JPH07163356A - 植物細胞の遺伝的修飾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 植物細胞の遺伝的修飾方法を提供する。 【構成】 (a)Ｔ−ＤＮＡプロモーターを含むＴ−ＤＮ
Ａへ植物構造遺伝子を挿入し、該プロモーターと該植物
構造遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物細
胞内で植物構造遺伝子が発現するような位置と方向にあ
り、それにより、Ｔ−ＤＮＡと植物構造遺伝子との結合
を形成する工程、次いで、(b)該Ｔ−ＤＮＡ／植物構造
遺伝子の結合物を植物細胞に移入する工程、を包含す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は植物細胞の遺伝的修飾方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】シャトルベクター RuvkunとAusubel（1981）Nature 298：85ー88、により
開発されたシャトルベクターは、外来遺伝物質を、大プ
ラスミド、ウイルスまたはゲノムの選ばれた位置に挿入
する方法を可能とする。大プラスミド又はゲノムを扱う
場合、２つの主要な問題がある。１つは大プラスミド
が、各制限酵素に対して多くの部位を有することであ
る。特定の部位特異的切断反応は再現性がなく、多部位
切断反応とそれに続く連結は、変化させたくない多くの
フラグメントの順序および方向を混乱させる大きな難点
を生ずる。第２に大ＤＮＡプラスミドを用いた形質転換
効率は非常に低い。シャトルベクターは、しばしばイン
ビトロで、外来遺伝物質を小プラスミドに容易に挿入
し、次に通常インビボ技術により、大プラスミドに移す
ことにより、これらの困難を打開することが可能であ
る。

【０００３】シャトルベクターは、究極の受容細菌へ導
入され得る通常プラスミドである、ＤＮＡ分子より成
る。それはまた、外来遺伝物質が挿入され得る受容ゲノ
ムのフラグメントのコピーと、これもまた受容ゲノムフ
ラグメントに挿入される選択形質をコードするＤＮＡセ
グメントを含む。選択形質（"マーカー"）は、トランス
ポソン突然変異誘発または制限酵素とリガーゼにより容
易に挿入される。

【０００４】該シャトルベクターは究極受容細胞、典型
的にはアグロバクテリウム属の細菌ヘ三親交雑（Ruvkun
とAusubel 、前出）、二親交雑での自己可動性ベクター
の直接移送、アグロバクテリウム細胞による外部ＤＮＡ
の直接取込み（M.Holsterset al.（1978）Molec. Gen.
Genet. 163：181-187 の条件を用いる"形質転換"）、他
の細菌細胞とアグロバクテリウムのスフェロプラスト融
合、リポソーム包括ＤＮＡの取込み、またはインビトロ
でパッケージ可能なウイルス上にあるシャトルベクター
の感染、により導入される。三親交雑はプラスミド可動
と接合移送に関する遺伝子を有する可動性プラスミドを
有する菌株とシャトルベクターを有する菌株との交雑を
含む。もしシャトルベクターがプラスミド遺伝子により
移動可能ならば、そのシャトルベクターは大ゲノム、例
えばアグロバクテリウム菌株のTiまたはRiプラスミドを
有する受容細胞へ移される。

【０００５】シャトルベクターが受容細胞へ導入された
後、マーカーのいずれか一方の側での１回の組換えを伴
う二重乗換えが期待される。この現象はマーカーを含む
ＤＮＡセグメントを受容ゲノムへ移し、挿入物を欠く相
同セグメントと置換し得る。元のシャトルベクターを欠
失した細胞を選択する為に、そのシャトルベクターは究
極受容細胞中で複製が不可能であるか、受容細胞に既存
の独立に選択可能なプラスミドと不和合性でなければな
らない。この為の１つの共通的な手段は、シャトルベク
ターと不和合性でかつ他の薬剤耐性マーカーを有する他
のプラスミドを第３の親に備えることである。

【０００６】従って両薬剤耐性で選択すると、生存細胞
はその中でシャトルベクターのマーカーが受容ゲノムと
組換えを起こしたもののみである。もしシャトルベクタ
ーが余分のマーカーを持っていれば、シャトルベクター
と受容プラスミド間での１回の乗換えの結果生じる完全
なシャトルベクターが受容プラスミドに組み込まれたも
のを有する細胞を選択し、排除できる。もし外来遺伝物
質が選択しようとするマーカー内か、近接した位置に挿
入されていれば、同じ二重組換の結果、それは受容プラ
スミドに組み込まれ得る。相同フラグメントのマーカー
内または近接した位置でなく、外来遺伝物質がマーカー
から遠く離れて挿入されている場合、外来遺伝物質とマ
ーカーの間で組換えが起こり、外来遺伝物質を移せない
ことも起こるだろう。

【０００７】シャトルベクターはアグロバクテリウムの
プラスミドの操作に有用であることが証明されている：
D.J.Garfinkel et al.（1981）Cell 27：143-153, A.J.
M.Matzke and M.D.Chilton（1981）J.Molec.Appl.Gene
t. 1：39-49、およびJ.Leemans et al.（1981）J.Male
c. Appl. Genet. 1：149-164を参照のこと、そこではシ
ャトルベクターを"中間ベクター（intermedeate vector
s）"と呼んでいる。

【０００８】アグロバクテリウム−概説 グラム陰性細菌、リゾビウム科のアグロバクテリウム属
には、アグロバクテリウム・チューメファシエンス（A.
tumefaciens）種とアグロバクテリウム・リゾゲネス
（A.rhizogenes）種がある。これらの種は夫々植物のク
ラウンゴール病、毛状根病（hairly root disease）の
原因となる。クラウンゴールは未分化組織の瘤（gall）
化に特徴付けられる。毛根は感染組織での異常な根（ル
ート）の誘導により特徴付けられる奇形腫である。両病
において、異状な増殖植物組織は、植物により正常には
生産されない通常オピンとして知られている、１つまた
はそれ以上のアミノ酸誘導体を生産し、これは感染細菌
により異化される。既知のオピンは３族に分類され、そ
の典型的なメンバーはオクトピン、ノパリン、アグロピ
ンである。異常増殖組織の細胞は培養により増殖可能で
あり、また適当な条件下で形質転換した表現型を保ちつ
つ完全な植物に再生される。

【０００９】アグロバクテリウムのヴィルレント株はア
グロバクテリウム・チューメファシエンスではTi（腫瘍
誘導；Tumor-inducing）プラスミド、アグロバクテリウ
ム・リゾゲネスではRi（ルート誘導；root- inducing）
プラスミドと呼ばれる大プラスミドを有する。これらの
プラスミドを菌から消去すると病原性を失う。Tiプラス
ミドはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる、腫瘍では
宿主植物のゲノム中に組み込まれている領域を含む。Ｔ
−ＤＮＡは数種の転写物をコードしている。突然変異の
研究からこれらのうちのいくつかは腫瘍の増殖の誘導に
関与していることが示された。tml、tmrおよびtms遺伝
子の変異は夫々巨大腫瘍（タバコで）、ルート出現傾
向、シュート誘発傾向を示す。Ｔ−ＤＮＡはまた少なく
とも１つのオピンシンセターゼ遺伝子をコードし、Tiプ
ラスミドは、しばしば、それが合成し得るオピンにより
分類される。各Ｔ−ＤＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモー
ターの支配下にある。このＴ−ＤＮＡプロモーターは真
核生物のプロモーターに構造が類似しており、形質転換
植物細胞でのみ機能するらしい。TiプラスミドはまたＴ
−ＤＮＡ領域外にも遺伝子を担っている。これらの遺伝
子はオピン異化、発癌性、アグロシン感受性、複製、細
菌細胞への自己輸送の機能に関与している。Riプラスミ
ドはTiプラスミドと類似の構造をとっている。植物細胞
の形質転換に関与する一連の遺伝子とＤＮＡ配列は、以
下では形質転換誘導因子（ＴＩＰ）として総合的に呼
ぶ。従ってＴＩＰの名称はTiおよびRiプラスミド両者を
包含する。ＴＩＰの取り込まれたセグメントを、ここで
はＴ−ＤＮＡと称し、TiプラスミドあるいはRiプラスミ
ドに由来している。最近のアグロバクテリウム起因病の
一般的総説はD.J.Marlo(1982)、Adv. Plant Pathol.
1：139-178、L.W.Ream and M.P.Gordon（1982）、Scien
ce 218：854-859,および M.W.Bevan and M.D.Chilton
（1982）、Ann.Reb.Genet. 16：357-384; G.Kahl and
J.Schell（1982）MolecularBiology of Plant Tumorsに
述べられている。

