JP2559355B2 - 植物構造遺伝子の発現 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は植物構造遺伝子の発現に関する。

（従来技術） シャトルベクター RuvkunとAusubel（1981）Nature 289:85−88,により
開発されたシャトルベクターは外来遺伝物質を大プラス
ミド，ウイルスまたはゲノムの選ばれた位置に挿入する
方法を可能とする。大プラスミド又はゲノムを扱う場
合,2つの主要問題がある。１つは大プラスミド各制限酵
素の多くの部位を有する。特定の部位特異的切断反応は
再現性がなく，多部位切断反応とそれに続く連結は変化
させたくない多くのフラグメントの順序，方向を混乱さ
せる大きな難点を生ずる。第二に大DNAプラスミドを用
いた形質転換効率は非常に低い。シャトルベクターは，
しばしばインビトロで，外来遺伝物質を小プラスミドに
容易に挿入し，次に通常インビボ技術により，大プラス
ミドに移すことにより，これらの困難を打開することが
可能である。

シャトルベクターは究極の受容細菌へ導入され得る，
通常プラスミドであるDNA分子より成る。それは又，外
来遺伝物質が挿入され得る受容ゲノムのフラグメントの
コピーと，これもまた受容ゲノムフラグメントに挿入さ
れる選択形質をコードするDNAセグメントを含む。選択
形質（“マーカー”）はトランスポソン突然変異誘発ま
たは制限酵素とリガーゼにより容易に挿入される。

該シャトルベクターは究極受容細胞，典型点にはアグ
ロバクテリウム属の細菌，へ三親交雑（RuvkunとAusube
l,前出），二親交雑での自己可動性ベクターの直接移
送，アグロバクテリウム細胞による外部DNAの直接取込
み（M.Holsters et．al．（1978）Molec.Gen.Genet.16
3:181−187の条件を用いる“形質転換”），多の細菌細
胞とアグロバクテリウムのスフェロプラスト融合，リポ
ソーム包括DNAの取込み，またはインビトロでパッケー
ジ可能なウイルス上にあるシャトルベクターの感染，に
より導入される。三親交雑はプラスミド可動と接合移送
に関する遺伝子を有する可動性プラスミドを有する菌株
とシャトルベクターを有する菌株との交雑を含む。もし
シャトルベクターがプラスミド遺伝子により移動可能な
らば，そのシャトルベクターは大ゲノム，例えばアグロ
バクテリウム菌株のTiまたはRiプラスミドを有する受容
細胞へ移される。

シャトルベクターが受容細胞へ導入された後，マーカ
ーのいずれか一方の側での１回の組換えを伴う二重乗換
えが期待される。この現象はマーカーを含むDNAセグメ
ントを受容ゲノムへ移し，挿入物を欠く相同セグメント
と置換することになるだろう，元のシャトルベクターを
欠失した細胞を選択する為に，そのシャトルベクターは
究極受容細胞中で複製が不可能であるか，受容細胞に既
存の独立に選択可能なプラスミドと不和合性でなければ
ならない。この為の１つの共通的な手段はシャトルベク
ターと不和合性でかつ他の薬剤耐性マーカーを有する他
のプラスミドを第３の親に備えることである。従って両
薬剤耐性で選択すると，生存細胞はその中でシャトルベ
クターのマーカーが受容ゲノムと組換えを怒こしたもの
のみである。もしシャトルベクターが余分のマーカーを
持っていれば，シャトルベクターと受容プラスミド間で
の１回の乗換えの結果生じる完全なシャトルベクターが
受容プラスミドに組み込まれたものを有する細胞を選択
し，排除できる。もし外来遺伝物質が選択しようとする
マーカー内か，近接した位置に挿入されていれば，同じ
二重組換の結果，それは受容プラスミドに組み込まれる
であろう。相同フラグメントのマーカー内または近接し
た位置でなく，外来遺伝物質がマーカーから遠く離れて
挿入されている場合，外来遺伝物質とマーカーの間で組
換えが起こり，外来遺伝物質を移せない事も起こるだろ
う。

シャトルベクターはアグロバクテリウムのプラスミド
の操作に有用であることが証明されている。

参照 D.J.Garfinkel et al．（1981）Cell 27:143−1
53,A.J.M.Matzke and M.D.Chilton（1981）J.Molec.App
l.Genet.１:39−49,およびJ.Leemans et al．（1981）
J.Malec.Appl.Genet.１:149−164,ここではシャトルベ
クターを“中間ベクター（intermedeate vectors）”と
呼んでいる。

アグロバクテリウム−概説 グラム陰性細菌，リゾビウム科のアグロバクテリウム
属に，アグロバクテリウム・チューメファシエンス（A.
tumefaciens）種とアグロバクテリウム・リゾゲネス
（A.rhizogenes）種がある。これらの種は夫々植物のク
ラウンゴール病，毛状根病（hairly root disease）の
原因となる。クラウンゴールは未分化組織の瘤（gall）
化に特徴づけられる。毛根は感染組織での異常な根（ル
ート）の誘導により特徴づけられる寄生腫である。両病
において，異状な増殖植物組織は植物により正常には生
産されない通常オピンとして知られている１つまたはそ
れ以上のアミノ酸誘導体を生産し，これは感染細胞によ
り異化される。既知のオピンは３族に分類され，その典
型的なメンバーはオクトピン，ノパリン，アグロピンで
ある。異常増殖組織の細胞は培養により増殖可能であ
り，また適当な条件下で形質転換した表現型を保ちつつ
完全な植物に再生される。

アグロバクテリウムのヴィルレント株はアグロバクテ
リウム・チューメファシエンスではTi（腫瘍誘導;Tumor
−inducing）プラスミド，アグロバクテリウム・リゾゲ
ネスではRi（ルート誘導:rootinducing）プラスミドと
呼ばれる大プラスミドを有する。これらのプラスミドを
菌から消去すると病原性を失う。TiプラスミドはＴ−DN
A（転移DNA）と呼ばれる，腫瘍では宿主植物のゲノム中
に組み込まれている，領域を含むＴ−DNAは数種の転写
物をコードしている。突然変異の研究からこれらのうち
いくつかは腫瘍の増殖の誘導に関与している事が示され
た。tml,tmrおよびtms遺伝子の変異は夫々巨大腫瘍（タ
バコで），ルート出現傾向，シュート誘発傾向を示す。
Ｔ−DNAはまた少なくとも１つのオピンシンセターゼ遺
伝子をコードし、Tiプラスミドは，しばしば，それが合
成し得るオピンにより分類される。各Ｔ−DNA遺伝子は
Ｔ−DNAプロモーターの支持下にある。このＴ−DNAプロ
モーターは真核生物のプポモーターに構造が類似してお
り，形質転換植物細胞でのみ機能するらしい。Taプラス
ミドはまたＴ−DNA領域外にも遺伝子を担っている。こ
れらの遺伝子はオピン異化，発癌性，アグロシン感受
性，複製，細菌細胞への自己輸送の機能に関与してい
る。RiプラスミドはTiプラスミドと類似の構造をとって
いる。植物細胞の形質転換に関与する一連の遺伝子とDN
A配列は以下形質転換誘導因子（TIP）として総合的に呼
ぶ。従ってTIPの名称はTiおよびRiプラスミド両者を包
含有する。TIPの取り込まれたセグメントを，ここでは
Ｔ−DNAと称し,TiプラスミドあるいはRiプラスミドに由
来している。最近のアグロバクテリウム起因病の一般的
総説はD.J.Marlo（1982）,Adv.Plant Pathol.１:139−1
78,L.W.Ream and M.P.Gordon（1982）,Science 218:854
−859,およびM.W.Bevan and M.D.Chilton（1982）,Ann.
Reb.Genet.16:357−384 ; G.Kahl and J.Schell（198
2）Molecular Baiology of Plant Tumorsに述べられて
いる。

アグロバクテリウム−植物組織の感染 植物細胞は既知の多くの方法によりアグロバクテリウ
ムにより形質転換され得る；例えば植物細胞とアグロバ
クテリウムとの共存培養；植物の直接感染；植物プロト
プラストとアグロバクテリウムスフェロプラストの結
合；植物細胞プロトプラストによる遊離DNAの取込みに
よる直接形質転換；部分的に細胞壁を再生しているプロ
トプラストの完全な細菌による形質転換；プロトプラス
トのＴ−DNA含有リポソームによる形質転換;T−DNAを保
持するウイルスの利用；ミクロインジェクション等。ど
の方法も遺伝子が確実に発現される限り充分であり，有
糸分裂および減数分裂を通じて安静に伝達される。

植物組織のアグロバクテリウムによる感染は熟練した
技術者には公知の単純な技術である。（例えばD.N.Butc
her et al．（1980）in Tissue Culture Methods for
Plant Pothologists,eds.:D.S.Ingranms and J.P.Helge
son,pp.203−208参照）。植物は種々のどの方法によっ
ても傷つけられる，例えば刃で切る，針で穴をあける，
あるいは研磨剤で摺るなど。次いで傷口を腫瘍誘導細菌
を含む溶液で感染させる。完全な植物を感染させる他の
方法はジャガイモの塊茎小片（D.K.Anand and G.T.Herb
erlein（1977）Amer.J.Bot.64:153−158）またはタバコ
茎の断片（Binns et al．）などの組織の小片を植えつ
けることである。誘導後，腫瘍は植物ホルモンを含まな
い培地で組織培養され得る。ホルモン非依存性増殖は形
質転換植物組織の典型であり，培養組織の増殖の通常の
条件とは大いに対照的である（A.C.Braun（1956）Cance
r Re.16:53−56）。

アグロバクテリウムまたは単離細胞および培養細胞
（Marton et al．（1979）Nature 277:129−131）およ
び単離したタバコ葉肉プロトプラストを感染させ得る。
後者の技術では，新しい細胞壁を一部再生させる時間を
おいて，次いでアグロバクテリウム細胞を培養に加え，
後，抗生物質を添加し殺した。アグロバクテリウム・テ
ューメファシエンス細胞に接触し,Tiプラスミドを保持
した細胞のみホルモンを含まない培地にプレートしたと
きカルスを形成した。大部分のカルスはオピン同化に関
する酵素活性を有していた。他の研究者（R.B.Horsch a
nd R.T.Fraley（18 Lanuary 1983 15th Miami Winter S
ymposium）は共存培養により，形質転換しホルモン非依
存性増殖するカルスを高頻度（10％以上）で得，カルス
の95％がオピンを作った。M.R.Davey et al．（1980）
in Ingram and Helgeson,前出,pp.209−219,はプロトプ
ラストから再生した老細胞の感染について述べている。

植物プロトプラストはTIPプラスミドの直接取込みに
より形質転換され得る。M.R.Davey et al.（1980）Pla
nt Sci.Lett.18:307−313,およびM.R.Davey et al．
（1980）in Ingram and Helgeson,前出，はペチュニア
のプロトプラストをポリ−Ｌ−α−オルニチン存在下で
Tiプラスミドで形質転換し，培養によりオピン合成とホ
ルモン非依存性増殖の表現型を示した。その後，ポリエ
チレングリコールがTi取込みを促進し，あるＴ−DNA配
列がゲノムに取り込まれることが示された（J.Draper e
t al．（1982）Plant and Cell Physiol.23:451−458,
M.R.Davey et al．（1982）in Plant Tissue Culture
1982,ed:A.Fujiwara,pp.515−516）。F.A.Krens et a
l．（1982）Nature 296:72−74は同様の結果をポリエチ
レングリコール次いでカルシウムショックによる方法で
報告したが，彼らの結果では取り込まれたＴ−DNAはTi
プラスミド配列の近接部分を含んでいた。

DNAを取り込ませる他の方法にリポソームの使用があ
る。DNA含有リポソームの調製はPapahadjopoulosの米国
特許第4,078,052号と第4,235,871号にあるTi−DNAをリ
ポソームによる導入する方法が報告されている（T.Naga
ta etal．（1982）in Fujiwara,前出,pp509−510および
T.Nagata（1981）Mol.Gen.Genet.184:161−165）。類似
の系に細胞壁を除去した植物と細菌の細胞の融合があ
る。この技術の例はS.Hasezawa et al．（1981）Mol.G
en.Genet.182:206−210により報告されているアグロバ
クテリウムのスフェロプラストによるツルニチニチソウ
（Vinca）の形質転換である。植物プロトプラストは細
胞壁が不完全なアグロバクテリウム細胞を取り込むこと
ができる。（S.Hasezawa et al．（1982）in Fujiwar
a,前出,pp517−518）。

Ｔ−DNAは２つのプロトプラストの融合による再生し
た組織に移り，一方のみが形質転換される（G.J.Wullem
s et al．（1980）Theor.Appl.Genet.56:203−208）。
植物の再生の項で詳しく述べるように,T−DNAは減数分
裂でも伝わり，単純なメンデル法則に従って子孫に伝達
される。

アグロバクテリウム−植物の再生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫
瘍から得られた。A.C.Braun and H.N.Wood（1976）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 73:496−500,はタバコ奇形腫（te
ratomas）を正常な植物につぎ木し，正常に見える開花
し得るシュートを得た。このシュートは培地におくと，
オピン生成能と，植物ホルモン非依存増殖能を保持し
た。選択された植物では，これら腫瘍表現型は子孫に伝
達されないようで，多分減数分裂の間に消失した。（R.
Turgeon et al．（1976）Proc. Natl.Acad.Sci.USA 7
3:3562−3564）。自然に腫瘍の性質を失った，あるいは
奇形腫の種から生じた植物は，当初すべてのＴ−DNAを
失ったように思われていた（F.−M.Yang et al．（198
0）In Vitro 16:87−92,F.Yang et al．（1980）Mole
c.Gen.Genet.177:707−714,M.Lemmers et al．（198
0）J.Mol.Biol.144:357−376）。しかしホルモン（1mg/
カイネチン）処理後復帰した植物を用いた後の研究
で，減数分裂を経た植物は形質転換表現型に関するＴ−
DNA遺伝子は失っているがＴ−DNAの両端に相同性のある
配列を維持していた。（F.Yang and R.B.Simpson（198
1）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:4151−4155）。G.J.Wul
lems et al．（1981）Cell 24:719−724,はさらにオピ
ン同化に関する遺伝子は，その植物は雄性不稔である
が，減数分裂を通して伝わること，そしておそらくＴ−
DNAはそのままメンデル法則に従って遺伝し得ることを
示した。（G.Wullems et al．（1982）in A.Fujiwara,
前出）。L.Otten et al．（1981）Molec.Gen.Genet.18
3:209−213,はシュートを生じる腫瘍生成にtms（シュー
ト誘導）遺伝子壁でのTn7トランスポソン起因Tiプラス
ミド変異を用いた。これらのシュートが植物中で再生す
る自己稔性花を生じた。着生した種が発芽した植物はＴ
−DNAを有しオピンを生成した。tmr（ルート誘導）変異
を用いた同様の実験で全Ｔ−DNAが減数分裂を通して子
孫に伝わり，これら子孫で程度にバラツキがあるが，ノ
パリン遺伝子が発現すること，また同時に伝達された酵
母のアルコール脱水酵素Ｉ遺伝子は発現しないことが示
された。（K.A.Barton et al．（1983）Cell 32:1033
−1043）。Ｔ−DNA配列を欠く再生組織はおそらく腫瘍
に混在していた非形質転換細胞の子孫であるらしい。
（G.Ooms et al．（1982）Gell 30:589−597）。アグ
ロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換の結果生じ
たルートは比較的容易に苗に再生することが示された。
（M.−D.Chilton et al．（1982）Nature 295:432−43
4）。

