JPS60210988A - 植物構造遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は植物構造遺伝子の発現に関する。

（従来技術） シャトルベクター ＲｕｖｋｕｎとＡｕ５ｕｂｅｌ　（１９８１）　Ｎａｔ
ｕｒｅ　２８９：８５−８８゜により開発されたシャト
ルベクターは外来遺伝物質を大プラスミド、ウィルスま
たはゲノムの選ばれた位置に挿入する方法を可能とする
。大プラスミド又はゲノムを扱う場合、２つの主要問題
がある。１つは大プラスミド各制限酵素の多くの部位を
有する。特定の部位特異的切断反応は再現性がなく、多
部位切断反応とそれに続く連結は変化させたくない多く
のフラグメントの順序、方向を混乱させる大きな難点を
生ずる。第二に大ＤＮＡプラスミドを用いた形質転換効
率は非常に低い。シャトルベクターは、しばしばインビ
トロで、外来遺伝物質を小プラスミドに容易に挿入し２
次に通常インビボ技術により、大プラスミドに移すこと
により、これらの困難を打開することが可能である。

シャトルベクターは究極の受容細菌へ導入され得る９通
常プラスミドであるＤＮＡ分子より成る。

それは又、〉［来遺伝物質が挿入され得る受容ゲノムの
フラグメントのコピーと、これもまた受容ゲノムフラグ
メントに挿入される選択形質をコードするＤＮＡセグメ
ントを含む。選択形質（”マーカー”）はトランスボソ
ン突然変異誘発または制限酵素とりガーゼにより容易に
挿入される。

該シャトルベクターは究極受容細胞、典型的にはアグロ
バクテリウム属の細菌、へ三組交雑（ＲｕｖｋｕｎとＡ
ｕ５ｕｂｅｌ　、前出）、二組交雑での自己可動性ベク
ターの直接移送、アグロバクテリウム細胞による外部Ｄ
ＮＡの直接取込み（Ｍ、　１ｌｏｌｓｔｅｒｓｅｔ、　
ａｌ、（１９７８）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、　１６３　：　１８１−１８７の条件を用いる”
形質転換”）、他の細菌細胞とアグロバクテリウムのス
フ二ロプラスト融合。

リポソーム包括ＤＮＡの取込み、またはインビトロでパ
ッケージ可能なウィルス上にあるシャトルベクターの怒
染、により導入される。三組交雑はプラスミド可動と接
合移送に関する遺伝子を有する可動性プラスミドを有す
る菌株とシャトルベクターを有する菌株との交雑を含む
。もしシャトルベクターがプラスミド遺伝子により移動
可能ならば、そのシャトルベクターは大ゲノム、例えば
アグロバクテリウム菌株のＴｉまたはＲｉプラスミドを
有する受容細胞へ移される。

シャトルベクターが受容細胞へ導入された後。

マーカーのいずれか一方の側での１回の組換えを伴う二
重乗換えが期待される。この現象はマーカーを含むＤＮ
Ａセグメントを受容ゲノムへ移し。

挿入物を欠く相同セグメントと置換することになるだろ
う１元のシャトルベクターを欠失した細胞を選択する為
に、そのシャトルベクターは究極受容細胞中で複製が不
可能であるか、受容細胞に既存の独立に選択可能なプラ
スミドと不和合性でなければならない。この為の１つの
共通的な手段はシャトルベクターと不和合性でかつ他の
薬剤耐性マーカーを有する他のプラスミドを第３の親に
備えることである。従って両薬剤耐性で選択すると。

生存細胞はその中でシャトルベクターのマーカーが受容
ゲノムと組換えを起こしたもののみである。

もしシャトルベクターが余分のマーカーを持っていれば
、シャトルベクターと受容プラスミド間での１回の乗換
えの結果化じる完全なシャトルベクターが受容プラスミ
ドに組み込まれたものを有する細胞を選択し、排除でき
る。もし外来遺伝物質が選択しようとするマーカー内か
、近接した位置に挿入されていれば、同じ二重組換の結
果、それは受容プラスミドに組み込まれるであろう。相
同フラグメントのマーカー内または近接した位置でなく
、外来遺伝物質がマーカーから遠く離れて挿入されてい
る場合、外来遺伝物質とマーカーの間で組換えが起こり
、外来遺伝物質を移せない事も起こるだろう。

シャトルベクターはアグロバクテリウムのプラスミドの
操作に有用であることが証明されている。

参照　Ｄ、Ｊ、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅＬ　ａｌ、（１
９８１）　Ｃｅ１ｌ　２７：１４３−１５３．＾、Ｊ、
Ｍ、Ｍａｔｚｋｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　
（１９８１）Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、ＧｅｎｅＬ、
土：　３９−４９．およびＪ　、　Ｌｅｅｍａｎｓｅｔ
　ａｌ、　（１９８１）　Ｊ、Ｍａｌｅｃ、　Ａｐｐｌ
、　Ｇｅｎｅｔ、土：　１４９−１６４、ここではシャ
トルベクターを”中間ベクター（ｉｎｔｅｒｍｅｄｅａ
ｔｅ　ｖｅｃｔｏｒｓ）　”と呼んでいる。

アグロバクテリウム−説 グラム陰性細菌、リゾビウム科のアグロバクテリウム属
に、アグロバクテリウム・チューメファシエンス（＾、
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）種とアグロバクテリウム・
リゾゲネス（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ＞種がある。こ
れらの種は夫々植物のクラウンゴール病９毛状根病（ｈ
ａｉｒｌｙ　ｒｏｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　）の原因とな
る。クラウンゴールは未分化組織の唐（ｇａｌｌ）化に
特徴づけられる。毛根は感染組織での異常な根（ルート
）の誘導により特徴づけられる奇形腫である。雨宿にお
いて、異状な増殖植物組織は植物により正常には生産さ
れない通常オピンとして知られている１つまたはそれ以
上のアミノ酸誘導体を生産し。

これは感染細菌により異化される。既知のオピンは３族
に分類され、その典型的なメンバーはオクトピン、ツバ
リン、アグロピンである。異常増殖組織の細胞は培養に
より増殖可能であり、また適当な条件下で形質転換した
表現型を保ちつつ完全な植物に再生される。

アグロバクテリウムのヴイルレント株はアグロバクテリ
ウム・チューメファシエンスではＴｉ　（腫瘍誘導；　
Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミド、アグロバ
クテリウム・リゾゲネスではＲｉ　（ルート誘４　ｉ　
ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドと呼ばれる大
プラスミドを有する。これらのプラスミドを菌から消去
すると病原性を失う。ＴｉプラスミドはＴ−ＤＮＡ　（
転移ＤＮＡ）と呼ばれる。腫瘍では宿主植物のゲノム中
に組み込まれている。領域を含む。Ｔ−ＤＮＡは数種の
転写物をコードしている。突然変異の研究からこれらの
うちのいくつかは腫瘍の増殖の誘導に関与している事が
示された。ｔｍｌ、ｔｍｒおよび〕遺伝子の変異は夫々
巨大腫瘍（タバコで）。

ルート出現傾向、シュート誘発傾向を示す。Ｔ−ＤＮＡ
はまた少なくとも１つのオピンシンセクーゼ遺伝子をコ
ードし、Ｔｉプラスミドは、しばしば。

それが合成し得るオピンにより分類される。　各Ｔ−Ｄ
ＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下にある。

このＴ−ＤＮＡプロモーターは真核生物のプロモーター
に構造が類似しており、形質転換植物細胞でのみ機能す
るらしい。ＴｉプラスミドはまたＴ−ＤＮＡ領域外にに
も遺伝子を担っている。これらの遺伝子はオビン異化９
発癌性、アゲロジン感受性、複製、細菌細胞への自己軸
道の機能に関与している。ＲｉプラスミドはＴｉプラス
ミドと類似の構造をとっている。植物細胞の形質転換に
関与する一連の遺伝子とＤＮＡ配列は以下形質転換誘導
因子（ＴＩＰ）として総合的に呼ぶ。

従ってＴＩＰの名称はＴｉおよびＲｉプラスミド両者を
包含する。ＴＩＰの取り込まれたセグメントを。

ここではＴ−ＤＮＡと称し、ＴｉプラスミドあるいはＲ
ｉプラスミドに由来している。最近のアグロバクテリウ
ム起因病の一般的総説はり、Ｊ、Ｍａｒｉｏ（１９８２
）　。

Ａｄｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏ＋、上：　１３９−１
７８．　Ｌ、Ｗ、Ｒｅａｍ　ａｎｄＭ、Ｐ、Ｇｏｒｄｏ
ｎ　（１９８２）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１８　：　
８５４−８５９．および門、Ｗ、Ｂｅｖａｎ　ａｎｄ　
Ｍ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９８２）　＋へｎｎ。

Ｒｅｂ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６　：　３５７−３８４；
　Ｇ、Ｋａｈｌ　ａｎｄ　Ｊ、Ｓｃｈｅｌｌ（１９８２
）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂａｉｏｌｏｇ　ｏｆ　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｔｕｍｏｒｓに述べられている。

アグロバクテリウム−直′組゛のＦ、染植物細胞は既知
の多くの方法によりアグロバクテリウムにより形質転換
され得る；例えば植物細胞とアグロバクテリウムとの共
存培養；植物の直接感染；植物プロトプラストとアグロ
バクテリウムスフェロプラストの融合；植物細胞プロト
プラストによる遊離ＤＮＡの取込みによる直接形質転換
；部分的に細胞壁を再生しているプロトプラストの完全
な細菌による形質転換；プロトプラストのＴ−ＤＮＡ含
有リポソームによる形質転換；Ｔ−ＤＮＡを保持するウ
ィルスの利用；ミクロインジェクション等。どの方法も
遺伝子が確実に発現される限り充分であり、有糸分裂お
よび減数分裂を通じて安定に伝達される。

植物組織のアグロバクテリウムによる感染は熟練した技
術者には公知の単純な技術である。（例えばり、Ｎ、Ｂ
ｕｔｃｈｅｒ　ｅｔ　旦、（１９８０）　ｉｎ　Ｔｉ５
ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏ　１ｓｔｓ、ｅｄｓ、：Ｄ、Ｓ
、Ｉｎｇｒａｎｍｓ　ａｎｄ　Ｊ、Ｐ、Ｉｌｅ１ｇｅｓ
ｏｎ＋　ｐｐ、２０３−２０８参照）。植物は種々のど
の方法によっても傷つけられる１例えば刃で切る。針で
穴をあける。あるいは研磨剤で摺るなど。次いで傷口を
腫瘍誘導細菌を含む溶液で感染させる。完全な植物を感
染させる他の方法はジャガイモの塊茎小片（Ｄ、に、Ａ
ｎａｎｄａｎｄ　Ｇ、Ｔ、ＩＩｅｒｂｅｒｌｅｉｎ　（
１９７７）　八ｍｅｒ、Ｊ、Ｂｏｔ、６４　：　１５３
−１５８）またはタバコ茎の断片（Ｂｉｎｎｓ　ｅｔ　
ａｌ、　）などの組織の小片を植えつけることである。

誘導後、腫瘍は植物ホルモンを含まない培地で組織培養
され得る。ホルモン非依存性増殖は形質転換植物組織の
典型であり、培養組織の増殖の通常の条件とは大いに対
照的である（Ａ、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　（１９５６）Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、■：　５３−５６　）。

アグロバクテリウムはまた単離細胞および培養細胞（Ｍ
ａｒｔｏｎ　ｅｔ　計、（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ　
２７７　：１２９−１３１　’Ｉおよび単離したタバコ
葉肉プロトプラストを感染させ得る。後者の技術では、
新しい細胞壁を一部再生させる時間をおいて９次いでア
グロバクテリウム細胞を培養に加え、後、抗生物質を添
加し殺した。アグロバクテリウム・テユーメファシエン
ス細胞に接触し、Ｔｉプラスミドを保持した細胞のみホ
ルモンを含まない培地にプレートしたときカルスを形成
した。大部分のカルスはオピン同化に関する酵素活性を
有していた。他の研究者（Ｒ，Ｂ、Ｈｏｒｓｃｈ　ａｎ
ｄ　Ｒ，Ｔ、Ｐｒａｌｅｙ　（１８Ｊａｎｕａｒｙ１９
８３　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍ　）は共存培養により、形質転換しホルモン
非依存性増殖するカルスを高頻度（１０％以上）で得、
カルスの９５％がオピンを作った。Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ
　ｅＬ　旦、（１９８０）ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ　ａｎｄ
　ｌｌｅ１ｇｅｓｏｎ＋前出、　ｐｐ、２０９−２１９
．はプロトプラスから再生した老細胞の感染について述
べている。

植物プロトプラストはＴＩＰプラスミドの直接取込みに
より形質転換され得る。Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ　ｅｔａｌ
、（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、　１
８：３０７−３１３．およびＭ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９８０）　ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ　ａｎｄ
ｌｌｅｌｇｅｓｏｎ、前出、はペチュニアのプロトプラ
ストをポリーＬ−α−オルニチン存在下でＴｉプラスミ
ドで形質転換し、培養によりオピン合成とホルモン非依
存性増殖の表現型を示した。その後、ポリエチレングリ
コールがＴｉ取込みを促進し、あるＴ−ＤＮＡ配列がゲ
ノムに取り込まれることが示された。　（Ｊ、Ｄｒａｐ
ｅｒ　ｅｔ　ａｔ、（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ
Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２３：４５１−４５８．
　Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　１９８２．　ｅｄ　：　Ａ。

Ｆｕｊｉｗａｒａ＋　ｐｐ、５１５−５１６）　ｏ　Ｆ
、Ａ、Ｋｒｅｎｓ　ｅｔ　旦。

（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９６　ニア２−７４は
同様の結果をポリエチレングリコール次いでカルシウム
ショックによる方法で報告したが、彼らの結果では取り
込まれたＴ−ＤＮＡはＴｉプラスミド配列の近接部分を
含んでいた。

ＤＮＡを取り込ませる他の方法にリポソームの使用があ
る。　ＤＮＡ含有リポソームの調製はＰａｐａｈａｄｊ
ｏｐｏｕｌｏｓの米国特許第４，０７８，０５２号と第
４．２３５，８７１号にある。Ｔｉ−ＤＮＡをリポソー
ムによる導入する方法が報告されている（Ｔ、Ｎａｇａ
ｔａｅｔａｌ、（１９８２）　ｉｎ　Ｆｕｊｉｗａｒａ
、前出、　ｐｐ、５０９−５１０およびＴ、Ｎａｇａｔ
ａ　（１９８１）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１
８４　：　１６１−１６５　）。類似の系に細胞壁を除
去した植物と細菌の細胞の融合がある。この技術の例は
Ｓ、１ｌａｓｅｚａｅｖａ鮎旦、（１９８１）　Ｍｏ１
．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８２：２０６−２１０
により報告されているアグロバクテリウムのスフェロプ
ラストによるツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ　）の形質
転換である。植物プロトプラストは細胞壁が不完全なア
グロバクテリウム細胞を取り込むことができる。（Ｓ、
１Ｉａｓｅｚａｓｖａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　１
ｎＦｕｊ　ｉｗａｒａ＋　前出、　ｐｐ、５１７−５１
８）。

Ｔ−ＤＮＡは２つのプロトプラストの融合による再生し
た組織に移り、一方のみが形質転換される（Ｇ、Ｊ、Ｗ
ｕｌｌｅｍｓ　ｅＬ旦、　（１９８０）　Ｔｈｅｏｒ、
　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、５６　：　２０３−２０８　）　、植物の
再生の項で詳しく述べるように、Ｔ−ＤＮＡは減数分裂
でも伝わり、単純なメンデル法則に従って子孫に伝達さ
れる。

アグロバクテリウム−１物の　生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫瘍
から得られた。Ａ、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　ａｎｄ　１１．Ｎ
、Ｗｏｏｄ（１９７６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３　：　４９６−５００゜は
タバコ奇形種（ｔｅｒａｔｏｍａｓ　）を正常な植物に
つぎ木し、正常に見える開花し得るシュートを得た。

このシュートは培地におくと、オビン生成能と。

植物ホルモン非依存増殖能を保持した。選択された植物
では、これら腫瘍表現型は子孫に伝達されないようで、
多分減数分裂の間に消失した。（Ｒ。

Ｔｕｒｇｅｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７６）　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵｓＡ互：　３５６２−３５６４　＞。自然に腫瘍の性
質を失った。あるいは奇形種の種から生じた植物は、当
初すべてのＴ、−Ｄ　Ｎ　Ａを失ったように思われてい
た（Ｆ、−Ｍ、Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　
Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６：８７−９２＋　Ｐ、Ｙａｎｇ
　ｅｔ　旦、（１９８０）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ。

１７７　ニア０７−７１４．　Ｍ、Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅ
ｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｊ、’Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．１
４４　：３５３−３７６　）。　しかしホルモン（１■
／βカイネチン）処理後復帰した植物を用いた後の研究
で、減数分裂を経た植物は形質転換表現型に関するＴ−
ＤＮＡ遺伝子は失っているがＴ−ＤＮＡの両端に相同性
のある配列を維持していた。（Ｆ、Ｙａｎｇ　ａｎｄ　
Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　（１９８１）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ヱ旦：　４１５
１−４１５５　）　、Ｇ、Ｊ。

Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｃｅ１ｌ
　２４ニア１９−７２４．はさらにオピン同化に関する
遺伝子は、その植物は雄性不稔であるが、減数分裂を通
して伝わること。

そしておそら＜Ｔ−ＤＮＡはそのままメンデル法則に従
って遺伝し得ることを示した。（Ｇ、Ｗｕｌｌｅ＋＋＋
ｓｅｔ　ａｌ、（１９８２）　ｉｎ　Ａ、Ｆｕｊｉｗａ
ｒａ＋前出）　。１．０Ｌｔｅｎｅｔ　ａｌ、（１９８
１）　Ｈｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８３：２
０９−２１３゜はシュートを生じる腫瘍生成に］（シュ
ート誘導）遺伝子壁でのＴａ２）ランスポソン起因Ｔｉ
プラスミド変異を用いた。これらのシュートが植物中で
再生すると自己稔性花を生じた。着生した種が発芽した
植物はＴ−ＤＮＡを有しオピンを生成した。瀘（ルート
誘導）変異を用いた同様の実験で全Ｔ−ＤＮＡが減数分
裂を通して子孫に伝わり。

これら子孫で程度にバラツキがあるが、ツバリン遺伝子
が発現すること、また同時に伝達された酵母のアルコー
ル脱水素酵素！遺伝子は発現しないことが示された。（
Ｋ、Ａ、Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａＬ　（１９８３）Ｃｅ
ｌ＋　３２：　１０３３−１０４３　）　、　Ｔ−ＤＮ
Ａ配列を欠く再生組織はおそら（腫瘍に混在していた非
形質転換細胞の子孫であるらしい。（Ｇ、Ｏｏｍｓ　ｅ
ｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０　：　５８９−５９７　
）　、アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換
の結果化じたルートは比較的容易に苗に再生することが
示された。

（Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２
）　Ｎａｔｕｒｅ　２９Ｆし４３２−４３４　）。

アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミド上の遺伝子ＴＩ
ＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に多数の遺伝子が同定され
た約半ダースのオクトピンプラスミドＴ−ＤＮＡ転写物
がマツピングされ（Ｓ、Ｂ、Ｇｅ１ｖｉｎＯ旦、（１９
８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩ
ＳＡ　７９　ニア６−８０．　Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅ
ｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　ＥＭＢＯＪ。

１　：　１３９−１４６　）　、またいくつかの機能が
明確にされた（Ｊ、Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅＬ　ａｌ、（１
９８２）　ＥＭＢＯＪ、土：１４７−１５２　）。オク
トピン型プラスミドの４つの遺伝子がｔｍｓ、　ｔｍｒ
および」１　を含むトランスボソン変異誘発により充分
明確になった。（Ｄ、Ｊ。