【００１０】アグロバクテリウム−植物組織の感染 植物細胞は既知の多くの方法によりアグロバクテリウム
により形質転換され得る；例えば植物細胞とアグロバク
テリウムとの共存培養；植物の直接感染；植物プロトプ
ラストとアグロバクテリウムスフェロプラストの融合；
植物細胞プロトプラストによる遊離ＤＮＡの取込みによ
る直接形質転換；部分的に細胞壁を再生しているプロト
プラストの完全な細菌による形質転換；プロトプラスト
のＴ−ＤＮＡ含有リポソームによる形質転換；Ｔ−ＤＮ
Ａを保持するウイルスの利用；ミクロインジェクション
等。いずれの方法も遺伝子が確実に発現される限り充分
であり、有糸分裂および減数分裂を通じて安定に伝達さ
れる。

【００１１】植物組織のアグロバクテリウムによる感染
は、当業者には公知の単純な技術である（例えばD.N.Bu
tcher et al.（1980）in Tissue Culture Methods for
Plant Pathologists, eds.：D.S.Ingrams and J.P.Helg
eson、pp.203-208 参照）。植物は種々のどの方法によ
っても傷つけられる、例えば刃で切る、針で穴をあけ
る、あるいは研磨剤で摺るなど。次いで傷口を腫瘍誘導
細菌を含む溶液で感染させる。完全な植物を感染させる
他の方法はジャガイモの塊茎小片（D.K.Anand and G.T.
Herberlein（1977）Amer.J.Bot. 64：153-158）または
タバコ茎の断片（Binns et al.）などの組織の小片を植
えつけることである。誘導後、腫瘍は植物ホルモンを含
まない培地で組織培養され得る。ホルモン非依存性増殖
は形質転換植物組織の典型であり、培養組織の増殖の通
常の条件とは大いに対照的である（A.C.Braun（1956）C
ancer Res.16：53-56）。

【００１２】アグロバクテリウムはまた単離細胞および
培養細胞（Marton et al.（1979）Nature 277：129-13
1）、および単離したタバコ葉肉プロトプラストを感染
し得る。後者の技術では、新しい細胞壁を一部再生させ
る時間をおいた後、一定時間の間アグロバクテリウム細
胞を培養に加え、次いで抗生物質を添加し殺した。Tiプ
ラスミドを保持するアグロバクテリウム・テューメファ
シエンス細胞に接触した細胞のみが、ホルモンを含まな
い培地にプレートしたとき、カルスを形成した。大部分
のカルスはオピン同化に関する酵素活性を有していた。
他の研究者（R.B.Horsch and R.T.Fraley（18 January
1983 15th Miami Winter Symposium）は共存培養によ
り、形質転換しホルモン非依存性増殖するカルスを高頻
度（10％以上）で得、カルスの95％がオピンを作った。
M.R.Davey et al.（1980）in Ingram and Helgeson、前
出、pp.209-219、は、プロトプラスから再生した老細胞
の感染について述べている。

【００１３】植物プロトプラストは、ＴＩＰプラスミド
の直接取込みにより形質転換され得る。M.R.Davey et a
l.（1980）Plant Sci.Lett.18：307-313,およびM.R.Dav
ey et al.（1980）in Ingram and Helgeson、前出、
は、ペチュニアのプロトプラストをポリ-Ｌ-α-オルニ
チン存在下でTiプラスミドで形質転換し、培養によりオ
ピン合成とホルモン非依存性増殖の表現型を示した。そ
の後、ポリエチレングリコールがTi取込みを促進し、特
定のＴ−ＤＮＡ配列がゲノムに取り込まれることが示さ
れた。（J.Draper et al.（1982）Plant and Cell Phys
iol. 23：451-458、M.R.Davey et al.（1982）in Plant
Tissue Culture 1982、ed：A.Fujiwara、pp.515-51
6）。F.A.Krens et al.（1982）Nature 296：72-74、は
同様の結果をポリエチレングリコール次いでカルシウム
ショックによる方法で報告したが、彼らの結果では取り
込まれたＴ−ＤＮＡはTiプラスミド配列の近接部分を含
んでいた。

【００１４】ＤＮＡを取り込ませる他の方法にリポソー
ムの使用がある。ＤＮＡ含有リポソームの調製は、Papa
hadjopoulosの米国特許第4,078,052号と第4,235,871号
にある。Ti−ＤＮＡをリポソームによる導入する方法が
報告されている（T.Nagata et al.（1982）in Fujiwar
a、前出、pp.509-510、および T.Nagata（1981）Mol.Ge
n.Genet.184：161-165）。類似の系に細胞壁を除去した
植物と細菌の細胞の融合がある。この技術の例は S.Has
ezawa et al.（1981）Mol. Gen. Genet.182：206-210に
より報告されているアグロバクテリウムのスフェロプラ
ストによるツルニチニチソウ（Vinca）の形質転換であ
る。植物プロトプラストは細胞壁が不完全なアグロバク
テリウム細胞を取り込むことができる（S.Hasezawa et
al.（1982）in Fujiwara、前出、pp.517-518）。

【００１５】Ｔ−ＤＮＡは２つのプロトプラストの融合
による再生した組織に移り、一方のみが形質転換される
（G.J.Wullems et al.（1980）Theor. Appl.Genet.56：
203-208）。植物の再生の項で詳しく述べるように、Ｔ
−ＤＮＡは減数分裂でも伝わり、単純なメンデル法則に
従って子孫に伝達される。

【００１６】アグロバクテリウム−植物の再生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫瘍
から得られた。A.C.Braun and H.N.Wood（1976）Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 73：496-500、はタバコ奇形腫（ter
atomas）を正常な植物につぎ木し、正常に見える開花し
得るシュートを得た。このシュートは培地におくと、オ
ピン生成能と、植物ホルモン非依存増殖能を保持した。
選択された植物では、これら腫瘍表現型は子孫に伝達さ
れないようで、多分減数分裂の間に消失した（R.Turgeo
n et al.（1976）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73：3562-3
564 ）。自然に腫瘍の性質を失った、あるいは奇形腫の
種から生じた植物は、当初すべてのＴ−ＤＮＡを失った
ように思われていた（F.-M.Yang et al.（1980）In Vit
ro 16：87-92, F.Yang et al.（1980）Molec.Gen.Gene
t.177：707-714、M.Lemmers et al.（1980）J.Mol.Bio
l.144：353-376）。しかし、ホルモン（１mg/l カイネ
チン）処理後復帰した植物を用いた後の研究で、減数分
裂を経た植物は形質転換表現型に関するＴ−ＤＮＡ遺伝
子は失っているが、Ｔ−ＤＮＡの両端に相同性のある配
列を維持していた（F.Yang and R.B.Simpson（1981）Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA 78：4151-4155）。

【００１７】G.J.Wullems et al.（1981）Cell 24：719
-724、はさらに、オピン同化に関する遺伝子が、その植
物は雄性不稔であるが、減数分裂を通して伝わること、
そしておそらくＴ−ＤＮＡはそのままメンデル法則に従
って遺伝し得ることを示した（G.Wullems et al.（198
2）in A.Fujiwara、前出）。L.Otten et al.（1981）Mo
lec.Gen.Genet.183：209-213、は、シュートを生じる腫
瘍生成に tms（シュート誘導）遺伝子座でのTn７トラン
スポソン起因のTiプラスミド変異を用いた。これらのシ
ュートが植物中で再生すると自己稔性花を生じた。着生
した種が発芽した植物はＴ−ＤＮＡを有しオピンを生成
した。tmr（ルート誘導）変異を用いた同様の実験で、
全Ｔ−ＤＮＡが減数分裂を通して子孫に伝わり、これら
子孫で、程度にバラツキがあるが、ノパリン遺伝子が発
現すること、また同時に伝達された酵母のアルコール脱
水素酵素Ｉ遺伝子は発現しないことが示された（K.A.Ba
rton et al.（1983）Cell 32：1033-1043）。Ｔ−ＤＮ
Ａ配列を欠く再生組織はおそらく腫瘍に混在していた非
形質転換細胞の子孫であるらしい（G.Ooms et al.（198
2）Cell 30：589-597）。アグロバクテリウム・リゾゲ
ネスによる形質転換の結果生じたルートは比較的容易に
苗に再生することが示された。（M.-D.Chilton et al.
（1982）Nature 295：432-434）。