アグロバクテリウム−TIPプラスミド上の遺伝子 TIPプラスミドのＴ−DNA内に多数の遺伝子が同定され
た約半ダースのオクトピンプラスミドＴ−DNA転写物が
マッピングされ（S.B.Gelvin et al．（1982）Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 79:76−80,L.Willmitzer et al．（1
982）EMBO J.１:139−146），またいくつかの機能が明
確にされた（J.Leemans et al．（1982）EMBO J.１:14
7−152）。オクトピン型プラスミドの４つの遺伝子がtm
s,tmrおよびtmlを含むトランスポソン変異誘発により充
分明確になった。（D.J.Garfikel et al．（1981）Cel
l 27:143−153）。これらの遺伝子に変異をもつTiプラ
スミドはニコチニア・タバカムの腫瘍カルスを刺激し，
シュートを生じ，ルートを生じ，そして正常より大きく
なる。他の宿主では，これら遺伝子の変異は異なった表
現型を誘導し得る（Chilton,M.D.Ann.Rev.Genet（198
2）参照）。tmsとtmrの表現型は腫瘍に存在する植物ホ
ルモンレベルの差異と相関いている。サイトカイニン：
オーキシン比の相違は培養で非形質転換カルス組織でシ
ュートまたはルート形成を誘導した場合と類似してい
る。（D.E.Akiyoshi et al．（1983）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 80:407−411）。tmsまたはtmrどちらか一方の
みの機能遺伝子を持つＴ−DNA（機能するtmlのみの場合
ではないが）は，明白な腫瘍増殖を刺激し得る。シュー
トとルートの刺激は機能tmlにより夫々促進と阻害を受
ける。（L.W.Ream et al．（1983）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80:1660−1664）。Ｔ−DNA遺伝子の変異が植物ゲ
ノムへのＴ−DNAの挿入に影響することはないようであ
る（J.Leemans et al．（1982）同上;L.W.Ream et a
l．（1983）同上）。オクトピンシンセターゼをコード
するOCS遺伝子はH.De Greve et al．（1982）J.Mol.Ap
pl.Genet.１:499−511,により塩基配列が決定された。
これはイントロン（真核遺伝子に共通して見られる介在
配列で転写後mRNAのプロセッシングの間にメッセンジャ
ー前駆体から除かれる）を有していない。また真核の転
写シグナル（TATAボックス）とポリアデニル化部位があ
る。オクトピンシンセメーゼを有する植物細胞をホモア
ルギニンを無毒化するので,OCS遺伝子は外来DNAによる
形質転換された植物細胞の有効な選択マーカーとなるだ
ろう。（G.M.S.Van Slogteren et al．（1982）Plant
Mol.Biol.１:133−142）。ノパリンTiプラスミドはノパ
リンシンセターゼ遺伝子（nos）をコードしており、nos
はA.Depicker et al．（1982）J.Mol.Appl.Genet.１:5
61−573,により配列が決定された。OCS遺伝子と同様nos
もイントロンがない。２つのポリアデニン化部位の候補
とTATAボックスとなり得る配列がある。OCSと対照的にn
osの上流にはCATボックスとして知られる転写シグナル
らしい配列がある。J.C.McPhersson et al．（1980）P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2666−2670,はクラウンゴー
ル組織のＴ−DNAがコードするmRNAのインビトロ翻訳を
報告した。

毛根Ｔ−DNAの転写もまた検出された（L.Willmitzer
et al．（1982）Mol.Gen.Genet.186:16−22）。機能的
には毛根症候群はtmrの変異したTiプラスミドによりも
たらされるクラウンゴール腫瘍と同等のようである。
（F.F.White and E.W.Nester（1980）J.Bacteriol.144:
710−720）。

真核生物において,DNAのメチル化（特にシトシン残基
の）は転写不活性化と相関している。比較的メチル化が
少ない遺伝子はmRNAに転写される。Gelvin et al．（1
983）Nucleic Acids Res.１:159−174,はクラウンゴー
ル腫瘍のＴ−DNAは常に少なくともメチル化されていな
い１コピーが存在する事を見出した。同じゲノムがメチ
ル化されている多くの他のＴ−DNAコピーを含むという
事は１つ以上の過剰のＴ−DNAのコピーは生物学的に不
活性である事を示唆する（G.Ooms et al．（1982）Cel
l 30:589−597も参照）。

TiプラスミドはＴ−DNA領域の外側にあり，感染過程
に必要な他の遺伝子をコードしている。（ノパリンプラ
スミドについてはM.Holsters et al．（1980）プラス
ミド３:212−230,オクトピンプラスミドについてはH.De
Greve et al．（1981）プラスミド６:235−248,D.J.G
arfinkel and E.W.Nester（1980）J.Bacteriol 144:732
−743,およびG.Ooms（1980）J.Bacteriol 144:82−91参
照）。最も重要なのはonc遺伝子で，これが変異するとT
iプラスミドの発癌性を失わせる。（これらの遺伝子座
はビルレンスに関する言葉virとして知られている）。o
nc遺伝子はトランスに作用し，異なったプラスミド型で
物理的に他のプラスミドに局在しているＴ−DNAでの植
物細胞の形質転換を引き起こし得る。（J.Hille et a
l．（1982）プラスミド７:107−118,H.J.Klee et al．
（1982）J.Bacteriol 150:327−331,M.−D.Chilton（18
January 1983）15th Miami Winter Symp.）。ノパリン
TiDNAはTiプラスミドからの切出し，または宿主ゲノム
への取込みに関与するらしく,T−DNAの左または右側の
境界に極めて隣接している約25塩基対の順方向繰り返し
配列（direct repeat）を有する（N.S.Yadav et al．
（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:632−6326），そ
して類似配列がオクトピンＴ−DNA境界に隣接した場所
に見つかっている（R.B.Simpson et al．（1982）Cell
29:1005−1014）。オピン同化はオクトピンおよびノパ
リン型プラスミドの夫々occおよびnoc遺伝子により特徴
づけられる。Tiプラスミドはまた複製開始点を含むそれ
自身の増殖に必要な機能をもコードしている。Tiプラス
ミド転写物はS.B.Gelvin et al．（1981）プラスミド
６:17−29,により，アグロバクテリウム・テューメファ
シエンス細胞中に見出されており，彼らはＴ−DNA領域
が非Ｔ−DNA配列に沿って弱く転写されることを見つけ
た。Tiプラスミドにより支配される性質はMerlo,前出
（特に第２表参照）およびReam and Gordon,前出，によ
りまとめられている。

アグロバクテリウム−TIPプラスミドDNA 種々のオクトピン型Tiプラスミドは互いにほぼ100％
相同性があることがDNAハイブリダイゼーション（T.C.C
urrier and E.W.Nester（1976）J.Bacteriol.126:157−
165）または制限酵素解析（D.Sciaky et al．（1978）
プラスミド１:238−253）により調べられた。ノパリン
型Tiプラスミドは互いに少なくとも67％相同性がある
（Currier and Nester,前出）種々のRiプラスミドは互
いに非常に相同性があることが明らかとなった（P.Cost
antino et al．（1981）プラスミド５:170−182）。N.
H.Drummond and M.−D.Chilton（1978）J.Bacteriol.13
6:1178−1183,はオクトピンおよびノパリン型Tiプラス
ミドは比較的狭い部分に互いに相同性があることを示し
た。これらの相同性はG.Engler et al．（1981）J.Mol
Biol.152:183−208により詳しくマップされた。彼らは
４つの類似領域の３つは更に３（Ｔ−DNAにまたがる）,
4（いくつかのonc遺伝子を含む），および９（onc遺伝
子を有する）の類似領域に細分化されることを見出し
た。連結している相同領域は少なくともtra遺伝子（Ti
プラスミドの他の細菌細胞への接合伝達に関与する）
と，複製および不和合性に関する遺伝子とを含む。この
領域はリゾビアッシー料の別の属であるリゾビウムの一
種から分離されたSymプラスミド（共生窒素固定に関与
する）と相同性がある（R.K.Prakash et al．（1982）
プラスミド７:271−280）。４つの領域の順序は保存さ
れていないが，いずれも同一方向に配置している。Ｔ−
DNA配列の一部はノパリンおよびオクトピンプラスミド
間で極めて良く保存されている（M.−D.Chilton et a
l．（1978）Nature 275:147−149,A.Depicker et al．
（1978）Nature 275:150−153）。Riプラスミドはそれ
らの間，およびオクトピン（F.F.White and E.W.Nester
（1980）J.Bacteriol.144:710−720）とノパリン（G.Ri
suleo et al．（1982）プラスミド７:45−51）の両Ti
プラスミドとにかなり相同性がある。その領域はおもに
onc遺伝子をコードしている領域である。Ri Ｔ−DNAは
Tiプラスミドの両型のＴ−DNAに弱いながらも，かなり
相同性がある。（L.Willmitzer et al．（1982）Mol.G
en.Genet.186:3193−3197）。未感染のニコチニア・グ
ラウカの植物DNAはcT−DNA（細胞のＴ−DNA）と呼ばれ
る配列を含んでおり、Ri T−DNAの一部と相同性があ
る。（F.F.White et al．（1983）Nature 301:348−35
0）。

Ti（M.−D.Chilton et al．（1977）Cell 11:263−2
71）またはRi（M.−D.Chilton（1982）Nature 295:432
−434,F.F.White et al．（1982）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 79:3193−3197,L.Willmitzer（1982）Mol.Gen.Ge
net.186:16−22）プラスミドの一部分は腫瘍植物細胞の
DNAに見出される。転移したDNAはＴ−DNAとして知られ
ている。Ｔ−DNAは核内（M.P.Nuti et al．（1980）Pl
ant Sci.Lett.18:1−6,L.Willmitzer et al．（1980）
Nature287:359−361,M.−D.Chilton et al．（1980）P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4060−4064）の宿主DNA（M.
F.Thomashow et al．（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.USA
77:6448−6452,N.S.Yadav et al．（1980）Nature 28
7:458−461）に取り込まれる。

M.F.Thomashow et al．（1980）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 77:6448−6452,およびM.F.Thomashow et al．
（1980）Cell 19:729−739,はオクトピン型Tiプラスミ
ドのＴ−DNAはＴ−DNAの左と右の夫々TL−DNAおよびTR
−DNAの２つの別の場所に取り込まれることを見出し
た。TRおよびTLのコピー数は変動し得る（D.J.Merlo et
al．（1980）Molec,Gen.Genet.177:637−643）。Ｔ−
DNAの中芯（core）は，ノパリンＴ−DNAと相同性が高く
（Chilton et al．（1978），前出，およびdepicker e
t al．（1978）前出），腫瘍維持に必要で,TLに見ら
れ，一般的に細胞当り１コピー存在し，そしてtms,tmr
およびtml遺伝子をコードする。他方,TRはコピー数は多
い（D.J.Merlo et al．（1980）前出）が，まったく不
要である。（M.De Beuckeleer et al．（1981）Molec,
Gen.Genet.183:283−88,G.Ooms et al．（1982）Cell
30:589−597）。G.Ooms et al．（1982）プラスミド
７:15−29によれば、TRがTiプラスミドから欠失しても
アグロバクテリウム・チューメファシエンスはヴィルレ
ンスを保っているが,TRがＴ−DNA取込みに関与すると想
定されている。G.Ooms et al．（1982）Cell 30:589−
597により,T−DNAは植物ゲノムに取り込まれた後，特に
欠失するが，一般に安定であること，またＴ−DNA構成
が異なる混成細胞を含む腫瘍は複数の形質転換現象の結
果であることが示された。ocsはTLに存在する。しか
し，腫瘍増殖に関連する表現型を失うことなく植物ゲノ
ムから欠失させ得る。組み込まれたTLの左端は順または
逆向きの繰り返しＴ−DNA配列から成る。（R.B.Simpson
et al．（1982）Cell 29:1005−1014）。

オクトピン型腫瘍の状況とは対照的にノパリンＴ−DN
Aは一連のフラグメントで宿主ゲノムに組み込まれる。
（M.Lemmers et al．（1980）J.Mol.Biol.144:353−37
6,P.Zambryski et al．（1980）Science 209:1385−13
91）。順方向繰り返し配列が観察された。寄生腫から生
じた植物のＴ−DNAは挿入DNAの端のフラグメントにわず
かな修飾がある（Lemmers et al.,前出）。右端と左端
の間の結合部の配列の解析から多くの順繰り返し配列と
１つ逆繰り返し配列が明らかになった。後者は結合部に
またがっている（Zambryski et al．（1980）前出）。
左端の結合部は少なくとも70塩基対（bp）が変動するこ
と，一方，右結合部は1bpのみの変動である（P.Zambrys
ki et al．（1982）J.Molec.Appl.Genet.１:361−37
0）。繰り返し配列の結合部の左および右端は130bp以上
のスペーサーにより分断されている。このスペーサーの
由来は不明であり，あるＴ−DNA配列を含んでいる。Ｔ
−DNAは繰り返し配列と低コピー数宿主配列の両者に組
み込まれている。

N.S.Yadav et al．（1982）Proc.Natl3Acad.Sci.USA
79:6322−3626,T−DNAの左端のすぐ外側のノパリンTi
プラスミド内にchi部位を見出し，こればバクテリオフ
ァージλで10Kbp離れているまわりのDNAで一般組み換え
を増大させる。R.B.Simpson et al．（1982）Cell 29:
1005−1014,はオクトピンtiプラスミド内にchi配列を見
出さなかったが，配列を決定した領域の外側に存在する
可能性を排除できない。Tiプラスミドでのchiの意義は
不明である。もしchiが機能を有しているとすれば,chi
がＴ−DNA内にないので，恐らく植物ではなくアグロバ
クテリウム細胞内で用いられているだろう。

アグロバクテリウム−TIPプラスミドの操作 シャトルベクターの項で詳しく述べるように，変化さ
せたDNA配列をTIPプラスミドの望みの場所に導入する技
術が開発された。トランスポソンはこの技術で容易に挿
入される。（D.J.Garfinkel et al．（1981）Cell 27:
143−157）。J.−P.Hernalsteen et al．（1980）Natu
re 287:654−656,はTiプラスミドのＴ−DNAに挿入され
たDNA配列（ここでは細菌のトランスポソン）受容植物
ゲノムへ移され，取り込まれることを示した。腫々の起
源の多くの外来DNAが挿入されたが，これまで，その遺
伝子は自身のプロモーターの支配下で発現したかった。
これらの遺伝子には酵母のアルコール脱水素酵素（Ad
n）（K.A.Barton et al．（1983）），トウモロコシの
AdhI（J.Bennetzen,未発表）とゼイン，哺乳類のインタ
ーフェロンとグロビン，哺乳類のウイルスSV40（J.Sche
ll,未発表）などがある。M.Holsters et al．（1982）
Mol.Gen.Genet.185:283−289,によれば,T−DNAに挿入さ
れた細菌のトランスポソン（Tn7）が植物ゲノムに取り
込まれた後，完全な機能を有し，多分変化していない形
で回収された。

TIPプラスミド内で欠点を種々の方法で起せる。シャ
トルベクターを標準の組み換えDNA技術でつくられた欠
失の導入に用いることができる。（Cohen and Boyer US
Pat.4.237,224）。前もって決められた一方の端の欠失
はトランスポソンの誤った切出しによりつくることがで
きる（B.P.Koekman et al．（1979）プラスミド２:347
−357,G.Ooms et al．（1982）プラスミド７:15−2
9）。J.Hille and R.Schilperoot（1981）プラスミド
６:151−154,は前もって決められた位置での両端を有す
る欠失は２つのトランスポソンを用いてつくれることを
示した。この技術はまたイソビボで“組み換えDNA分
子”の構築に用いられる。