これらの遺伝子に変異をもつＴｉプラスミドはニコチニ
ア・ツバカムの腫瘍カルスを刺激し、シュートを生じ、
ルートを生じ、そして正常より大きくなる。他の宿主で
は、これら遺伝子の変異は異なった表現型を誘導し得る
（Ｃｈｉｌｔｏｎ、　Ｍ、Ｄ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　（１９８２）参照）。」懸とＡ　の表現
型は腫瘍に存在する植物ホルモンレベルの差異と相関い
ている。サイトカイニン：オーキシン比の相違は培養で
非形質転換カルス組織でシュートまたはルート形成を誘
導した場合と類似している。（Ｄ、Ｅ。

Ａｋｉｙｏｓｈｉ　ｅ↓　ａｌ、　（１９８３）　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０　：　４０７−４１１　）　、ｔｌｌ１３
またはＡどららか一方のみの機能遺伝子を持つＴ−ＤＮ
Ａ　（ｉ能する」１のみの場合ではないが）は、明白な
腫瘍増殖を刺激し得る。シュートとルートの刺激は機能
ｔｍｌにより夫々促進と阻害を受ける。（Ｌ、Ｗ、Ｒｅ
ａｍ　ｅｔａｌ、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：　１６６０−１
６６４　）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子の変異が植物ゲノムへの
Ｔ−ＤＮＡの挿入に影響することはないようである（Ｊ
、１、ｅｃｍａｎｓ　ｅＬ　ａｌ、（１９８２）同上；
　Ｌ、Ｗ。

Ｒｅａｍ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）同上）。オクトピ
ンシンセターゼをコードするＯＣ８遺伝子はＨ，Ｄｅ　
Ｇｒｅｖｅｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ
ｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、土：　４９９−５１１゜により
塩基配列が決定された。これはイントロン（真核遺伝子
に共通して見られる介在配列で転写後ｍＲＮＡのプロセ
ッシングの間にメンセンジャー前駆体から除かれる）を
有していない。また真核の転写シグナル（ＴＡＴＡボッ
クス）とポリアデニル化部位がある。オクトピンシンセ
ターゼを有する植物細胞はホモアルギニンを無毒化する
ので、ＯＣＳ遺伝子は外来ＤＮＡによる形質転換された
植物細胞の有効な選択マーカーとなるだろう。

（Ｇ、Ｍ、Ｓ、Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、（１９８２）　ＰｌａｎｔＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、１　
：　１３３−１４２　）。　ツバリフＴｉプラスミドは
ツバリンシンセターゼ遺伝子（虱）をコードしており、
ニジ　はＡ、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　旦。

（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ！、八ｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、よ
：　５６１−５７３．により配列が決定された。ＯＣ３
遺伝子と同様」匹　もイントロンがない。２つのポリア
デニン化部位の候補とＴＡＴＡボックスとなり得る配列
がある。

監と対照的に！の上流にはＣＡＴボックスとして知られ
る転写シグナルらしい配列がある。Ｊ。

Ｃ，ＭｃＰｈｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、１ＩＳＡ　７７　：　２６６６−２６７０．は
クラウンゴール組織のＴ−ＤＮＡがコードするｍＲＮＡ
のインビトロ翻訳を報告した。

毛根Ｔ−ＤＮＡの転写もまた検出された（　Ｌ。

ＷｉｌｌｍｉＬｚｅｒ　ｅＬ　ａｌ、（１９８２）　Ｍ
ｏ１．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、１８６　：１６−２２　）
。機能的には毛根症候群は」の変異したＴｉプラスミド
によりもたらされるクラウンゴール腫瘍と同等のようで
ある。（Ｆ、Ｆ、ＷｂｉＬｅ　ａｎｄ　Ｅ。

Ｈ，Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　１４４　：　７１０−７２０　）。

真核生物において、ＤＮＡのメチル化（特にシトシン残
基の）は転写不活性化と相関している。

比較的メチル化が少ない遺伝子はｍＲＮＡに転写される
。Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　旦、（１９８３）　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、上：　１５９−１７４．はク
ラウンゴール腫瘍のＴ−ＤＮＡは常に少なくともメチル
化されていない１コピーが存在する事を見出した。同じ
ゲノムがメチル化されている多くの他のＴ−ＤＮＡコピ
ーを含むという事は１つ以上の過剰のＴ−ＤＮＡのコピ
ーは生物学的に不活性である事を示唆する（Ｇ。

Ｏｏｍｓ　旦　旦、（１９Ｂ２）　Ｃｅ１ｌ　３０　：
　５８９−５９７　も参照）。

ＴｉプラスミドはＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　ｗ４域の外側にあ
り。

感染過程に必要な他の遺伝子をコードしている。

（ツバリンプラスミドについてはＭ、Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ
旦　旦、（１９８０）プラスミドユニ　２１２−２３０
．オクトピンプラスミドについては１１．Ｄｅ　Ｇｒｅ
ｖｅ　ｅｔ　ａｌ工。

（１９８１）プラスミド６　：　２３５−２４８．　Ｄ
、Ｊ、ＧａｒｆｉｎｋｅｌａｎｄＥ、Ｉ曽、Ｎｅ５ｔｅ
ｒ（１９８０）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１４４ニア３２
−７４３、およびＧ、Ｏｏｍｓ　（１９８０）　Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ　１４４　：８２−９１参照）。最も
重要なのは」匹遺伝子で、これが変異するとＴｉプラス
ミドの発癌性を失わせる。

（これらの遺伝子座はビルレンスに関する言葉泄として
知られている）。！遺伝子はトランスに作用し、異なっ
たプラスミド型で物理的に他のプラスミドに局在してい
るＴ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を引き起こし得る
。（Ｊ、旧ｌｉｅ旦　旦、（１９８２）プラスミＦ　７
　：　１０７−１１８．　Ｈ，Ｊ。

Ｋｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ　１５０　：３２７−３３１．Ｍ、−Ｄ、Ｃｈ
ｉｌｔｏｎ　（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３　）　１
５ｔｈ　ＭｉａｍｉＷｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、）。　ツ
バリンＴｉＤＮＡはＴｉプラスミドからの切出し、また
は宿主ゲノムへの取込みに関与するらしく、Ｔ−ＤＮＡ
の左または右側の境界に極めて隣接している約２５塩基
対の順方向繰り返し配列（ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ
　）を有する（Ｎ、Ｓ。

Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬｌｓＡ７９　：　６３
２２−６３２６　）　、そして類似配列がオクトピンＴ
−ＤＮＡ境界に隣接した場所に見つかっている（Ｒ，Ｂ
、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、（１９８２）　Ｃｅ１
ｌ　２９　：　１００５−１０１４）。オピン同化はオ
クトピンおよびツバリン型プラスミドの夫々」匹および
」匹遺伝子により特徴づけられる。Ｔｉプラスミドはま
た複製開始点を含むそれ自身の増殖に必要な機能をもコ
ードしている。Ｔｉプラスミド転写物はＳ、Ｂ、Ｇｅ１
ｖｉｎ　ｅｔａｔ、（１９８１）プラスミド６　：　１
７−２９．により、アグロバクテリウム・チューメフプ
シエンス細胞中に見出されており、彼らはＴ　−Ｄ　Ｎ
　Ａ　ｔＪ域が非Ｔ−ＤＮＡ配列に沿って弱く転写され
ることを見つけた。Ｔｉプラスミドにより支配される性
質はＭｅｒｌｏ。

前出（特に第２表参照）およびＲｅａｍ　ａｎｄ　Ｇｏ
ｒｄｏｎ。

前出、によりまとめられている。

アグロバタテリウムーＴＩＰプラスミドＤＮＡ種々のオ
クトピン型Ｔｉプラスミドは互いにほぼ１００％相同性
があることがＤＮＡハイブリダイゼーション（Ｔ、Ｃ，
Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ　（１
９７６）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２６　：　１５７
−１６５　）または制限酵素解析（Ｄ、５ｃｉａｋｙ　
ｅｔ　旦、（１９７８）プラスミド上＝２３８−２５３
　）により調べられた。　ツバリン型Ｔｉプラスミドは
互いに少な（とも６７％相同性がある（Ｃｕｒｒｉｅｒ
　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ＋前出）０種々のＲｉプラスミ
ドは互いに非常に相同性があることが明らかとなった（
Ｐ、Ｃｏ５Ｌａｎｔｉｎｏ　ｅｔ　旦、（１９８１）プ
ラスミド５　：　１７０−１８２　）　。Ｎ、Ｈ，Ｄｒ
ｕｍｍｏｎｄ　ａｎｄ　Ｍ、−Ｄ。

Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９７Ｂ）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、１３６　：　１１７８−１１８３　。

はオクトピンおよびツバリン型Ｔｉプラスミドは比較的
狭い部分に互いに相同性があることを示した。

これらの相同性はＧ、Ｅｎｇｌｅｒ　ｅｔ　旦、（１９
８１）　Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏ１．鼠：　１８３−２０８に
より詳しくマツプされた。

彼らは４つの類似領域の３つは更に３（Ｔ−ＤＮＡにま
たがる）、４（いくつかの」匹遺伝子を含む）、および
９　（」匹遺伝子を有する）の類似領域に細分化される
ことを見出した。連結している相同領域は少なくとも」
■遺伝子（Ｔｉプラスミドの他の細菌細胞への接合伝達
に関与する）と、複製および不和合性に関する遺伝子と
を含む。この領域はりゾビアソシー科の別の属であるリ
ゾビウムの一種から分離された」Ｌプラスミド（共生窒
素固定に関与する）と相同性がある（Ｒ，に、Ｐｒａｋ
ａｓｈ旦　ａｔ、（１９８２）プラスミド７　：　２７
１−２８０　）。４つの領域の順序は保存されていない
が、いずれも同一方向に配置している。Ｔ−ＤＮＡ配列
の一部はツバリンおよびオクトピンプラスミド間で極め
て良く保存されている（Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅ
ｔ　旦。

（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７５　：　１４７−１
４９．　八、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔａｌ、（１９７Ｂ
）　Ｎａｔｕｒｅ−η’５　：　１５０−１５３　）　
、　Ｒｉプラスミドはそれらの間、およびオクトピン（
Ｆ、Ｆ、Ｗｈｉｔｅａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ　（
１９８０）　Ｊ、ｌ１ａｃｔｅｒｉｏ１．１４４　：　
７１０−７２０）とツバリン　（Ｇ、Ｒ１５ｕｌｅｏ旦
　ａｌ、　（１９８２）プラスミド７　：　、１５−５
１　）の両Ｔｉプラスミドとにかなり相同性がある。そ
の領域はおもに」匹遺伝子をコードしている領域である
。Ｒｉ　Ｔ　ＤＮＡはＴｉプラスミドの両型のＴ−ＤＮ
Ａに弱いながらも。

かなり相同性がある。（Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８６
　：　３１９３−３１９７　＞　、未感染のニコチニア
・グラウカの植物ＤＮＡはｃＴ−ＤＮＡ　（細胞のＴ−
ＤＮＡ）と呼ばれる配列を含んでおり、Ｒｉ　Ｔ−ＤＮ
Ａの一部と相同性がある。（Ｆ、Ｐ、Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ
　ａｌ、（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０１　：３４
Ｂ−３５０＞。

Ｔｉ　（Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１
９７７）　Ｃｅ１ｌ　１１　：２６３−２７１　）また
はＲｉ　（Ｍ、−Ｄ、ＣｈｉｌＬｏｎ　（１９Ｂ２）　
Ｎａｔｕｒｅ２９５　：４３２−４３４．　Ｆ、Ｆ、Ｗ
ｈｉｔｅ　ｅＬ　旦−（１９Ｂ２）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　３
１９３−３１９７．　Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９
８２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８６　：　
１６−２２　）プラスミドの一部分は腫瘍植物細胞のＤ
ＮＡに見出される。

転移したＤＮＡはＴ−ＤＮＡとして知られている。

Ｔ−ＤＮＡは核内（Ｍ、Ｐ、ＮｕＬｉ　ｅｔ　旦、（１
９Ｂ０）Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、ＬｅＬＬ、１８：　１　
６＋　Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ４０６０−４０
６４　）の宿主ＤＮＡ　（Ｍ、Ｆ、Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ
　ｅｔ４５Ｂ−４６１）に取り込まれる。

Ｍ、Ｆ、Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０
）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ″７７　：　６４４８−
６４５２．　およびＭ、Ｆ。

Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　旦、（１９８０）　Ｃｅ１
ｌ　１９　：　７２９−７３９゜はオクトピン型Ｔｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡはＴ−ＤＮＡの左と右の夫々ＴＬ
−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡの２つの別の場所に取り込
まれることを見出した。ＴＲおよびＴＬのコピー数は変
動し得る（Ｄ、Ｊ、Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８
０）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１７７　：６３７−６４３　）　、　Ｔ−ＤＮＡの中芯
（ｃｏｒｅ）は。

ツバリンＴ−ＤＮＡと相同性が高＜　（（：ｈｉｌｔｏ
ｎ　ｅｔ但−、（１９７８）　、前出、およびＤｅｐｉ
ｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７８）前出）、腫瘍維持に必要で、ＴＬに見られ
１一般的に細胞当り１コピー存在し、そして展展および
」１　遺伝子をコードする。他方、ＴＲはコピー数は多
い（Ｄ、Ｊ、Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）
前出）が、まったく不要である。（Ｍ、Ｄｅ　Ｂｅｕｃ
ｋｅｌ−１５−２９によれば、ＴＲがＴｉプラスミドか
ら欠失してもアグロバクテリウム・チューメファシェン
スはヴイルレンスを保っているが、ＴＲがＴ−ＤＮＡ取
込みに関与すると想定されている。Ｇ、Ｏｏｍｓｅｔ　
ａｌ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０　：　５８９−５
９７により、Ｔ−ＤＮＡは植物ゲノムに取り込まれた後
、特に欠失するが、一般に安定であること、またＴ−Ｄ
ＮＡ構成が異なる混成細胞を含む腫瘍は複数の形質転換
現象の結果であることが示された。ｏｃｓばＴＬに存在
する。しかし、腫瘍増殖に関連する表現型を失うことな
く植物ゲノムから欠失させ得る。

組み込まれたＴＬの左端は順または逆向きの繰り返しＴ
−ＤＮＡ配列から成る。　（Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎｅ
ｔ　ａｌ、（１９Ｂ２）　Ｃｅ１ｌ　２９：１００５−
１０１４　）。

オクトピン型腫瘍の状況とは対照的にツバリンＴ−ＤＮ
Ａは一連のフラグメントで宿主ゲノムに組み込まれる。

（Ｍ、Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅＬ　ａｌ、（１９８０）　Ｊ
。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１４４　：　３５３−３７６＋　
Ｐ、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ旦、（１９８０）　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２０９　：　１３８５−１３９１　）　、
順方向繰り返し配列が観察された。奇形種から生じた植
物のＴ−ＤＮＡは挿入ＤＮＡの端のフラグメントにわず
かな修飾がある（Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅｌ□　旦、、前出
）。右端と左端の間の結合部の配列の解析から多くの順
繰り返し配列と１つ逆繰り返し配列が明らかになった。

　後者は結合部にまたがっている（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ
　ｅＬ　ａｌ、（１９８０）前出）。左側の結合部は少
なくとも７０塩基対（ｂｐ）が変動すること。

一方、右結合部はｌｂｐのみの変動である（Ｐ。

Ｚａｍｈｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｊ、
Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ。

±：　３６１−３７０　）。繰り返し配列の結合部の左
および右端ば１３０　ｂｐ以上のスペーサーにより分断
されている。このスペーサーの由来は不明であり。

あるＴ−ＤＮＡ配列を含んでいる。Ｔ−Ｄ　Ｎ　Ａは繰
り返し配列と低コピー数宿主配列の両者に組み込まれて
いる。

Ｎ、Ｓ、Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　６３２２−６３２６．は
Ｔ−ＤＮＡの左端のすぐ外側のツバリンＴｉプラスミド
内に」財部位を見出し、これはバクテリオファージλで
１０　Ｋｂｐ離れているまわりのＤＮＡで一般組み換え
を増大させる。Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　２９　：１００５−１０１４
．はオクトピンＴｉプラスミド内に二Ｕ配列を見出さな
かったが、配列を決定した領域の外側に存在する可能性
を排除できない。Ｔｉプラスミドでの」…の意義は不明
である。もし」吋が機能を有しているとすれば、」１が
Ｔ−ＤＮＡ内にないので、恐らく植物ではなくアグロバ
クテリウム細胞内で用いられ°ζいるだろう。

アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドの操乍シャトル
ヘクターの項で詳しく述べるように。

変化させたＤＮＡ配列をＴＩＰプラスミドの望みの場所
に導入する技術が開発された。１−ランスポソンはこの
技術で容易に挿入される。　（Ｄ、Ｊ。

Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅＬ　ａｌ、（１９８１）　Ｃｅ
１ｌ　２７：１４３−１５３　）。

Ｊ、−Ｐ、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（１
９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７：　６５４−６５６．
はＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ配列
（ここでは細菌のトランスポラン）が受容植物ゲノムへ
移され、取り込まれることを示した。種々の起源の多く
の外来ＤＮＡが挿入されたが、これまで、その遺伝子は
自身のプロモーターの支配下で発現したかった。これら
の遺伝子には酵母のアルコール脱水素酵素（＾ｄｈ）（
Ｋ、＾。

Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　）　、）ウ
モロコシのＡｄｈｌ　（Ｊ、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ＋未発
表）とゼイン、＠乳類のインターフェロンとグロビン、
哺乳類のウィルス５ｖ４０　（Ｊ、５ｃｈｅｌｌ、未発
表）などがある。Ｍ、１ｌｏｌｓｔｅｒｓｅｔ　ａｌ、
（１９８２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８５
：２８３−２８９゜によれば、Ｔ−ＤＮＡに挿入された
細菌のトランスポラン（Ｔｎ　７　）が植物ゲノムに取
り込まれた後。

完全な機能を有し、多分変化していない形で回収された
。

ＴＩＰプラスミド内で欠点を種々の方法で起せる。シャ
トルヘクターを標準の組み換えＤＮＡ技術でつ（られた
欠失の導入に用いることができる。

（Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ　ＩＩｓ　Ｐａｔ、
　Ｃ２３７＋２２４　）　＊前もうて決められた一方の
端の欠失はトランスポランの誤った切出しによりつくる
ことができる。（Ｂ。

Ｐ、Ｋｏｅｋｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、（１９７９）プラス
ミド１３４７−３５７、Ｇ、０ｏｔａｓ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８２）プラスミド１：１５−２９　）　、　Ｊ、
旧ｌｉｅ　ａｎｄ　Ｒ，５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ　（１
９８１）ブラスミＦ″６　：　１５１−１５４．は前も
って決められた位置での両端を有する欠失は２つのトラ
ンスポランを用いてつくれることを示した。この技術は
またイソビボで”組み換えＤＮＡ分子”の構築に用いら
れる。

ツバリンシンセターゼ遺伝子が、形質転換された植物細
胞を選択するのに用いられる薬剤耐性をコードするＤＮ
Ａセグメントの挿入に用いられた。

Ｍ、Ｂｅｖａｎ　（Ｍ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、（１８Ｊａｎｕａｒｙ１９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉ
ａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、、により報告された
；およびＪ、ＬｌＭａｒｘ　（１９８３）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２１９　：　８３０参照）とＲ，Ｈｏｒｓｃｈ　
ｅｔ　ａｌ、（（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３　）１
５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、、およ
びＭａｒｘ＋　前出、参照）、はＴｉ５のカナマイシン
耐性遺伝子（ネオマイシンフォスフオドランスフェラー
ゼ）をツノ々リンプロモーターの後に（その制御下に）
挿入した。

その作成には培養でカナマイシンおよびＧ４１８のよう
なアナグロ耐性になるよう植物細胞を形質転換する方法
がとられた。Ｊ、５ｃｈｅｌｌ　■　ａｌ、　（１８Ｊ
ａｎｕａｒｙ　１９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗ
ｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、（Ｍａｒｘ。