【００１８】アグロバクテリウム−TIP プラスミド上の
遺伝子 ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に多数の遺伝子が同定
された。約半ダースのオクトピンプラスミドＴ−ＤＮＡ
転写物がマッピングされ（S.B.Gelvin et al.（1982）P
roc.Natl.Acad.Sci. USA 79：76-80、L.Willmitzer et
al.（1982）EMBO J. 1：139-146）、またいくつかの機
能が明確にされた（J.Leemans et al.（1982）EMBO J.
1：147-152 ）。オクトピン型プラスミドの４つの遺伝
子がtms、tmr およびtmlを含むトランスポソン変異誘発
により充分明確になった（D.J.Garfinkel et al.（198
1）Cell 27：143-153）。これらの遺伝子に変異をもつT
iプラスミドは、ニコチニア・タバカムの腫瘍カルスを
刺激し、シュートを生じ、ルートを生じ、そして正常よ
り大きくなる。他の宿主では、これら遺伝子の変異は、
異なった表現型を誘導し得る（Chilton, M.D. Ann.Rev.
Genet.（1982）参照）。tmsとtmrの表現型は、腫瘍に存
在する植物ホルモンレベルの差異と相関している。サイ
トカイニン：オーキシン比の相違は、非形質転換カルス
組織でシュートまたはルート形成を誘導する培養中のサ
イトカイン：オーキシン比の相違と類似している(D.E.
Akiyoshi et al.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 8
0：407-411）。tmsまたはtmrどちらか一方のみの機能遺
伝子を持つＴ−ＤＮＡ（機能するtmlのみの場合ではな
いが）は、明白な腫瘍増殖を刺激し得る。シュートとル
ートの刺激は機能tmlにより夫々促進と阻害を受ける
（L.W.Ream et al.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 8
0：1660-1664）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子の変異が植物ゲノム
へのＴ−ＤＮＡの挿入に影響することはないようである
（J.Leemans et al.（1982）同上；L.W.Ream et al.（1
983）同上）。オクトピンシンセターゼをコードするocs
遺伝子はH.De Greve et al.（1982）J.Mol.Appl. Gene
t.1：499-511、により塩基配列が決定された。これはイ
ントロン（真核遺伝子に共通して見られる介在配列で転
写後ｍＲＮＡのプロセッシングの間にメッセンジャー前
駆体から除かれる）を有していない。また真核の転写シ
グナル（ＴＡＴＡボックス）とポリアデニル化部位があ
る。オクトピンシンセターゼを有する植物細胞はホモア
ルギニンを無毒化するので、ocs遺伝子は、外来ＤＮＡ
による形質転換された植物細胞の有効な選択マーカーと
なり得る（G.M.S.Van Slogteren et al.（1982）Plant
Mol.Biol. 1：133-142）。

【００１９】ノパリンTiプラスミドはノパリンシンセタ
ーゼ遺伝子（nos）をコードしており、nosは A. Depick
er et al.（1982）J.Mol.Appl.Genet.1：561-573、によ
り配列決定された。ocs遺伝子と同様nosもイントロンが
ない。２つのポリアデニン化部位の候補とＴＡＴＡボッ
クスとなり得る配列がある。ocsと対照的にnosの上流に
はＣＡＴボックスとして知られる転写シグナルらしい配
列がある。J.C.McPhersson et al.（1980）Proc.Natl.A
cad. Sci.USA 77：2666-2670、は、クラウンゴール組織
のＴ−ＤＮＡがコードするｍＲＮＡのインビトロ翻訳を
報告した。

【００２０】毛根Ｔ−ＤＮＡの転写もまた検出された
（L. Willmitzer et al.（1982）Mol.Gen.Genet.186：1
6-22）。機能的には毛根症候群はtmrの変異したTiプラ
スミドによりもたらされるクラウンゴール腫瘍と同等の
ようである（F.F.White and E.W.Nester（1980）J.Bact
eriol.144：710-720）。

【００２１】真核生物において、ＤＮＡのメチル化（特
にシトシン残基の）は転写不活性化と相関している。比
較的メチル化が少ない遺伝子はｍＲＮＡに転写される。
Gelvin et al.（1983）Nucleic Acids Res.1：159-17
4、はクラウンゴール腫瘍のＴ−ＤＮＡは常に少なくと
もメチル化されていない１コピーが存在することを見出
した。同じゲノムがメチル化されている多くの他のＴ−
ＤＮＡコピーを含むということは１つ以上の過剰のＴ−
ＤＮＡのコピーは生物学的に不活性であることを示唆す
る（G. Ooms et al.（1982）Cell 30：589-597 も参
照）。

【００２２】TiプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域の外側にあ
り、感染過程に必要な他の遺伝子をコードしている（ノ
パリンプラスミドについては M.Holsters et al.（198
0）Plasmid 3：212-230,オクトピンプラスミドについて
は H.De Greve et al.（1981）Plasmid 6：235-248、D.
J.Garfinkeland E.W.Nester（1980）J.Bacteriol 144：
732-743、および G.Ooms（1980）J.Bacteriol 144：82-
91参照）。最も重要なのは onc遺伝子で、これが変異す
るとTiプラスミドの発癌性を失わせる（これらの遺伝子
座はビルレンスに関する言葉virとして知られてい
る）。onc遺伝子はトランスに作用し、異なったプラス
ミド型で物理的に他のプラスミドに局在しているＴ−Ｄ
ＮＡでの植物細胞の形質転換を引き起こし得る（J.Hill
e et al.（1982)Plasmid 7：107-118、H.J. Klee et a
l.（1982）J.Bacteriol 150：327-331、M.-D.Chilton
（18 January 1983）15th Miami Winter Symp.）。ノパ
リンTiＤＮＡはTiプラスミドからの切出し、または、宿
主ゲノムへの取込みに関与するらしく、Ｔ−ＤＮＡの左
または右側の境界に極めて隣接している約25塩基対の順
方向繰り返し配列（direct repeat）を有し（N.S.Yadav
et al.（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6322-632
6）、そして類似配列がオクトピンＴ−ＤＮＡ境界に隣
接した場所に見つかっている（R.B.Simpson et al.（19
82）Cell 29：1005-1014）。オピン同化はオクトピンお
よびノパリン型プラスミドの夫々ocsおよびnos遺伝子に
より特徴付けられる。Tiプラスミドはまた複製開始点を
含むそれ自身の増殖に必要な機能をもコードしている。
Tiプラスミド転写物は S.B.Gelvin et al.（1981）Plas
mid 6：17-29、によりアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス細胞中に見出されており、彼らはＴ−ＤＮＡ
領域が非Ｔ−ＤＮＡ配列に沿って弱く転写されることを
見い出した。Tiプラスミドにより支配される性質はMerl
o、前出（特に第２表参照）、およびReam and Gordon、
前出によりまとめられている。