ノパリンシンセターゼ遺伝子が，形質転換された植物
細胞を選択するのに用いられる薬剤耐性をコードするDN
Aセグメントの挿入に用いられた。M.Bevan（M.D.Chilto
n et al．（18 January 1983）15th Miami Wihter Sym
p.,により報告された；およびJ.L.Marx（1983）Science
219:830参照）とR.Horsch et al．（（18 January 19
83）15th Miami Wihter Symp.,およびMarx,前出，参
照），はTn5のカナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ）をノパリンプロモータ
ーの後に（その制御下に）挿入した。その作成には培養
でカナマイシンおよびG418のようなアナログ耐性になる
よう植物細胞を形質転換する方法がとられた。J.Schell
et al．（18 January 1983）15th Miami Wihter Sym
p.（Marx,前出，も参照），は同様の作成法を報告し，
そこではTn7のメトトレキレート耐性遺伝子（ジハイド
ロフォレート レダクターゼ）がノパリンシンセターゼ
プロモーターの後につながれた。形質転換細胞はメトト
レキセート耐性であった。オクトピンシンセターゼを有
する植物細胞は毒性化学物質，ホモアルギニンに耐性で
あり,G.M.S.Van Slogteren et al．（1982）Plant Mo
l.Biol.１:133−142,はこの酵素を洗濯マーカーに用い
ることを提案した。

M.−D.Chilton et al．（1983），前出，はA.Defrem
euが“小Ti（mini−Ti）プラスミド”を作成したと報告
した。ノパリンＴ−DNAにはまともには１ケ所の制限酵
素Kpn Iの切断部位がある。この部位を欠く変異がつく
られ，完全なノパリンＴ−DNAをKpn Iフラグメントが単
離された。このフラグメントはカナマイシン耐性遺伝子
と共にpRK290に挿入され，アグロバクテリウム・チュー
メファシエンス内で維持され，すべての非Ｔ−DNA配列
を欠く，プラスミドが得られた。それ自身では，このプ
ラスミドは植物細胞を形質転換できなかった。しかし，
オクトピンTiプラスミドを持つアグロバクテリウム・チ
ューメファシエンス株に入れると，オクトピンとノパリ
ン両方を合成する腫瘍が誘導された。これはノパリンTi
プラスミド機能の消失がオクトピンTiプラスミドにより
相補されたこと，およびノパリン“小Ti"は植物細胞を
形質転換する能力があったことを示す。Chilton et a
l．（1983），前出，はまた小TiをSma Iで切り，ノパリ
ンシンセターゼ遺伝子とその左および右端以外はすべて
のＴ−DNAを欠失した。“微Ti"（micro−Ti）を作成し
た。この微TiはSma I部位を欠くpRK290プラスミド誘導
対に挿入され，小Tiと同様にして用いられ，匹敵する結
果を得た。

H.Lorz et al．（1982）in Plant Tissue Culture 1
982,ed:A.Fujiwara,pp.511−512,はDNA取込みと維持にT
IP系が見掛け上無関係なプラスミドベクターを作り，マ
ーカーとしてノパリンシンセターゼ遺伝子を用いた。

フォセオリンと遺伝子調節 一般に高等真核生物の遺伝子は高度に調節されてい
る。植物のような多細胞器官は多くの分化した組織を有
し，夫々は特有の遺伝子産物を要求する特有の機能を持
つ。そのような組織の１つに子要（cotyledon）があ
る。豆果（legumes）では子葉は，発芽の間に必要とな
るまで，脂質，炭水化物，無機物および蛋白質などを保
存する種の貯蔵器官である。フォセオラス・ブルガリス
L.（フレンチビーン，インゲン豆（kidny bean），乾燥
白豆（navy,bean），緑豆（green bean）などの名でも
知られる）では，主要貯蔵蛋白質はフォセオリンであ
る。この蛋白は極めて類似しかつ互いに等量の小数の分
子種から成る。フォセオリンは乾燥豆の主要な栄養価を
担っており，しばしば乾燥重量の10％以上を占める。

フォセオリンはフォセオラス・ブルガリスの生活環の
間で高度に調節されている。この蛋白は種がさやの中で
生ずる間でのみつくられ，そのレベルは遺伝的に決まっ
た合成のスケジュールに従い検出限界の低い値から種の
蛋白の半分を占めるまで，上昇する。そのピークではフ
ォセオリン合成は子葉細胞の蛋白合成の80％以上にも達
する。他の時期には，また他の組織では，フォセオリン
合成は検知できない。世界的な栄養源の重要性に伴いフ
ォセオリンの調節の仕組みは，フォセオリンの研究，そ
の性質およびその調節に大いに興味をそそる。

（発明の目的） ここに開示の発明により，植物遺伝子を導入し,T−DN
Aプロモーターの支配下で，そこで発現する遺伝的に修
飾された植物細胞により成る植物が提供される。さら
に，本発明は植物細胞を含む植物組織を提供する。この
植物細胞のゲノムはＴ−DNAプロモーターの支配下で植
物細胞内で発現するようにＴ−DNAプロモーターに関し
て方向と間隙をもって挿入された植物構造遺伝子を含む
Ｔ−DNAを有する。本発明は，また,T−DNA（ここではＴ
−DNAプロモーターの支配下で植物細胞内で発現するよ
うに,T−DNAプロモーターに関して方向と間隔をもった
挿入植物構造遺伝子を含むように修飾されたＴ−DNAと
定義される）を含みかつ複製する新規な細菌株を提供す
る。さらに本発明はエセリシア・コリー内で複製能を有
し,T−DNAを含み，さらに植物細胞内でＴ−DNAプロモー
ターの支配下で発現するようにプラスミド内に含まれる
Ｔ−DNAに挿入された植物構造遺伝子を含む新規なプラ
スミドを提供する。

ここに示された実験的研究はＴ−DNAを介して導入後
Ｔ−DNAプロモーターの支配下で植物細胞内で植物構造
遺伝子が発現する。即ち，既知の方法によりＴ−DNAに
Ｔ−DNAプロモーター支配下で植物構造遺伝子を挿入
し，その挿入物を含むＴ−DNAを植物細胞に導入するこ
とにより行ったものであるが，最初の例であるを信ず
る。ここに示された実験はまた，イントロンを含む植物
構造遺伝子がＴ−DNAを介して導入された植物細胞内で
Ｔ−DNAプロモーターの支配下で発現した最初の例を提
供するものと信ずる。これらの結果はＴ−DNAプロモー
ター支配下で発現する既報の遺伝子は,T−DNA内生遺伝
子であれ，挿入外来遺伝子であれ，現在知られている限
りイントロンを含まないという事実から見れば驚くべき
事である。この結果はまた植物構造遺伝子が適当な条件
下でＴ−DNAに導入された時,T−DNAプロモーターは植物
構造遺伝子の発現を制御する機能を果たすという例を従
来技術では示し得なかったという観点から，容易に考え
られえないものである。本発明は他の植物種または株か
ら有用な植物構造遺伝子を導入し，植物組織または全植
物体を遺伝的に修飾するのに有用である。このような有
用植物構造遺伝子は貯蔵蛋白質，レクチン，病気，昆虫
および除草剤に対する耐性因子，環境ストレスに対し耐
性を与える因子などの遺伝子，さらに特異的芳香剤の遺
伝子などを含むが，これらに限らない。本発明は豆類，
ファセオラス・ブルガリス L.の主たる種の貯蔵蛋白質
であるフォセオリン構造遺伝子をヒマワリやタバコの植
物細胞への導入と発現という例を提供する。植物構造遺
伝子がＴ−DNAプロモーターの支配下で発現する植物細
胞が一度得られれば，植物組織および全植物体を当該分
野で既知の方法と技術を用いて再生させ得る。再生した
植物は次いで通常の方法で増殖し，像入された遺伝子は
通常の植物改良技術により他の植物や培養物へ移され
る。例えば，ファセオリン構造遺伝子の導入，発現はア
ルファルファのような馬糧作物蛋白含量，栄養価の向上
に用いることができる。本発明の他の用途，即ち，他の
植物種への導入された他の構造遺伝子の性質の開拓など
は当業者にとって容易なことである。本発明によれば，
原理的には，いかなる植物構造遺伝子も,T−DNAへの導
入が可能でかつ安定に複製維持されうるいかなる植物種
へ導入されうる。一般にこれらの種に以下のものがある
が，それに限定されない，即ちヒマワリ（コンポシテ
科），タバコ（ソラナシ科），アルファルファ，大豆お
よび他のマメ類（レグミノシ科）および大部分の野菜類
などのような双子葉植物である。

（発明の構成） 明細書と特許請求の範囲に使用する意図と範囲に関し
て不明瞭さを除くために，以下の定義を行う。

Ｔ−DNA:植物ゲノムに組み込まれる腫瘍誘導因子（TI
P）由来のDNAセグメント，ここで用いる時，この用語は
アグロバクテリウム・チューメファシエンスおよびアグ
ロバクテリウム・リゾゲネスを含むアグロバクテリウム
のいかなる腫瘍誘導株に本質的に由来するDNAを含む。
後者の菌株の挿入セグメントを従来は時々Ｒ−DNAと呼
んでいた。さらにここで用いるＴ−DNAという用語は自
然発生または実験質操作による，いかなる変化，修飾，
変異，挿入，脱落をも含む。修飾に関する基本的な構造
上の要件および限定は，自然に発生するＴ−DNAの右端
および左端が充分量存在しその結果,T−DNAの特徴であ
る形質転換された植物細胞ゲノム内への安定な組み込み
という期待される機能が確実に果たされるということで
ある。さらにＴ−DNAは挿入された植物構造遺伝子の転
写の開始および翻訳の開始を制御するに充分に完全な形
のＴ−DNAプロモーターを少なくとも含まなければなら
ない。できれば，そのプロモーターに関して，そこへ挿
入された植物構造遺伝子が直接または融合蛋白として，
そのプロモーターの支配下で発現するような位置にある
べく，挿入部位はそのプロモーターにより開始される転
写と翻訳の方向で“下流”にあるのがよい。

植物構造遺伝子：ここでの使用は植物の蛋白，ペプチド
またはその一部をコードするが，通常プロモーと称され
る転写開始，翻訳開始を調節する植物遺伝子の機能要素
を欠く,DNAセグメントを含む植物遺伝子の部分を言う。
植物構造遺伝子は１つまたはそれ以上のイントロンを含
むかもしれないし，また分断されないコード配列から成
るかもしれない。植物構造遺伝子は完全にまたは部分的
に植物のゲノムDNA,cDNAおよび化学合成されたDNAに由
来するだろう。さらに植物構造遺伝子はコード領域に，
またはイントロンに発現産物の化学構造，発現速度或い
は発現調節様式に影響し得る修飾を含むことができると
期待される。そのような修飾は変異，挿入，欠落および
“静（silent）”修飾を含むが，それに限らない。この
静修飾は発現産物の化学構造を変化させないが，発現産
物の細胞内局在性，輸送，分泌または安定性などに影響
する。構造遺伝子は複数の起源に由来するセグメントの
混成物でありうる。それは自然的に発生するかもしくは
混成蛋白をコードする。この混成蛋白は植物蛋白の一部
を成している。

Ｔ−DNAプロモーター：挿入Ｔ−DNAと一般に相関してい
る，いかなる自然に生ずるプロモーターをも指す。これ
はＴ−DNAのTIP起源の部分に依存して，オクトピン シ
ンセターゼ遺伝子，ノパリン シンセターゼ遺伝子,Tm
s,Tml,Tmr遺伝子を含むし，これに限らない。Ｔ−DNAプ
ロモーター支配下での発現は，直接発現の形をとるかも
しくは融合蛋白発現の形をとりうる。直接発現において
は，正常にはそのプロモーターにより制御されている構
造遺伝子が除かれ挿入植物構造遺伝子に置換され，開始
コドンはＴ−DNAの構造遺伝子の残りまたは挿入植物構
造遺伝子の一部として提供される。融合蛋白発現におい
ては，植物構造遺伝子の一部または全てがえ存在するＴ
−DNA構造遺伝子内で正しい翻訳フレームで挿入され
る。後者の場合，発現産物は融合蛋白と呼ばれる。

植物組織：根，芽，花粉，種，クラウンゴールのような
腫瘍組織および胚，カルスのような培養植物細胞の種々
の形の集合物を含む植物の分化，未分化の組織を含む。

植物細胞：栽培植物細胞，培養植物細胞およびプロトプ
ラストを含む。Ｔ−DNAを介して導入された植物構造遺
伝子を発現する遺伝的修飾植物の生産は本願明細書の開
示事項を当該分野に既知な種々の技術および経験を合併
したものである。多くの例において，別の手段が全過程
の各段階に存在する。手段の選択は基本的TIPの選択，
修飾される植物種，希望する再生方法など要素に依存
し，それらにはいずれも当業者が望む結果を達成する為
に選択し用い得る別のプロセス段階がある。本発明の基
本的な特徴な植物構造遺伝子の性質と構造であり，その
Ｔ−DNAの挿入方法である。遺伝的修飾植物を得る為に
残っているステップは，植物細胞へ修飾Ｔ−DNAを移送
すること（そこでは，植物細胞の中で修飾Ｔ−DNAが植
物細胞ゲノムの一部として安定に組み込まれる）を含
み，それにはインビトロ培養および完全植物体への実際
の再生に関する技術がある。この技術は形質転換植物細
胞の選択と検出に関するステップおよび最初の形質転換
株から商業的に認められうる培養体へ導入遺伝子を移す
ステップを包含しうる。

本発明の基本的特色は先に定義したＴ−DNAプロモー
ターの支配下にある挿入植物構造遺伝子を有するＴ−DN
Aの構築である。植物構造遺伝子はＴ−DNAに関して正し
い位置と方向で挿入されなければならない。まず第一に
構造遺伝子をプロモーターのどちら側へ挿入するかであ
る。大部分のプロモーターはDNAに沿って一方向での
み，転写と翻訳の開始を制御することが知られている。
プロモーター支配下に存在するDNA領域をプロモーター
の“下流”あるいは“後”にあるという。従って，プロ
モーターに支配される為には，植物構造遺伝子挿入の正
しい位置はプロモーターの“下流”になければならな
い。（2,3の既知プロモーターは両方向に支配する，即
ちプロモーターのどちらの側も“下流”と見なされ得
る，ことが知られている。）位置の第二の問題はプロモ
ーターの既知機能要素，例えば転写開始部位と構造遺伝
子の翻訳開始部位間の，塩基対での距離である。プロモ
ーターからプロモーターへのこの距離に関して，事実上
変動がある。従って，この点に関して要求される構造は
機能するか否かという事で判断される。近い表示をすれ
ば，プロモーターと挿入構造遺伝子間の距離が，正常に
支配しているプロモーターとＴ−DNAの距離に似ておれ
ばうまく作用する。方向（orentation）は構造遺伝子の
向きを表す。慣例により植物蛋白質のアミノ末端を最終
的にコードする構造遺伝子の部分を構造遺伝子の５′末
端と呼び，一方，蛋白質のカルボキシル末端近くのアミ
ノ酸をコードする遺伝子の端を構造遺伝子の３′末端と
呼ぶ。植物構造遺伝子の正しい方向はＴ−DNAプロモー
ターの近くにその５′末端を持つものである。融合蛋白
発現をもたらすよう構成する場合にさらに要求されるこ
とは，植物構造遺伝子のＴ−DNA構造遺伝子への挿入が
当業者によく知られている構造上の要求性，つまり２つ
の遺伝子のコード配列が同一翻訳フレームにあるという
ことである。本発明に関連する，この要求の例外が，イ
ントロンがＴ−DNA遺伝子と植物構造遺伝子の最初のコ
ード領域を分断する場合に存在する。その場合，イント
ロン切断部位が，転写後のプロセッシングによりイント
ロンが除去された後,T−DNA遺伝子と植物構造遺伝子の
正しい翻訳フレームが保存されるような位置になければ
ならない。Ｔ−DNAの起源は，いかなるTIPプラスミドで
も良い。植物構造遺伝子は当業者によく知られている標
準的技術で挿入される。発現度の違いは，ある植物構造
遺伝子が異なったＴ−DNAプロモーターの支配下に挿入
されたときにみられる。発現蛋白質自身の安定性，細胞
内局在性または分泌，抗原性および他の機能上の性質な
どを含む異なった性質は融合蛋白質の場合，見られるで
あろうが，それは挿入部位，融合蛋白質中に含まれるＴ
−DNA蛋白セグメントの長さと性質，およびその立体構
造に影響する融合蛋白質の成分間で相互作用などに依存
し，これらの全ては希望する利用目的に応じて発現産物
の機能性を操作し，制御する為の多数の機会を提供す
る。フォセオリン構造遺伝子の発現がアグロバクテリウ
ム・チューメファシエンスのオクトピンプラスミドから
のオクトピン シンセターゼ プロモーターの支配下に
その遺伝子が挿入されたときに観察された。