前出、も参照）、は同様の作成法を報告し、そこではＴ
ｉ７のメトトレキセート耐性遺伝子（ジハイドロフォレ
ート　−レダクターゼ）がツバリンシンセターゼプロモ
ーターの後につながれた。形質転換細胞はメトトレキセ
ート耐性であった。オクトピンシンセターゼを有する植
物細胞は毒性化学物質、ホモアルギニンに耐性であり、
　Ｇ、Ｍ、Ｓ、ＶａｎＳｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、上
：　１３３−１４２．はこの酵素を洗濯マーカーに用い
ることを提案した。

ｈ、−〇、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）
　、　前出、は八。

Ｄｅｆ　ｒｅｍｅｕ　が”小Ｔｉ　（ｍｉｎｉ−Ｔｉ　
）プラスミド”を作成したと報告した。ツバリンＴ−Ｄ
ＮＡにはまともには１ケ所の制限酵素」匹Ｉの切断部位
がある。この部位を欠く変異がつくられ、完全なツバリ
ンＴ−ＤＮＡを含む」部！フラグメントが単離された。

このフラグメントはカナマイシン耐性遺伝子と共にｐＲ
Ｋ２９０に挿入され、アグロバクテリウム・チェーメフ
ァシエンス内で維持され、すべての非Ｔ−ＤＮＡ配列を
欠く、プラスミドが得られた。それ自身では、このプラ
スミドは植物細胞を形質転換できなかった。しかし、オ
クトピンＴｉプラスミドを持つアグロバクテリウム・チ
ューメファシエンス株に入れると、オクトピンとツバリ
ン両方を合成する腫瘍が誘導された。これはツバリンＴ
ｉプラスミド機能の消失がオクトピンＴｉプラスミドに
より相補されたこと、およびツバリン”小Ｔｉ”は植物
細胞を形質転換する能力があったことを示す。Ｃｈｉｌ
ｔｏｎ旦　ａｌ、（１９８３）　、前出、はまた小Ｔｉ
をＳｍａ　Ｉで切り、ツバリンシンセターゼ遺伝子とそ
の左および右端以外はすべてのＴ−ＤＮＡを欠失したＱ
Ｔｉ″　（ｍｉｃｒｏ−Ｔｉ）を作成した。

この微ＴｉはＳｍａ　１部位を欠＜　ｐＲＫ２９０プラ
スミド誘導対に挿入され、小Ｔｉと同様にして用いられ
１匹敵する結果を得た。

■ルｏｒｚ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　ｉｎ　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　１９８２＋　ｅｄ
　：　八、Ｆｕｊｉｗａｒａ＋　ｐｐ、５１１−５１２
＋　はＤＮＡ取込みと維持にＴＩＰ系が見掛は上熱関係
なプラスミドヘクターを作り、マーカーとしてツバリン
シンセターゼ遺伝子を用いた。

フォセオリンと゛　云子調貨 一般に高等真核生物の遺伝子は高度に調節されている。

植物のような多細胞器官は多（の分化した組織を有し、
夫々は特有の遺伝子産物を要求する特有の機能を持つ。

そのような組織の１つに子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　）
がある。豆果（ｌｅｇｕｍｅｓ　）では子葉は１発芽の
間に必要となるまで、脂質、炭水化物、無機物および蛋
白質などを保存する種の貯蔵器官である。フォセオラス
・ブルガリスＬ、（フレンチビーン、インゲン豆（ｋｉ
ｄｎｙ　ｂｅａｎ）　＋乾燥自互（ｎａｖｙ　ｂｅａｎ
　）　、緑豆（ｇｒｅｅｎ　ｂｅａｎ）などの名でも知
られる）では、主要貯蔵蛋白質はフォセオリンである。

この蛋白は極めて類領しかつ互いに等量の小数の分子種
から成る。フォセオリンは乾燥豆の主要な栄養価を担っ
ており、しばしば乾燥重量の１０％以上を占める。

フォセオリンはファセオラス・ブルガリスの生活環の間
で高度に調節されている。この蛋白は種がさやの中で生
ずる間でのみつくられ、そのレベルは遺伝的に決まった
合成のスケジュールに従い検出限界の低い値から種の蛋
白の半分を占めるまで、上昇する。そのピークではフォ
セオリン合成は子葉細胞の蛋白合成の８０％以上にも達
する。他の時期には、また他の組織では、フォセオリン
合或は検知できない。世界的な栄養源の重要性に伴いフ
ォセオリンの調節の仕組みは、フォセオリンの研究、そ
の性質およびその調節に大いに興味をそそる。

（以下余白） （発明の目的） ここに開示の発明により、植物遺伝子を導入し。

Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下で、そこで発現する遺
伝的に修飾された植物細胞より成る植物が提供される。

さらに１本発明は植物細胞を含む植物組織を提供する。

この植物細胞のゲノムはＴ−ＤＮＡプロモーターの支配
下で植物細胞内で発現するようにＴ−ＤＮＡプロモータ
ーに関して方向と間隙をもって挿入された植物構造遺伝
子を含むＴ−ＤＮＡを有する。本発明は、また、Ｔ−Ｄ
ＮＡ（ここではＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物
細胞内で発現するように、Ｔ−ＤＮＡプロモーターに関
して方向と間隔をもった挿入植物構造遺伝子を含むよう
に修飾されたＴ−ＤＮＡと定義される）を含みかつ複製
する新規な細菌株を提供する。さらに本発明はエセリシ
ア・コリー内で複製能を存し、Ｔ−ＤＮＡを含み、さら
に植物細胞内でＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａプロモーターの支配下
で発現する。

ようにプラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡに挿入された
植物構造遺伝子を含む新規なプラスミドを提供する。

ここに示された実験的研究はＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａを介して
導入後Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物細胞内で
植物構造遺伝子が発現する。即ち、既知の方法によりＴ
−ＤＮＡにＴ−ＤＮＡプロモーター支配下で植物構造遺
伝子を挿入し、その挿入物を含むＴ−ＤＮＡを植物細胞
に導入することにより行ったものであるが、最初の例で
あると信する。

ここに示された実験はまた。イントロンを含む植物構造
遺伝子がＴ−ＤＮＡを介して導入された植物細胞内でＴ
−ＤＮＡプロモーターの支配下で発現した最初の例を提
供するものと信する。これらの結果は’１”　−Ｄ　Ｎ
　Ａプロモーター支配下で発現する既報の遺伝子は、Ｔ
−ＤＮＡ内生遺伝子であれ。

挿入外来遺伝子であれ、現在知られている限りイントロ
ンを含まないという事実から見れば驚くべき事である。

この結果はまた植物構造遺伝子が適当な条件下でＴ−Ｄ
ＮＡに導入された時、　Ｔ−ＤＮＡプロモーターは植物
構造遺伝子の発現を制御する機能を果たすという例を従
来技術では示し得なかったという観点から、容易に考え
られえないものである。本発明は他の植物種または株か
ら有用な植物構造遺伝子を導入し、植物組織または全植
物体を遺伝的に修飾するのに有用である。このような有
用植物構造遺伝子は貯蔵蛋白質、レクチン、病気、昆虫
および除草剤に対する耐性因子。

環境ストレスに対し耐性を与える因子などの遺伝子、さ
らに特異的芳香剤の遺伝子などを含むが。

これらに限らない。本発明は豆類、ファセオラス・ブル
ガリス　し、の主たる種の貯蔵蛋白質であるファセオリ
ン構造遺伝子をヒマワリやタバコの植物細胞への導入と
発現という例を提供する。植物構造遺伝子がＴ−ＤＮＡ
プロモーターの支配下で発現する植物細胞が一度得られ
れば、植物組織および全植物体を当該分野で既知の方法
と技術を用いて再生させ得る。再生した植物は次いで通
常の方法で増殖し、導入された遺伝子は通常の植物改良
技術により他の植物や培養物へ移される。例えば、ファ
セオリン構造遺伝子の導入２発現はアルファルファのよ
うな馬糧作物蛋白含量、栄養価の向上に用いることがで
きる。本発明の他の用途。

即ち、他の植物種への導入された他の構造遺伝子の性質
の開拓などは当業者にとって容易なことである。本発明
によれば、原理的には、いかなる植物構造遺伝子も、Ｔ
−ＤＮＡへの導入が可能でかつ安定に複製維持されうる
いかなる植物種へ導入されうる。一般にこれらの種に以
下のものがあるが、それに限定されない、即ちヒマワリ
　（コンボシテ科）、タバコ（ソラナシ科）、アルファ
ルファ、大豆および他のマメ類（レグミノシ科）および
大部分の野菜類などのような双子葉植物である。

（発明の構成） 明細書と特許請求の範囲に使用する意図と範囲に関して
不明瞭さを除くために、以下の定義を行う。

Ｔ−ＤＮＡ　：植物ゲノムに組み込まれる腫瘍誘導因子
（ＴＩＰ）由来のＤＮＡセグメント、ここで用いる時、
この用語はアグロバクテリウム・チューメファシエンス
およびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含むアグロバ
クテリウムのいかなる腫１１ｉ！誘導株に本質的に由来
するＤＮＡを含む。後者の菌株の挿入セグメントを従来
は時々Ｒ−ＤＮＡと呼んでいた。さらにここで用いるＴ
−ＤＮＡという用語は自然発生または実験質操作による
。いかなる変化、修飾、変異、挿入、脱落をも含む。

修飾に関する基本的な構造上の要件および限定は。

自然に発生ずるＴ−ＤＮＡの右端および左端が充分量存
在しその結果、Ｔ−ＤＮＡの特徴である形質転換された
植物細胞ゲノム内への安定な組み込みという期待される
機能が確実に果たされるということである。さらにＴ−
ＤＮＡは挿入された植物構造遺伝子の転写の開始および
翻訳の開始を制御するに充分に完全な形のＴ−ＤＮＡプ
ロモーターを少な（とも含まなければならない。できれ
ば。

そのプロモーターに関して、そこへ挿入された植物構造
遺伝子が直接または融合蛋白として、そのプロモーター
の支配下で発現するような位置にあるべく、挿入部位は
そのプロモーターにより開始される転写と翻訳の方向で
“下流”にあるのがよい。

皿隻盪遣逼伝子：ここでの使用は植物の蛋白、ペプチド
またはその一部をコードするが、ｉｍｍジブロモと称さ
れる転写開始、翻訳開始を調節する植物遺伝子の機能要
素を欠＜、ＤＮＡセグメントを含む植物遺伝子の部分を
言う。植物構造遺伝子は１つまたはそれ以上のイントロ
ンを含むかもしれないし、また分断されないコード配列
から成るかもしれない。植物構造遺伝子は完全にまたは
部分的に植物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成
されたＤＮＡに由来するだろう。さらに植物構造遺伝子
はコード領域に、またはイントロンに発現産物の化学構
造２発現速度或いは発現調節様式に影響し得る修飾を含
むことができると期待される。そのような修飾は変異、
挿入、欠落および“静（ｓｉｌｅｎｔ）　”修飾を含む
が、それに限らない。

この静修飾は発現産物の化学構造を変化させないが９発
現産物の細胞内局在性、輸送１分泌または安定性などに
影響する。構造遺伝子は複数の起源に由来するセグメン
トの混成物でありうる。それは自然的に発生ずるかもし
くは混成蛋白をコードする。この混成蛋白は植物蛋白の
一部を成している。

Ｔ−ＤＮＡプロモーター：挿入Ｔ−ＤＮＡと一般に相関
している。いかなる自然に生ずるプロモーターをも指す
。こればＴ−ＤＮＡの′Ｉ″ＩＰ起源の部分に依存して
、オクトピン　シンセターゼ遺伝子、ツバリン　シンセ
ターゼ遺伝子、　Ｔｍｓ、　Ｔｍｌ＋Ｔｍｒ　ｉｌｌ伝
子を含むし、これに限らない。Ｔ−ＤＮＡプロモーター
支配下での発現は、直接発現の形をとるかもしくは融合
蛋白発現の形をとりうる。

直接発現においては、正常にはそのプロモーターにより
制御されている構造遺伝子が除かれ挿入植物構造遺伝子
に置換され、開始コドンはＴ−ＤＮＡの構造遺伝子の残
りまたは挿入植物構造遺伝子の一部として提供される。

融合蛋白発現においては、植物構造遺伝子の一部または
全てがえ存在するＴ−ＤＮＡ構造遺伝子内で正しい翻訳
フレームで挿入される。後者の場合１発現産物は融合蛋
白と呼ばれる。

Ｍ！ＭＭＬ！＠：根、芽、花粉９種、クラウンゴールの
ような腫瘍組織および胚、カルスのような培養植物細胞
の種々の形の集合物を含む植物の分化、未分化の組織を
含む。

植物細胞：栽培植物細胞、培養植物細胞およびプロトプ
ラストを含む。Ｔ−ＤＮＡを介して導入された植物構造
遺伝子を発現する遺伝的修飾植物の生産は本願明細書の
開示事項を当該分野に既知な種々の技術および経験を合
併したものである。

多くの例において、別の手段が全過程の各段階に存在す
る。手段の選択は基本的ＴＩＰの選択、修飾される植物
種、希望する再生方法など要素に依存し、それらにはい
ずれも当業者が望む結果を達成する為に選択し用い得る
別のプロセス段階がある。本発明の基本的な特徴は植物
構造遺伝子の性質と構造であり、そのＴ−ＤＮＡの挿入
方法である。遺伝的修飾植物を得る為に残っているステ
ップは、植物細胞へ修飾Ｔ−ＤＮＡを移送すること（そ
こでは、植物細胞の中で修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノ
ムの一部として安定に組み込まれる）を含み、それには
インビトロ培養および完全植物体への実際の再生に関す
る技術がある。この技術は形質転換植物細胞の選択と検
出に関するステップおよび最初の形質転換株から商業的
に認められうる培養体へ導入遺伝子を移すステップを包
含しうる。

本発明の基本的特色は先に定義したＴ　−’Ｄ　Ｎ　Ａ
プロモーターの支配下にある挿入植物構造遺伝子を有す
るＴ−ＤＮＡの構築である。植物構造遺伝子はＴ−ＤＮ
Ａに関して正しい位置と方向で挿入されなければならな
い。まず第一に構造遺伝子をプロモーターのどちら側へ
挿入するかである。大部分のプロモーターはＤＮＡに沿
って一方向でのみ、転写と翻訳の開始を制御することが
知られている。プロモーター支配下に存在するＤ　Ｎ　
Ａ　領域をプロモーターの“下流”あるいは“後”にあ
るという。従って、プロモーターに支配される為には、
植物構造遺伝子挿入の正しい位置はプロモーターの“下
流”になければならない。（２，３の既知プロモーター
は両方向に支配する。即ちプロモーターのどちらの側も
“下流”と見なされ得る。

ことが知られている。）位置の第二の問題はプロモータ
ーの既知機能要素１例えば転写開始部位と構造遺伝子の
翻訳開始部位間の、塩基対での距離である。プロモータ
ーからプロモーターへのこの距離に関して、事実上変動
がある。従って、この点に関して要求される構造は機能
するか否かという事で判断される。近い表現をすれば、
プロモーターと挿入構造遺伝子間の距離が、正常に支配
しているプロモーターとＴ−ＤＮＡの距離に似ておれば
うまく作用する。方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　）は
構造遺伝子の向きを表す。慣例により植物蛋白質のアミ
ノ末端を最終的にコードする構造遺伝子の部分を構造遺
伝子の５”末端と呼び、一方、蛋白質のカルボキシル末
端近くのアミノ酸をコードする遺伝子の端を構造遺伝子
の３″末端と呼ぶ。植物構造遺伝子の正しい方向はＴ−
ＤＮＡプロモーターの近くにその５゛末端を持つもので
ある。融合蛋白発現をもたらすよう構築する場合にさら
に要求されることは、植物構造遺伝子のＴ−ＤＮＡ構造
遺伝子への挿入が当業者によく知られている構造上の要
求性、つまり２つの遺伝子のコード配列が同一翻訳フレ
ームにあるということである。本発明に関連する。この
要求の例外が、イントロンがＴ−ＤＮＡ遺伝子と植物構
造遺伝子の最初のコード領域を分断する場合に存在する
。その場合、イントロン切断部位が、転写後のプロセッ
シングによりイントロンが除去された後、Ｔ−ＤＮＡ遺
伝子と植物構造遺伝子の正しい翻訳フレームが保存され
るような位置になければならない。Ｔ−ＤＮＡの起源は
、いかなるＴＩＰプラスミドでも良い。植物構造遺伝子
は当業者によく知られている標準的、技術で挿入される
。発現度の違いは、ある植物構造遺伝子が異なったＴ−
ＤＮＡプロモーターの支配下に挿入されたときにみられ
る。発現蛋白質自身の安定性、細胞内局在性または分泌
、抗原性および他の機能上の性質などを含む異なった性
質は融合蛋白質の場合、見られるであろうが。

それは挿入部位、融合蛋白質の中に含まれるＴ−ＤＮＡ
蛋白セグメントの長さと性質、およびその立体構造に影
響する融合蛋白質の成分間で相互作用などに依存し、こ
れらの全ては希望する利用目的に応じて発現産物の機能
性を操作し、制御する為の多数の機会を提供する。フオ
セオリン構造遺伝子の発現がアグロバクテリウム・チュ
ーメファシエンスのツバリンプラスミドであるｐＣ５Ｂ
のツバリン　シンセターゼ　プロモーターの支配下にそ
の遺伝子が挿入されたときに観察された。

（以下余白） 植物構造遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する簡便法に、上で
意義したシャトルベクターがあり、これはエシェリヒア
・コリー内で複製可能なプラスミドへ取り込まれた’［
’−ＤＮＡセグメント　（ここへ挿入を期待するセグメ
ント）を有する。このＴ−ＤＮＡセグメントは好ましく
はシャトルベクターに特異な１つの制限部位を有する。

植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡセグメント内の特異的部位
に挿入され得る。そしてこのシャトルベクターは適当な
アグロバクテリウム株（好ましくはそれの有するＴ−Ｄ
ＮＡがシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメントと相同
性がある）の細胞へ移される。形質転換されたアグロバ
クテリウム株を、Ｔｉプラスミドの既存おセグメントを
シャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメントで置換する２
重相同組み換え現象を選択する条件下で増殖させる。

ここで述べた方針に従い修飾Ｔ−ＤＮＡを当該分野で既
知のどれかの技術により植物細胞に移すことができる。

例えば、この移送はＴ−ＤＮＡ内に取り込まれた植物遺
伝子を含む新規のアグロバクテリウム株の持つプラスミ
ドの直接感染、あるいはアグロバクテリウム株と植物細
胞の共存培養により最も容易に達成される。前者の技術
、直接感染はやかて感染部位に腫瘍体またはクラウンゴ
ールの出現をもたらす。クラウンゴール細胞を次いで培
養で増殖させ、そして当業者に既知の適当な環境下で挿
入Ｔ−ＤＮＡセグメントを有する完全植物体に再生させ
る。共存培養の方法により。

植物細胞のある部分が形質転換される。即ち細胞内にＴ
−ＤＮＡが移り、植物細胞ゲノムに挿入される。いずれ
にしても、形質転換細胞を選択あるいは未形質転換細胞
と区別しなければならない。

選択はＴ−ＤＮＡの中に植物構造遺伝子と共に。

取り込まれる選択マーカーを用いる事により容易に達成
される。例として、ツバリンシンセターゼプロモーター
支配下で発現するジハイドロフォレート　レダクターゼ
あるいはネオマイシン　ファスフオトランスフェラーゼ
がある。これらのマーカーは夫々メトトレキセートまた
はカナマイシンあるいはそれらの類似物を含む培地での
増殖により選択される。さらにＴ−ＤＮＡは内生マーカ
ー。

例えばＴｉ−誘導腫瘍の培養でホルモン非依存増殖を制
御する遺伝子または遺伝子群、　Ｒｉ−誘導腫瘍ルート
の異常形態を制御する遺伝子または遺伝子群、およびア
ミノ酸類似物のような毒性化合物に対する耐性（その耐
性はオビンシンセターゼによりもたらされる）を制御す
る遺伝子群を有する。