【００２３】アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドＤ
ＮＡ 種々のオクトピン型Tiプラスミドは、互いにほぼ100％
相同性があることがＤＮＡハイブリダイゼーション（T.
C.Currier and E.W.Nester（1976）J.Bacteriol.126：1
57-165）または制限酵素解析（D.Sciaky et al.（197
8）Plasmid 1：238-253）により調べられた。ノパリン
型Tiプラスミドは互いに少なくとも67％相同性がある
（Currier and Nester、前出）。種々のRiプラスミドは
互いに非常に相同性があることが明らかとなった（P.Co
stantino et al.（1981）Plasmid 5：170-182）。N.H.D
rummond and M.-D.Chilton（1978）J.Bacteriol.136：1
178-1183、は、オクトピンおよびノパリン型Tiプラスミ
ドは比較的狭い部分に互いに相同性があることを示し
た。これらの相同性は、G.Engler et al.（1981）J.Mol
Biol.152：183-208、により詳しくマップされた。それ
らは、４つの類似領域の３つが、更に３（Ｔ−ＤＮＡに
またがる）、４（特定のonc遺伝子を含む）、および９
（onc遺伝子を有する）の類似領域に細分化されること
を見出した。連結している相同領域は、少なくともtra
遺伝子（Tiプラスミドの他の細菌細胞への接合伝達に関
与する）と、複製および不和合性に関する遺伝子とを含
む。この領域はリゾビアッシー科の別の属であるリゾビ
ウムの一種から分離されたSymプラスミド（共生窒素固
定に関与する）と相同性がある（R.K.Prakash et al.
（1982）Plasmid 7：271-280）。４つの領域の順序は保
存されていないが、いずれも同一方向に配置している。
Ｔ−ＤＮＡ配列の一部はノパリンおよびオクトピンプラ
スミド間で極めて良く保存されている（M.-D. Chilton
et al.（1978）Nature 275：147-149、A.Depicker et a
l.（1978）Nature 275：150-153）。Riプラスミドはそ
れらの間、およびオクトピン（F.F.White and E.W.Nest
er（1980）J.Bacteriol.144：710-720）とノパリン（G.
Risuleo et al.(1982)Plasmid 7：45-51）の両Tiプラス
ミドにはかなり相同性がある。その領域はおもにonc遺
伝子をコードしている領域である。RiＴ−ＤＮＡはTiプ
ラスミドの両型のＴ−ＤＮＡに弱いながらも、かなり相
同性がある（L.Willmitzer et al.（1982）Mol.Gen.Gen
et.186：3193-3197）。未感染のニコチニア・グラウカ
の植物ＤＮＡは、ｃＴ−ＤＮＡ（細胞のＴ−ＤＮＡ）と
呼ばれる配列を含んでおり、RiＴ−ＤＮＡの一部と相同
性がある（F.F.White et al.（1983）Nature 301：348-
350）。

【００２４】Ti（M.-D.Chilton et al.（1977）Cell 1
1：263-271）またはRi（M.-D.Chilton（1982）Nature 2
95：432-434、F.F.White et al.（1982）Proc. Natl.Ac
ad.Sci. USA 79：3193-3197、L.Willmitzer（1982）Mo
l.Gen.Genet. 186：16-22）プラスミドの一部分は、腫
瘍植物細胞のＤＮＡに見出される。転移したＤＮＡはＴ
−ＤＮＡとして知られている。Ｔ−ＤＮＡは核内（M.P.
Nuti et al.（1980）Plant Sci.Lett. 18：1-6、L.Will
mitzer et al.（1980）Nature 287：359-361、M.-D.Chi
lton et al.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77：406
0-4064）の宿主ＤＮＡ（M.F.Thomashow et al.(1980)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 77：6448-6452、N.S.Yadav et a
l.（1980）Nature 287：458-461）に取り込まれる。

【００２５】M.F.Thomashow et al.（1980）Proc.Natl.
Acad.Sci. USA 77：6448-6452、および M.F. Thomashow
et al.（1980）Cell 19：729-739、は、オクトピン型T
iプラスミドのＴ−ＤＮＡが、Ｔ−ＤＮＡの左と右の夫
々ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡの２つの別の場所に
取り込まれることを見出した。ＴＲおよびＴＬのコピー
数は変動し得る（D.J.Merlo et al.（1980）Molec.Gen.
Genet.177：637-643）。Ｔ−ＤＮＡの中芯（core）は、
ノパリンＴ−ＤＮＡと相同性が高く（Chiltonet al.（1
978）前出、およびDepicker et al.（1978）前出）、腫
瘍維持に必要で、ＴＬに見られ、一般的に細胞当り１コ
ピー存在し、そしてtms、tmr およびtml遺伝子をコード
する。他方、ＴＲはコピー数は多い（D.J.Merlo et al.
(1980)前出）が、まったく不要である（M.De Beuckelee
r et al.（1981）Molec.Gen.Genet.183：283-288、G.Oo
ms et al.（1982）Cell 30：589-597）。G.Ooms et al.
（1982）Plasmid 7：15-29 によれば、ＴＲがTiプラス
ミドから欠失してもアグロバクテリウム・チューメファ
シエンスはヴィルレンスを保っているが、ＴＲがＴ−Ｄ
ＮＡ取込みに関与すると想定されている。G.Ooms et a
l.（1982）Cell 30：589-597により、Ｔ−ＤＮＡは植物
ゲノムに取り込まれた後、時として欠失するが、一般に
安定であること、またＴ−ＤＮＡ構成が異なる混成細胞
を含む腫瘍は、複数の形質転換現象の結果であることが
示された。 ocsはＴＬに存在する。しかし、腫瘍増殖に
関連する表現型を失うことなく植物ゲノムから欠失させ
得る。組み込まれたＴＬの左端は順または逆向きの繰り
返しＴ−ＤＮＡ配列から成る（R.B.Simpson et al.（19
82）Cell 29：1005-1014）。

【００２６】オクトピン型腫瘍の状況とは対照的にノパ
リンＴ−ＤＮＡは一連のフラグメントで宿主ゲノムに組
み込まれる（M.Lemmers et al.（1980）J.Mol.Biol.14
4：353-376、P.Zambryski et al.（1980）Science 20
9：1385-1391）。順方向繰り返し配列が観察された。奇
形腫から生じた植物のＴ−ＤＮＡは、挿入ＤＮＡの端の
フラグメントにわずかな修飾がある（Lemmers et al.、
前出）。右端と左端の間の結合部の配列の解析から多く
の順繰り返し配列と１つ逆繰り返し配列が明らかになっ
た。後者は結合部にまたがっている（Zambryski et al.
（1980）前出）。左側の結合部は少なくとも70塩基対
（bp）が変動すること、一方、右結合部は１bpのみの変
動である（P.Zambryski et al.（1982）J.Molec.Appl.G
enet.1：361-370 ）ことが示された。繰り返し配列の結
合部の左および右端は、130bp以上のスペーサーにより
分断されている。このスペーサーの由来は不明であり、
特定のＴ−ＤＮＡ配列を含んでいる。Ｔ−ＤＮＡは繰り
返し配列と低コピー数宿主配列の両者に組み込まれてい
る。

【００２７】N.S.Yadav et al.（1982）Proc.Natl.Aca
d. Sci. USA 79：6322-6326、は、Ｔ−ＤＮＡの左端の
すぐ外側のノパリンTiプラスミド内にchi部位を見出
し、これはバクテリオファージλで10Kbp離れているま
わりのＤＮＡで一般組み換えを増大させる。R.B.Simpso
n et al.（1982）Cell 29：1005-1014、は、オクトピン
Tiプラスミド内にchi配列を見出さなかったが、配列を
決定した領域の外側に存在する可能性を排除できない。
Tiプラスミドでのchiの意義は不明である。もしchiが機
能を有しているとすれば、chiがＴ−ＤＮＡ内にないの
で、恐らく植物ではなくアグロバクテリウム細胞内で用
いられているだろう。

【００２８】アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドの
操作 シャトルベクターの項で詳しく述べるように、変化させ
たＤＮＡ配列をＴＩＰプラスミドの望みの場所に導入す
る技術が開発された。トランスポソンはこの技術で容易
に挿入される（D.J.Garfinkel et al.（1981）Cell 2
7：143-153）。J.-P.Hernalsteen et al.（1980）Natur
e 287：654-656、は、TiプラスミドのＴ−ＤＮＡに挿入
されたＤＮＡ配列（ここでは細菌のトランスポソン）
が、受容植物ゲノムへ移され取り込まれることを示し
た。種々の起源の多くの外来ＤＮＡが挿入されたが、こ
れまで、その遺伝子は自身のプロモーターの支配下で発
現しなかった。これらの遺伝子には酵母のアルコール脱
水素酵素（Adh）（K.A.Barton etal.（1983））、トウ
モロコシのAdhI（J.Bennetzen、未発表）とゼイン、哺
乳類のインターフェロンとグロビン、哺乳類のウイルス
SV40（J.Schell、未発表）などがある。M.Holsters et
al.（1982）Mol.Gen.Genet.185：283-289、によれば、
Ｔ−ＤＮＡに挿入された細菌のトランスポソン（Tn７）
が植物ゲノムに取り込まれた後、完全な機能を有し、多
分変化していない形で回収された。