植物構造遺伝子をＴ−DNAに挿入する簡便法に，上で
意義したシャトルベクターがあり，これはエンシェリヒ
ア，コリー内で複製可能なプラスミドへ取り込まれたＴ
−DNAセグメント（ここへ挿入を期待するセグメント）
を有する。このＴ−DNAセグメントは好ましくはシャト
ルベクターには特異な１つの制限部位を有する。植物構
造遺伝子はＴ−DNAセグメント内の特異的部位に挿入さ
れ得る。そしてこのシャトルベクターは適当なアグロバ
クテリウム株（好ましくはそれの有するＴ−DNAがシャ
トルベクターのＴ−DNAセグメントと相同性がある）の
細胞へ移される。形質転換されたアグロバクテリウム株
を,Tiプラスミドの既存おセグメントをシャトルベクタ
ーのＴ−DNAセグメントで置換する２重相同組み換え現
象を選択する条件下で増殖させる。

ここで述べた方針に従いＴ−DNAを当該分野で既知の
どれかの技術により植物細胞に移すことができる。例え
ば，この移送はＴ−DNA内に取り込まれた植物遺伝子を
含む新規のアグロバクテリウム株の持つプラスミドの直
接感染，あるいはアグロバクテリウム株と植物細胞の共
存培養により最も容易に達成される。前者の技術，直接
感染はやがて感染部位に腫瘍体またはクラウンゴールの
出現をもたらす。クラウンゴール細胞を次いで培養で増
殖させ，そして当業者に既知の適当な環境下で挿入Ｔ−
DNAセグメントを有する完全植物体に再生させる。共存
培養の方法により，植物細胞のある部分が形質転換され
る。即ち細胞内にＴ−DNAが移り，植物細胞ゲノムに挿
入される。いずれにしても，形質転換細胞を選択あるい
は未形質転換細胞と区別しなければならない。選択はＴ
−DNAの中に植物構造遺伝子と共に，取り込まれる選択
マーカーを用いる事により容易に達成される。例とし
て，ノパリンシンセターゼプロモーター支配下で発現す
るジハイドロフォレート レダクターゼあるいはネオマ
イシン ファスフォトランスフェラーゼがある。これら
のマーカーは夫々メトトレキセートまたはカナマイシン
あるいはそれらの類似物を含む倍地での増殖により選択
される。さらにＴ−DNAは内生マーカー，例えばTi−誘
導腫瘍の培養でホルモン非異存増殖を制御する遺伝子ま
たは遺伝式群,Ri−誘導腫瘍ルートの異常形態を制御す
る遺伝子または遺伝子群，およびアミノ酸類似物のよう
な毒性化合物に対する耐性（その耐性はオピンシンセタ
ーゼによりもたらされ）を制御する遺伝子群を有する。
当業者によく刷られている検索法は，オピン生産の測
定，特徴的RNAまたはＴ−DNA配列に対する特異的ハイブ
リザイゼーション，あるいはELISA（酵素連関免疫吸着
分析の略），ラジオイムノアッセイ，および“ウエスタ
ン”ブロットなどの特異的蛋白質の免疫学的分析があ
る。

シャトルベクター作戦の別の方法にＴ−DNAまたはそ
こに植物構造遺伝子を挿入した修飾Ｔ−DNAを含むプラ
スミド，アグロバクテリウム株内で独立に複製し得るプ
ラスミドの使用がある。最近の資料により，アグロバク
テリウム株がＴ−DNAの植物細胞への移動を促進する機
能をもつトランスに作用する遺伝子を有するならば，そ
のようなプラスミドのＴ−DNAがアグロバクテリウム株
から植物細胞へ移され得るということが示されている。
Ｔ−DNAを含み，アグロバクテリウム株内で独立に複製
できるプラスミドをここでは“サブ−TIP"（sub−TIP）
プラスミドと呼ぶ。変動範囲があり，そこでは，“サブ
−TIP"プラスミドはそれらが含有するＴ−DNAの量に差
がある。その範囲の一端はTIPプラスミドからのＴ−DNA
がすべて残っているもので，特に“小TIP"（mini−TI
P）プラスミドと呼ばれる。その範囲のもう一端はＴ−D
NA境界のまわりのDNAの最小量を残してすべてが欠失し
ている。その残存部分は宿主細胞内で転移と組み込みが
できる必要最小量である。このようなプラスミドは“微
TIP"（micro−TIP）と呼ばれるサブ−TIPプラスミドは
小さく，直接操作するのが比較的容易であるという利点
がある。希望する構造遺伝子を挿入した後,T−DNA転移
を促進するトランスに作用する遺伝子を含アグロバクテ
リウム細胞へ直接容易に導入できる。アグロバクテリウ
ム株への導入はアグロバクテリウム株の形質転換か，供
与細菌細胞から直接伝達という当業者によく知られてい
る技術により簡便に達成される。

再生は既知の技術で達成される。再生ステップの目的
は正常に，しかし組み込まれたＴ−DNAを保持して，増
殖および再生産する全植物体を得ることである。再生の
技術は当該分野で既知の原理によれば,T−DNAの起源，
そこでの修飾の性質，およびセグメントされた植物の種
によりいくらか変動する。Ri−型Ｔ−DNAで形質転換さ
れた植物細胞は，公知の技術により何ら余分な実験なし
に，容易に再生される。Ti−型Ｔ−DNAで形質転換され
た植物細胞は，ある例では培養のホルモンレベルを適当
に操作することにより再生され得る。しかし，好ましく
は,Ti−形質転換組織は，もしＴ−DNAがTmrとTms遺伝子
の一方または双方に変異を受けておれば，最も簡単に再
生される。これらの遺伝子の不活性化は形質転換組織の
ホルモンバランスを正常に戻し，培養での組織のホルモ
ンレベルを極めて容易に操作できるようになる結果，簡
単に再生するようなより正常なホルモン生理を有する植
物をもたらす。数例においては，腫瘍細胞は，ノパリン
シンセターゼのような組み込まれたＴ−DNAをもちかつ
Ｔ−DNA遺伝子を発現するシート，そしてまた挿入植物
構造遺伝子を発現するシュートを再生させることができ
る。このシュートは根を有する植物につぎ木する事によ
り栄養細胞で維持でき，稔性花を着生できる。シュート
はこのようにしてＴ−DNAを有し，そこへ挿入された植
物遺伝子を発現する正常な子孫植物の親植物体となる。

（実施例） 次に述べる例は,TIPsとアグロバクテリウムの分子生
物学および操作に関する当業者によく知られかつ受け入
れられうる多くの技術を利用している；それらの方法は
常に詳しく，記載されているわけではない。酵素は市販
品であり，これらは業者の推薦あるいは当該分野によく
知られた方法により用いられた。

試薬，緩衝液および培養条件もまた，当業者には知ら
れている。そのような標準となる技術を含む関連研究を
次に挙げる： R.Wu.ed.（1979）Meth.Enzymol.68;J.H.Miller（1972）
Experiments in Molecular Genetics;R.Davis et a
l．（1980）Advanced Bacterial Genetics;R.F.Schle
if and P.C.Wnesink（1982）Practical Methods in
Molecular Biology． これらの例の中には（塩基）配列を見やすくする為に
（to clarify sequences）特別な記号が用いられてい
る。

蛋白質をコードしているか，コードし得る配列には下
線を引き，コドンは斜線（／）で区切った。

制限酵素などにより生じた各々の鎖の切れ目や隙間に
は星印（＊）を配する。（ある例では，二重鎖DNA分子
は，制限酵素切断部位の星印に隣接する一本線で表され
ている；遺伝子と思われる部分はその一本線の下に下線
を引いた“×”で示してある。） 該プラスミドは例外として，プラスミドあるいは唯一
のプラスミド（only plasmids）は“P"で始める。
（例）p3.8あるいはpKS4。プラスミドを持つ細胞は，そ
の細胞本来の名にプラスミドを付加的に示すことにより
表す。（例）アグロバクテリウム・チューメファシエン
ス（pTi15955）あるいはK802（pKS4−KB）。

表１にはプラスミドとそれらの関係を同定するのに有
用な索引が記されている。表２には寄託菌株の索引が記
されている。

第39図には例11,12,および14に記述されている構成を
比較するのに有用である。

第40図は遺伝コードを示し，配列の解釈に有用であ
る。重要なＴ−DNA遺伝子tmlの塩基配列はこれらの例に
は用いられていないが，第41図に示されている。それ
は，ここに記述されていない構成を示すのに有用であ
る。

実施例１ 融合タンパクの遺伝子は，オクトピンシンセターゼプ
ロモーター，オクトピンシンセターゼの構造遺伝子のア
ミノ末端90個のアミノ酸，二つの遺伝子間に重複する三
個のアミノ酸，そして，最初の11個のアミノ酸を省くフ
ァセオリン遺伝子の全部分を含むように構成されてい
る。構成を開始するに先だち,pTi15955 T−DNAのクロー
ン,p233（配列はpBR322中で,p203,p303と提示されてい
る；第１図参照）の配列をBamH I部位からPvu II部位ま
で，決定した。これは，全オクトピンシンセターゼ遺伝
子を含む（第２図）。オクトピンシンセターゼ（遺伝
子）配列及び，リーディングフレームは，制限酵素EcoR
Iにより切断された部位の近くに続いて見つかってい
る： EcoR Iによる開裂により示す末端をもつ断片を生じ
る： 豆の種子の貯蔵タンパク質であるファセオリンの構造
遺伝子（以前に配列決定されている；第３図）は５′
（アミノ末端）末端の近くに次に示すようにEcoR I部位
を持っている： EcoR Iによる開裂により次に示す末端を持つ断片が生
じる。

これらの２つの断片は連結後，次に示す構造を形成す
る： これは同じリーディングフレームを保持し，かつ，間
に終止信号を生じていない。つまり，ファセオリン遺伝
子のEcoR I/Bam H I制限酵素断片は,pTi 15955のＴ−DN
Aのオクトピンシンセターゼ遺伝子にEcoR I部位で連結
されたのである。この融合遺伝子はocsプロモーター，
オクトピンシンセターゼの最初の90個のアミノ酸，そし
て，プロモーターと最初の11個のアミノ酸のないフォセ
オリン遺伝子，及び，両遺伝子の継目にあたる３個のア
ミノ酸配列を含んでいる。

1.1 pBR 322からのEcoR I部位の除去 pBR 322のEcoR IをEcoR Iで分解後Ｔ−4 DNAポリメラ
ーゼにより，粘着末端を埋め，平滑末端同志を連結す
る。そしてE.coli HB101株を形質転換することによりpB
R 322よりEcoR I部位を除去した。形質転換体の選択に
アンピシリンを用いた。又，コロニーは少量のプラスミ
ドDNAを単離する（D.Horowitz（1982）Molecnlar Cloni
ngC.S.H）ことにより選別した。そして,pBR 322−Ｒと
呼ばれるEcoR I部位を持たないクローンを選択した。

1.2 Bam H I T−DNA断片のpBR 322−Ｒへのクローニン
グ P203（第42図）を単離し,Bam H Iにより分離した。Ｔ
−DNA4.7kbp（キロベースペアー）の断片をアガロース
ゲル電気泳動により単離し,pBR 322−ＲのBam H I部位
に連結した。このプラスミドをE.coli HB101株に形質転
換し，アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を
用いて選択した。陽性クローンが得られ，それをpks 16
9と名ずけた。

1.3 オクトピンシンセターゼ遺伝子からのEcoR I部位
及び断片の除去 pKS 169をEcoR Iで分解した。8.6kbp（キロベースペ
アー）の断片をアガロースゲル電気泳動により単離精製
した。この断片は除かれたocs遺伝子中に２個の小さな
（0.36kbp及び0.2kbp）断片を持っていた。

1.4 ファセオリン遺伝子DNA断片及び，カナマイシン耐
性遺伝子を含むEcoR I断片の単離 pKS4−KB（第７図）を精製し,EcoR Iで分解した。ネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼII（NPT II）
をコードしているカナマイシン耐性遺伝子を含む,1.85k
bpのDNA断片と3.0kbpのEcoR I/Bam H Iファセオリン遺
伝子断片をBam H I部位で連結して用いる為に4.8kbpの
断片を単離した。

1.5 ファセオリン遺伝子のオクトピンシンセターゼ遺
伝子への連結 ファセオリン/NPT II断片を実施例1.3で記述したEcoR
I断片とEcoR I部位で連結した。連結したDNAを,HB101
に形質転換し，コロニーをアンピシリンとカナマイシン
で選択した。pKS−B17−KB3.0（第43図）と名ずけたコ
ロニーを選択した。このコロニーは正しい配置（すなわ
ち，ファセオリン遺伝子が，正しい方向とリーディング
フレームでocs遺伝子へ連結されている）を持つプラス
ミドを保有している。このことは，少数のコロニーから
のプラスミドの制限地図により確認した。適当な領域の
DNA配列を構造認識の為に決定した。

1.6 BPT II,ファセオリン，及びocs DNAを含むＴ−DNA
断片のPRK290への移入 広い宿主範囲をもつプラスミドであるpRK290をBgl II
で分解跡,T−DNA,NPT II遺伝子，及びpKS−B17−KB3.0
からのファセオリンDNAを含む9.1kbpのBam H I断片へ連
結した。上記のことは,pKS−B17−KB3.0をBam H Iで部
分分解後，アガロースゲル電気泳動で他の６本のバンド
から単離することにより完遂した。連結し,E.coli K802
株へ形質転換後，コロニーをカナマイシン及びテトラサ
イクリンで選択した。要求される制限パターンを有する
コロニーを選択し,pKS−os−KB 3.0と名ずけた。

1.7 pTi 15955上のオクトピンシンセターゼのオクトピ
ンシンセターゼ ファセオリン融合タンパク遺伝子への
置換 A.tumefaciens（ストレプトマイシン耐性）,E.coli
（pKS−OSI−KB 3.0），及びE.coli（pRK 2013）の三親
交雑により，我々はストレプトマイシン，カナマイシ
ン，及びテトラサイクリン耐性のコロニーを選択した。
あるコロニーをE.coli（pPH1J1）と交雑した。カナマイ
シン及び，ゲンタマイシン耐性のコロニーを選択した。
これは,p15955−12A,pTi15955（制限酵素地図作成及
び，電気泳動的に分画した制限断片のフィルターハイブ
リダイゼーション（実施例19）によるocs遺伝子のEcoR
I部位へ設計したファセオリン遺伝子及び，カナマイシ
ン耐性遺伝子を持つ）をもつアグロバクテリウム・チュ
ーメファシエンスを表している。

類似した三親交雑はアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス（pTi A66）で行われている。結果として生
ずるプラスミドpA66−12Aにより形質転換されたシュー
ト（shoots）は，前述のようにファセオリンを有するこ
とを示している。