当業者によく知られている検索法には、オピン生産の測
定、特徴的ＲＮＡまたはＴ−ＤＮＡ配列に対する特異的
ハイブリダイゼーション、あるいはＥＬＩＳＡ（酵素連
関免疫吸着分析の略）、ラジオイムノアッセイ、および
”ウェスタン”プロットなどの特異的蛋白質の免疫学的
分析がある。

シャトルベクター作戦の別の方法にＴ−ＤＮＡまたはそ
こに植物構造遺伝子を挿入した修飾Ｔ−ＤＮＡを含むプ
ラスミド、即ちアグロバクテリウム株内で独立に複製し
得るプラスミドの使用がある。最近の資料により、アグ
ロバクテリウム株がＴ−ＤＮＡの植物細胞への移動を促
進する機能をもつあるトランスに作用する遺伝子を有す
るならば、そのようなプラスミドのＴ−ＤＮＡがアグロ
バクテリウム株から植物細胞へ移され得るということが
示されている。Ｔ−ＤＮＡを含み、アグロバタテリウム
株内で独立に複製できるプラスミドをここでは”サブ−
ＴＩＰ”　（ｓｕｂ−ＴＩＰ　）プラスミドと呼ぶ。変
動範囲があり、そこでは、”サブ−ＴＩＰ”プラスミド
はそれらが含有するＴ−ＤＮＡの量に差がある。その範
囲の一端ばＴＩＰプラスミドからのＴ−ＤＮＡがすべて
残っているもので、特に”小ＴＩ’Ｐ″　（ｍｉｎｉ−
ＴＩＰ）プラスミドと呼ばれる。その範囲のもう一端は
Ｔ−ＤＮＡ境界のまわりのＤＮＡの最小量を残してすべ
てが欠失している。その残存部分は宿主細胞内で転移と
組み込みができる必要最小量である。　このようなプラ
スミドは″微ＴＩＰ″　（ｍｉｃｒｏ−ＴＩＰ　）と呼
ばれる。サブーＴＩＰプラスミドは小さく、直接操作す
るのが比較的容易であるという利点がある。

希望する構造遺伝子を挿入した後、Ｔ−ＤＮＡ転移を促
進するトランスに作用する遺伝子を含む植物細胞へ直接
容易に導入できる。アグロバクテリウム株への導入はア
グロバクテリウム株の形質転換か、供与細菌細胞から接
合伝達という当業者によく知られている技術により簡便
に達成される。

再生は既知の技術で達成される。再生ステップの目的は
正常に、しかし組み込まれたＴ−ＤＮＡを保持して、増
殖および再生産する全植物体を得ることである。再生の
技術は当該分野で既知の原理によれば、Ｔ−ＤＮＡの起
源、そこでの修飾の性質、および形質転換された植物の
種によりいくらか変動する。Ｒｉ−型Ｔ−ＤＮＡで形質
転換された植物細胞は、公知の技術により何ら余分な実
験なしに、容易に再生される。Ｔｉ−型Ｔ’１−ＤＮＡ
で）。

形質転換された植物細胞は、ある例では培養のホルモン
レベルを適当に操作することにより再生され得る。しか
し、好ましくは、Ｔｉ−形質転換組織は、もしＴ−ＤＮ
ＡがＴａｒとＴｌｌ１ｓ遺伝子の一方または双方に変異
を受けておれば、最も簡単に再生される。これらの遺伝
子の不活性化は形質転換組織のホルモンバランスを正常
に戻し、培養での組織のホルモンレベルを極めて容易に
操作できるようになる結果、簡単に再生するようなより
正常なホルモン生理を有する植物をもたらす。数例にお
いては、腫瘍細胞は、ツバリンシンセターゼのような組
み込まれたＴ−ＤＮＡを持ちかつＴ−ＤＮＡ遺伝子を発
現するシート、そしてまた挿入植物構造遺伝子を発現す
るシュートを再生させることができる。このシュートは
根を有する植物につぎ木する事により栄養細胞で維持で
き、稔性花を着生できる。シュートはこのようにしてＴ
−ＤＮＡを有し、そこへ挿入された植物遺伝子を発現す
る正常な子孫植物の親植物体となる。

（以）ｕｔ３） （実施例） 次に述べる例はｒ　Ｔ　Ｉ　Ｐ　ｓとアグロバクテリウ
ムの分子生物学および操作に関する当業者によく知られ
かつ受け入れられうる多くの技術を利用している；それ
らの方法は常に詳しく、記述されているわけではない。

酵素は市販品であり、これらは業者の推薦あるいは当該
分野によく知られた方法により用いられた。

試薬、緩衝液および培養条件もまた。当業者には知られ
ている。そのような標準となる技術を含む関連研究を次
に挙げる： Ｒ，Ｗｕ、　ｅｄ、　（１９７９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　６８；　Ｊ、ＩＩ。

Ｍｉｌｌｅｒ　（１９７２）　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓ
　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　；　Ｒ
，Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ａｄｖａｎ
ｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　；　Ｒ
，Ｆ、５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　Ｐ、Ｃ。

Ｗｎｅｓｉｎｋ　（１９８２）　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　＄。

これらの例の中にはく塩基）配列を見やすくする為に（
ｔｏ　ｃｌａｒｉｆｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　）特別な
記号が用いられている。

蛋白質をコードしているか、コードし得る配列には下線
を引き、コドンは斜線（１）で区切った。

制限酵素などにより生じた各々の鎖の切れ目や隙間には
星印（＊）を配する。（ある例では、二重鎖ＤＮＡ分子
は、制限酵素切断部位の星印に隣接する一本線で表され
ている；　遺伝子と思われる部分はその一本線の下に下
線を引いた“×”で示しである。） 該プラスミドは例外として、プラスミドあるいは唯一の
プラスミド（ｏｎｌｙ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　）は“Ｐ″
で始める。（例）　ｐ３．８あるいはｐＫ５４゜プラス
ミドを持つ細胞は、その細胞本来の名にプラスミドを付
加的に示すことにより表す。（例）アグロバクテリウム
・チューメファシエンス（ｐＴｉ１５９５５）あるいは
に８０２　（ｐＫＳ４−ＫＢ　）。

表１にはプラスミドとそれらの関係を同定するのに有用
な索引が記されている。表２には寄託菌株の索引が記さ
れている。

第３９図にば例１１，１２．および１４に記述されてい
る構成を比較するのに有用である。

第４０図は遺伝コードを示し、配列の解釈に有用である
。重要なＴ−ＤＮＡ遺伝子 田しの塩基配列はこれらの例には用いられていないが、
第４１図に示されている。それは、ここに記述されてい
ない構成を示すのに有用である。

（以下余白） 去ｍ 融合タンパクの遺伝子は、オクトピンシンセターゼプロ
モーター、オクトピンシンセターゼの構造遺伝子のアミ
ノ末端９０個のアミノ酸、二つの遺伝子間に重複する三
個のアミノ酸、そして、最初の１１個のアミノ酸を省く
ファセオリン遺伝子の全部分を含むように構成されてい
る。構成を開始するに先たち、ｐＴｉ１５９５５　Ｔ−
ＤＮ＾のクローン、　ｐ２３３　（配列はｐＢＲ３２２
中で、　ｐ２０３．　ｐ３０３と提示されている：第１
図参照）の配列をＢａｍ１ｌ　１部位からＰｖｕ　ｎ部
位まで、決定した。これは、全オクトピンシンセターゼ
遺伝子を含む（第２図）。オクトピンシンセターゼ（遺
伝子）配列及び、リーディングフレームは、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩにより切断された部位の近くに続いて見つかっ
ている： ８４　８Ｆ）　ｌｊｂ　ｌｊｌ　８８　１ｊ９　９ＵＥ
ｃｏＲＩによる開裂により次に示す末端をもつ断片を生
じる： 豆の種子の貯蔵タンパク質であるファセオリンの構造遺
伝子（以前に配列決定されている；第３図）は５′　（
アミノ末端）末端の近くに次に示すようにＥｃｏＲＩ部
位を持っている： ＥｃｏＲＩによる開裂により次に示す末端を持つ断片が
生じる。

これらの２つの断片は連結後１次に示す構造を形成する
： ＝　ＡＴＥ；／ＧＧＣ／ＣＡＧ／ＣＡＡ／ＧＧ＊Ａ／Ａ
Ｔ　Ｔ／Ｃ，ＴＴ／ＴＴＣ・−これは同じリーディング
フレームを保持し、かつ２間に終止信号を生じていない
。つまり、ファセオリン遺伝子のに列Ｉ／ハｍＨＩ制限
酵素断片は、　ｐＴｉ　１５９５５のＴ−ＤＮＡのオク
トピンシンセターゼ遺伝子にＥｃｏＲＩ部位で連結され
たのである。この融合遺伝子は！プロモーター、オクト
ピンシンセターゼの最初の９０個のアミノ酸、そして、
プロモーターと最初の１１個のアミノ酸のないフォセオ
リン遺伝子、及び１両遺伝子の継目にあたる３個のアミ
ノ酸配列を含んでいる。

１、１　ｐＢＲ３２２からのＥｃｏＲ１部位の除去ｐＢ
Ｒ３２２の匡廿１部位を匣■で分解後Ｔ−４ＯＮＡポリ
メラーゼにより、粘着末端を埋め、平滑末端同志を連結
する。そしてＥ、ｃｏｌｉ　Ｈ８１０１株を形質転換す
ることによりｐＢＲ３２２よりＥｃｏＲ１部位を除去し
た。形質転換体の選択にアンピシリンを用いた。又、コ
ロニーは少量のプラスミドＩＩＮＡを単離する（Ｄ、Ｈ
ｏｒｏｗｉｔｚ　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｎｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃ，Ｓ、Ｈ）ことにより選別した。そして、　ｐＢＲ３
２２−Ｒと呼ばれるＥｃｏＲ１部位を持たないクローン
を選択した。

しＪ−−１岬ＩＩ　Ｉ↓別植−逝茸聯工肥」η」しきｑ
クローニング Ｐ２Ｏ３（第４２図）を単離し、匠ＩＩ　１により分解
した。Ｔ−ＤＮへの４．７　ｋｂｐ（キロベースペアー
）の断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、　ｐ
ＢＲ３２２−ＲのＢａｍ　ＩＩ　Ｉ部位に連結した。こ
のプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　１１８１０１株に形質転
換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を
用いて選択した。陽性クローンが得られ、それをｐｋｓ
　１６９と名ずけた。

ｐＫｓ　１６９をに憇Ｉで分解した。８゜６　ｋｂｐ（
キロベースペアー）の断片をアガロースゲル電気泳動に
より単離精製した。この断片は除かれた」印遺伝子中に
２個の小さな（０，３６ｋｂｐ及び０．２　ｋｂｐ）断
片を持っていた。

１．４　ファセオリン遺伝子ＤＮＡ断片及び、カナマイ
シン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片の単離ｐＫＳ４−
ＫＢ（第７図）を精製し、ＥｃｏＲＩで分解した。

ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ■（ＮＰＴ
ＩＩ）をコードしているカナマイシン耐性遺伝子を含む
、１．８５　ｋｂｐのＯＮ＾断片と３．０　ｋｂｐのに
列１　／Ｒａｍ　Ｉｔ　Ｉファセオリン遺伝子断片をＢ
ａｍＨＩ部位で連結して用いる為に４．８　ｋｂｐの断
片を単離した。

ファセオリン／ＮＰＴ　Ｉ［断片を実施例１．３で記述
したＥｃｏＲＩ断片ζ竪ｏＲＩ部位で連結した。連結し
たＤＮＡを、　１（８１０１に形質転換し、コロニーを
アンピシリンとカナマイシンで選択した。ｐＫＳ−Ｂ１
７−ＫＢ３．０（第４３図）と名ずけたコロニーを選択
した。このコロニーは正しい配置（すなわち、ファセオ
リン遺伝子が、正しい方向とリーディングフレームでｏ
ｃｓ遺伝子へ連結されている）を持つプラスミドを保有
している。このことは、少数のコロニーからのプラスミ
ドの制限地図により確認した。適当な領域のＤＮＡ配列
を構造確認の為に決定した。

１、６　８ＰＴ　ＩＩ、ファセオリン、　びｏｃｓ　Ｄ
ＮＡを広い宿主範囲をもつプラスミドであるｐＲＫ　２
９０をガ１」で分解後、　Ｔ−ＤＮＡ、ＮＰＴＩＩ遺伝
子、及びｐＭＳ−８１７−にＢ３．０からのファゼオリ
ンＤＮＡを含む９．１ｋｂｐのＢａａ　ＩＩ　Ｉ断片へ
連結した。上記のことは。

ｐＫＳ−Ｂ１７−ＫＢ３．Ｏを堕−■で部分分解後、ア
ガロースゲル電気泳動で他の６本のバンドから単離する
ことにより完遂した。連結し、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ２
Ｏ２株へ形質転換後、コロニーをカナマイシン及びテト
ラサイクリンで選択した。要求される制限パターンを有
するコロニーを選択し、　ｐＫＳ−ｏｓ−に８３．０と
名ずけた。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　（ｐＭＳ−０５１−にＢ　３．０）　
、及びＥ、　ｃｏｌｉ　（ｐＲに２０１３）の三親交雑
により、我々はストレプトマイシン、カナマイシン、及
びテトラサイクリン耐性のコロニーを選択した。あるコ
ロニーをＥ、ｃｏｌｉ（ｐＰＨＩＪｌ）と交雑した。カ
ナマイシン及び、ゲンタマイシン耐性のコロニーを選択
した。これは。

ｐ１５９５５−１２＾、　ｐＴｉ１５９５５　（制限酵
素地図作成及び。

電気泳動的に分画した制限断片のフィルクーハイブリダ
イゼーション（実施例１９）による」■遺伝子のＥｃｏ
Ｒ１部位へ設計したファセオリン遺伝子及び、カナマイ
シン耐性遺伝子を持つ）をもつアグロバクテリウム・チ
ューメファシエンスを表している。

類似した三親交雑はアグロバクテリウム・チューメファ
シエンス（ｐＴｉ　Ａ６６）で行われている。結果とし
て生ずるプラスミドｐＡ６６−１２Ａにより形質転換さ
れたシュート（ｓｈｏｏｔｓ）は、前述のようにフォセ
オリンを有することを示している。

１、８　クラウンゴールのノ　び 設計されたＴｉプラスミドを、ヒマワリに接種した０組
織培養において、クラウンゴールが形成された。発現は
ランニングＥＬＩＳＡｓ及び電気泳動的に分けられたｍ
ＲＮＡへのフィルターハイブリダイゼーション（“ノー
ザンプロット”；実施例１９）らにより試験した０期待
される大きさのＲＮＡをファセオリン及びオクトピンシ
ンセターゼの両方に対するハイブリダイゼーションプロ
ーブにより見つけた。又１期待される大きさのＲＮＡは
全ポリ（＾）５＋４　ＲＮＡの約０．５％であった。ゴ
ールより単離したポリ（Ａ）５＋４　ＲＮＡでファセオ
リンに対する抗体により沈澱する期待される大きさのタ
ンパクのインビトロ合成を行った。

叉旅■１ 実施例１に似た融合タンパクの遺伝子をファセオリンと
ツバリンシンターゼよりツバリンシンセターゼ遺伝子の
プロモーターの支配下において構成した。それは、ツバ
リンシンセターゼのプロモーター、ツバリンシンセター
ゼの最初の５９個のアミノ酸（最後の残基は合成して加
えた）と１個のつぎ目のアミノ酸をコードしている部分
、及び最初の１２個のアミノ酸を除くすべてのファセオ
リン構造遺伝子を有する。構成を開始するに先たち。

ｐＴｉＣ５ＢのＴ−ＤＮＡ　（ｐＣＦ　４４Ａ、第６図
）のクローンを一番左のｌｎ部位から中はど０Ｈｉｎ　
ｄ　Ｉ［［部位（Ｔ−ＤＮＡ　ｔＩＪＩ域の外側）にか
けて配列決定を行った。

これは、すべてのＪ■遺伝子を含んでいた（第４図）、
ツバリンシンセターゼの配列及びリーディングフレーム
は、後に示すように、制限酵素肛Ｉにより切断された部
位の近（に見つかった。

四凰Ｉ ５′・・・ＣＣＡ／ＧＧ＾／Ｔ＊ＣＧ／ＡＴＣ／ＴＣＡ
・・・３′Ｃ１ａ　Ｉによる切断で次のような末端を持
つ断片が生ずる。： 実施例１の場合と同様に、続（ファセオリンのＥｃｏＲ
１部位は： 均摩且Ｉ 次に示す構造に切断することができる；はアニールし次
に示す構造を形成し得る。

これは該ＤＮＡ断片と連なり次に示す構造を形成しこの
リンカ−の有するいくつかの機能を記す：新しいアミノ
酸が１つ導入される；ツバリンシンセターゼの欠失した
配列の一部分が再び構成されている；２つの相反する制
限部位が適合している；オープンリーディングフレーム
は保存されている。

つまり、ファセオリン遺伝子（７）ＥｃｏＲＩ　／Ｂａ
ｇ　ＨＩ制限断片をリンカ−によりＥｃｏＲ１部位を且
ａＩ部位に変換した後ツバリンシンセターゼ遺伝子のＣ
１ａ　Ｉ部位へ結合したのである。この融合遺伝子は、
ツバリンシンセターゼのプロモーター、ツバリンシンセ
ターゼの最初の５８個のアミノ酸、リンカ−（これはツ
バリンシンセターゼ配列の一部分を再構成し、かつ、新
しいアミノ酸１個をそう人したもの）、及び最初の１２
個のアミノ酸残基を省くすべてのファセオリンを含んで
いる。

２、１　リンカ−の人゛ 次に示す２個のリンカ−を合成した： これらを例１７の方法により合成した。これらのオリゴ
クレオタイドａ）とｂ）はアニールして次の構造を形成
する： ｐＫＳ　ｎｏｐ　ＩＶ　（構造は第６図に記述しである
）はｐＲＫ　２９０の旦ＬＬＩ［部位にツバリンのＴ−
ＤＮＡをクローン化したものである。そのツバリンのＴ
−ＤＮＡは唯−Ｃ１ａ　１部位を有する。これはｔ　ｎ
ｏｓ中の皿１部位と二遺伝子の外側下流部分のＣ１ａ　
Ｉ部位との間が欠失した結果である（第５図、第６図）
。

我々はｐＫＳ４−ＫＢ（第７図）を精製し、舷１１で分
解した。４．８ｋｂｐのｋａｎ／ｂｅａｎ耐性断片をゲ
ル電気泳動により精製した。この断片はＴｉ５のカナマ
イシン耐性遺伝子（旦蛙のＢａｇ　ＨＩ　／ＥｃｏＲＩ
断片にＢａｍＨＩ部位で連結しているＥｃｏＲＩ　／Ｄ
ａｍ　Ｈ１のファセオリンＤＮＡの断片（ｋａｎ／ｂｅ
ａｎ中のｂｅａｎとして称される）を含んでいる。

我々は＋　Ｃ１ａ　Ｉにより直線化したｐに５−ｎｏｐ
　ＩＶをｋａｎ／ｂｅａｎ断片及び１例２．１に示すリ
ンカ−を用いて連結した。　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２
を形質転換し、カナマイシン及びテトラサイクリン耐性
コロニーを選択した。二通りの配置が存在し、その一つ
は、ファセオリンＤＮＡがツバリンシンセターゼ遺伝子
に連結したものであり、もう一つは、カナマイシン耐性
遺伝子がツバリンシンセターゼの隣に連結したものであ
った。第８図に示した要求される配置を持ったプラスミ
ド、　ｐＮＮＮｌ、を保有する細胞を決定する為に、制
限部位地図作成を用いた。

アグロバクテリウム・チューメファシエンスー５ｔｒＲ
Ｃ５８，Ｅ、　ｃｏｌｔ　（ｐＲＫ　２０１３）　＊及
びＥ、　ｃｏｌｔ（ＰＮＮＮＩ）の間の二組交雑（従来
技術のシャトルベクターの項を参照）を用いて、構成物
をＴｉプラスミドへ挿入した。