【００２９】ＴＩＰプラスミド内で欠失を種々の方法で
生成し得る。シャトルベクターを標準の組み換えＤＮＡ
技術でつくられた欠失の導入に用いることができる（Co
henand Boyer US Pat. 4,237,224）。前もって決められ
た一方の端の欠失はトランスポソンの誤った切出しによ
り作成し得る（B.P.Koekman et al.（1979）Plasmid
2：347-357、G.Ooms et al.（1982）Plasmid 7：15-2
9）。J.Hille and R.Schilperoot（1981）Plasmid 6：1
51-154は、前もって決められた位置での両端を有する欠
失が、２つのトランスポソンを用いて作成し得ることを
示した。この技術はまたインビボで"組み換えＤＮＡ分
子"の構築に用いられる。

【００３０】ノパリンシンセターゼ遺伝子が、形質転換
された植物細胞を選択するのに用いられる薬剤耐性をコ
ードするＤＮＡセグメントの挿入に用いられた。M.Beva
n（M.D.Chilton et al.（18 January 1983）15th Miami
Winter Symp.、により報告された；およびJ.L.Marx（1
983）Science 219：830 参照）とR.Horsch et al.（（1
8 January 1983）15th Miami Winter Symp.、およびMar
x、前出、参照）は、Tn5のカナマイシン耐性遺伝子（ネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼ）をノパリン
プロモーターの後に（その制御下に）挿入した。その作
成には、培養でカナマイシンおよびG418 のようなアナ
グロ耐性になるよう植物細胞を形質転換する方法がとら
れた。J.Schell et al.(18January 1983）15th Miami W
interSymp.（Marx、前出、も参照）は同様の作成法を報
告し、そこではTn7のメトトレキセート耐性遺伝子（ジ
ハイドロフォレートレダクターゼ）が、ノパリンシンセ
ターゼプロモーターの後につながれた。形質転換細胞は
メトトレキセート耐性であった。オクトピンシンセター
ゼを有する植物細胞は毒性化学物質、ホモアルギニンに
耐性であり、G.M.S.Van Slogteren et al.（1982）Plan
t Mol.Biol.1：133-142、は、この酵素を洗濯マーカー
に用いることを提案した。

【００３１】M.-D.Chilton et al.（1983）、前出、
は、A.Defremeuが"小Ti（mini-Ti）プラスミド"を作成
したと報告した。ノパリンＴ−ＤＮＡには、通常１ケ所
の制限酵素KpnIの切断部位がある。この部位を欠く変異
がつくられ、完全なノパリンＴ−ＤＮＡを含むKpnIフラ
グメントが単離された。このフラグメントはカナマイシ
ン耐性遺伝子と共にpRK290に挿入され、アグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス内で維持され、すべての非
Ｔ−ＤＮＡ配列を欠くプラスミドが得られた。それ自身
では、このプラスミドは植物細胞を形質転換できなかっ
た。しかし、オクトピンTiプラスミドを持つアグロバク
テリウム・チューメファシエンス株に入れると、オクト
ピンとノパリン両方を合成する腫瘍が誘導された。これ
はノパリンTiプラスミド機能の消失がオクトピンTiプラ
スミドにより相補されたこと、およびノパリン"小Ti"は
植物細胞を形質転換する能力があったことを示す。Chil
tonet al.（1983）、前出、はまた、小TiをSmaIで切
り、ノパリンシンセターゼ遺伝子とその左および右端以
外はすべてのＴ−ＤＮＡを欠失した"微Ti"（micro-Ti）
を作成した。この微TiはSmaI部位を欠くpRK290プラスミ
ド誘導対に挿入され、小Tiと同様にして用いられ、匹敵
する結果を得た。

【００３２】H.Lorz et al.（1982）in Plant Tissue C
ulture 1982、ed：A.Fujiwara、pp.511-512、は、ＤＮ
Ａ取込みと維持にＴＩＰ系が見掛け上無関係なプラスミ
ドベクターを作り、マーカーとしてノパリンシンセター
ゼ遺伝子を用いた。

【００３３】ファセオリンと遺伝子調節 一般に高等真核生物の遺伝子は高度に調節されている。
植物のような多細胞生物は多くの分化した組織を有し、
夫々は特有の遺伝子産物を要求する特有の機能を持つ。
そのような組織の１つに子葉（cotyledon）がある。豆
果（legumes）では子葉は、発芽の間に必要となるま
で、脂質、炭水化物、無機物および蛋白質などを保存す
る種の貯蔵器官である。フォセオラス・ブルガリスＬ．
（フレンチビーン、インゲン豆（kidny bean）、乾燥白
豆（navy bean）、緑豆（green bean）などの名でも知
られる）では、主要貯蔵蛋白質はファセオリンである。
この蛋白は極めて類似しかつ互いに等量の小数の分子種
から成る。ファセオリンは乾燥豆の主要な栄養価を担っ
ており、しばしば乾燥重量の10％以上を占める。

【００３４】ファセオリンはファセオラス・ブルガリス
の生活環の間で高度に調節されている。この蛋白は種が
さやの中で生ずる間でのみつくられ、そのレベルは遺伝
的に決まった合成のスケジュールに従い、検出限界の低
い値から種の蛋白の半分を占めるまで上昇する。そのピ
ークではファセオリン合成は子葉細胞の蛋白合成の80％
以上にも達する。他の時期には、また他の組織では、フ
ァセオリン合成は検知できない。世界的な栄養源の重要
性に伴い、ファセオリンの調節の仕組みは、ファセオリ
ンの研究、その性質およびその調節に大いに興味をそそ
る。

【００３５】

【発明の要旨】ここに開示の発明により植物遺伝子を導
入し、Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下でそこで発現す
る遺伝的に修飾された植物細胞より成る植物が提供され
る。さらに、本発明は植物細胞を含む植物組織を提供す
る。この植物細胞のゲノムはＴ−ＤＮＡプロモーターの
支配下で植物細胞内で発現するようにＴ−ＤＮＡプロモ
ーターに関して方向と間隙をもって挿入された植物構造
遺伝子を含むＴ−ＤＮＡを有する。本発明は、また、Ｔ
−ＤＮＡ（ここではＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で
植物細胞内で発現するように、Ｔ−ＤＮＡプロモーター
に関して方向と間隔をもった挿入植物構造遺伝子を含む
ように修飾されたＴ−ＤＮＡと定義される）を含みかつ
複製する新規な細菌株を提供する。さらに本発明はエセ
リシア・コリー内で複製能を有し、Ｔ−ＤＮＡを含み、
さらに植物細胞内でＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で
発現するようにプラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡに挿
入された植物構造遺伝子を含む新規なプラスミドを提供
する。