1.8 クラウンゴールの形成及び発現 設計されたTiプラスミドを，ヒマワリに接種した。組
織培養において，クラウンゴールが形成された。発現は
ランニングELISAs及び電気泳動的に分けられたmRNAへの
フィルターハイブリダイゼーション（“ノーザンブロッ
ト";実施例19）らにより試験した。期待される大きさの
RNAをファセオリン及びオクトピンシンセターゼの両方
に対するハイブリダイゼーションプローブにより見つけ
た。又，期待される大きさのRNAは全ポリ（Ａ）５＋4 R
NAの約0.5％であったゴールより単離したポリ（Ａ）５
＋4 RNAでファセオリンに対する抗体により沈澱する期
待される大きさのタンパクのインビトロ合成を行った。

実施例２ 実施例１に似た融合タンパクの遺伝子をファセオリン
とノパリンシンセターゼよりノパリンシンセターゼ遺伝
子のプロモーターの支配下において構成した。それは，
ノパリンシンセターゼのプロモーター，ノパリンシンセ
ターゼの最初の59個のアミノ酸（最後の残基は合成して
加えた）と１個のつぎ目のアミノ酸をコードしている部
分，及び最初の12個のアミノ酸を除くすべてのファセオ
リン構造遺伝子を有する。構成を開始するに先だち,pTi
C58のＴ−DNA（pCF 44A,第６図）のクローンを一番左の
Bgl II部位から中ほどのHin d III部位（Ｔ−DNA領域の
外側）にかけて配列決定を行った。これは，すべてのno
s遺伝子を含んでいた（第４図）。ノパリンシンセター
ゼの配列及びリーディングフレームは，後に示すよう
に，制限酵素Cla Iにより切断された部位の近くに見つ
かった。

Cla Iによる切断で次のような末端を持つ断片が生ず
る。： 実施例１の場合と同様に，続くファセオリンのEcoR I
部位は： 次に示す構造に切断することができる： 次に示す２つのリンカー ａ）５′ CGATCCC ３′ ｂ）５′ AATTGGGAT ３′ はアニールし次に示す構造を形成し得る。

５′ CGATCCC ３′ （ａ ５′ TAGGGTTAA ５′ （ｂ これは該DNA断片と連なり次に示す構造を形成し得る： このリンカーの有するいくつかの機能を記す： 新しいアミノ酸が１つ導入される；ノパリンシンセタ
ーゼの欠失した配列の一部分が再ば構成されている。;2
つの相反する制限部位が適合している；オープンリーデ
ィングフレームは保持されている。

つまり，ファセオリン遺伝子のEcoR I/Bam H I制限断
片をリンカーによりEcoR I部位をCla I部位に変換した
後ノパリンシンセターゼ遺伝子のCla I部位へ結合した
のである。この融合遺伝子は，ノパリンシンセターゼの
プロモーター，ノパリンシンセターゼの最初の58個のア
ミノ酸，リンカー（これはノパリンシンセターゼ配列の
一部分を再構成し，かつ，新しいアミノ酸１個をそう入
したもの），及び最初の12個のアミノ酸残基を省くすべ
てのファセオリンを含んでいる。

2.1 リンカーの合成 次に示す２個のリンカーを合成した： ａ）５′ CGATCCC ３′ ｂ）５′ AATTGGGAT ３′ これらを例17の方法により合成した。これらのオリゴク
レオタイドａ）とｂ）はアニールして次の構造を形成す
る： ５′ CGATCCC ３′（ａ ３′ TAGGGTTAA ５′（ｂ 2.2 シャトルベクターの調製 pKS nop IV（構造は第６図に記述してある）はpRK 29
0のBgl II部位にノパリンのＴ−DNAをクローン化したも
のである。そのノパリンのＴ−DNAは唯一Cla I部位を有
する。これは,nos中のCla I部位とnos遺伝子の外側下流
部位のCla I部位との間が欠失した結果である（第５
図，第６図）。

我々はpKS4−KB（第７図）を精製し,EcoR Iで分解し
た。4.8kbpのkan/bean耐性断片をゲル電気泳動により精
製した。この断片はTn5のカナマイシン耐性遺伝子（ka
n）のBam H I/EcoR I断片にBam H I部位で連結している
EcoR I/Bam H IのファセオリンDNAの断片（kan/bean中
のbeanとして称される）を含んでいる。

我々は,Cla Iにより直線化したpKS−nop IVをkan/bea
n断片及び，例2.1に示すリンカーを用いて連結した。E.
coli K802を形質転換し，カナマイシン及びテトラサイ
クリン耐性コロニーを選択した。二通りの配置が存在
し，その一つは，ファセオリンDNAがノパリンシンセタ
ーゼ遺伝子に連結したものであり，もう一つは，カナマ
イシン耐性遺伝子がノパリンシンセターゼの隣に連結し
たものであった。第８図に示した要求される配置を持っ
たプラスミド,pNNN1,を保有する細胞を決定する為に，
制限部位地図作成を用いた。

2.3 pTiC58上のノパリンシンセターゼ遺伝子の修飾さ
れたファセオリンへの置換 アグロバクテリウム・チューメファシエンス−strR C
58,E.coli（pRK 2013），及びE.coli（PNNN1）の間の三
親交雑（従来技術のシャトルベクターの項を参照）を用
いて，構成物をTiプラスミドへ挿入した。

我々はストレプトマイシン，カナマイシン、及びテト
ラサイクリンに耐性なアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス細胞を選択した。選択した形質転換体をE.co
li（pPHIJI）と交雑し，カナマイシン及びゲンタマイシ
ン耐性コロニーを選択した。

2.4 クラウンゴールの形成及び発現 ヒマワリに接種し，組織培養中でクラウンゴールを形
成させた。発現の試験は，実施例17及び20で示したよう
にELISA及びmRNAへのハイブリダイゼーションにより行
った。

実施例３ この実施例の目的は,ATG翻訳開始信号から構造遺伝子
の残りの部分へ連結することができるEcoR I部位までの
完全なファセオリン遺伝子のコーディング配列の再構成
である。５′未満にCla I部位を構成する。そうすれば
該遺伝子を容易に復元することができる。次に示す２個
のオリゴ又はクレオタイド配列を合成した： これらはアニールして次に示す構造を形成し得る： 実施例１の場合と同様，次に示すファセオリンのEcoR
I部位は： 次の構造へ開裂し得る： この末端を前述の合成二本鎖ヌクレオタイドリンカー
へ連結するとコーディング配列の先頭のCal I粘着末端
よりの完全なファセオリンのポリペプチドをコードする
遺伝子が生じる。

3.1 リンカーの合成 実施例17の方法により次の２個のリンカーを合成し
た： これらはアニールし，次の構造を形成する： 3.2 pKS−nop IVにクローン化されているファセオリン
遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子の完全な構成 Cla Iで直線化したpKS−nov IVを実施例3.1で示し
た。アニールしたリンカーとKS4−KB（実施例2.2を参
照）由来のの精製kan/bean EcoR I断片とを連結した。
E.coli K82を形質転換し，テトラサイクリン及びカナマ
イシン耐性コロニーを選択した。また，二種の配置が可
能なのであるが，ファセオリン遺伝子がノパリンシンセ
ターゼ遺伝子の隣に連結されたものはただ一つであっ
た。正しい配置のクローンをエンドヌクレアーゼ地図作
成後に選択した。、3.3 クラウンゴール形成及び発現 実施例21に示す大要に従って，相同部位組み換え及び
クラウンゴール組織培養の単離を行った。そして，クラ
ウンゴールにおけるファセオリン遺伝子の発現の試験
は，実施例19及び20と同様に行った。

実施例４ ここに示す構成の目的は，クラウンゴール細胞中での
外来遺伝子の発現の為のpTi方式に用いるシャトルベク
ターの構成方法を教えることにある。そこでは，外来遺
伝子はnosプロモーターの支配下にあり部分的に合成物
を含む，又，ノパリンシンセターゼをコードする部分は
無くなっている。構成を開始するに先だち,pTiC58T−DN
A（pCF44A）クローンの配列をnosプロモーターを見つけ
るべく決定した。（第４図） 4.1 nosプロモーターの５′部分の単離 PCF44をXho Iで切り，再び連結し，それをpCF44Bと名
ずけた。それは次の構造をもつ： この新しいプラスミドのSst II断片を欠失させる結果
としてできたプラスミドpCF44Cは次のとおりである： これをBgl IIで分解し,3.6kbp断片をpRK 290のBgl II
部位に挿入する。Grunstein−Hogness分析においてＴ−
DNAをハイブリダイゼーションする為に選択したコロニ
ーをpKS−nop Vと名づける。それをCla Iで分解し，再
び連結しpKS−nop VIを形成する。

これをCla IとSst IIで分解すると22kbpの直線化した
ビークル（Vehicle）と355bpの断片が得られる。これら
は塩勾配遠心分離により容易に分けることができる。該
外断片をHin f Iで分解後,149bpのSst II/Hin f I及び2
08bpのCla I/Hin f I断片をゲル電気泳動により単離す
る。

4.2 リンカーの合成 実施例17の方法により次の二つのリンカーを合成し
た： これらは，たがいにアニールし，次に示す構造を形成
する： この配列は左側にHin f I部位を，そして右側にNco I
及びCla I部位を有する。交互の配列はNco I及びCla I
部位の間に,Bcl I部位を有するであろう。この配列は下
線で示した、Ａ−ＴベースペアーとGLベースペアーの置
換を除くとＴ−DNAにおいて見つかったものと一致す
る。

4.3 pNNN2の組み立て 22kbpのCla I/Sst IIビークスを第９図に示すように1
49bpのSst II/Hin f I断片及び合成リンカーにより連結
すると次の構造を形成する。

4.4 ファセオリン遺伝子の挿入及び発現 実施例4.3で構成したプラスミドpNNN2（第９図）をCl
a Iで切り，実施例4.2で合成したCla I/EcoR Iリンカー
及びpKS4−KBから電気泳動に精製したEcoR I/Cla I kan
/bean遺伝子の断片と混ぜ連結し，形質転換，単離，制
限地図作成を行う。適当なプラスミドpNNN4を実施例21,
19,及び20に記述したように導入し，発現の試験を行
う。

4.5 イントロンを欠くファセオリン遺伝子の挿入及び
発現 実施例4.4に概略した手順をpcDNA31のpKS4−KBあるい
はpKS4−KBのpMC6−cDNA由来のアナログについての交換
により繰り返す。

4.6 ファセオリンcDNAの挿入及び発現 この構成は,cDNA,一本鎖Pst Iリンカー及びPst I kan
断片を使用することについて，実施例10に類似してい
る。又，半合成nosプロモーターの使用については実施
例4.1,4.2及び4.3に類似している。性格ずけ，移入，及
び再現試験については実施例4,4に記述したものと同様
である。

実施例4.3で構成したプラスミド4.2で合成したCla I/
EcoR Iリンカー,pKS4−KBから単離し，電気泳動的に精
製した1.7kkbpのEcoR I/Pst I bean断片，電気泳動的に
精製した0.93kbpのPst I Tn5kan断片，及びすでに実施
例17の方法により合成した一本鎖Cla I/Pst Iリンカー
５′CGAATT3′を混ぜ連結した。

実施例５ この構成の目的は,EcoR IからBam H I部位までのファ
セオリン遺伝子をP403のHin d III部位にまたがる活性
Ｔ−DNA遺伝子（このmRNAは，地図上,1.6と記されてい
る第１図参照）へ連結することでいる。この配列（第10
図参照）をP401の右側にCla I部位のあるHin d III部位
から決定した。（第11図参照）。Hin d IIIとCla I部位
の間から始まりHin d III部位へ向かうオープンリーデ
ィングフレームがある。（第11図に地図で示される1450
bpのmRNAを参照。） このCla I部位は,Hin d III部位に広がる遺伝子のmRN
Aの翻訳されないリーダーの中にある。我々はp403の中
央のCla I断片を切り名省くことによりプロモータービ
ークルを作成した。これは，中のCla IはE.coli株中で
メチル化されていないか,EcoR I部位の隣のCla I部位は
メチル化されているので可能である。

ここで，ファセオリン遺伝子をCla I部位に,ATGをも
ったまま連結する。これはpKS4−3.0KBを用いれば可能
である。pBR 322のCla I部位からファセオリンのEcoR I
部位にいたる塩基配列を次に示す： オープンリーディングフレーム及びATGに留意のこ
と。Cla I部位と翻訳開始信号（ATG）の間には18bpがあ
る。これをCla I部位からＴ−DNA遺伝子の開始までの12
bpと比較する。

再び，オープンリーディングフレームとATGに留意の
こと。このように，プロモータークローンのCla I部位
へファセオリン遺伝子を連結すると,T−DNA中で活性フ
ァセオリン遺伝子を作ることとなる。ファセオリン遺伝
子は本来生ずる末端の12残基のアミノ酸についての２個
のアミノ酸が交換されたこととなる。

5.1 プロモータービークルの構成 pKS III（Ｔ−DNAクローンp403（第１図参照）に対応
するpRK 290クローン）をCla Iで分解し，再連結する。
連結混合物をK802に形質転換し，カナマイシン耐性によ
り選択する。プラスミドは，「ミニプレップ」（minipe
rps）（少量の培養細胞からプラスミドを調整するこ
と）を行うことにより単離する。又，構造を証明する為
に制限地図作成を行う。新ビークル,pKs−Pro I,はHin
d IIIでは分解できないが,Cla Iにより線状化すること
ができる（第12図。）pKS−Pro Iを精製し,Cla Iによる
分解で線状分子を作る。

5.2 部分的ファセオリン遺伝子のカナマイシン耐性へ
連結 ５′側端を除く３′側への広範囲な部分のファセオリ
ン遺伝子を含む3.0kbpの断片をp7.2（第13図）（ファセ
オリンゲノミッククーロン117.4のpBR322サブクーロン
で構成は実施例6.1に記載している。）のHin d IIIとBa
m H I分解物をアガロースゲル電気泳動から溶出して得
た。これをpKS4（第18図）から同様に単離した。3.0kbp
のカナマイシン耐性Hin d III/Bam H I断片及びHin d I
IIで線状化したpBR322と混ぜ連結した。アンピシリン耐
性形質転換体から単離したプラスミドの制限地図作成
後，第７図に示す構造を持ったプラスミドをpKS4−KBと
した。

5.3 pKS4−3.0KBからのkan/bean断片の精製 pKS4−KB（第７図）をCla Iで分解し,4.9kbp断片をア
ガロースゲル電気泳動により精製した。

5.4 Cla I kan/bern耐性断片のCla I分解pKS−Pro Iへ
の連結 pKS−Pro IをCla I分解で線状化し，実施例5.3からの
カナマイシン耐性遺伝子/bean断片を一緒に連結し,K802
へ形質転換する。カナマイシン耐性形質転換体を選び
「ミニプレップ」により単離したプラスミドを適当な配
置を持つものを見つける為に制限地図作成を行った。該
プラスミドをpKS−Pro I KB（第14図）とした）。

5.5 形質転換及び，発現 pKS−Pro I−KBを持つpTi 15955,pTiA 60あるいは他
の適当なTIPプラスミドを持つアグロバクテリウム細胞
と交雑する。カナマイシンで組み掻え体を選択後，植物
に接種し，組織培養でクラウンゴールを形成させた。フ
ァセオリンの合成の試験は実施例19及び20に示すとおり
である。

実施例６ この実施例は，他のさまざまな例に示す，ベクター
へ，ファセオリン遺伝子を挿入する進んだ操作に先だっ
て，豆（Phasealus,Vnlgaris L.）の種子の主要貯蔵タ
ンパク質であるファセオリンの遺伝子の操作を教える。