我々はストレプトマイシン、カナマイシン、及びテトラ
サイクリンに耐性なアグロバクテリウム・チューメファ
シエンス細胞を選択した。選択した形質転換体をＬ　ｃ
ｏｌｉ　（ｐＰＨＩＪＩ）と交雑し、カナマイシン及び
ゲンタマイシン耐性コロニーを選択した。

２．４　クラウンゴールのノ　び ヒマワリに接種し１組織培養中でクラウンゴールを形成
させた。発現の試験は、実施例１７及び２０で示したよ
うにＥＬＩＳ八及びｍＲＮＡへのハイブリダイゼーショ
ンにより行った。

実施例３ この実施例の目的は、　ＡＴＧ翻訳開始信号から構造遺
伝子の残りの部分へ連結することができる閃可■部位ま
での完全なファセオリン遺伝子のコーディング配列の再
構成である。５′末端にＣ１ａ　Ｉ部位を構成する。そ
うすれば該遺伝子を容易に復元することができる。次に
示す２個のオリゴ又りレオタイド配列を合成した： ａ）　５　′　＾ＡＴＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧ
ＴＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴ３’ ｂ）　５　’　ＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣ八八ＧＧＧ
ＴＴＣＣＡＣＴへへＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧ　３’ これらはアニールして次に示す構造を形成し得る：実施
例１の場合と同様１次に示すファセオリンのに列１部位
は： 次の構造へ開裂し得る： この末端を前述の合成二本鎖ヌクレオタイドリンカ−へ
連結するとコーディング配列の先頭のＣ１ａ　Ｉ粘着末
端よりの完全なファゼオリンのポリペプチドをコードす
る遺伝子が生じる。

３．１　リンカ−の人゛ 実施例１７の方法により次の２個のリンカ−を合成した
： ａ）　５′　へＡＴＴＣＣＣＡＧＣ＾へＣＡＧＧＡＧＴ
ＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＴｂ）　５　’　Ｃ
ＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧこれらはアニールし１次の構造を
形成する：５　’　ＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣ八八Ｇ
ＧＧＴＴＣＣＡＣＴへへＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧ３’　Ｔ
ＡＣＴＡＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡ
ＣＡＡＣＧＡＣＣＣＴＴ金蕉標底 Ｃ１ａ　Ｉで直線化したｐＫＳ−ｎｏｐ　ＩＶを実施例
３．１で示した。アニールしたリンカ−とＫＳ４−ＫＢ
　（実施例２．２を参照）由来の精製ｋａｎ／ｂｅａｎ
　ＥｃｏＲＩ断片とを連結した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ２
Ｏ２を形質転換し、テトラサイクリン及びカナマイシン
耐性コロニーを選択した。また、二種の配置が可能なの
であるが。

ファゼオリン遺伝子がツバリンシンセターゼ遺伝子の隣
に連結されたものはただ一つであった。正しい配置のク
ローンをエンドヌクレアーゼ地図作成後に選択した。

３．３　クラウンゴールノ　び 実施例２１に示す大要に従って、相同部位組み換え及び
クラウンゴール組織培養の単離を行った。

そして、クラウンゴールにおけるファセオリン遺伝子の
発現の試験は、実施例１９及び２０と同様に行った。

ス１１吐（ ここに示す構成の目的は、クラウンゴール細胞中での外
来遺伝子の発現の為のｐＴｉ方式に用いるシャトルベク
ターの構成方法を教えることにある。

そこでは、外来遺伝子はニプロモーターの支配下にあり
部分的に合成物を含む、又、ツバリンシンセターゼをコ
ードする部分は無くなっている。

構成を開始するに先たち、　ｐＴｉｃ５８Ｔ−ＤＮＡ　
（ｐＣＦ４４Ａ）クローンの配列をｎｏｓプロモーター
を見つけるべく決定した。（第４図） ４．１　ｎｏｓプロモーターの５′部分の単離ＰＣＦ４
４をＸｈｏ　Ｉで切り、再び連結し、それをｐＣＦ４４
Ｂと名ずけた。それは次の構造をもつ：この新しいプラ
スミドのＳｓｔ　Ｉ［断片を欠失させる結果としてでき
たプラスミドｐＣＦ４４Ｃは次のとおりである： 以下余白 これをｈＬＩＩで分解し、　３．６ｋｂｐ断片をｐＲＫ
　２９０のｌｎ部位に挿入する。　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
−１１ｏｇｎｅｓｓ分析においてＴ−ＤＮＡをハイブリ
ダイゼーションする為に選択したコロニーをｐｕｓ−ｎ
ｏｐ　Ｖと名づける。それをＣ１ａ　１で分解し、再び
連結しｐｕｓ−ｎｏｐ　ＶＩを形成する。

これをＣ１ａ　ＩとＳｓｔ　ｎで分解すると２２ｋｂｐ
の直線化したビークル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と３５５ｂｐ
の断片が得られる。これらは塩勾配遠心分離により容易
に分けることができる。該外断片をｌ１ｉｎｆｌで分解
後。

１４９ｂｐの謀すュ■／肛ｎｆｌ及び２０８ｂｐの且虹
■／Ｈ４ｎｆｌ断片をゲル電気泳動により単離する。

４．２　リンカ−の人 実施例１７の方法により次の二つのリンカ−を合成した
； ＧＡＧ　３’ これらは、たがいにアニールし１次に示す構造を形成す
′る： この配列は左側にＨｉｎｆ１部位を、そして右側にＮｃ
ｏ　Ｉ及びＣ１ａ　１部位を有する。交互の配列はと見
」部位とＣ１ａ　１部位の間に＋　Ｂｃｌ　１部位を有
するであろう。この配列は下線で示したＡ−Ｔベースペ
アーとＧＬベースペアーの置換を除くとＴ−ＤＮＡにお
いて見つかったものと一致する。

４．３　ＮＮＮ２の　み立て ２２ｋｂｐのＣ１ａｌ／顕見■ビークルを第９図に示す
ように１４９ｂｐのＳｓｔ　ｎ／Ｉ（ｉｎ　ｆ　ｌ断片
及び合成リンカ−により連結すると次の構造を形成する
。

ＴＡＴＴＡＧＡＣＧ　ＧＴＡＣ＊ＣＴＡ　ＧＣ＊ＴＡ・
・・Ｔ−１１ＮＡ・・・ｂ４．４　ファセオリン゛　云
　の　び 実施例４．３で構成したプラスミドｐＮＮＮ２　（第９
図）をＣ１ａ　Ｉで切り、実施例４．２で合成したＣ１
ａ１　／　ＥｃｏＲＩリンカ−及びｐＫＳ４−ＫＢから
電気泳動的に精製したＥｃｏＲＩ／　Ｃ１ａ　Ｉ　ｋａ
ｎ／ｂｅａｎ遺伝子の断片と混ぜ連結し、形質転換、単
離、制限地図作成を行う、適当なプラスミドｐＮＮＮ４
を実施例２１．１９゜及び２０に記述したように導入し
１発現の試験を行う。

実施例４．４に概略した手順をｐｃＤＮＡ３１のｐＫＳ
４−ＫＢあるいはｐＫＳ４−ＫＢのｐＭＣ６−ｃＤＮＡ
由来のアナログについての交換により繰り返す。

４．６　ファセオリンｃＤＮ＾の　び この構成は＋　ｃＤＮＡ、−重鎖−Ｐｓｔｌリンカ−及
びハｔ　Ｉ　ｋａｎ　断片を使用することについて、実
施例１０に類似している。又、半合成！プロモーターの
使用については実施例４．１．４．２及び４．３に類似
している。性格すけ、移入、及び発現試験については実
施例４．４に記述したものと同様である。

実施例４．３で構成したプラスミド、　ｐＮＮＮ２（第
９図）をＣ１ａ　Ｉで切り、実施例４．２で合成した皿
■／ム吐■リンカ−、ｐＫＳ４−ＫＢから単離し、電気
泳動的に精製した１、７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　／Ｐｓｔ
　Ｉ　ｂｅａｎ断片、電気泳動的に精製した０、９３ｋ
ｂｐのＰｓｔ　ｒＴｎ５　ｋａｎ断片、及びすでに実施
例１７の方法により合成した一本鎖且虹Ｉ／カリニ■リ
ンカー５　’　ＣＧＡＡＴ７３′を混ぜ連結した。

大嵐史ｌ この構成の目的は、ＩＥｃｏＲ１部位からＢａｍＨＩ部
位までのファセオリン遺伝子をＰ２Ｏ３のＨｉｎｄＩ［
［部位にまたがる活性Ｔ−ＤＮＡ遺伝子（このａ＋ＲＮ
＾は、地図上、１．６と記されている第１図参照）へ連
結することである。この配列（第１０図参照）をＰ２Ｏ
３の右側にＣ１ａ　１部位のあるＨｉｎ　ｄ　ｍ部位か
ら決定した。（第１１図参照）。１ｌｉｎ　ｄ　ｍ部位
とＣ１ａ　１部位の間から始まりＨｉｎ　ｄ　ｍ部位へ
向かうオープンリーディングフレームがある。（第１１
図に地図で示される１４５０ｂｐのｎ＋ＲＮＡを参照。

）このＣ１ａ　１部位は＋　Ｈｔｎ　ｄ　ｎ［部位に広
がる遺伝子のｍＲＮＡの翻訳されないリーダーの中にあ
る。我々はＰ４Ｏ３の中央のＣ１ａ　ｌ断片を切り省く
ことによリプロモータービークルを作成した。これは、
中のＣ１ａ　１部位はＥ、　ｃｏｌｉ株中でメチル化さ
れていナイか、ＥｃｏＲＩ部位の隣のりａ１部位はメチ
ル化されているので可能である。

ここで、ファセオリン遺伝子をＣ１ａ　１部位に。

ＡＴＧをもったまま連結する。これはｐＫＳ４−３．０
ＫＢを用いれば可能である。ｐＢＲ３２２のＣ１ａ　１
部位からファセオリンのＥｃｏＲ１部位にいたる塩基配
列を次に示す： ｐｔｌｌｌ　３２２　由来／ファセオリン　・・・オー
プンリーディングフレーム及びＡＴＧに留意の　−こと
、すａｊ部位と翻訳開始信号（ＡＴＧ）の間にはｔｓｂ
ｐがある。これをＣ１ａ　Ｉ部位からＴ−ＤＮＡ遺伝子
の開始までの１２ｂｐと比較する： 再び、オープンリーディングフレームと＾ＴＧに留意の
こと。このように、プロモータークローンのＣ１ａ　１
部位ヘファゼオリン遺伝子を連結すると。

Ｔ−ＤＮＡ中で活性ファゼオリン遺伝子を作ることとな
る。ファゼオリン遺伝子は本来生ずる末端の１２残基の
アミノ酸についての２個のアミノ酸が交換されたことと
なる。

５．１　プロモータービークルの　′ ｐＫＳ　ｍ　（Ｔ−ＤＮＡクローンｐ４０３　（第１図
参照）に対応すルｐＲＫ　２９０　りＣ１−７）をＣ１
ａ　Ｉで分解し。

再連結する。連結混合物をに８０２に形質転換し、カナ
マイシン耐性により選択する。プラスミドは。

［ミニプレツブＪ　（ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）　（少量の
培養細胞からプラスミドを調製すること）を行うことに
より単離する。又、構造を証明する為に制限地図作成を
行う。新ビークル、　ｐＫＳ−Ｐｒｏ　Ｉ　＋　はＨｉ
ｎ　ｄ　ｍでは分解できないが、　Ｃ１ａ　Ｉにより線
状化することができる（第１２図）。　ｐＫｓ−Ｐｒｏ
　Ｉを精製し。

Ｃ１ａ　Ｉによる分解で線状分子を作る。

５′側端を除く３′側への広範囲な部分のファセオリン
遺伝子を含むａ、ｏｋｂｐの断片をＰ７．２　（第１３
図）　（ファセオリンゲノミンククローン１７７．４の
ｐＢＲ３２２サブクローンで構造は実施例６．１に記述
している。）のＨｉｎ　ｄ　ｍとＢａｍＨＩ分解物をア
ガロースゲル電気泳動から溶出して得た。　これをｐＫ
Ｓ４　（第１８図）から同様に単離した。　３．０ｋｂ
ｐのカナマイシン耐性Ｈｉｎ　ｄ　ｎ［／Ｂａｇ　ＨＩ
断片及びＨｉｎｄｎｌで線状化したｐＢＲ３２２と混ぜ
連結した。アンピシリン耐性形質転換体から単離したプ
ラスミドの制限地図作成後、第７図に示す構造を持った
プラスミドをｐＫＳ４−ＫＢとした。

５．３　ＫＳ４−３．０ＫＢからのｋａｎ／ｂｅａｎ　
の　盲！ｐＫｓ４−ＫＢ（第７図）を且ａｌで分解し、
　４．９ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精
製した。

５、　４　Ｃ１ａ　Ｉ　ｋａｎ／ｂｅａｎ　主　のＣ１
ａ　ＩｐＫＳ−Ｐｒｏ　ＩをＣ１ａ　Ｉ分解で線状化し
、実施例５．３からのカナマイシン耐性遺伝子／ｂｅａ
ｎ断片を一緒に連結し、　Ｋ２Ｏ２へ形質転換する。カ
ナマイシン耐性形質転換体を選び「ミニプレツブ」によ
り単離したプラスミドを適当な配置を持つものを見つけ
る為に制限地図作成を行った。　該プラスミドをｐＫＳ
−Ｐｒｏ　Ｉ−にＢ（第１４図）とした。

５、５　ノ　云　び。

ｐＫＳ−Ｐｒｏ　Ｉ−ＫＢを持つ細胞をｐＴｉ　１５９
５５．　ｐＴｉＡ　６０あるいは他の適当なＴＩＰプラ
スミドを持つアグロバクテリウム細胞と交雑する。カナ
マイシンで組み換え体を選択後、植物に接種し９組織培
養でクラウンゴールを形成させた。ファセオリンの合成
の試験は実施例１９及び２０に示すとおりである。

大亀開工 この実施例は、他のさまざまな例に示す、ベクターへ、
ファセオリン遺伝子を挿入する進んだ操作に先だって、
豆（Ｐｈａｓｅａｌｕｔ＋　ハ釦肛圏り、）の種子の主
要貯蔵タンパク質であるファセオリンの遺伝子の操作を
教える。

６、１　ファセオ盲ン゛　云　のサフ゛クローニングシ
ャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　２４Ａ、　ＡＧ−ＰＶＰｈ　
１７７．４　（あるいは、　１７７．４　ＨＳ、Ｍ、Ｓ
ｕｎ　ｅｔ、　ａｌ　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２８
９　：　３７−４１．　Ｊ、Ｌ、Ｓｌｉｇｈｔｏｍ　ｅ
ｔ、　ａｌ　（１９８３）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８０　；
第１５図）中の、ファセオリンのゲノミッククローンを
」紅］１及びＢａｍＨＩで分解した。ファセオリン遺伝
子及び隣接配列を持つ３．８ｋｂｐの断片をアガロース
ゲル電気泳動で単離し、ＢａＬＨＩで線状化したｐＢＲ
３２２と混ぜ連結した。混合物をＨＢＩＯＩに形質転換
し。

アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性コロニーを
選択した。

これらのクローンから単離したプラスミドの制限地図を
作成した。第１６図に示す構造を持つプラスミドを選択
し、　ＡＧ−ｐＰＶＰｈ　３．８　（あるいは９代わり
にＰ３．８）とした、１ｎとＢａｍ　ＩＩ　Ｉ　部位カ
互’ｔ’に連結したものは１両方の部位が消失する。

もう一つの１７７．４のサブクローンを次のように構成
した。まず、ＥｃｏＲＩ分解し、ファセオリン遺伝子の
３”側配列および５′側端以外のすべてを含む７．２ｋ
ｂｐの断片を単離し、　ＩＩＢＩＯＩ形質転換体のアン
ピシリン選択したものを制限地図作成後車Ａｔ１ｔル。

ｐＢＲ３２２のＨｉｎ　ｄ　ｍ部位がファセオリン遺伝
子の５′末端と３′末端の翻訳されない領域に隣接して
いるような配置の挿入を有するプラスミドをＡＧ−ｐＰ
ＶＰｈ　７．２　（あるいは、ｐ７．２；第１３図；Ｓ
ｕｎ　ｅｔ　旦、　ａｎｄ　ＳｌｉｇｈｔｏｌＩｉｅｔ
　ａｌ。５ｕｐｒａ　）とした。

ｐＲＺ１０２　（Ｒ，＾、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９７９）　Ｍｏ１ｅｃ。

ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７７　：　６５−７２）　
（これはトランスポゾンＴｎ５を１コピー持つＣｏ１Ｅ
　１プラスミドである）をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ　ｄ　
ｍで分解し、前もって同じ２つの酵素で線状化しである
ｐＢＲ３２２と混ぜ、連結し、　Ｋ２Ｏ２へ形質転換し
た。アンピシリン及びカナマイシンの両方に耐性な形質
転換体から単離したプラスミドの制限地図を作成し、第
１８図に示す構造をもつものをｐＫＳ−４とした。

Ｐ３．８をＣ１ａ　ＩとＢａｍＨＩで分解し、ファセオ
リン遺伝子とｐＢＲ３２２の一部分の配列を含む４．２
ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動より単離した。

これをｐＫＳ４　（第Ｉ８図）からのカナマイシン耐性
（ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ■）遺伝
子を持ったＴｎ　５のＣ１ａ　Ｉ　／Ｂａｍ　１１　Ｉ
断片及びＣ１ａ　Ｉですでに線状化したｐＢＲ３２２（
第１７図）と混ぜた。混合物を連結し、　Ｋ２Ｏ２へ形
質転換した。

アンピシリン及びカナマイシン耐性コロニーを選択し、
制限地図作成を行った。第１９図に示す構造をもつコロ
ニーをｐＫＳ−ＫＢ　３．８とした。

もう一つの有用なプラスミド、　ｐＫＳ４−ＫＢの構造
は実施例５．２に示しである。

去隻桝工 この実施例は、ファセオリンのゲノミッククローンに対
するｃＤＮＡクローンの置換以外は、実施例５に述べた
構成に類似している。この構成によりイントロンを欠失
した遺伝子ができるだろう。

７、１　ｐＫＳ４−ＫＢ　２．４　（ＫＳ４−ＫＢに　
゛）の　′ｐＭＣ６をム姐■と並ｍ１ｌｌで分解した後
、　２．４ｋｂｐのフ１セオリンｃＤＮＡ断片を塩勾配
遠心かゲル電気泳動により単離する。カナマイシン耐性
遺伝子を含む１．９　ｋｂｐの断片をｐＫＳ４　（第１
８図）の皿！及びハｍＨ１分解から精製し、　ｃＤＮ＾
断片及び、匡■Ｉで線状化したｐＢＲ３２２と混ぜ、連
結し、　Ｋ２Ｏ２へ形質転換する。カナマイシン耐性コ
ロニーを選択し、プラスミドを単離し制限地図作成後、
第２１図に示すプラスミドをｐＫＳ４−ＫＢ２．４とし
た。

ｐＫＳ４−ＫＢ２．４を且虹Ｉで分解し、只とＩで線状
化したｐＫＳ−ｐｒｏ　Ｉ　（第１２図）と連結する。

形質転換。

選択、プラスミド単離そして性格ずけの後、希望の構造
（すなわち、ファセオリン配列がＴ−ＤＮＡプロモータ
ーへ隣接している）をＴｉプラスミドへ移入する。接種
及び試験は実施例２１．１９．及び２０に述べるとおり
である。

ス五〇」１ この実施例は遺伝子からイントロンを除く方法を教える
。これは、ゲノミンクな環境にｃＤＮＡを配置すること
と同じことである。制限酵素部位は。

処理されていない転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の５
′及び３′末端の両方のエクソン中に見出されるかある
いは特異的変異により作られる。これらの部位はゲノミ
ッククロン及びｃＤＮＡの両方に存在する。