【００３６】ここに示された実験的研究はＴ−ＤＮＡを
介して導入後、Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物
細胞内で植物構造遺伝子が発現する。即ち、既知の方法
によりＴ−ＤＮＡにＴ−ＤＮＡプロモーター支配下で植
物構造遺伝子を挿入し、その挿入物を含むＴ−ＤＮＡを
植物細胞に導入することにより行ったものであるが、最
初の例であると信ずる。ここに示された実験はまた、イ
ントロンを含む植物構造遺伝子がＴ−ＤＮＡを介して導
入された植物細胞内でＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下
で発現した最初の例を提供するものと信ずる。これらの
結果は、Ｔ−ＤＮＡプロモーター支配下で発現する既報
の遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ内生遺伝子であれ、挿入外来遺
伝子であれ、現在知られている限りイントロンを含まな
いという事実から見れば驚くべき事である。この結果は
また植物構造遺伝子が適当な条件下でＴ−ＤＮＡに導入
された時、Ｔ−ＤＮＡプロモーターは植物構造遺伝子の
発現を制御する機能を果たすという例を従来技術では示
し得なかったという観点から、容易に考えられえないも
のである。本発明は他の植物種または株から有用な植物
構造遺伝子を導入し、植物組織または全植物体を遺伝的
に修飾するのに有用である。このような有用植物構造遺
伝子は貯蔵蛋白質、レクチン、病気、昆虫および除草剤
に対する耐性因子、環境ストレスに対し耐性を与える因
子などの遺伝子、さらに特異的芳香剤の遺伝子などを含
むが、これらに限らない。本発明は豆類、ファセオラス
・ブルガリス Ｌ．の主たる種の貯蔵蛋白質であるファ
セオリン構造遺伝子をヒマワリやタバコの植物細胞への
導入と発現という例を提供する。植物構造遺伝子がＴ−
ＤＮＡプロモーターの支配下で発現する植物細胞が一度
得られれば、植物組織および全植物体を当該分野で既知
の方法と技術を用いて再生させ得る。再生した植物は次
いで通常の方法で増殖し、導入された遺伝子は通常の植
物改良技術により他の植物や培養物へ移される。例え
ば、ファセオリン構造遺伝子の導入、発現はアルファル
ファのような馬糧作物蛋白含量、栄養価の向上に用いる
ことができる。本発明の他の用途、即ち、他の植物種へ
の導入された他の構造遺伝子の性質の開拓などは当業者
にとって容易なことである。本発明によれば、原理的に
は、いかなる植物構造遺伝子も、Ｔ−ＤＮＡへの導入が
可能でかつ安定に複製維持されうるいかなる植物種へ導
入されうる。一般にこれらの種に以下のものがあるが、
それに限定されない、即ちヒマワリ（コンポシテ科）、
タバコ（ソラナシ科）、アルファルファ、大豆および他
のマメ類（レグミノシ科）および大部分の野菜類などの
ような双子葉植物である。

【００３７】

【発明の構成】本発明は、植物細胞の遺伝的修飾方法で
あって、(a)Ｔ−ＤＮＡプロモーターを含むＴ−ＤＮＡ
へ植物構造遺伝子を挿入し、該プロモーターと該植物構
造遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物細胞
内で植物構造遺伝子が発現するような位置と方向にあ
り、それにより、Ｔ−ＤＮＡと植物構造遺伝子との結合
を形成する工程、次いで、(b)該Ｔ−ＤＮＡ／植物構造
遺伝子の結合物を植物細胞に移入する工程、を包含す
る。上記植物細胞の遺伝的修飾方法は、前記工程（ｂ）
の実行後に、さらに、（ｃ）前記Ｔ−ＤＮＡプロモータ
ー／植物構造遺伝子結合物を含む植物細胞内での植物構
造遺伝子の発現を検知する工程を包含し得る。前記植物
構造遺伝子は１つあるいはそれ以上のイントロンを含み
得、ファセオリンなどの種子貯蔵タンパクをコードして
いる遺伝子などが使用され得る。

【００３８】前記Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺
伝子結合物は、前記工程(b)に先立ってシャトルベクタ
ーの一部分として保存され複製される。前記工程(b)の
プロモーターは、好適には、tmr、tml、tms、ノパリン
シンセターゼ、オクトピンシンセターゼおよび"1.6"転
写物からなる群から選択される。

【００３９】前記植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ構造遺伝
子へ融合し得、そのことにより前記Ｔ−ＤＮＡ構造遺伝
子／植物構造遺伝子結合物がＴ−ＤＡにコードされるタ
ンパクと植物のタンパク配列とを含む融合タンパクをコ
ードし得る。

【００４０】前記細胞は、好適には、コンポジテあるい
はレグミノシなどの双子葉植物の細胞である。

【００４１】明細書と特許請求の範囲に使用する意図と
範囲に関して不明瞭さを除くために以下の定義を行う。

【００４２】Ｔ−ＤＮＡ：植物ゲノムに組み込まれる腫
瘍誘導因子（ＴＩＰ）由来のＤＮＡセグメント、ここで
用いる時、この用語はアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含
むアグロバクテリウムのいかなる腫瘍誘導株に本質的に
由来するＤＮＡを含む。後者の菌株の挿入セグメントを
従来は時々Ｒ−ＤＮＡと呼んでいた。さらにここで用い
るＴ−ＤＮＡという用語は自然発生または実験質操作に
よる、いかなる変化、修飾、変異、挿入、脱落をも含
む。修飾に関する基本的な構造上の要件および限定は、
自然に発生するＴ−ＤＮＡの右端および左端が充分量存
在しその結果、Ｔ−ＤＮＡの特徴である形質転換された
植物細胞ゲノム内への安定な組み込みという期待される
機能が確実に果たされるということである。さらにＴ−
ＤＮＡは挿入された植物構造遺伝子の転写の開始および
翻訳の開始を制御するに充分に完全な形のＴ−ＤＮＡプ
ロモーターを少なくとも含まなければならない。できれ
ばそのプロモーターに関して、そこへ挿入された植物構
造遺伝子が直接または融合蛋白として、そのプロモータ
ーの支配下で発現するような位置にあるべく、挿入部位
はそのプロモーターにより開始される転写と翻訳の方向
で“下流”にあるのがよい。

【００４３】植物構造遺伝子：ここでの使用は植物の蛋
白、ペプチドまたはその一部をコードするが、通常プロ
モーと称される転写開始、翻訳開始を調節する植物遺伝
子の機能要素を欠く、ＤＮＡセグメントを含む植物遺伝
子の部分を言う。植物構造遺伝子は１つまたはそれ以上
のイントロンを含むかもしれないし、また分断されない
コード配列から成るかもしれない。植物構造遺伝子は完
全にまたは部分的に植物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよ
び化学合成されたＤＮＡに由来するだろう。さらに植物
構造遺伝子はコード領域に、またはイントロンに発現産
物の化学構造、発現速度或いは発現調節様式に影響し得
る修飾を含むことができると期待される。そのような修
飾は変異、挿入、欠落および“静（silent）”修飾を含
むが、それに限らない。

【００４４】この静修飾は、発現産物の化学構造を変化
させないが、発現産物の細胞内局在性、輸送、分泌また
は安定性などに影響する。構造遺伝子は複数の起源に由
来するセグメントの混成物でありうる。それは自然的に
発生するかもしくは混成蛋白をコードする。この混成蛋
白は植物蛋白の一部を成している。

【００４５】Ｔ−ＤＮＡプロモーター：挿入Ｔ−ＤＮＡ
と一般に相関している、いかなる自然に生ずるプロモー
ターをも指す。これはＴ−ＤＮＡのＴＩＰ起源の部分に
依存して、オクトピンシンセターゼ遺伝子、ノパリンシ
ンセターゼ遺伝子、Tms、Tml、Tmr遺伝子を含むし、こ
れに限らない。Ｔ−ＤＮＡプロモーター支配下での発現
は、直接発現の形をとるかもしくは融合蛋白発現の形を
とりうる。直接発現においては、正常にはそのプロモー
ターにより制御されている構造遺伝子が除かれ挿入植物
構造遺伝子に置換され、開始コドンはＴ−ＤＮＡの構造
遺伝子の残りまたは挿入植物構造遺伝子の一部として提
供される。融合蛋白発現においては、植物構造遺伝子の
一部または全てがえ存在するＴ−ＤＮＡ構造遺伝子内で
正しい翻訳フレームで挿入される。後者の場合、 発現
産物は融合蛋白と呼ばれる。

【００４６】植物組織：根、芽、花粉、種、クラウンゴ
ールのような腫瘍組織および胚、カルスのような培養植
物細胞の種々の形の集合物を含む植物の分化、未分化の
組織を含む。