6.1 ファセオリン遺伝子のサブクローニング シャロン（Charon）24A AG−PVPh 177.4（あるいは,1
77.4;S.M.Sun et al．（1981）Nature 289:37−41,J.
L.Slightom et al．（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80；第15図）中の，ファセオリンのゲノミッククローン
をBgl II及びBam H Iで分解した。ファセオリン遺伝子
及び隣接配列を持つ3.8kbpの断片をアガロースゲル電気
泳動で単離し,Bam H Iで線状化したpBR 322と混ぜ連結
した。混合物をHB101に形質転換し，アンピリシン耐
性，テトラサイクリン感受性コロニーを選択した。

これらのクローンから単離したプラスミドの制限地図
を作成した。第16図に示す構造を示すプラスミドを選択
し,AG−pPVPh 3.8（あるいは，代わりにP3.8）とした。
Bgl IIとBam H I部位が互いに連結したものは，両方の
部位が消失する。

もう一つの177.4のサブクローンを次のように構成し
た。まず,EcoR I分解し，ファセオリン遺伝子の３′側
配列および５′側配列端以外のすべてを含む7.2kbpの断
片を単離し,HB101形質転換体のアンピシリン選択したも
のを制限地図作成後単離する。pBR 322のHin d III部位
がファセオリン遺伝子の５′末端と３′末端の翻訳され
ない領域に隣接しているような配置の挿入を有するプラ
スミドをAG−pPVPh 7.2（あるいは,p7.2;第13図;Sun et
al.and Slightom et al.,Supra）とした。

6.2 カナマイシン耐性遺伝子のクローニング及び単離 pRZ102（R.A.Jorgenson et al．（1979）Molec.gen.
Genet.177:65−72）（これはトランスポソンTn5を１コ
ピー持つColE 1プラスミドである）をBam H I及びHin d
IIIで分解し，前もって同じ２つの酵素で線状化してあ
るpBR 322と混ぜ，連結し,K802へ形質転換した。アンピ
シリン及びカナマイシンの両方に耐性な形質転換体から
単離したプラスミドの制限地図を作成し，第18図に示す
構造をもつものをpKS−４とした。

6.3 ファセオリン遺伝子とカナマイシン耐性との結合 P3.8をCla IとBam H Iで分離し，ファセオリン遺伝子
とpBR 322の一部分の配列を含む4.2kbpの断片をアガロ
ースゲル電気泳動より単離した。これをpKS4（第18図）
からのカナマイシン耐性（ネオマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼII）遺伝子を持ったTn 5のCla I/Bam H
I断片及びCla Iですでに線状化したpBR 322（第17図）
と混ぜた。混合物を連結し,K802へ形質転換した。アン
ピシリン及びカナマイシン耐性コロニーを選択し，制限
地図作成を行った。第19図に示す構造をもつコロニーを
pKS−KB 3.8とした。

もう一つの有用なプラスミド,pKS4−KBの構造は実施
例5.2に示してある。

実施例７ この実施例は，ファセオリンのゲノミッククローンに
対するcDNAクローンの置換以外は，実施例５に述べた構
成に類似している。この構成によりイントロンを欠失し
た遺伝子ができるだろう。

7.1 pKS−KB 2.4（pKS−KBに類似）の構成 pMC6をEcoR IとBam H Iで分解した後,2.4kbpのファセ
オリンcDNA断片を塩勾配遠心かゲル電気泳動により単離
する。カナマイシン耐性遺伝子を含む1.9kbpの断片をpK
S4（第18図）のEcoR I及びBam H I分解から精製し,cDNA
断片及び,EcoR Iで線状化したpBR 322と混ぜ，連結し,K
802へ形質転換する。カナマイシン耐性コロニーを選択
し，プラスミドを単離し制限地図作成後，第21図に示す
プラスミドをpKS−KB 2.4とした。

7.2 Cla I kan/bean DNAのCla Iで分解したpKS−Pro I
への連結 pKS−KB 2.4をCla Iで分解し,Cla Iで線状化したpKS
−Pro I（第12図）と連結する。形質転換，選択，プラ
スミド単離そして性格ずけの後，希望の構造（すなわ
ち，ファセオリン配列がＴ−DNAプロモーターへ隣接し
ている）をTiプラスミドへ移入する。接種及び試験は実
施例21,19及び20に述べるとおりである。

実施例８ この実施例は遺伝子からイントロンを除く方法を教え
る。これは，ゲノミックな環境にcDNAを配置することと
同じことである。制限酵素部位は，処理されていない転
写物（transcript）の５′及び３′未満の両方のエクソ
ン中に見出されるかあるいは特異的変異により作られ
る。これらの部位はゲノミッククロン及びcDNAの両方に
存在する。介在イントロンを含むDNAを除き，対応する
イントロンを含まないcDNAクローン断片を２つの部位に
橋渡しすることができる。逆の操作も可能である：イン
トロンを含むゲノミック配列をcDNA環境に配置すること
もできる。

ゲノミッククローンの中の断片をcDNAクローンを切り
出した対応するすき間（gap）へ挿入する。この後者の
方法は類似しているが，イントロンがその変換される断
片を作るために選ばれる酵素に感受性な部位を含むより
もしばしば，技術的にはより困難である。この困難は部
分分解の条件の注意深い選択とアガロースゲル電気泳動
による所望断片の精製により克服された。この戦略をさ
らにねったものは，遺伝子内の個々のイントロンを他の
イントロンとエクソンとに影響を及ぼさないで操作する
こと，および不都合な介在する制限部位が上述するよう
にイントロン内に存在するときの配列を段階的に交換す
ることを含む。

8.1 ファセオリンのイントロンを含む断片のcDNAとの
置換 ファセオリン遺伝子及びその付近の配列のプラスミド
クローンであるp3.8をEcoR Iで部分分解,Sac Iで完全分
解し,pBR 322ベクターと遺伝子の５′及び３′の両末端
を含む6.4kbpの断片をアガロースゲル電気泳動により単
離した。ファセオリンmRNAから作ったcDNAのpBR 322プ
ラスミドクローンであるpcDNA31をSac Iで部分分解,Eco
R Iで完全分解し,5′及び３′未満を除く全ファセオリ
ンcDNAを含む1.33kbpの断片をアガロースゲル電気泳動
により単離した。これらの２つの断片を連結して,HB101
へ形質転換した。コロニーを選択し，細胞を増殖させ，
プラスミドを単離し，制限地図作成により希望の構造を
もつプラスミドを決定した。このプラスミドをp3.8−cD
NAとした（第22図）。

8.2 p3.8−cDNAの利用 次のことに留意のこと。p3.8−cDNAは他の実施例で用
いられているp3.8のようなゲノミックDNA源（source）
の代わりをすることができる。又，そのように使用した
とき，イントロンを欠いているという相違をもつ類似し
た例となる。もしくは，この戦略はすでに作った構造か
らイントロンを除くのに使うことができる。

実施例９ 実施例はイントロンのない遺伝子の発現を教える。フ
ァセオリンcDNAを実施例８に述べたように調製する。遺
伝子はイントロンを欠いているがこれも又，使うことが
できる。

実施例８で教えたものと類似の構造を用いる。pKS4−
KBとpMC6を実施例８のようにEcoR IとSac Iで分解し，
そこで示したようにcDNAを挿入したものをベクター及び
ファセオリンの５′及び３′末端部分を含むpKS4−KB断
片に連結する。新プラスミド,pKS4−KBcをpKS4−KBと類
似した方法で構成に用いる。

実施例10 この実施例の目的はＴ−DNAの中にＴ−DNA遺伝子のプ
ロモーター支配下で,Phaseolus vulgarisレクチンのcDN
Aを設置し，その構造物を植物細胞へ移入し，植物組織
でのこの構造物の発現を見つけることである。

この構成には，制限酵素Pst I及びHin d IIIでの分解
により生じた粘着末端を接続する一本鎖リンカーが使わ
れている。下記のPst I部位とHind III部位 が開裂すると次の末端を形成する： そして適当な配列のリンカーの存在下に混ぜる： これらは，互いに連結し，次に示す構造を形成し得る： Hin d III部位が再び構成されたことに留意のこと。

レクチンのcDNAをプラスミドクローン,pPVL134及びAT
CC39181より得る。pPVL134及びATCC39181はポリＣ鎖を
つけた２本鎖cDNAをPst Iで切りポリＧ鎖をつけたpBR 3
22に挿入することにより構成した。このクローンはL.Ho
ffman et al．（1982）Nucleic Acids Res.10:7819−7
822により記述されたものと同種である。

10.1 リンカーの合成 リンカー５′AGCTTGCA3′を実施例17の方法により合
成する。

10.2 レクチンcDNA及びカナマイシン耐性遺伝子を含む
クローンの構成 pPVL 134をBcl I及びPst Iで分解し，レクチンのコー
ディング配列,3′の翻訳されない領域及びC/G鎖を含む
中間の大きさの断片を電気泳動で分画後アガロースゲル
電気泳動から溶出することにより単離する。pBR 325をB
cl I及びHin d IIIで分解し，一番大きな断片を塩勾配
を通して，沈降させ単離する。Bcl I/Hin d III pBR 32
5断片をBcl I/Pst Iレクチン断片及び例10.1で調製した
Pst I/Hin d IIIリンカーと混ぜ連結する。E.coli K802
を形質転換し，薬剤耐性及びレクチン配列の存在で選択
する。そのような，細胞から単離したプラスミドをII c
とする。II cをHin d III及びBam H I分解することによ
り生じた一番大きな断片を前もてアガロースゲル電気泳
動で単離したpKS−４のカナマイシン耐性遺伝子を持つH
in d III/Bam H I断片（第23図）と混ぜ連結する。K802
を形質転換し，コロニーをカナマイシン耐性で選択す
る。プラスミドを単離し制限地図を作成し，性格ずけを
する。希望のプラスミドをPL−Ｂとする。

10.3 pKS−pro IにおけるCla I部位のBam H Iへの変換 実施例5.1に示す構造をもつpKS−pro I（第12図参
照）をCla Iで分解する。この切断点は1.6kbpの転写物
のプロモーターとATG翻訳開始信号の間にある（第１図
参照）。粘着末端を,DNAポリメラーゼＩで埋めることに
より平滑末端に変える。Bam H Iリンカーをすき間に連
結し，露光したBgl II粘着末端を削り取り，連結し,K80
2へ形質転換する。望むプラスミドpKS−pro I A（第24
図）を持つコロニーは「ミニプレップ」によるプラスミ
ド単離および制限酵素地図作成による性格ずけの後選択
される。

10.4 レクチン及びカナマイシン耐性遺伝子のpKS−pro
I Aへの挿入 pL−Ｂ（実施例10.2）をBcl I及びBam H Iで分解し，
カナマイシン耐性遺伝子及びレクチン配列をもつ断片を
電気泳動で分画後，アガロースゲルから溶出した。この
断片をBam H Iで線状化した。pKS−pro IAと混ぜ連結し
た。連結混合物をK802へ形質転換した，プラスミドをカ
ナマイシン耐性コロニーから単離し，制限地図作成によ
り性格ずれを行い，望み構造をpKS−pro I Aとした（第
25図）。

10.5 植物中での発現 pKS−pro I AをK802（pKS−pro I A）.E.coli（201
3）及びアグロバクテリウム・チューメファシエンス（p
Ti 15955）（ストレプトマイシン耐性）の三親交雑（実
施例21）によりTiプラスミドの移入する。pPHLJ1のアグ
ロバクテリウムへの付加的，接合的挿入の後，二重相同
部位組み換え体をカナマイシン，ストレプトマイシン，
及びゲンタイマイシン上で生育する細胞から選択する。
レクチンは適当な抗体を用いて,ELISAにより見つける。

実施例11 この実施例の目的は,pTi 15955及び他のオクトピンTi
プラスミドのtms（「シューティング」ローカス（losu
s））からtmr（「ルーティング」ローカス（losus））
まで欠失しているTiプラスミドを埋み出すことである。
この構造体は有用である。なぜならば、これで形質転換
した細胞の方が完全なtmsとtmr遺伝子を持つpTi 15955
で形質転換したものより容易に完全な植物に再生するか
らである。

tms−tmr欠失pTi 15955は結局２つの方法で変えられ
る。tms−tmrの不活性化及び外来遺伝子の挿入である。
これらの２つの変化がＴ−DNAの違う所にあるならば、
各々の変化は異なるシャトルベクターによって別々に挿
入される。変化に依存する各々のシャトルベクターを独
立に選択するには，少なくともアグロバクテリウム中で
２つの選択マーカーの使用が必要となるだろう。通常の
カナマイシン耐性に加えてこの例では,pBR 325由来のク
ロラムフェニルコール耐性も用いる。

11.1 クロラムフェニルコール耐性遺伝子クローンの構
成 pBR 325をHin c IIで分解し,Hin d IIIリンカーと平
滑末端結合する。精製物をHin d IIIで分解し，再結合
し，クロラムフェニルコール耐性（cam）で選択したも
のを,pks−５とする。これはcam遺伝子をもつHin d III
/Bcl I断片の源となる（第26図）。

11.2 欠失及びcam遺伝子をもつＴ−DNAのpBR322クロー
ンの構成 P203のHin d III完全分解Bam H I部分分解から9.2kbp
の線状DNA断片を単離する。cam遺伝子を持つ断片をpKS
−５から単離し,9.2kbpの線状断片と混ぜ，連結し,E.co
liに形質転換する。そして，クロラムフェニコール耐性
で選択したものをpKS−Oct.Cam 203とする（第27図）。

pKS−oct.Cam 203は現在，多数のpTi 15955の欠失TL
変異の構成に使えるプラスミドである。それは,TLの右
手の腕及び右腕の左への耐性遺伝子を含む。我々はTLの
種々の左腕をCam遺伝子の左（Hin d III部位）へ付ける
ことができる。簡単に言えば，もし,p102を付けたら，
欠失は5.kbpでtmsとtmrのすべてを含むことになる。も
し,p103を付けたら欠失は3.2kbpとなり,tmsの一部分と
すべてのtmrを含むことになる。第１図参照。pKS−oct.
Cam 203をHin d IIIで分解する。p102あるいはp103をHi
n d IIIで分解し,2.2kbpあるいは2.0kbpのＴ−DNA断片
を単離し，線状化したpKS−oct.Cam 203と連結し，形質
転換し，生ずるpKS−oct.del II（第28図）あるいはpKS
−oct.del I（第29図）をそれぞれ単離する。これらの
構成を接合，相同部位組み換え及び，クロラムフェニコ
ール耐性の選択によりアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス移す。もしくは,Bam H Iで，もっているプラ
スミド構成を線状化し,pRK 290のBgl II部位に連結する
という。確立された方法を使えば構成をpRK 290に移す
ことができる（第30図）。

実施例12 この実施例において,tmr中のHpa I部位からtml中のSm
a I部への間のＴ−DNAの欠失によりTiプラスミドを変異
させる。修飾され得るTiプラスミドは,pTi 15955,pTiB
6,pTiA66及びその他である。この組み立ては，第31図に
図解してある。

12.1 cam遺伝子の単離 pKS−５（第26図）をHin d IIIとBcl Iで分解する。
実施例１で教えたように，最小の断片をアガロースゲル
で分画後，単離する。

12.2 欠失のあるＴ−DNAのpBR 322クローンの構成 Ｔ−DNAの右手の腕の欠失をp203のSma I部位にBgl II
部位を挿入することにより構成する（第１図参照）。p2
03をSma Iで分解し,Bgl IIリンカーを連結する。そして
Bgl IIで分解し，再連結する。そしてK802へ形質転換す
る。（変化した構成においては,Bam H IリンカーをBgl
IIリンカーの代わりに用いて適当なBam H I部分分解産
物を単離する。）生じたプラスミドをp203−Bgl IIとす
る。そしてそれをBgl IIとHin d IIIで分解する。断片
を含む大きなBgl II/Bam H IIIベクターを実施例12.1に
示したクロラムフェニコール耐性断片と連結する。K802
へ形質転換後，クロラムフェニコール耐性を選択する。
結果として生じたプラスミドをp2fとする。（第31
図）。