介在イントロンを含むＤＮ＾を除き、対応するイントロ
ンを含まないｃＤＮＡクローン断片を２つの部位に橋渡
しすることができる。逆の操作も可能である：イントロ
ンを含むゲノミック配列をｃＤＮＡ環境に配置すること
もできる。

ゲノミッククローンの中の断片をｃＤＮＡクローンを切
り出した対応するすき間（ｇａｐ）へ挿入する。

この後者の方法は類似しているが、イントロンがその変
換される断片を作るために選ばれる酵素に感受性な部位
を含むよりもしばしば、技術的にはより困難である。こ
の困難は部分分解の条件の注意深い選択とアガロースゲ
ル電気泳動による所望断片の精製により克服された。こ
の戦略をさらにねったものは、遺伝子内の個々のイント
ロンを他のイントロンとエクソンとに影響を及ぼさない
で操作すること、および不都合な介在する制限部位が上
述するようにイントロン内に存在するときの配列を段階
的に交換することを含む。

ファセオリン遺伝子及びその付近の配列のプラスミドク
ローンであるｐ３．８をＥｃｏＲＩで部分分解。

Ｓａｃ　Ｉで完全分解し、ｐＢＲ３２２ベクターと遺伝
子の５′及び３′の両末端を含む６．４ｋｂｐの断片を
アガロースゲル電気泳動により単離した。ファセオリン
ｍＲＮＡから１乍ったｃＤＮＡ（７）　ｐＢＲ３２２プ
ラスミドクローンであるｐｃＤＮＡ３１をＳａｃ　Ｉで
部分分解、に憇Ｉで完全分解し、５′及び３′末端を除
く全ファセオリンｃＤＮＡを含む１．３３ｋｂｐの断片
をアガロースゲル電気泳動により単離した。これらの２
つの断片を連結して、■旧０１へ形質転換した。コロニ
ーを選択し、細胞を増殖させ、プラスミドを単離し。

制限地図作成により希望の構造をもつプラスミドを決定
した。このプラスミドをｐ３．８−　ｃＤＮＡとした（
第２２図）。

８．２　３．８−ｃＤＮＡの１ 次のことに留意のこと。ｐ３．８−ｃＤＮＡは他の実施
例で用いられているｐ３．８のようなゲノミックＤＮＡ
源（ｓｏｕｒｃｅ）の代わりをすることができる。又。

そのように使用したとき、イントロンを欠いているとい
う相違をもつ類似した例となる。もしくは。

この戦略はすでに作った構造からイントロンを除くのに
使うことができる。

実施炎工 この実施例はイントロンのない遺伝子の発現を教える。

ファセオリンｃＤＮＡを実施例８に述べたように調製す
る。遺伝子はイントロンを欠いているがこれも又、使う
ことができる。

実施例８で教えたものと類似の構成を用いる。

ｐＫＳ４−ＫＢ　とｐＭＣ６を実施例８のようにＥｃｏ
ＲＩとＳａｃユ■で分解し、そこで示したようにｃＤＮ
Ａを挿入したものをベクター及びファセオリンの５′及
び３′末端部分を含むｐＫＳ４−ＫＢ断片に連結する。

新プラスミド＋　ｐＫＳ４−ＫＢｃをｐＫｓ４．ＫＢと
類イ以した方法で構成に用いる。

去施桝刊 この実施例の目的はＴ−ＤＮＡの中にＴ−ＤＮ＾遺伝子
のプロモーター支配下で、　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　４レ
クチンのｃＤＮＡを設置し、その構成物を植物細胞へ移
入し、植物組織でのこの構成物の発現を見つけることで
ある。

この構成には、制限酵素ＰｓｔＩ及び１ｌｉｎ　ｄ　Ｉ
ＩＩでの分解により生じた粘着末端を接続する一重鎖リ
ンカーが使われている。下記のＰｓｔ　１部位とｌ１ｉ
ｎｄＩ［１部位 が開裂すると次の末端を形成する： そして適当な配列のリンカ−の存在下に混ぜる：３’　
ＡＣＧＴＴＣＧＡ５’ これらは、互いに連結し１次に示す構造を形成し得る： １１ｉｎ　ｄ　Ｉ［［部位が再び構成されたことに留意
のこと。

レクチンのｃＤＮＡをプラスミドクローン、　ｐＰＶＬ
１３４及びＡＴＣＣ３９１８１より得る。ｐＰＶＬ１３
４及びＡＴＣＣ３９１８１はポリＣ鎖をつけた２末鎖ｃ
ＤＮＡをＰｓｉ　Ｉで切りポリＧ鎖をつけたｐＢＲ３２
２に挿入することにより構成した。このクローンはり、
　Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
１０ニア８１９−７８２２により記述されたものと同種
である。

１０．１　リンカ−の合成 ！Ｊ　７カー　５　’　ＡＧＣＴＴＧＣＡ３　’を実施
例１７の方法により合成する。

１０．２　レクチンｃＤＮＡ１びカナマイシン（性遺伝
ヱ奎食Ｕ久旦二ｙｏ盪底 ｐｐｖｔ、　１３４を取［Ｉ及びハｔｌで分解し、レク
チンのコーディング配列、３′の翻訳されない領域及び
Ｃ／Ｇ鎖を含む中間の大きさの断片を電気泳動で分画後
アガロースゲル電気泳動から溶出することにより単離す
る。　ｐＢＲ３２５を脂１工■及びｌ１ｉｎ　ｄ　ＩＩ
Ｉで分解し、一番大きな断片を塩勾配を通して、沈降さ
せ単離する。舷１　１／担ｎ　ｄ　ｍ　ｐＢＲ３２５断
片をＢｃｌ　Ｉ／Ｐｓｔ　Ｉ−レクチン断片及び例１０
．１で調製したＰｓｔ　Ｉ　／Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩＩリン
カ−と混ぜ連結する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２を形質転換し、薬剤耐性及び
レクチン配列の存在で選択する。そのような、細胞から
単離したプラスミドをＩｌｃとする。　ｎｃを１１ｉｎ
　ｄ　ｍ及びＢａｍＨＩ分解することにより生じた一番
大きな断片を前もってアガロースゲル電気泳動で単離し
たｐＫｓ−４のカナマイシン耐性遺伝子を持つＨｉｎ　
ｄ　Ｉｎ／Ｂａｍ　ＨＩ断片（第２３図）と混ぜ連結す
る。Ｋ２Ｏ２を形質転換し、コロニーをカナマイシン耐
性で選択する。プラスミドを単離し制限地図を作成し、
性格ずけをする。希望のプラスミドをＰＬ−Ｂとする。

１０、３　ＫＳ−ｒｏ　ＩにおけるＣ１ａ１６立のＢａ
ｍＨＩ実施例５．１に示す構造をもつｐＫＳ−ｐｒｏ　
Ｉ　（第１２図参照）をＣ１ａ　Ｉで分解する。この切
断点は１．６ｋｂｐの転写物のプロモーターとＡＴＧ翻
訳開始信号の間にある（第１図参照）。粘着末端を、　
ＤＮＡポリメラーゼＩで埋めることにより平滑末端に変
える。ＢａｍＨＩリンカ−をすき間に連結し、露出した
Ｂａｍ１１１粘着末端を削り取り、連結し、　Ｋ２Ｏ２
へ形質転換する。望むプラスミドｐＭＳ−ｐｒｏ　Ｉ　
Ａ　（第２４図）を持つコロニーは「ミニプレツブ」に
よるプラスミド単離および制限酵素地図作成による性格
ずけの後選択される。

ｐＬ−Ｂ　（実施例１０．２）を匙上ｊ及びハｎ＋ＨＩ
で分解し、カナマイシン耐性遺伝子及びレクチン配列を
もつ断片を電気泳動で分直後、アガロースゲルから溶出
した。この断片をＢａｍＨＩで線状化した。

ｐｌｓ−ｐｒｏ　Ｉ　Ａと混ぜ連結した。連結混合物を
に８０２へ形質転換した。プラスミドをカナマイシン耐
性コロニーから単離し、制限地図作成により性格ずけを
行い、望みの構造をｐＬＫ−ｐｒｏ　Ｉ　Ａとした（第
２５図）。

１０．５　での ｐＬＫ−ｐｒｏ　Ｉ　Ａ　’ｌｃ　Ｋ２Ｏ２（ｐＬＫ−
ｐｒｏ　Ｉ＾）＋　Ｅ、　ｃｏｌｉ（２０１３）及びア
グロバクテリウム・チューメファシエンス（ｐＴｉ　１
５９５５）（ストレプトマイシン耐性）の玉肌交雑（実
施例２１）によりＴｉプラスミドへ移入する。　ｐＰＨ
ＩＪｌのアグロバクテリウムへの付加的。

接合的移入の後、二重相同部位組み換え体をカナマイシ
ン、ストレプトマイシン、及びゲンタマイシン上で生育
する細胞から選択する。レクチンは適当な抗体を用いて
、　ＥＬＩＳＡにより見つける。

大衡炎■ この実施例の目的は、　ｐＴｉ　１５９５５及び他のオ
クトピンＴｉプラスミドのｔｓｉｓ（ｒシューテイング
」ローカス（１ｏｃｕｓ）　）からｔｓ＋ｒ（ｒルーテ
ィング」ローカス（ｌｏｃｕｓ））まで欠失しているＴ
ｉプラスミドを生み出すことである。この誘導体は有用
である。なぜなら、これで形質転換した細胞の方が完全
な」Ｌとｔｍｒ遺伝子を持つｐＴｉ　１５９５５で形質
転換したものより容品に完全な植物に再生するからであ
る。

ｔｍｓ−ｔＩＩＩｒ欠失ｐＴｉ　１５９５５は結局２つ
の方法で変えられるｅ　ｔ＋ｗｓ−ｔ＋ｗｒの不活性化
及び外来遺伝子の挿入である。これらの２つの変化がＴ
−ＤＮＡの違う所にあるならば、各々の変化は異なるシ
ャトルベクターによって別々に挿入される。変化に依存
する各々のシャトルベクターを独立に選択するには。

少なくともアグロバクテリウム中で２つの選択マーカー
の使用が必要となるだろう。通常のカナマイシン耐性に
加えてこの例では、　ｐＢＲ３２５由来のクロラムフェ
ニコール耐性も用いる。

ｐＢＲ３２５を旧ｎｃｎで分解し＋　Ｈｉｎ　ｄ　ｌ［
リンカ−と平滑末端結合する。調製物をＢｉｎ　ｄ　Ｉ
ＩＩで分解し、再結合し、クロラムフェニコール耐性（
」煎で選択したものを、　ｐｋｓ−５とする。これは」
憇遣転子をもつＨｉｎ　ｄ　Ｉ［［／Ｂｃｌ　Ｉ断片の
源となる（第２６図）。

Ｐ２Ｏ３の１ｌｉｎ　ｄ　ｍ完全分解Ｂａｓ＋Ｈ１部分
分解から９．２　ｋｂｐの線状ＤＮＡ断片を単離する。

虱遺転子をもつ断片をｐＫＳ−５から単離し、　９．２
ｋｂｐの線状断片と混ぜ、連結し、　Ｅ、　ｃｏｌｔに
形質転換する。そして、クロラムフェニコール耐性で選
択したものをｐＭＳ−Ｏｃｔ、　Ｃａｎ＋　２０３とす
る（第２７図）。

ｐＫＳ−ｏｃｔ、　Ｃａ１１２０３は現在、多数のｐＴ
ｉ　１５９５５の欠失ＴＬ変異の構成に使えるプラスミ
ドである。それは、　ＴＬの右手の腕及び右腕の左への
耐性遺伝子を含む。我々はＴＬの種々の左腕を（Ｌ遺伝
子の左（ｌｌｉｎ　ｄ　ｍ部位）へ付けることができる
。簡単に言えば、もし、　Ｐ１Ｏ２を付けたら、欠失は
５．２ｋｂｐで展と展のすべてを含むことになる。　も
し。

Ｐ１Ｏ３を付けたら欠失は３．２ｋｂｐとなり、田との
一部分とすべての」Ｌを含むことになる。第１図参照。

ｐＫＳ−ｏｃｔ、　Ｃａｍ　２０３をＨｉｎ　ｄ　ＩＩ
で分解する。Ｐ１Ｏ２あるいはＰ１Ｏ３をＨｉｎ　ｄ　
ｍで分解し、　２．２ｋｂｐあるいは２、０ｋｂｐのＴ
−ＤＮＡ断片を単離し、線状化したｐＭＳ　−ｏｃｔ、
　Ｃａ１１１２０３と連結し、形質転換し、生ずるｐＫ
Ｓ−ｏｃｔ、　ｄｅｌＩＩ　（第２８図）あるいはｐＫ
Ｓ−ｏｃｔ、　ｄｅｌ　Ｉ　（第２９図）をそれぞれ単
離する。これらの構成を接合、相同部位組み換え及び、
クロラムフェニコール耐性の選択によりアグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス移す。もしくは、　Ｂａｇ
　ＨＩで、もっているプラスミド構成を線状化し、　ｐ
ＲＫ　２９０の虱Ｉ［部位に連結するという。確立され
た方法を使えば構成をｐＲＫ　２９０に移すことができ
る（第３０図）。

去遡糎Ｕ この実施例において、　ｔａｒ中のｕＩ！Ｌ１部位から
ｔｍｌ中のＳ＋ｗａ　Ｉ部への間のＴ−ＤＮＡの欠失に
よりＴｉプラスミドを変異させる。修飾され得るＴｉプ
ラスミドは＋　ｐＴｉ　１５９５５＋　ｐＴｉＢ６．　
ｐＴｉＡ６６及びその他である。この組み立ては、第３
１図に図解しである。

１２．１　ｃａ１云の ｐＭＳ−５（第２６図）を肛ｎｄｌｌ［ζＢｃｌ　Ｉで
分解する。

実施例１１で教えたように、最小の断片をアガロースゲ
ルで分画後、単離する。

Ｔ−ＤＮＡの右手の腕の欠失をＰ２Ｏ３のＳｅａ　１部
位にｑｎ部位を挿入することにより構成する（第１図参
照）。Ｐ２Ｏ３をＳｍａ　Ｉで分解し、　ＢＪＬＬＩＩ
リンカ−を連結する。そしてｌ■で分解し、再連結する
。そしてに８０２へ形質転換する。（変化した構成にお
いては＋　ＬＬＨＩリンカ−をｈＬＩｌリンカ−の代わ
りに用いて適当なりａｍＨ１部分分解産物を単離する。

）生じたプラスミドをＰ２Ｏ３４ｇ上」とする。そして
それをｈＬＩＩとＨｉｎ　ｄ　ｍで分解する。断片を含
む大きなｈＬＩＩ　／　Ｈｉｎ　ｄ　ｍベクターを実施
例１２．１に示したクロラムフェニコール耐性断片と連
結する。に８０２へ形質転換後、クロラムフェニコール
耐性を選択する。結果として生じたプラスミドをｐ２ｆ
とする。（第３１図）。

１２．３　Ｔ−ＤＮＡの　の　の　したクロー乙■盪底 」匹１分解及びＨｉｎ　ｄ　ｍリンカ−との連結により
Ｐ２Ｏ２の展１部位にＨｉｎ　ｄ　ｍ部位を挿入する。

Ｈｉｎ　ｄ　ｍ分解によりＨｉｎ　ｄ　ｍ粘着末端を露
出させた後、　Ｈｉｎ　ｄ　ｍ末端を持つ２ｋｂｐの肛
とＩ断片を単離する。　胆ｎｄｌ［Ｉで分解したＢｉｎ
　ｄ　ｍ末端の肛ＬＩ断片をに８０２へ形質転換する。

所望の構造をもつコロニーを単離し、性格ずけをした後
、そのプラスミドをｐ３ｅとした（第３２図）。

１２．４　Ｔ−ＤＮＡ　クローンの クローンの左手の腕を、電気泳動後、アガロースゲルか
ら溶出し＋　ｐ３ｅのｌ１ｉｎ　ｄ　ｍ分解物の２ｋｂ
ｐの断片を精製することにより得た。ｐ２ｆをＨｉｎ　
ｄ　ＩＩＩで切りアルカリフォスファターゼ処理後、　
２ｋｂｐ断片と混ぜ連結し、　Ｋ２Ｏ２を形質転換する
。そしてクロラムフェニコール耐性で選択する。プラス
ミドを個々のコロニーから単離し、制限地図作成により
性格ずけをした。望みの二つ連なった配置で２つの腕を
持っているプラスミドを選択し、　ｐＫｓ　−ｏｃｔ、
　ｄｅｌ　ｍとした（第３３図）ｐＫＳ−ｏｃｔ、　ｄ
ｅｌｌ［ｌをアグロバクテリウム・チューメファシエン
スへ交雑により移し、相同部位組み換え体をクロラムフ
ェニコールで選択した。ヒマワリとタバコの根と葉茎に
他の例に示したものと同様に、接種し、腫瘍の生成をオ
パインについて試験した。

去施炭旦 この実施例は実施例１２の変形例であり、　ｔｍｒと独
の欠失を構成することを教える。

を平滑末端連結しＢｇｌｌ１分離後、再連結する（第３
４図）。クロラムフェニコール耐性をに８０２あるいは
ＧＭ３３の形質転換した後９選択する。結果として生じ
たプラスミド、　ｐＫＳ−６ｃａｍ遺伝子をもっ展■／
取［Ｉ断片の源となる。

１３、２　ｔｍｒ、　ｔｍｌ　失クローンの葺成ｐ　２
０３　ヲ掩ＬＩξＳ’ｍａ　Ｉで分解する。Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉリンカ−の平滑末端連結の後、　Ｂｇｌ　Ｉ［粘着末
端を露出させる為に、　堕ＬＩＩで分解する。再連結し
、　Ｋ２Ｏ２へ形質転換する。望みの構造を同定し＋　
ｐ２とした（第３５図ン。

二遺転子をもつｌｎ断片をｐＫＳ−６から単離し、　Ｂ
ｇｌ　ｎで切ったｐ２へ連結する。Ｋ２Ｏ２の形質転換
後、クロラムフェニコール耐性を選択した。結果として
生じるプラスミドをｐＫＳ−ｏｃｔ、　ｄｅｌｎ［ａ（
第３６図）とし、実施例１２．４に記述しているように
試験する。

大施且Ｕ この構成の目的は、クロラムフェニコール耐性遺伝子の
挿入による。　ｔｍｒローカスの肛し■部位のみにおけ
る変異の例を与えることである。この遺伝子は、　ｐＫ
Ｓ−６からのＢｇｌ　ＩＩ／Ｂｃｌ　Ｉ断片として単離
し＋　ｐ２０３のＨｐａ　Ｉ部位をＢｇｌ　１１部位に
変えた後でそこに連結する。

１４、　Ｉ　Ｈｐａ　１部位のＢｇｌ　１１部位への変
ρ２０３をＨＰＬｉで分解し、　Ｂｇｌ　ＩＩリンカ−
を連結する。ｌｎで分解し、再連結する。Ｋ２Ｏ２を形
質転換後、コロニーｈＬ１１部位の挿入について制限地
図作成により選別し９選択する（第３７図）。

月−Ｉ−一組ｍｊｊＱｋＬ東免除 ｐＫＳ−６をＢｇｌ　ｎ及びＢｃｌ　Ｉで分解する。最
小の断片をアガロースゲル電気泳動より単離する。

１４．３　変、したＴ−ＤＮＡクローンの　゛実施例１
４．１で得た修飾されたｐ２０３をＢｇｌ　ｎで分解し
、実施例１４．２で精製した」憇遺転子と連結し。

Ｋ２Ｏ２へ形質転換する。クロラムフェニコール耐性を
選択し、プラスミドを単離し、制限酵素地図作成により
性格ずけを行い、　ｐＭＳ−ｏｃｔ、　ｔｍｒとする（
第３８図）。