【００４７】植物細胞：栽培植物細胞、培養植物細胞お
よびプロトプラストを含む。Ｔ−ＤＮＡを介して導入さ
れた植物構造遺伝子を発現する遺伝的修飾植物の生産
は、本願明細書の開示事項を当該分野に既知な種々の技
術および経験を合併したものである。多くの例におい
て、別の手段が全過程の各段階に存在する。手段の選択
は基本的ＴＩＰの選択、修飾される植物種、希望する再
生方法など要素に依存し、それらにはいずれも当業者が
望む結果を達成する為に選択し用い得る別のプロセス段
階がある。本発明の基本的な特徴は植物構造遺伝子の性
質と構造であり、そのＴ−ＤＮＡの挿入方法である。

【００４８】遺伝的修飾植物を得る為に残っているステ
ップは、植物細胞へ修飾Ｔ−ＤＮＡを移送すること（そ
こでは、植物細胞の中で修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノ
ムの一部として安定に組み込まれる）を含み、それには
インビトロ培養および完全植物体への実際の再生に関す
る技術がある。この技術は形質転換植物細胞の選択と検
出に関するステップおよび最初の形質転換株から商業的
に認められうる培養体へ導入遺伝子を移すステップを包
含しうる。

【００４９】本発明の基本的特色は先に定義したＴ−Ｄ
ＮＡプロモーターの支配下にある挿入植物構造遺伝子を
有するＴ−ＤＮＡの構築である。植物構造遺伝子はＴ−
ＤＮＡに関して正しい位置と方向で挿入されなければな
らない。まず第一に構造遺伝子をプロモーターのどちら
側へ挿入するかである。大部分のプロモーターはＤＮＡ
に沿って一方向でのみ、転写と翻訳の開始を制御するこ
とが知られている。プロモーター支配下に存在するＤＮ
Ａ領域をプロモーターの“下流”あるいは“後”にある
という。従って、プロモーターに支配される為には、植
物構造遺伝子挿入の正しい位置はプロモーターの“下
流”になければならない。（２、３の既知プロモーター
は両方向に支配する、即ちプロモーターのどちらの側も
“下流”と見なされ得る、ことが知られている。）位置
の第二の問題はプロモーターの既知機能要素、例えば転
写開始部位と構造遺伝子の翻訳開始部位間の、塩基対で
の距離である。プロモーターからプロモーターへのこの
距離に関して、事実上変動がある。従って、この点に関
して要求される構造は機能するか否かという事で判断さ
れる。近い表現をすれば、プロモーターと挿入構造遺伝
子間の距離が、正常に支配しているプロモーターとＴ−
ＤＮＡの距離に似ておればうまく作用する。方向（orie
ntation）は構造遺伝子の向きを表す。慣例により植物
蛋白質のアミノ末端を最終的にコードする構造遺伝子の
部分を、構造遺伝子の5'末端と呼び、一方、蛋白質のカ
ルボキシル末端近くのアミノ酸をコードする遺伝子の端
を構造遺伝子の3'末端と呼ぶ。植物構造遺伝子の正しい
方向はＴ−ＤＮＡプロモーターの近くにその5'末端を持
つものである。融合蛋白発現をもたらすよう構築する場
合にさらに要求されることは、植物構造遺伝子のＴ−Ｄ
ＮＡ構造遺伝子への挿入が当業者によく知られている構
造上の要求性、つまり２つの遺伝子のコード配列が同一
翻訳フレームにあるということである。本発明に関連す
る、この要求の例外が、イントロンがＴ−ＤＮＡ遺伝子
と植物構造遺伝子の最初のコード領域を分断する場合に
存在する。その場合、イントロン切断部位が、転写後の
プロセッシングによりイントロンが除去された後、Ｔ−
ＤＮＡ遺伝子と植物構造遺伝子の正しい翻訳フレームが
保存されるような位置になければならない。Ｔ−ＤＮＡ
の起源は、いかなるＴＩＰプラスミドでも良い。植物構
造遺伝子は当業者によく知られている標準的技術で挿入
される。発現度の違いは、ある植物構造遺伝子が異なっ
たＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下に挿入されたときに
みられる。発現蛋白質自身の安定性、細胞内局在性また
は分泌、抗原性および他の機能上の性質などを含む異な
った性質は融合蛋白質の場合、見られるであろうが、そ
れは挿入部位、融合蛋白質の中に含まれるＴ−ＤＮＡ蛋
白セグメントの長さと性質、およびその立体構造に影響
する融合蛋白質の成分間で相互作用などに依存し、これ
らの全ては希望する利用目的に応じて発現産物の機能性
を操作し、制御する為の多数の機会を提供する。フォセ
オリン構造遺伝子の発現がアグロバクテリウム・チュー
メファシエンスのオクトピンプラスミドからのオクトピ
ンシンセターゼプロモーターの支配下にその遺伝子が挿
入されたときに観察された。

【００５０】植物構造遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する簡
便法に、上で意義したシャトルベクターがあり、これは
エシェリヒア・コリー内で複製可能なプラスミドへ取り
込まれたＴ−ＤＮＡセグメント（ここへ挿入を期待する
セグメント）を有する。このＴ−ＤＮＡセグメントは好
ましくはシャトルベクターに特異な１つの制限部位を有
する。植物構造遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡセグメント内の特
異的部位に挿入され得る。そしてこのシャトルベクター
は適当なアグロバクテリウム株（好ましくはそれの有す
るＴ−ＤＮＡがシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメン
トと相同性がある）の細胞へ移される。形質転換された
アグロバクテリウム株を、Tiプラスミドの既存おセグメ
ントをシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメントで置換
する２重相同組み換え現象を選択する条件下で増殖させ
る。

【００５１】ここで述べた方針に従い修飾Ｔ−ＤＮＡを
当該分野で既知のどれかの技術により植物細胞に移すこ
とができる。例えば、この移送はＴ−ＤＮＡ内に取り込
まれた植物遺伝子を含む新規のアグロバクテリウム株の
持つプラスミドの直接感染、あるいはアグロバクテリウ
ム株と植物細胞の共存培養により最も容易に達成され
る。前者の技術、直接感染はやがて感染部位に腫瘍体ま
たはクラウンゴールの出現をもたらす。クラウンゴール
細胞を次いで培養で増殖させ、そして当業者に既知の適
当な環境下で、挿入Ｔ−ＤＮＡセグメントを有する完全
植物体に再生させる。共存培養の方法により、植物細胞
のある部分が形質転換される。即ち細胞内にＴ−ＤＮＡ
が移り、植物細胞ゲノムに挿入される。いずれにして
も、形質転換細胞を選択あるいは未形質転換細胞と区別
しなければならない。選択はＴ−ＤＮＡの中に植物構造
遺伝子と共に、取り込まれる選択マーカーを用いる事に
より容易に達成される。例として、ノパリンシンセター
ゼプロモーター支配下で発現するジハイドロフォレート
レダクターゼあるいはネオマイシンファスフォトランス
フェラーゼがある。これらのマーカーは、夫々メトトレ
キセートまたはカナマイシンあるいはそれらの類似物を
含む培地での増殖により選択される。さらにＴ−ＤＮＡ
は内生マーカー、例えばTiー誘導腫瘍の培養でホルモン
非依存増殖を制御する遺伝子または遺伝子群、Riー誘導
腫瘍ルートの異常形態を制御する遺伝子または遺伝子
群、およびアミノ酸類似物のような毒性化合物に対する
耐性（その耐性はオピンシンセターゼによりもたらされ
る）を制御する遺伝子群を有する。当業者によく知られ
ている検索法には、オピン生産の測定、特徴的ＲＮＡま
たはＴ−ＤＮＡ配列に対する特異的ハイブリダイゼーシ
ョン、あるいはＥＬＩＳＡ（酵素連関免疫吸着分析の
略）、ラジオイムノアッセイ、および”ウエスタン”ブ
ロットなどの特異的蛋白質の免疫学的分析がある。