12.3 Ｔ−DNAの左手の腕の欠失したクローンの構成 Hpa I分解及びHin d IIIリンカーとの連結によりp202
のHpa I部位にHin d III部位を挿入する。Hin d III分
解によりHin d III粘着末端を露出させた後,Hin d III
を持つ2kbpのHpa I断片を単離する。Hin d IIIで分解し
たHin d III末端のHpa I断片をK802へ形質転換する。所
望の構造をもつコロニーを単離し，性格ずけをした後，
そのプラスミドをp3eとした（第32図）。

12.4 Ｔ−DNA失欠クローンの構成 クローンの左手の腕を，電気泳動後，アガロースゲル
から溶出し,p3eのHin d III分解物の2kbpの断片を精製
することにより得た。p2fをHin d IIIで切りアルカリフ
ォスファターゼ処理跡,2kbp断片と混ぜ連結し,K802を形
質転換する。そしてクロラムフェニコール耐性で選択す
る。プラスミドを個々のコロニーから単離し，制限地図
作成により性格ずけをした。望みの二つ連なった配置で
２つの腕を持っているプラスミドを選択し,pKS−oct.de
l IIIとした（第33図） pKS−oct.del IIIをアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンスへ交雑により移し，相同部位組み換え体をク
ロラムフェニコールで選択した。ヒマワリとタバコの根
と葉茎に他の例に示したものと同様に，接種し，腫瘍の
精製をオパインについて試験した。

実施例13 この実施例は実施例12の変形例であり,tmrとtmlの欠
失を構成することを教える。

13.1 Bgl II部位でのクロラムフェニコール耐性断片の
構成 pBR 325をHin c IIで分離し,Bgl IIリンカーを平滑末
端連結しBgl II分離後，再結合する（第34図）。クロラ
ムフェニコール耐性をK802あるいはGM33の形質転換した
後，選択する。結果として生じたプラスミド,pKS−6 ca
m遺伝子をもつBgl II/Bcl I断片の源となる。

13.2 tmr,tml欠失クローンの構成 p203をHpa IとSma Iで分離する。Bgl IIリンカーの平
滑末端連結の後,Bgl II粘着粉末を露出させる為に,Bgl
IIで分解する。再連結し,K802へ形質転換する。望みの
構造を同定し,p2とした（第35図）。

13.3 Ｔ−DNA欠失クローン（pKS−oct.del III a）の
構成 cam遺伝子をもつBgl II断片をpKS−６から単離し,Bgl
IIで切ったp2へ連結する。K802の形質転換後，クロラ
ムフェニコール耐性を選択した。結果として生じるプラ
スミドをpKS−oct.del III a（第36図）とし，実施例1
2.4に記述しているように試験する。

実施例14 この構成の目的は，クロラムフェニコール耐性遺伝子
の挿入による,tmrローカスのHpa I部位のみにおける変
異の例を与えることである。この遺伝子は,pK6からのBg
l II/Bcl I断片として単離し,p203のHpa I部位をBgl II
部位に変えた後でそこに連結する。

14.1 Hpa I部位のBgl IIへの変換 p203をHpa Iで分解し,Bgl IIリンカーを連結する。Bg
l IIで分解し，再連結する。K802を形質転換後，コロニ
ーBgl II部位の挿入について制限地図作成により選別
し，選択する（第37図）。

14.2 cam遺伝子の単離 pKS−６をBgl II及びBcl Iで分解する。最小の断片を
アガロースゲル電気泳動より単離する。

14.3 変異したＴ−DNAクローンの構成 実施例14.1で得た修飾されたp203をBgl IIで分解し，
実施例14.2で精製したcam遺伝子と連結し,K802へ形質転
換する。クロラムフェニコール耐性を選択し，プラスミ
ドを単離し，制限酵素地図作成により性格ずけを行い,p
KS−oct.tmrとする（第38図）。

実施例15 この実施例における再生は,Riに基礎をおくTIPにより
引き起こされるニンジンの腫瘍を含む。そしてこの例は
本質的にM.D.Chilton et al．（1982）Nature 295:432
−434により示されたのと同様に遂げられる。

15.1 毛根（hairy root）における感染 ニンジンの平板（disk）に0.1mlの水の中で10594バク
テリアを接種する。得られたルート（root）の端の1.5c
m部分を切りとりホルモンを欠く固体（１〜1.5％寒天）
Monier培地（D.A.Tepfer and J.C.Tempe（1981）C.R.He
bd.Seac.Acad.Sci.Paris 295:153−156）に置く。そし
て25℃から27℃の暗所で成育させる。

バクテリアの混じっていない培養物を２〜３週間ごと
に移し，ホルモンと寒天を欠くMonier培地においてサブ
カルチャーとする。

15.2 根（root）の植物への再生 実施例9.1における培養根組織を0.36μM 2,4−Ｄ及び
0.72μＭキネチン（kinetin）を含む固体（0.8％寒天）
Monier培地に置く。４週間後，生じたカルス組織をホル
モンを欠く液体Monier培地に移す。振とう器（150rpm）
で22℃〜250にて保温している間にカルスは懸濁培養
（ここから卵が分化する）へ分離していく。これをホル
モンを欠くMonier培地の入ったペトリ皿に移すと植物へ
成長する。これらの小植物を徐々に，湿気の少ない環境
にさらして「鍛えた」後に，温室あるいは庭園の土壌へ
移す。

15.3 毛ではない（non−hairy）根のベクターの使用 機能するtmr遺伝子を待たない,Tiが基礎となっている
ベクターを実施例15.1及び15.2に示したRiが基礎となっ
ているベクターのかわりに用いる。適当な欠失の構成は
実施例12,13及び14に示してある。

実施例16 この例における再生は,Tiに基礎をおくTIPにより引き
起こされたタバコの腫瘍を含む。又，この例は本質的に
K.A.Barton et al．（1983）Cellに示されたものと同
様に挙げられる。

16.1 クラウンゴールの感染 タバコ組織を，最初,A.C.Braun（1956）Canc.Res.16:
53−56により表わされた転化した茎の一部分を用いる方
法により形質転換する。茎を７％市販クロロックス（Ch
lorox）および80％エタノールの溶液で表面殺菌し，殺
菌した蒸留水で洗い,1cmの断片に切り端を上にして，寒
天で固化したホルモンを欠くMS培地（T.Murashige and
F.Skoog（1962）Physiol.Plant.15:473−497）の入った
ペトリ皿に置く。切り取った茎の表面に注射器の針で穴
をあけ，バクテリアを注入することにより接種を行う。
茎25℃で１日あたり16時間光にあたるようにして，培養
する。発育したcalliを駆使切片の表面から取り去り0.2
mg/mlのカルベニシリンを含みホルモンを欠く固体MS培
地に置き，続いて，約１ケ月の周期で３回，新しいカル
ベニシリン入りMS培地に移す。そして，バクテリアに支
配され続けているかどうか，確認する為の試験を行う。
無菌の組織を補足物を欠いた固体MS培地上で前述の培地
条件で保存する。（25℃,16時間:8時間 明：暗）。

16.2 形質転換した組織の培養 A.Binns and F.Meins（1979）Plinta 145:365−369で
示されたようにして，形質転換した無菌組織からクロー
ンを得る。ナフタレン酢酸（NAA）0.02mg/入りの液体
MS培地で,2,3日間,25℃,135r.p.m.で振とう培養するこ
とにより，カルス（calli）を懸濁細胞に変換する。そ
して,543及び213μｍのステンレススチールメッシュ
で，順番にろ過する。通過したろ過を濃縮し,0.5％溶解
した寒天（melted agar）,2.0mg/ NAA,0.3ml/ キ
ネチン,0.4g/ Difco酵母エキスを含む5mlのMS培地
に，約８×10534細胞/mlの濁度でプレーティングする。
直径1mmになったコロニーを外科用メス針Scalpel Point
で拾い,2.0mg/ NAA,0.3mg/キネチンを含む固体MS培
地へ置き，成育させる。生じたカルスを小片に分割し，
形質転換した表現型について試験する。

16.3 植物の再生 形質転換した植物を0.3mg/のキネチンを含む固体MS
培地に置き，実施例16.1に示したように培養する。形成
した葉茎（Shoot）を1/10強度のMS培地塩,0.4mg/チア
ミンを含み，ショ糖及び，ホルモンを欠く固体（1.0％
寒天）培地（pH7.0）に置き根を出させる。根が出た小
植物を培養して成長させ，実施例15.2のように鍛え，室
温或いは，庭園の土壌に移す。

16.4 使用ベクター 実施例16.1,16.2及び16.3に示した方法は，機能するt
mr遺伝子を欠くTiに基礎を置くベクターに適している。
適当な欠失の構成は，実施例12,13,及び14に示してあ
る。これらの方法は,Riに基礎を置くベクターを用いる
場合も効果的である。実施例16.1に示した。

転化した茎の切片の感染に関する方法はしばしばTIP
で形質転換したセルライン（cell line）を作るのに有
用である。

実施例17 これまでの実施例で用いたDNA断片の化学合成の手法
は,DNA合成の専門家によく知られた多くの手法を利用し
ている。ヌクレオシドの修飾は,H.Schallor et al．
（1963）J.Amer.Chem.Soc.85:3820及びH.Buchi and H.
G.Khorana（1965）J.Amer.Chem.Soc.87:2990らにより示
されている。デオキシヌクレオシドフォスフォルアミダ
イトの調製はS.L.Beaucage and M.H.Caruthers（1981）
Tetrahedron Lett.22:1859により示されている。固相樹
脂の調製は,S.P.Adams et al．（1983）J.Amer.Chem.S
oc.により示されている。二本鎖合成リンカーの形成に
有用なハイブリダイゼーション課程は,J.J.Rossi et a
l．（1982）J.Biol.Chem.257:11070により示される。

実施例18 ファセオリンはPhaseolis vulgaris.の最も豊富な貯
蔵タンパクである（全種子タンパクの約50％）。機能す
るファセオリン遺伝子のアルファルファへの移入，及び
貯蔵ファセオリンへのファセオリンmRNAの翻訳は重要な
経済的価値を持つ。なぜなら，家畜飼料として，用いる
葉に貯蔵タンパクを導入することになるからである。ア
ルファルファは牛の飼料となり，生育も早く，リゾビウ
ムの共生によりチッ素固定が可能で，クラウンゴールの
感染ができ，単細胞或いはプロトプラストから植物体を
再生することができる。これらのことから，アルファル
ファはファセオリン遺伝子を移入し，発現されるのに価
値ある植物だといえる。この例は，発現し得るファセオ
リン遺伝子をアルファルファに導入することを教える。

18.1 シャトルベクターの構成 遺伝的に手を加えたアグロバクテリウムのプラスミド
（後述）を持つクラウンゴール組織からアルファルファ
を再生させる。最初の段階として，我々はＴ−DNAプロ
モーターの支配下にあるファセオリン構造遺伝子に連結
しているtmr5−４及びtms5−Ｔ−DNA変異を持つ「シャ
トルベクター」を構成する。この構成を機能するネオマ
イシンフォスフォトランスフェラーゼ（NPT II）構造遺
伝子（カナマイシン耐性）を下流に持つノパリンシンセ
ターゼプロモーター（M.D.Chilton et al．（18 Junua
ry 1983）15th Miami Winter Symposiumにより報告され
ている。又,J.L.Marx（1983）Science 219:830及びR.Ho
rsch et al．（18 Junuary 1983）15th Miami Winter
Symposium参照）に順に連結する。この構成の形式は実
施例１に示してある。

18.2 アグロバクテリウム及び植物細胞への移入 “シャトルベクター”を型にはまった手法（実施例2
1）によりpTi 15955のようなTiプラスミドをもつアグロ
バクテリウム株へ形質転換する。組み換えプラスミドを
持つバクテリアを選択し，細胞壁を再生するアルファル
ファプロトプラスト（Marton et al．（1979）Nature
277:129−131;G.J.Wullems et al．（1981）Proc.Na
t′l Acad.sci（U.S.A.）78:4344−4348;R.B.Horsch an
d R.T.Fraley（18 Junuary 1983）15th Miami Winter S
ymposium）と一緒に培養する。

培養中細胞は成長し，生じたカルスについてスーザン
ブロッティング（実施例19）により適当なmRNAの存在
を，そしてELISA試験（実施例20）（J.L.Marx（1983）S
cience 219:830;R.B.Horsch and R.T.Fraley（18 Junua
ry 1983）15th Miami Winter Symposium参照）により適
当なタンパクの存在を試験する。

18.3 植物再生 それから,A.V.P.Dos santos et al．（1980）Z.Pfla
nzenphysiol.99:261−270,T.J.McCoy and E.T.Bingham
（1977）Plant.Sci.Letters 10:59−66 and K.A.Walker
et al．（1979）Plant.Sci.Letters 16:23−30等によ
りすでに用いられたのと同様の方法によりカルス組織か
らアルファルファを再生させる。それからこれらの再生
植物を新しい商品変種についての基礎を形成する型には
まったく植物育種の手法により栽培する。

実施例19 全ての例においてRNAを次に示す手順により抽出し分
画し発現する。

19.1 RNAの抽出 この手順はSilflow et al．（1981）Biochemistry 1
3:2725−2731の修飾型である。塩化セシウム遠心分離の
かわりに，塩化リチウム沈澱を代用するのは,Murray et
al．（1981）J. Mol.Evol.17:31−42に示されている。

2M 塩化リチウムに加えて2M尿素を沈澱に用いること
はRhodes（1975）J.Biol.Chem.25:8088−8097より採用
した。

繊維を，ポリトンあるいはグラウンドグラスホモジナ
イザーを用いて,4〜５倍容量の冷50mM Tris ・ Cl（pH
8.0）（４％ｐ−アミノサリシル酸,1％トリイソプロピ
ルナフタレンスルホン酸,10mMジチオスレイトール（新
しく作る）および10mMメタバイ亜硫酸ソーダ（新しく作
る）を含む）中でホモジナイズした。オクタノールは泡
立ちを制御するのに必要に応じて用いられた。１％８−
ヒドロキシキノリンを含む等量のトリス飽和フェノール
をホモジェネートに加え，乳濁するまで振る。そして20
00〜30000gで４℃15分間遠心分離した。上層の水相をク
ロロホルム／オクタノール（24:1）で１回抽出し，上記
のように遠心分離した。それから農塩化リチウル−尿素
を最終濃度がそれぞれ2Mとなるように加え，混合物を20
℃で数時間静置した。そうしてRNA沈澱物を遠心分離で
落とし，ペレットを分散させる為に2M塩化リチウムで洗
浄した。沈澱物を70％エタノール−0.3M酢酸ナトリウム
で洗い，澄んだ溶液になるよう殺菌水に溶かした。２分
の１容量のエタノールを加え，混合物を氷中１時間，放
置した。その後，遠心分離し，余分な多糖類を除いた。
RNA沈澱物をそれから，回収し，水，あるいは殺菌済無
塩，ポリ（Ｕ）緩衝液に再び溶解した。

19.2 ポリ（Ｕ）／セファデックス クロマトグラフィ
ー ２つのポリ（Ｕ）／セファデックス（商標:Pharmaci
a,Inc.,Uppsala,Sweden）緩衝液を用いた。一つは，無
塩で,20mM Tris,1mM EDTAおよび0.1％SDSを含んでい
る。もう一つは一つめの緩衝液に0.1Mの塩化ナトリウム
を加えたものである。A42605において，良好な会合を起
こすために,2x貯蔵緩衝液を作ることが必要である。そ
して一部分に塩を加えるべきである。最終濃度にあわせ
てから，緩衝液をオートクレーブにかける。