去旅囲■ この実施例における再生は、Ｒ１に基礎をおくＴＩＰに
より引き起こされるニンジンの腫瘍を含む。そしてこの
例は本質的にＭ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　
（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９５　：　４３２−４
３４により示されたのと同様に遂げられる。

】５．１　毛　（ｈａｉｒ　ｒｏｏｔ）における感仇ニ
ンジンの平板（ｄｉｓｋ）にＯ，１ｍｌの水の中で１０
５９４バクテリアを接種する。得られたルート（ｒｏｏ
ｔ）の端の１．５ｃｍ部分を切りとりホルモンを欠く固
体（１〜１．５％寒天）　Ｍｏｎ１ｅｒ培地（Ｄ、Ａ、
Ｔｅｐｆｅｒ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｃ，Ｔｅｍｐｅ　（１９８１）　Ｃ，Ｒ，Ｈｅｂｄ、５
ｅａｎｃ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｐａｒｉｓ　２９５　：　１５３−１５６）に置く。　
そして２５℃から２７℃の暗所で成育させる。

バクテリアの混じっていない培養物を２〜３週間ごとに
移し、ホルモンと寒天を欠＜　Ｍｏｎ１ｅｒ培地におい
てサブカルチャーとする。

１５．２　根（ｒｏｏｔ）の　物への再生実施例９．１
における培養根組織を０．３６μＭ　２．４−Ｄ及び０
．７２μＮキネチン（ｋｉｎｅｔｉｎ）を含む固体（０
，８％寒天）　Ｍｏｎ１ｅｒ培地に置く。４週間後、生
じたカルス組織をホルモンを欠く液体Ｍｏｎ　ｉ　ｅｒ
培地に移す。振とう器（１５０ｒｐｍ）で２２℃〜２５
℃にて保温している間にカルスは懸濁培養（ここから卵
が分化する）へ分離していく。これをホルモンを欠くＭ
ｏｎ１ｅｒ培地の入ったペトリ皿に移すと植物へ成長す
る。これらの小植物を徐々に、湿気の少ない環境にさら
して「鍛えた」後に、温室あるいは庭園の土壌へ移す。

（以下余白） １５．３　ではない（ｎｏｎ−ｈａｉｒ）のベクターの
使■ 機能する上遺転子を持たない＋ｈが基礎となっているベ
クターを実施例１５．１及び１５．２に示したＲｉが基
礎となっているベクターのかわりに用いる。

適当な欠失の構成は実施例１２．１３及び１４に示しで
ある。

実施■測 この例における再生は、Ｔｉに基礎をおく　ＴＩＰによ
り引き起こされたタバコの腫瘍を含む。又、この例は本
質的にに、Ａ、Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
３）Ｃｅｌｌに示されたものと同様に遂げられる。

１６．１　クラウンゴールの、染 タバコ組織を、最初＋　Ａ、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　（１９５
６）　Ｃａｎｃ。

Ｒｅｓ、１６：５３−５６により表わされた転化した茎
の一部分を用いる方法により形質転換する。茎を７％市
販クりロソクス（Ｃｈ　Ｉ　ｏｒｏχ）および８０％エ
タノールの溶液で表面殺菌し、殺菌した蒸留水で洗い。

１ｃｍの断片に切り端を上にして、寒天で固化したホル
モンを欠＜ＭＳ培地（Ｔ、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ
　Ｆ、Ｓｋｏｏｇ（１９６２）　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌ
ａｎｔ、旦：　４７３−４９７　）の入ったペトリ皿に
置く。切り取った茎の表面に注射器の針で穴をあけ、バ
クテリアを注入することにより接種を行う。茎を２５℃
で１日あたり１６時間光にあたるようにして、培養する
。発育したｃａｌｌｉを茎切片の表面から取り去り０．
２■／ｌｌ１ｌのカルベニシリンを含みホルモンを欠く
固体ＭＳ培地に置き。

続いて、約１ケ月の周期で３回、新しいカルベニシリン
入り耶培地に移す。そして、バクテリアに支配され続け
ているかどうか、確認する為の試験を行う。無菌の組織
を補足物を欠いた固体ＭＳ培地上で前述の培地条件で保
存する。（２５℃、　１６時間＝８時間　明：暗）。

１６．２　ノ　転　した組°の培養 Ａ、　Ｂ１ｎｎ５　ａｎｄ　Ｆ、Ｍｅｉｎｓ　（１９７
９）　Ｐｌａｎｔａ　１４５　：　３６５−３６９で示
されたようにして、形質転換した無菌組織からクローン
を得る。ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０．０２■／β入り
の液体ＭＳ培地で、２．３日間。

２５℃、　１３５ｒ、　ｐ、ｍ、で振とう培養すること
により。

カルス（ｃａｌｌｉ　）を懸濁細胞に変換する。そして
。

５４３及び２１３μｍのステンレススチールメソシュで
、順番にろ過する。通過したろ液を濃縮し、０．５％溶
解した寒天（ｍｅｌｔｅｄ　ａｇａｒ）＋２．０　ｍｇ
／　ＩＩ　ＮＡＡ＋０．３ｍｇ／７！　キネチン＋　０
．４８／　１Ｄｉｆｃｏ酵母エキスを含む５ｍｌのＭＳ
培地に、約８Ｘ１０５３４細胞／ｍｌの濁度でブレーテ
ィングする。直径１鶴になったコロニーを外科用メス針
５ｃａｌｐｅｌ　ｐｏｉｎｔで拾い。

２．０■／ｊ！　ＮＡＡ、０．３■／βキネチンを含む
固体ＭＳ培地へ置き、成育させる。生じたカルスを小片
に分割し、形質転換した表現型について試験する。

１６．３を物の再生 形質転換した植物を０．３■／Ｉｌのキネチンを含む固
体ＭＳ培地に置き、実施例１６．１に示したように培養
する。形成した葉茎（Ｓｈｏｏｔ）をｌ／１０強度のＭ
Ｓ培地塩、０．４■／ｌチアミンを含み、ショ糖及び、
ホルモンを欠く固体（１，０％寒天）培地（ｐＨ７，０
）に置き根を出させる。根が出た小植物を培養して成長
させ、実施例１５．２のように鍛え、温室或いは、庭園
の土壌に移す。

１６．４　ベタ　− 実施例１６．１．１６．２及び１６．３に示した方法は
１機能するｔｍｒ遺伝子を欠（Ｔｉに基礎を置くベクタ
ーに適している。適当な欠失の構成は、実施例１２゜１
３、及び１４に示しである。これらの方法は＋　Ｒｉに
基礎を置くベクターを用いる場合も効果的である。

実施例１６．１に示したｄ 転化した茎の切片の感染に関する方法はしばしばＴＩＰ
で形質転換したセルライン（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）を作
るのに有用である。

大息性Ｕ これまでの実施例で用いたＤＮＡ断片の化学合成の手法
は、　ＤＮＡ合成の専門家によく知られた多くの手法を
利用している。ヌクレオシドの修飾は。

Ｈ，５ｃｈａｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９６３）　
Ｊ、＾ｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ。

ＳＯｃ、８１し３８２０及びＨ，Ｂｕｃｈｉ　ａｎｄ　
Ｈ，Ｇ、Ｋｈｏｒａｎａ　（１９６５）　Ｊ、Ａｍｅｒ
、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、８７　：　２９９０らに
より示されている。デオキシヌクレオシドフォスフオル
アミダイトの調製はＳ、　Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａ
ｎｄ　Ｍ、ＩＩ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２訂１Ｂ５９により示されている
。固相樹脂の調製は、　Ｓ、Ｐ。

Ａｄａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｊ、Ａｍｅｒ
、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、により示されている。二本鎖
合成リンカ−の形成に有用なハイブリダイゼーション課
程は、　Ｊ、Ｊ、Ｒｏｓｓｉ　ｅｔａｌ、　（１９８２
）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５７：１１０７０
により示される。

去ｍ ファセオリンはＰｈａｓｅｏｌｉｓ　旦几肛鎚、の最モ
豊富な貯蔵タンパクである（全種子タンパクの約５０％
）。機能するファセオリン遺伝子のアルファルファへの
移入、及び貯蔵ファセオリンへのファセオリンａ＋ＲＮ
Ａの翻訳は重要な経済的価値を持つ。

なぜなら、家畜飼料として、用いる葉に貯蔵タンパクを
導入することになるからである。アルファルファは牛の
飼料となり、生育も早く、リゾビウムの共生によりチッ
素固定が可能で、クラウンゴールの感染ができ、単細胞
或いはプロトプラストから植物体を再生することができ
る。これらのことから、アルファルファはファセオリン
遺伝子を移入し１発現されるのに価値ある植物だといえ
る。

この例は１発現し得るファセオリン遺伝子をアルファル
ファに導入することを教える。

１８．１　シャトルベクターの　１ 遺伝的に手を加えたアグロバクテリウムのプラスミド（
後述）を持つクラウンゴール組織からアルファルファを
再生させる。最初の段階として。

我々はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下にあるファセオ
リン構造遺伝子に連結しているｔ＋＋ｒ５４及びｔｏ＋
ｓ　５−Ｔ−ＤＮＡ変異を持つ「シャトルベクター」を
構成する。この構成を機能するネオマイシンフォスフオ
ドランスフェラーゼ（ＮＰＴ　ｎ　）　構造遺伝子（カ
ナマイシン耐性）を下流に持つツバリンシンセターゼプ
ロモーター（Ｍ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ、ｅｔ　ａｌ、　
（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３　）　１５ｔｈ　Ｍｉ
ａｎ＋ｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙ＋ＩＩｐｏｓｉｕｍによ
り報告されている。　又、　Ｊ、　Ｌ、　Ｍａｒｘ（１
９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９　：　８３０及びＲ，
Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１８Ｊａｎｕａｒｙ　
１９８３　）　１５ｔｈ　Ｍｉａｓｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　
Ｓｙｎ＋ｐｏｓｉｕｍ参照）に順に連結する。この構成
の形式は実施例１に示しである。

１８．２　アグロバクテリウム　び　への入 “シャトルベクター”を型にはまった手法（実施例２１
）によりｐＴｉ　１５９５５のようなＴｉプラスミドを
もつアグロバクテリウム株へ形質転換する。組み換えプ
ラスミドを持つバクテリアを選択し、細胞壁を再生する
アルファルファプロトプラスト（Ｍａｒｔｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ　２７Ｌ：　１２
９−１３１：Ｇ、Ｊ、　Ｗｕｌｌｅ＋＊ｓ　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ＩＡｃａｄ、
　Ｓｃｉ　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７８　：　４３４４−４
３４８　；　Ｒ，Ｂ。

Ｈｏｒｓｃｈ　ａｎｄ　Ｒ，Ｔ、Ｆｒａｌｅｙ　（１８
Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）　１５ｔｈＭｉａｍｉ　Ｗ
ｉｒ＋ｔｅｒ　Ｓｙｎ＋ｐｏｓｉｕｍ　）と−緒に培養
する。

培養中細胞は成長し、生じたカルスについてスーザンプ
ロッティング（実施例１９）により適当なｍＲＮ＾の存
在を、そしてＩ！ＬＩＳＡ試験（実施例２０）　（Ｊ。

Ｌ、　Ｍａｒｘ　（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９
　：　８３０　；　Ｒ，Ｂ、Ｈｏｒｓｃｌ＋ａｎｄ　Ｒ
，Ｔ、Ｆｒａｌｅｙ　（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３
）　１５ｔｈ　ＭｉａｍｉＷｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｏ＋参照）により適当なタンパクの存在を試験する
。

刊工り一鼠隻再生 それから、＾、Ｖ、Ｐ　Ｄｏｓ　５ａｎｔｏｓ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８０）Ｚ、　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓ
ｉｏｌ、　９９　：　２６１−２７（Ｌ　Ｔ、Ｊ、Ｍｃ
Ｃｏｙａｎｄ　Ｈ，Ｔ、Ｂｉｎｇｈａｍ　（１９７７）
　Ｐｌａｎｔ、Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔｅｒｓ測：　５９−６
６　ａｎｄ　Ｋ、Ａ、　Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（
１９７９）Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１
６　：　２３−３０らによりすでに用いられたのと同様
の方法によりカルス組織からアルファルファを再生させ
る。それからこれらの再生植物、を新しい商品変種につ
いての基礎を形成する型にはまった植物育種の手法によ
り栽培する。

（以下余白） ス［ 全ての例においてＲＮＡを次に示す手順により抽出し分
画し発見する。

１９、Ｉ　ＲＮ　Ａの　１ この手順はＳｉｌｆｌｏｗ旦　ａｌ、（１９８１）　Ｂ
ｉｏ−ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　１３　：　２７２５−２
７３１の修飾型である。塩化セシウム遠心分離のかわり
に、塩化リチウム沈澱を代用するのは＋　Ｍｕｒｒａｙ
　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｅｖｏｌ、　１７　：　３１−４２に示されている。

２Ｍ　塩化リチウムに加えて２Ｍ尿素を沈澱に用いるこ
とはＲｈｏｄｅｓ　（１９７５）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２５：８０８８−８０９７より採用した。

組織を、ポリトンあるいはグラウンドグラスホモジナイ
ザーを用いて、４〜５倍容量の冷５０ｍＭＴｒｉｓＣ１
（ｐＨ８，０）　（４％ｐ−アミノサリシル酸。

１％トリイソプロピルナフタレンスルホン酸、１０ｍＭ
ジチオスレイトール（新しく作る）および１０ｍＭメタ
バイ亜硫酸ソーダ（新しく作る）を含む）中でホモジナ
イズした。　オクタツールは泡立ちを制御するのに必要
に応じて用いられた。　１％８−ヒドロキシキノリンを
含む等量のトリス飽和フェノールをホモジェネートに加
え、乳濁するまで振る。そして２００００〜３００００
ｇで４℃１５分間遠心分離した。上層の水層をクロロホ
ルム／オクタツール（２４：１）で１回抽出し、上記の
ように遠心分離した。それから製塩化リチウムー尿素を
最終濃度がそれぞれ２Ｍとなるように加え、混合物を２
０℃で数時間静置した。そうしてＲＮＡ沈澱物を遠心分
離で落とし、ペレットを分散させる為に２Ｍ塩化リチウ
ムで洗浄した。沈澱物を７０％エタノール−０，３Ｍ酢
酸ナトリウムで洗い、澄んだ溶液になるよう殺菌水に溶
かした。２分の１容量のエタノールを加え、混合物を氷
中１時間、放置した。その後、遠心分離し、余分な多糖
類を除いた。ＲＮＡ沈澱物をそれから１回収し、水、あ
るいは殺菌情無塩、ポＩＪ（Ｕ）緩衝液に再び溶解した
。

１９．２−水茎」旦ム／皇スＬ尤ヱ久入−久旦ヱ上久ラ
フイー ２つのポリ　（Ｕ）セファデックス　（商標：Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ、　ＩｎｃｌＵｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅ
ｎ）緩衝液を用いた。一つは、無塩で、　２Ｏｎ＋Ｍ　
Ｔｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＯ５を
含んでいる。もう一つは一つめの緩衝液に０．１Ｍの塩
化ナトリウムを加えたものである。＾４２６０５におい
て、良好な会合を起こすために＋　２ｘ貯藏緩衝液を作
ることが必要である。そして一部分に塩を加えるべきで
ある。最終濃度にあわせてから、緩衝液をオートクレー
ブにかける。

ポリ　（Ｕ）セファデックスは＋　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　
Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより得
た。１００μｇの期待さえるポリ　（Ｕ）ＲＮＡについ
て１ｇのポリ　（Ｕ）セファデックスを用いた。ポリ　
（Ｕ）セファデックスを、無塩のポリーＵ緩衝液に水和
し、ジャケットをつけたカラムに流し込む。温度を６０
℃に上げ、カラムを無塩緩衝液で２６０ｍｍにおけるベ
ースラインが平滑になるまで洗った。最終的には、カラ
ムを塩を含むポリ　（Ｕ）緩衝液で４０℃で平衡化する
。

濃度が５００μｇ／ｍ１２以下のＲＮＡを無塩緩衝液中
で６５℃、５分間加熱した。その後、冷却し。

塩化ナトリウムを０．１Ｍの濃度になるように加えた。

それから光学濃度が安定なベースラインまで落ちるまで
、流速１ｍｊ！／ｍｉｎ以下で流したカラムにＲＮＡを
移ず。それから、カラム温度を６０°Ｃまで上げ、ＲＮ
Ａを無塩ポリ　（Ｕ）緩衝液で溶出させた。

ＲＮＡは普通３倍のカラム容量で洗い出される。

溶出したＲＮＡを用いやすい容量まで２級ブタノールで
濃縮し、　１０ｍＭになるように塩化ナトリウムを加え
た後、２倍容量のエタノールを加え沈澱させる。エタノ
ール沈澱物を水に溶かし、　ＮＨ４４５−酢酸塩を０．
１Ｍになるよう加える。そしてエタノールで再び沈澱さ
せる。最終的にＲＮＡを殺菌水に再溶解し、−７０℃に
おいて保存する。

１９．３　ホルムアルデヒド　ＲＮＡ　ゲル用いる方法
はＴｈｏｍａｓ　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’
ｌ。

Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　（ＩＪ、Ｓ、Ａ、）　７７　：
　５２０１およびｔｌｏｆｆｍａｎ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、２５６：２５９７によるものである。

２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８〜７．０　）を
含む０．７５〜１．５％のアガロースゲルを固めた。も
し高分子の集合したバンドが現れたら、６％あるいは２
．２Ｍのホルムアルデヒド（３６％の貯蔵溶液ヲ用いる
）を加えて、実験をやり直した。ホルムアルデヒドを、
アガロースに６５℃まで冷やしてから加えた。ホルムア
ルデヒドを加えると臭化エチヂウムにより発見が困難に
なる。泳動緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６
，８〜７．０）である。

電気泳動に先だち、ＲＮＡを最終濃度６％ホルムアルデ
ヒド、５０％ボルムアミド、　２０ｍＦリン酸ナトリウ
ム緩衝液および５ｍＭＥＤＴＡの変性緩衝液で処理した
。ＲＮＡを緩衝液中６０℃で１０〜２０分間保温した。

保温は、停止緩衝液の添加に停止した。

２０μｌのサンプルについて、４μ！５０％グリセロー
ル、　１０ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　５　ｍＭリン酸ナトリ
ウムそしてブロムフェノールブルーを加えた。

浸水した電気泳動を用いる。ゲルを浸す前に。

ＲＮＡをロードした。そして１２５ｍＡで５分間ゲルの
中にいれた。それからゲルを水に浸し、電流を３０ｍＭ
　（夜通し）あるいは５０ｍＭ　（６〜８時間）に下げ
る。

緩衝液を循環させ、低温室で電気泳動を行った。

１９．４　“ノーザン”プロット もし、特異的なＲＮＡを発見するためにプロットするゲ
ルならば、染色しなかった。しかし１分離したマーカー
のレーンは染色に用いた。染色は０．１Ｍ酢酸ナトリウ
ム中５μｇ　／　ｍ　Ｉｔ臭化ブロマイドで行い、脱染
は、　０．１Ｍ酢酸ナトリウム中数時間行った。染色の
前に、５〜１０分間６０〜７０℃の水で処理すると視認
が容易になった。

プロットするゲルを１５分間１０ｘ標準サリンクエン酸
（ＳＳＣ）　−３％ホルムアルデヒドに浸した。

もし、大きなＲＮＡに切れ目を入れるために５（ｌｎＭ
水酸化ナトリウム中１０〜３０分間処理した。もし。

基礎処理を用いたのなら、プロットする前に、ゲルを中
和し、５ＳＣ−ホルムアルデヒドに？ｌ−べきである。

ＲＮＡのニトロセルロースへの転移は標準方法により行
った。

プレハイブリダイゼーションを４２℃で最低４時間、５
０％ホルムアルデヒド、１０％硫酸デキストラン＋　５
ｘＳＳＣ，５ｘデンハート、　１００　、ｌｊｇ　／　
ｍｉ！変性キャリアーＤＮＡ、２０μｇ／ｍｌｌポリ　
（Ａ）。

