600
AATATAGGCG	GTATTCCGGC	CATTATAACA	TAATATAAAT	AATAGTAGAG	GCGGTATACC
-590	-580	-570	-560	-550	-540
GACCATTATA	ACAGGGTATA	AATGATACAA	ATAAATTTTA	CCGAATCGCA	GAGTGATCGT
-530	-520	-510	-500	-490	-480
GCTGATAACG	TGTTATGAAA	ATAACTGAAA	TTTTATTATA	TCGCGGGAAT	TTAAATAAGG
-470	-460	-450	-440	-430	-420
GCAAAATIII	aiaCccgtaa	AaATTATaAC	ACTGAaaGAa	AGTGTTTATC	TGAGAGAGAA
-410	-400	-390	-380	-370	-360
GGGAAGAGTG	AAGTGTGTTC	TTGAAACGAT	CGAACTTGAT	CGTATATATA	AAGAAAAAAT
-350	-340	-330	-320	-310	-300
CTACTGTGCA	AATAGTGCAG	CGGGCCCCAC	ATCATTTATA	ATTTCAACTT	ATGCGGCGCT
-290	-280	-270	-260	-250	-240
GTGTTCTCTG	ACTTTCATAA	CAAAATTATG	TTATTTGTTT	TAACACAAAA	AAGTAGAAAA
-230	-220	-210	-200	-190	-180
TTATAAAGAA	GAAGAAAATA	ACACATTGAC	CAAAAAGAAG	TAAATTAGTT	ACACCCCAAG
-170	-160	-150	-140	-130	-120
ATTATTGGGC	CCAACTTGTC	TCAAACTAAC	AAGTTAAGCA	TAATGGATCT	CAGAAGGATC
-110	-100	-90	-80	-70	-60
TAGAAACCCT	ATAACGTTTG	TGTATATATA	CGTAACTTGT	CTCTTCACTA	CTCCGCATCT
-50	-40	-30	-20	-10	-1
GCTCTCTCTA	TTATCGTACC	TCCTTGATAA	ACCCTAGATC	TCCCCGATTC	TCAGCAACG

+ 1 ATG

172 945

Eco RI (51021 iSacI (6)

KpnI <1?)

Xmal /Smal (17) (BamHI/8glIIi20)

Ncil 14334)

Orali 3955) Dra! (3936) (,3⁶⁾

FnuDII(43i)

Ncil (3287) Dra II32M)

Pstl (2014)

Xbal (2266)

Hitidllf (2 4>

Accl(952)

FnuD II11060) Sph 1(1080) (BamHl/Bg III (120D ^4Xba/(i20ó) \j-Sa/I(i2io) \ Pstl (1220)

ECOR 1(1466)

Fig. 2

172 945

Hindlll

PsII

Sali, AccI

Bglll fragment Bgl JJ klonowany do miejsca BamHII wektora^_rii ‘

EcoRKSi.66)

Ssci w;

KpnJ (12)

Xmal/Smal (17) 'BamHl/BglH (20) XbaU68) bal (161) * ΡηνΟΠ fc63)

HctlfW.

mutagenoza in wtro 2 wytworzeniem miejsc restrykcji BamI, SpHI

Pstl (2378) Xbal (2632)

HtntiUI (2638)

£co RI Sac I KpnI

Xmal/Smal eamHI/Bg/B

FnuDK

A pal 11.20)

BamHJ (1454)

Sphl (IkSU (BamHl / Bglll(1565) Xbal 11570) 'Sali (1574)

Pstl (1S8U

EcoRI (1830)

Fi§. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowego konstruktu promotora roślinnego związanego operatywnie z genem heterologicznym, znamienny tym, że łączy się gen heterologiczny z a) promotorem Brassica hsp 80 o długości 1568 par zasad, którego pełna sekwencja przedstawiona jest w tabeli 1, b) jego delęcyjną pochodną, zachowującą aktywność promotora, korzystnie wybraną z grupy 602 Δ3-2, posiadającej delecję regionów - 1568 do -1000 i -488 do -134 oraz z grupy 602 Δ4-9 posiadającej delecję regionów -1548 do -830 i -488 do -134 oraz c) funkcjonalnymi odpowiednikami sekwencji wymienionych w (a) i (b), które hybrydyzują z nimi w ostrych warunkach hybrydyzacji.
2. 2. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako gen heterologiczny stosuje się heterologiczną sekwencję kodującą wybraną z grupy obejmującej geny insekcydalne, geny oporności na herbicydy, geny przeciwdrobnoustrojowe, geny przeciwgrzybicze, geny przeciwwirusowe i geny przeciwfidantowe.