ポリ（Ｕ）セファデックスは,Bethesda Research lab
oratoriesより得た。100μｇの期待さえるポリ（Ｕ）RN
Aについて1gのポリ（Ｕ）セファデックスを用いた。ポ
リ（Ｕ）セファデックスを，無塩のポリ−Ｕ緩衝液に水
和し，ジャケットをつけたカラムに流し込む。温度を60
℃上げ，カラムを無塩緩衝液で260mmにおけるベースラ
インが平滑になるまで洗った。最終的には，カラムを塩
を含むポリ（Ｕ）緩衝液で40℃で平衡化する。

濃度が500μg/ml以下のRNAを無塩緩衝液中で65℃,5分
間加熱した。その後，冷却し，塩化ナトリウムを0.1Mの
濃度になるように加えた。それから光学濃度が安定なベ
ースラインまで落ちるまで，流速1ml/min以下で流した
カラムにRNAを移す。それから，カラム温度を60℃まで
上げ,RNAを無塩ポリ（Ｕ）緩衝液で溶出させた。RNAは
普通３倍のカラム容量で洗い出される。溶出したRNAを
用いやすい容量まで２級ブタノールで濃縮し,10mMにな
るように塩化ナトリウムを加えた後,2倍容量のエタノー
ルを加え沈澱させる。エタノール沈澱物を水に溶かし,N
H445−酢酸塩を0.1Mになるよう加える。そしてエタノー
ルで再び沈澱させる。最終的にRNAを殺菌水に再溶解
し，−70℃において保存する。

19.3 ホルムアルデヒド RNA ゲル 用いる方法はThomas（1980）Proc.Nat′l.Acid.Sci
（U.S.A.）77:5201およびHoffman, et al．（1981）J.
Biol.Chem.256:2597によるものである。

20mMリン酸ナトリウム（pH6.8〜7.0）を含む0.75〜1.
5％のアガロースゲルを固めた。もし高分子の集合した
バンドが現れたら,6％あるいは2.2Mのホルムアルデヒド
（36％の貯蔵溶液を用いる）を加えて，実験をやり直し
た。ホルムアルデヒドを，アガロースに65℃まで冷やし
てから加えた。ホルムアルデヒドを加えると臭化エチヂ
ウムにより発見が困難になる。泳動緩衝液は10mMリン酸
ナトリウム（pH6.8〜7.0）である。

電気泳動に先だち,RNAを最終濃度６％ホルムアルデヒ
ド,50％ホルムアルデヒド,20mMリン酸ナトリウム緩衝液
および5mM EDTAの変形緩衝液で処理した。RNAを緩衝液
中60℃で10〜20分間保温した。保温は，停止緩衝液の添
加に停止した。

20μのサンプルついて,4μ50％グリセロール,10m
M EDTA 5mMリン酸ナトリウムをそしてブロムフェノール
ブルーを加えた。

浸水した電気泳動を用いる。ゲルを浸す前に,RNAをロ
ードした。そして125mAで５分間ゲルの中にいれた。そ
れからゲルを水に浸し，電流を30mA（夜通し）あるいは
50mA（６〜８時間）に下げる。

緩衝液を循環させ，低温度で電気泳動を行った。

19.4 “ノーザン”ブロット もし，特異的なRNAを発見するためにブロットするゲ
ルならば，染色しなかった。しかし，分離したマーカー
のレーンは染色に用いた。染色は0.1M酢酸ナトリウム中
５μg/ml臭化ブロマイドで行い，脱染は,0.1M酢酸ナト
リウム中数時間行った。染色の前に,5〜10時間60〜70℃
の水で処理すると視認が容易になった。

ブロットするゲルを15分間10x標準サリンクエン酸（S
SC）−３％ホルムアルデヒドに浸した。もし，大きなRN
Aに切れ目を入れるために50mM水酸化ナトリウム中10〜3
0分間処理した。もし，基礎処理を用いたのなら，ブロ
ットする前に，ゲルを中和し,SSC−ホルムアルデヒドに
浸すべきである。RNAのニトロセルロースへの転移は標
準方法により行った。

プレハイブリダイゼーションを42℃で最低４時間,50
％ホルムアルデヒド,10％硫酸デキストラン,5xSSC,5xデ
ンハート,100μg/ml変性キャリアーDNA,2μg/mlポリ
（Ａ）,40mMリン酸ナトリウム（pH6.8〜7.0）,0.2％SDS
中で行った。ハイブリダイゼーションをプローブと同じ
緩衝液に加え，一晩保温して行った。プローブは大体5x
10554c.p.m./ml以上の濃度で用いた。

ハイブリダイゼーション後，ニトロセルロースを,42
℃で2xSSC,25mMリン酸ナトリウム,5mM EDTA,2mMピロリ
ン酸ナトリウム溶液を用いて何度も洗った。最後に,64
℃で20分間1xSSCで洗った。

もし，オートラジオグラフィーに際して，フィルター
が乾燥していなくて，また，プローグ1mM EDTAにより64
℃で広範囲に洗ったことで除かれているのなら，最上の
結果が得られた。

実施例20 “ウェスタン”ブロット（SDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後，抗原を発見するために行う）は，本質的
にはR.P.Legocki and D.P.S.Verma（1981）Analyt.Bioc
hem.111:385−392に示されていると同様に行った。

マイクロ−ELISA（enzyme−linked immnnosorbant as
say）を96個のウェル（well）をもつImmulon−２型プレ
ートを用いて次に示すステップにより行った。

20.1 プレートへの抗体の結合 一日目，ウェルをコーティング緩衝液で1:1000に希釈
した。抗体（ウサギ抗ファセオリンIgG）でコート（coa
t）した。200μ/wellで37℃で２〜４時間，保温し
た。プレートをサランラップでおおった。それから，プ
レートをリン酸緩衝液サリン−ツィーン（PBS−Tween）
で３回洗った。各々の洗いのステップは５分間あけた。
それから１％のボバインセーラムアルブミン（BSA）を
洗いのために加え,20分間放置してから捨てた。洗いはP
BS−Tweenを用いて５回以上，行った。

20.2 組織のホモジェナイジング 組織を，小片に切ってから，ポリトロンにより1gの組
織/mlリン酸緩衝液サリン−ツィーン−２％ポリビニル
ピロリドン−40（PBS−Tween−２％PVP−40）の条件で
ホモジェナイズした。すべてのサンプルは，破砕前後お
よびファセオリン標準曲線の作成の前後に氷中で保存し
た。組織のホモジェネートで標準曲線を作成した。そし
て，組織に依存するファセオリンの回収をチェックする
ために緩衝液で標準曲線を作った。ホモジェナイズした
サンプルを遠心分離した後，各々のサンプルのうち100
μをウェルに入れ,4℃で一晩放置した。失敗を避ける
ために各々のサンプルについて２個同じことをした。保
温中，プレートはシールした。

20.3 酵素の結合 一晩保温後，抗原を捨て，ウェルをPBS−Tweenで５回
洗う。各々の洗いの間に５分間の間隔をおいた。

結合物（ウサギ抗ファセオリンIgGアルカリフォスフ
ァターゼ結合）をPBS−Tween−−２％PVP（0.2％BSAを
含む）で1:3000に希釈し,150μを各ウェルに加えた。
そして,37℃で３〜６時間保温した。保温後，結合物を
捨て，ウェルをPBS−Tweenで５回洗う。各々の洗いの間
に５分間の間隔を置く。

20.4 分析 分析を始める直前に,p−ニトロフェニルフォスフェイ
トの5mgの錠剤（Sigmaより得た。そして暗所で凍結保
存）を,10mlの基質に加え，錠剤が溶解するまで撹拌す
る。200μの室温溶液をすばやく各ウェルに加える。
反応を種々の時間（例えば,t＝0,10,20,40,60,90,120
分）においてdynatech micro−elisa reader用いて測定
する。

ｐ−ニトロフェニルフォスフェート（無色）がアルカ
リフォスファターゼにより無機リン酸とｐ−ニトロフェ
ノールに加水分解されるとｐ−ニトロフェノールが溶液
に黄色を与える。それは,410nmにおけるスペクトロメト
リカリーによむことができる。

発見できる最小量は0.1ngより小である。

実施例21 三親交雑は，一般的に，次に示すように行われた。当
業者に知られた他の変法も用いることができる。

E.Coli K802（pRK290に基礎をおくシャトルベクタ
ー）をE.coli（pRK2013）およびストレプトマイシンに
耐性なA.tumefaciens株と交雑した。pRK2013は，シャト
ルベクターを持つ株に移り,Agrobacteriumへ移入するた
めのシャトルベクターを作った。ストレプトマイシンお
よびシャトルベクターが耐性である薬剤（だいたいカナ
マイシンか，クロラムフェニコール）の両方を含む培地
で成育するものの中からシャトルベクター配列を有す
る。Agrobacteriumの細胞を選択した。これらの細胞と
E.coli（pPH1J1）との交雑によりAgrobacterium細胞にp
PH1J1が移った。pPH1J1とpRK290に基礎を置くシャトル
ベクターは同一細胞内に長時間，共存することができな
い。ゲンタマイシン（pPH1J1が耐性遺伝子をもつ）を含
む培地で成育させれば,pRK290配列の欠落した細胞を選
択することができた。

ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンおよびカナ
マイシンあるいはクロラムフェニコールに耐性な細胞の
みがシャトルベクターと二重相同部位組み換えをおこし
たTiプラスミドを持ち，望みの構成を持っている。

【図面の簡単な説明】

第１図はpTi 15955のＴ−DNA領域を示す説明図，第２図
はオクトピンシンセターゼ遺伝子の塩基配列図，第３図
（第３図−１と第３図−２として表示）はファセオリン
遺伝子とcDNAの完全塩基配列図，第４図はノパリンシン
セターゼ遺伝子の完全塩基配列図，第５図はpKS−nop I
Vの構造を示す説明図，第６図はpKS−Nop IV KB3.8の作
成と構造を示す説明図，第７図はpKS4−KBの構造を示す
説明図，第８図はシャトルベクターpNNN1の構造を示す
説明図，第９図はpNNN2の作成とその構造を示す説明
図，第10図（第10図−１と第10図−２として表示）はp4
01の右側にcIa I部位のあるHind III部位からの塩基配
列図，第11図はpTi 15955の構造を示す説明図，第12図
はpKS−Pro Iの作成を示す説明図，第13図はp7.2の構造
を示す説明図，第14図はpKS−Pro I−KBの構造を示す説
明図，第15図はファセオリン貯蔵タンパク遺伝子の構造
を示す説明図，第16図はp3.8の構造を示す説明図，第17
図はpBR322の構造を示す説明図，第18図はpKS−４の構
造を示す説明図，第19図はpKS−KB3.8の構造を示す説明
図，第20図はpKS4−KB2.4の作成手順を示す説明図，第2
1図はpKS4−KB2.4の構造を示す説明図，第22図はファセ
オリンんの遺伝的環境へのファセオリンcDNAのクローニ
ングを示す説明図，第23図pL−Ｂの作成を示す説明図，
第24図はpKS−Pro I Aの構造を示す説明図，第25図はpL
K−Pro I Aの構造を示す説明図，第26図はPKS−５の作
成を示す説明図，第27図はpKS−oct.Cam203の作成を示
す説明図，第28図はpKS−oct.del IIの構造を示す説明
図，第29図はpKS−oct.del Iの構造を示す説明図，第30
図はpRK290の構成を示す説明図，第31図はp2fの作成を
示す説明図，第32図はp3eの作成を示す説明図，第33図
はpKS−oct.del IIIの作成を示す説明図，第34図はpKS
−６の作成を示す説明図，第35図はp2の作成を示す説明
図，第36図はpKS−oct.del III aの作成を示す説明図，
第37図はp203のHpa I部位のBgl II部位への変換を示す
説明図，第38図はpKS−oct.tmrの構を示す説明図，第39
図は実施例11,12,14のプラスミドの構造を示す説明図，
第40図は遺伝子コードを説明する説明図，第41図は大腫
瘍遺伝子の塩基板配列図，第42図はp203構造を示す説明
図，第43図はpKS−B17−KB3.0の構造を示す説明図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジエリー エル．スライトム アメリカ合衆国 ウイスコンシン 53714 マジソン，レタナ ドライブ 5010 (72)発明者 デニス ダブリユ．サツトン アメリカ合衆国 ウイスコンシン 53558 マツクフアーランド，アルベン アベニユー 5611 (72)発明者 ノリモト ムライ アメリカ合衆国 ウイスコンシン 53703 マジソン，ウエスト ゴーラム ストリート 138

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｔ−DNAプロモーターの支配下で挿入され
   た植物構造遺伝子を持つＴ−DNAを含むDNAベクターであ
   って、該植物構造遺伝子はイントロンを持ち、そして該
   Ｔ−DNAプロモーターはノパリンシンセターゼプロモー
   ターおよび“1.6"転写物プロモーターからなる群から選
   択される、DNAベクター。
2. 【請求項２】前記植物構造遺伝子がcDNAを含む、特許請
   求の範囲第１項に記載のDNAベクター。
3. 【請求項３】前記Ｔ−DNAがtmsあるいはtmrの変化ある
   いは欠失により修飾をうけている、特許請求の範囲第１
   項に記載のDNAベクター。
4. 【請求項４】Ｔ−DNAプロモーターの支配下で挿入され
   た植物構造遺伝子を持つＴ−DNAを含むDNAベクターを有
   し、かつ複製させるバクテリア株であって、該植物構造
   遺伝子はイントロンを持ち、そして該Ｔ−DNAプロモー
   ターはノパリンシンセターゼプロモーターおよび“1.6"
   転写物プロモーターからなる群から選択される、バクテ
   リア株。
5. 【請求項５】前記植物構造遺伝子がcDNAを含む、特許請
   求の範囲第４項に記載のバクテリア株。
6. 【請求項６】前記Ｔ−DNAがtmsあるいはtmrの変化ある
   いは欠失により修飾をうけている、特許請求の範囲第４
   項に記載のバクテリア株。
7. 【請求項７】アグロバクテリウム・チューメファシエン
   スあるいはアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む、特
   許請求の範囲第４項に記載のバクテリア株。
8. 【請求項８】前記DNAベクターが、pKS4、p3.8、pcDNA31
   あるいはpPVL 134からなる群から選択される、特許請求
   の範囲第４項に記載のバクテリア株。
9. 【請求項９】Ｔ−DNAプロモーターの支配下で挿入され
   た植物構造遺伝子を持つＴ−DNAを含むDNAが移入された
   植物組織または植物細胞；ここで、該植物構造遺伝子は
   イントロンを持ち、そして該Ｔ−DNAプロモーターはノ
   パリンシンセターゼプロモーターおよび“1.6"転写物プ
   ロモーターからなる群から選択される。
10. 【請求項１０】前記植物構造遺伝子がcDNAを含む、特許
    請求の範囲第９項に記載の植物組織または植物細胞。
11. 【請求項１１】前記植物構造遺伝子が種子貯蔵タンパク
    をコードしている、特許請求の範囲第９項に記載の植物
    組織または植物細胞。
12. 【請求項１２】前記植物構造遺伝子がファセオリンをコ
    ードしている、特許請求の範囲第９項に記載の植物組織
    または植物細胞。
13. 【請求項１３】前記植物構造遺伝子がＴ−DNA構造遺伝
    子へ融合されており、そのことにより前記Ｔ−DNA構造
    遺伝子／植物構造遺伝子結合物がＴ−DNAにコードされ
    るタンパクと植物のタンパク配列とを含む融合タンパク
    をコードする、特許請求の範囲第９項に記載の植物組織
    または植物細胞。