４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８〜７．０　＞　
、　０．２％ＳＤＳ中で行った。ハイブリダイゼーショ
ンをプローブと同じ緩衝液に加え、−晩保温して行った
。

プローブは大体５ｘ１０５５４　ｃ、ｐ、ｍ、／　ｒａ
ｉ１以上の濃度で用いた。

ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロースを、４２
℃で２ｘＳ　Ｓ　Ｃ，２５ｍＭリン酸ナトリウム、　５
ｍＭＦ、ＤＴＡ、２ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液を用
いて何度も洗った。最後に、６４℃で２０分間１ｘＳＳ
Ｃで洗った。

もし、オートラジオグラフィーに際して、フィルターが
乾燥していなくて、また、プローグ１ｍＭＥＤＴＡによ
り６４℃で広範囲に洗ったことで除かれているのなら、
最上の結果が得られた。

叉旌炭叉襄 “ウェスタン”プロット（ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後、抗原を発見するために行う）は９本質的
にはＲ，Ｐ、Ｌｅｇｏｃｋｉ　ａｎｄ　Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖ
ｅｒｍａ（ｉ９８１）＾ｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、１１１　：　３８５−３９２に示されているのと同様
に行った。

マイクロ−Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉ
ｎｋｅｄ　１ｍｍｎｎｏ−５ｏｒｂａｎｔ　ａｓｓａｙ
　）を９６個のウェル（ｗｅｌｌ）をもつＩＩＩｌｍｕ
ｌｏｎ−２型プレートを用いて次に示すステップにより
行った。

２０．１　プレートへのｒ体の結入 −日目、ウェルをコーティング緩衝液で１：１０００に
希釈した。抗体（ウサギ抗ファセオリンＩｇＧ　）でコ
ート（ｃｏａｔ）　シた。２００　＃　１．　／ｗｅｌ
ｌで３７℃で２〜４時間、保温した。プレートをサラン
ラップでおおった。それから、プレートをリン酸緩衝液
すリンーツィーン（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｔ＋ｅｅｎ　）で
３回洗った。各々の洗いのステップは５分間あけた。そ
れから１％のボバインセーラムアルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ
）を洗いのために加え、２０分間放置してから捨てた。

洗いはＰ　Ｂ　５−Ｔｎｅｅｎを用いて５回以上１行っ
た。

２０．２　”のホモジェナイジング 組織を、小片に切ってから、ポリトロンによりＩｇの組
織／ｍβリン酸緩衝液サリす−ツィーン−２％ポリビニ
ルピロリドン−４０（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ−２％
Ｐ　Ｖ　Ｐ−４０）の条件でホモジェナイズした。

すべてのサンプルは、破砕前後およびファセオリン標準
曲線の作成の前後に水中で保存した。組織のホモジェネ
ートで標準曲線を作成した。そして。

組織に依存するファセオリンの回収をチェックするため
に緩衝液で標準曲線を作った。ホモジェナイズしたサン
プルを遠心分離した後、各々のサンプルのうち１００μ
ｌをウェルに入れ、４℃で一晩放置した。失敗を避ける
ために各々のサンプルについて２個同じことをした。保
温中、プレートはシールした。

昶バＬ」１１列直企 一晩保温後、抗原を捨て、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
で５回洗う。各々の洗いの間に５分間の間隔をおいた。

結合物（ウサギ抗ファセオリンＩｇＧアルカリフォスフ
ァターゼ結合）をＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ−−２％ｐ
ｖＰ　（０，２％　ＢＳＡを含む）テ１：３０００ニ希
釈し、１５０μｌを各ウェルに加えた。そして、３７℃
で３〜６時間保温した。保温後、結合物を捨て、ウェル
をＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで５回洗う。各々の洗いの間
に５分間の間隔を置く。

匹」−分析 分析を始める直前に、ｐ−ニトロフェニルフォスフエイ
トの５ｎ＋Ｈの錠剤（Ｓｉｇｍａより得た。そして暗所
で凍結保存）を、１０ｍｊ！の基質に加え９錠剤が溶解
するまで攪拌する。２００μｌの室温溶液をすばやく各
ウェルに加える。反応を種々の時間（例えば、ｔ＝０．
１０．２０．４０．６０．９０．１２０分）においてｄ
ｙｎａｔｅｃｈ　ｍ１ｃｒｏ−ｅｌｉｓａ　ｒｅａｄｅ
ｒ用いて測定する。

ｐ−ニトロフェニルフォスフェート（無色）がアルカリ
フォスファターゼにより無機リン酸とｐ−ニトロフェノ
ールに加水分解されるとｐ−ニトロフェノールが溶液に
黄色を与える。それは、４１０ｎｍにおけるスペクトロ
メトリカリ−によむことができる。

発見できる最小量は０．　ｌｎｇより小である。

大施洟１上 三組交雑は、一般的に２次に示すように行われた。当業
者に知られた他の変法も用いることができる。

旦、　ｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２（ｐＲＫ２９０に基礎をお（
シャトルベクター）を旦、延（ｐＲＫ２０１３　）およ
びストレプトマイシンに耐性な人、　ｔｕ＋ｎｅｆａｃ
ｉｅｎｓ株と交雑した。ｐＲＫ２０１３は、シャトルベ
クターを持つ株に移り、　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｄｍ
へ移入するためのシャトルベクターを作った。ストレプ
トマイシンおよびシャトルベクターが耐性である薬剤（
だいたいカナマイシンか、クロラムフェニコール）の両
方ヲ含む培地で成育するものの中からシャトルベクター
配列を有する。＾ｇｒｏｂａｃ　ｔｅｒ　ｉｕｍの細胞
を選択した。

これらの細胞とＥ、　ｃｏｌｔ　（ｐＰＨＩＪｌ）との
交雑によりＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞にｐＰＨＩ
Ｊｌが移った。ｐＰＨＩＪｌとｐＲＫ２９０に基礎を置
くシャトルベクターは同一細胞内に長時間、共在するこ
とができない。ゲンタマイシン（ｐｐＨ１Ｊ１が耐性遺
伝子をもつ）を含む培地で成育させれば、　ｐＲＫ２９
０配列の欠落した細胞を選択することができた。

ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンおよびカナマ
イシンあるいはクロラムフェニコールに耐性な細胞のみ
がシャトルベクターと二重相同部位組み換えをおこした
Ｔｉプラスミドを持ち、望みの構成をもっている。

（以下余白） 表２

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＴｉ　１５９５５のＴ−ＤＮＡ領域を示す説
明図、第２図はオクトピシンセターゼ遺伝子の塩基配列
図、第３図（第３図−１と第３図−２として表示）はフ
ァセオリン遺伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列図、第４図
はツバリンシンセターゼ遺伝子の完全塩基配列図、第５
図はｐＫＳ−ｎｏｐ　Ｎの構造を示す説明図、第６図は
ｐＫＳ−Ｎｏｐ　１ＶＫＢ３．８　（７）作成と構造を
示す説明図、第７図はｐ）［５４−Ｋｎの構造を示す説
明図、第８図はシャトルベクター　ｐＮＮＮｌの構造を
示す説明図、第９図はｐＮＮＮ２の作成とその構造を示
す説明図、第１０図（第１０図−１と第１０図−２とし
て表示）はｐ４０１の右側にｃｌａ　１部位のある旧ｎ
ｄｌ［［部位からの塩基配列図、第１１図はｐＴｉ１５
９５５の構造を示す説明図、第１２図はｐ）［５−Ｐｒ
ｏ　Ｉの作成を示す説明図、第１３図はｐ７．２の構造
を示す説明図、第１４図はｐＫＳ−Ｐｒｏ　Ｉ−ＫＢの
構造を示す説明図、第１５図はファセオリン貯蔵タンパ
ク遺伝子の構造を示す説明図、第１６図はｐ３．８の構
造を示す説明図、第１７図はｐＢＲ３２２の構造を示す
説明図、第１８図はｐＭＳ−４の構造を示す説明図、第
１９図はｐＭＳ−ＫＢ３．８の構造を示す説明図、第２
０図はｐＫＳ４−ＫＢ２．４の作成手順を示す説明図、
第２１図はｐＫＳ４−ＫＢ２．４の構造を示す説明図、
第２２図はファセオリンんの遺伝的環境へのファセオリ
ンｃＤＮＡのクローニングを示す説明図、第２３図ｐＬ
−Ｂの作成を示す説明図。 第２４図はｐＫｓ−Ｐｒｏ　Ｉ　Ａの構造を示す説明図
、第２５図はｐＬＫ−Ｐｒｏ　Ｉ　Ａの構造を示す説明
図、第２６図はｐＫＳ−５の作成を示す説明図、第２７
図はｐＭＳ−ｏｃｔ。 Ｃａｍ２０３の作成を示す説明図、第２８図はｐＭＳ−
ｏｃｔ。 ｄｅｌ　ｍの構造を示す説明図、第２９図はｐＫｓ−ｏ
ｃｔ。 ｄｅｌ　Ｉの構造を示す説明図、第３０図はｐＲＫ２９
０の構造を示す説明図、第３１図はｐ２ｆの作成を示す
説明図、第３２図はｐ３ｅの作成を示す説明図、第３３
図はｐＫＳ−ｏｃｔ、ｄｅｌ　ｍの作成を示す説明図、
第３４図はｐＫｓ−６の作成を示す説明図、第３５図は
ｐ２の作成を示す説明図、第３６図はｐＫｓ−ｏｃｔ、
ｄｅｌ　ｎ［ａの作成を示す説明図、第３７図はｐ２０
３のＨｐａ　Ｉ部位のＢｇｌ　ＩＩ部位への変換を示す
説明図、第３８図はｐＫＳ−ｏｃｔ。 ｔｍｒの構を示す説明図、第３９図は実施例１１．１２
゜１４のプラスミドの構造を示す説明図、第４０図は遺
伝子コードを説明する説明図、第４１図は大腫瘍遺伝子
の塩基配列図、第４２図はｐ２０３構造を示す説明図、
第４３図はｐＫｓ−ｎ＋１−ＫＢ３．０の構造を示す説
明図である。 以上 代理人　弁理士　山本秀策 ０　０　０　０　８ −８８８８８ ０ｏ　Ｏｏ　８　８　８　８ ｏ　ｇ　ｇ　ｇ　ε　＝　Ｘ　＝ ７　ｆｆｌ　ｍ？、ｌ”ｌ　ｗｅ、ツ　ｉ　ツ　ｉ　電
　ｉ　ツ　ｉ　ツ　ｉミ　ｇ　よ　こ　た　丞　に　舌
　ミ　后　た　ｇ　ミ　吉　よ−υ　−ｕ　ｘ　ｕ　−
ｕ　−ｕ　＋　ｕ　−υ　−８　８８８　８　０　８ ｍ　Ｎ　Ｍ　璧　Ｌｌ’＋　ψ　ト ロ　８ ０　８　８　８　。 ｃｏ　小　−−−Ｈ ｏ　８　８　８　８ ＦＩＧ、５ ８　。 ｏ　８ Ｌｌ’ｌ　ｔｏ　Ｎ ８　８　８ ８　８　８ ０　８　基 ＦＩＧ、　１６ ｐＢＲ３２２ρＫＳ−４ ＦＩＧ、　１７　ＦＩＧ、　１８ ＦＩＧ、　＋９ の ＦＩＧ、　２４ Ｂｃｌ　ｒ　Ｂｃｌ工 ｐＫＳ−４Ｈｉｎｄ　ｍ７ ＢａｍＨ工断片 日Ｉ ＦＩＧ、　２８ ＦＩＧ、　２９ ＦＩＧ、　３０ ヒ　エ 其　和　３号 ―＋／＋　ｊ；Ｆ　蓄ＨＨＥ イトム　タナ　ドラ４１ ０発　明　者　デニス　ダブリュ、サ　アメリカ合衆国
ットン　ランド、アルベ ライスコンシン　５３７１４　マジソン、し０１０ ライスコンシン　５３５５８　マツクファー／　アベニ
ュー　５６１１ ライスコンシン　５３７０３　マジソン、ウム　ストリ
ート　１３８ 手続補正書く方式） 昭和５９年８月２３日 昭和５９年特許願第７７４５２号 ２、発明の名称 植物構造遺伝子の発現 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　コロラド　８０３０１−２２４
４ボールグー、ミンチエル　レーン　３３７５名称　ア
グリジェネティクス　リサーチコーポレーション 代表者　ゾール　ジェイ、ハンセン 国籍　アメリカ合衆国 ４、代理人　〒５３０ 住所　大阪府大阪市北区西天満４丁目３番１７号６、補
正により増加する発明の数二〇 ７、補正の対象 （１）願書の出願人の欄 （２）委任状 （３）明細書の発明の詳細な説明の欄 （４）図面 ８、補正の内容 ＋ｌ）願書および委任状については別紙のとおり（２）
明細書第１３２頁から１３４只の表１および１３５頁の
表２の浄書・別紙のとおり（内容に変更なし） （３）第２図、第３図、第４図、第ｉ０図、第１５図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．７−ＤＮＡプロモーターの支配下で挿入された植物
   構造遺伝子をもつＴ−ＤＮＡを含むＤＮＡベクター。 ２、前記植物構造遺伝子はイントロンを持つ特許請求の
   範囲第１項に記載のＤＮＡベクター。 ３、前記植物構造遺伝子は、　ｔｍｒ　、　ｔｍｌ　＋
   　Ｌｍｓ　＋ツバリンシンセターゼ、オクトピンシンセ
   ターゼあるいは”１．６”転写物からなるＴ−ＤＮＡ遺
   伝子の群から選択されたプロモーターの支配下にある特
   許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡベクター。 ４、前記植物構造遺伝子はｃＤＮＡを含む特許請求の範
   囲第１項に記載のＤＮＡベクター。 ５、前記Ｔ−ＤＮＡが展あるいは」Ｌの変化あるいは欠
   失により修飾をうけている特許請求の範囲第１項に記載
   のＤＮＡベクター。 ６．７−ＤＮＡプロモーターの支配下で挿入された植物
   構造遺伝子をもつＴ−ＤＮＡを含むＤＮＡベクターを有
   し、かつ複製するバクテリア株。 ７、前記植物構造遺伝子はイントロンを持つ特許請求の
   範囲第６項に記載のバクテリア株。 ８、前記植物構造遺伝子は、ハＬ、田し、旦と。 ツバリンシンセターゼ、オクトピンシンセターゼあるい
   は”１．６”転写物からなるＴ−ＤＮＡ遺伝子の群から
   選択されたプロモーターの支配下にある特許請求の範囲
   第６項に記載のバクテリア株。 ９、前記植物構造遺伝子はｃＤＮＡを含む特許請求の範
   囲第６項に記載のバクテリア株。 １０、前記Ｔ−ＤＮＡが展あるいは展の変化あるいは欠
   失により修飾をうけている特許請求の範囲第６項に記載
   のバクテリア株。 １１、アグロバクテリウム・チューメファシェンスある
   いはアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む特許請求の
   範囲第６項に記載のバクテリア株。 １２、前記ＤＮＡベクターはＴ−ＤＮＡを含みがつＴ−
   ＤＮＡプロモーター支配下で挿入された植物構造遺伝子
   を有し、そしてｐＫＳ　４　、　ｐ３．８．　ｐｃＤＮ
   Ａ３１あるいはｐＰＶＬ　１３４の群から選択される特
   許請求の範囲第６項に記載のバクテリア株。 １３、１ａｌＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａプロモーターを含むＴ−
   ＤＮＡへ植物構造遺伝子を挿入し、該プロモーターと該
   植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植
   物細胞内で植物構造遺伝子が発現するような位置と方向
   にあり、それにより、Ｔ−ＤＮＡと植物構造遺伝子との
   結合を形成する工程１次いで。 （ｂｌ該Ｔ−ＤＮＡ／植物構造遺伝子の結合物を植物細
   胞に移入する工程 を包含する植物細胞の遺伝的修飾方法。 １４、前記工程（ｂ）の実行後に、さらに、（Ｃ）前記
   Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺伝子結合物を含む
   植物細胞内での植物構造遺伝子の発現を検知する特許請
   求の範囲第１３項に記載の方法。 １５、前記植物構造遺伝子は１つあるいはそれ以上のイ
   ントロンを含む特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 １６、前記植物構造遺伝子は種子貯蔵タンパクをコード
   している特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 １７、前記植物構造遺伝子はフオセオリンをコードして
   いる特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 １Ｂ、前記Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺伝子結
   合物は前記工程（ｂｌに先立ってシャトルベクターの一
   部分として保存され複製される特許請求の範囲第１３項
   に記載の方法。 １９、前記工程（ｂｌのプロモーターは釦り、ハＬ。 虱、ツバリンシンセターゼ、オクトピンシンセターゼお
   よび”１．６”転写物からなる群から選択される特許請
   求の範囲第１３項に記載の方法。 ２０、前記植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ構造遺伝子へ融
   合されており、そのことにより前記Ｔ−ＤＮＡ構造遺伝
   子／植物構造遺伝子結合物がＴ−ＤＮＡにコードされる
   タンパクと植物のタンパク配列とを含む融合タンパクを
   特徴とする特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 ２１、前記細胞は双子葉植物からのものである特許請求
   の範囲第１３項に記載の方法。 ２２、前記双子葉植物はコンポジテあるいはレグミノシ
   の一員である特許請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３、　（ａｌＴ−ＤＮＡプロモーターを含むＴ−ＤＮ
   Ａへ植物構造遺伝子を挿入し、該プロモーターと該植物
   構造遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物細
   胞内で植物構造遺伝子が発現するような位置と方向にあ
   り、それにより、Ｔ−ＤＮＡと植物構造遺伝子との結合
   を形成する工程１次いで、（ｂ）該Ｔ−ＤＮＡ／植物構
   造遺伝子の結合物を植物細胞に移入する工程を包含する
   植物細胞の遺伝的修飾方法により作られた植物、植物組
   織あるいは植物細胞。 ２４、前記工程ｔｂｌの実行後に、さらに、（Ｃ）前記
   Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺伝子結合物を含む
   植物細胞内での植物構造遺伝子の発現を検知する特許請
   求の範囲第２３項に記載の植物、植物組織あるいは植物
   細胞。 ２５、前記植物構造遺伝子は１つあるいはそれ以上のイ
   ントロンを含む特許請求の範囲第２３項に記載の植物、
   植物組織あるいは植物細胞。 ２６、前記植物構造遺伝子は種子貯蔵タンパクをコード
   している特許請求の範囲第２３項に記載の植物、植物組
   織あるいは植物細胞。 ２７、前記植物構造遺伝子はフォセオリンをコードして
   いる特許請求の範囲第２３項に記載の植物。 植物組織あるいは植物細胞。 ２８、前記Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺伝子結
   合物は前記工程（ｂ）に先立ってシャトルベクターの一
   部分として保存され複製される特許請求の範囲第２３項
   に記載の植物、植物組織あるいは植物細胞。 ２９、前記工程（ｂ）（７）プロモーターはｔｍｒ　、
   　ｔｍｌ　。 展、ツバリンシンセターゼ、オクトピンシンセターゼお
   よび１．６”転写物からなる群から選択される特許請求
   の範囲第２３項に記載の植物、植物組織あるいは植物細
   胞。 ３０、前記植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ構造遺伝子へ融
   合されており、そのことにより前記Ｔ−ＤＮＡ構造遺伝
   子／植物構造遺伝子結合物がＴ−ＤＮＡにコードされる
   タンパクと植物のタンパク配列とを含む融合タンパクを
   特徴とする特許請求の範囲第２３項に記載の植物、植物
   組織あるいは植物細胞。 ３１、前記細胞は双子葉植物からのものである特許請求
   の範囲第２３項に記載の植物、植物組織あるいは植物細
   胞。 ３２、前記双子葉植物はコンポジテあるいはレグミノシ
   の一員である特許請求の範囲第３１項に記載の植物、植
   物組織あるいは植物細胞。 （以下余白）