【００５２】シャトルベクター作戦の別の方法にＴ−Ｄ
ＮＡまたはそこに植物構造遺伝子を挿入した修飾Ｔ−Ｄ
ＮＡを含むプラスミド、即ちアグロバクテリウム株内で
独立に複製し得るプラスミドの使用がある。最近の資料
により、アグロバクテリウム株が、Ｔ−ＤＮＡの植物細
胞への移動を促進する機能をもつあるトランスに作用す
る遺伝子を有するならば、そのようなプラスミドのＴ−
ＤＮＡがアグロバクテリウム株から植物細胞へ移され得
るということが示されている。Ｔ−ＤＮＡを含み、アグ
ロバクテリウム株内で独立に複製できるプラスミドをこ
こでは”サブ−ＴＩＰ”（sub-TIP）プラスミドと呼
ぶ。変動範囲があり、そこでは、”サブ−ＴＩＰ”プラ
スミドはそれらが含有するＴ−ＤＮＡの量に差がある。
その範囲の一端はＴＩＰプラスミドからのＴ−ＤＮＡが
すべて残っているもので、特に”小ＴＩＰ”（mini-TI
P）プラスミドと呼ばれる。その範囲のもう一端はＴ−
ＤＮＡ境界のまわりのＤＮＡの最小量を残してすべてが
欠失している。その残存部分は宿主細胞内で転移と組み
込みができる必要最小量である。このようなプラスミド
は”微ＴＩＰ”（micro-TIP ）と呼ばれる。サブーＴＩ
Ｐプラスミドは小さく、直接操作するのが比較的容易で
あるという利点がある。

【００５３】希望する構造遺伝子を挿入した後、Ｔ−Ｄ
ＮＡ転移を促進するトランスに作用する遺伝子を含むア
グロバクテリウム細胞へ直接容易に導入できる。アグロ
バクテリウム株への導入はアグロバクテリウム株の形質
転換か、供与細菌細胞から接合伝達という当業者によく
知られている技術により簡便に達成される。再生は既知
の技術で達成される。再生ステップの目的は正常に、し
かし組み込まれたＴ−ＤＮＡを保持して、増殖および再
生産する全植物体を得ることである。再生の技術は当該
分野で既知の原理によれば、Ｔ−ＤＮＡの起源、そこで
の修飾の性質、および形質転換された植物の種によりい
くらか変動する。Ri-型Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植
物細胞は、公知の技術により何ら余分な実験なしに、容
易に再生される。Ti-型Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植
物細胞は、ある例では培養のホルモンレベルを適当に操
作することにより再生され得る。しかし、好ましくは、
Ti-形質転換組織は、もしＴ−ＤＮＡが TmrとTms遺伝子
の一方または双方に変異を受けておれば、最も簡単に再
生される。これらの遺伝子の不活性化は形質転換組織の
ホルモンバランスを正常に戻し、培養での組織のホルモ
ンレベルを極めて容易に操作できるようになる結果、簡
単に再生するようなより正常なホルモン生理を有する植
物をもたらす。数例においては、腫瘍細胞は、ノパリン
シンセターゼのような組み込まれたＴ−ＤＮＡを持ちか
つＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現するシュート、そしてまた挿
入植物構造遺伝子を発現するシュートを再生させること
ができる。このシュートは根を有する植物につぎ木する
事により栄養細胞で維持でき、稔性花を着生できる。シ
ュートはこのようにしてＴ−ＤＮＡを有し、そこへ挿入
された植物遺伝子を発現する正常な子孫植物の親植物体
となる。

【００５４】

【実施例】次に述べる例は、ＴＩＰｓとアグロバクテリ
ウムの分子生物学および操作に関する当業者によく知ら
れかつ受け入れられうる多くの技術を利用している；そ
れらの方法は常に詳しく、記述されているわけではな
い。酵素は市販品であり、これらは業者の推薦あるいは
当該分野によく知られた方法により用いられた。

【００５５】試薬、緩衝液および培養条件もまた、当業
者には知られている。そのような標準となる技術を含む
関連研究を次に挙げる：R. Wu. ed. (1979) Meth. Enz
ymol. 68； J.H.Miller (1972) Experiments inMolecul
ar Genetics； R. Davis et al. (1980) Advanced Bact
erial Genetics；R.F.Schleif and P.C.Wnesink (1982)
Practical Methods in Molecular Biology. これらの例の中には（塩基）配列を見やすくする為に
（to clarify sequences）特別な記号が用いられてい
る。

【００５６】蛋白質をコードしているか、コードし得る
配列には下線を引き、コドンは斜線（／）で区切った。

【００５７】制限酵素などにより生じた各々の鎖の切れ
目や間隙には星印（＊）を配する（ある例では、二重鎖
ＤＮＡ分子は、制限酵素切断部位の星印に隣接する一本
線で表されている； 遺伝子と思われる部分はその一本
線の下に下線を引いた“×”で示してある。）。

【００５８】該プラスミドは例外として、プラスミドあ
るいは唯一のプラスミド（only plasmids）は“Ｐ”で
始める。（例）p3.8あるいはpKS4。プラスミドを持つ細
胞は、その細胞本来の名にプラスミドを付加的に示すこ
とにより表す。（例）アグロバクテリウム・チュ−メフ
ァシエンス（pTil5955）あるいはK802（pKS4-KB）。

【００５９】表１、２および３にはプラスミドとそれら
の関係を同定するのに有用な索引が記されている。表４
には寄託菌株の索引が記されている。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【表２】

【００６２】

【表３】

【００６３】

【表４】

【００６４】第４２図には例１１、１２、および１４に
記述されている構成を比較するのに有用である。

【００６５】第４３図は遺伝コードを示し、配列の解釈
に有用である。重要なＴ−ＤＮＡ遺伝子tmlの塩基配列
はこれらの例には用いられていないが、第４４図に示さ
れている。それは、ここに記述されていない構成を示す
のに有用である。

【００６６】（実施例１）融合タンパクの遺伝子は、オ
クトピンシンセターゼプロモーター、オクトピンシンセ
ターゼの構造遺伝子のアミノ末端90個のアミノ酸、二つ
の遺伝子間に重複する三個のアミノ酸、そして、最初の
11個のアミノ酸を省くファセオリン遺伝子の全部分を含
むように構成されている。構成を開始するに先だち、pT
i15955 T-DNAのクローン、p233（配列はpBR322中で、p2
03、p303と提示されている;図１参照）の配列をBamHI部
位からPvuII部位まで、決定した。これは、 全オクトピ
ンシンセターゼ遺伝子を含む（図２）。オクトピンシン
セターゼ（遺伝子）配列及び、 リーディングフレーム
は、制限酵素EcoRIにより切断された部位の近くに続い
て見つかっている。

【００６７】

【化１】

【００６８】EcoRIによる開裂により次に示す末端をも
つ断片を生じる。

【００６９】

【化２】

【００７０】豆の種子の貯蔵タンパク質であるファセオ
リンの構造遺伝子（以前に配列決定されている；図３お
よび図４）は５′（アミノ末端）末端の近くに次に示す
ようにEcoRI部位を持っている。

【００７１】

【化３】

【００７２】EcoRIによる開裂により次に示す末端を持
つ断片が生じる。

【００７３】

【化４】

【００７４】これらの２つの断片は連結後、次に示す構
造を形成する。

【００７５】

【化５】

【００７６】これは同じリーディングフレームを保持
し、かつ、間に終止信号を生じていない。つまり、ファ
セオリン遺伝子のEcoRI／BamHI制限酵素断片は、 pTi 1
5955のT-DNAのオクトピンシンセターゼ遺伝子にEcoRI部
位で連結されたのである。この融合遺伝子はocsプロモ
ーター、オクトピンシンセターゼの最初の90個のアミノ
酸、そして、プロモーターと最初の11個のアミノ酸のな
いフォセオリン遺伝子、及び、両遺伝子の継目にあたる
３個のアミノ酸配列を含んでいる。

【００７７】1. 1 pBR 322 からのEcoRI部位の除去 pBR 322のEcoRI部位をEcoRIで分解後 T-4 DNAポリメラ
ーゼにより、粘着末端を埋め、平滑末端同志を連結す
る。そしてE.coli HB101 株を形質転換することによりp
BR 322 よりEcoRI部位を除去した。形質転換体の選択に
アンピシリンを用いた。又、コロニーは少量のプラスミ
ドDNAを単離する（D.Horowitz（1982）Molecnlar Cloni
ng、C.S.H ）ことにより選別した。そして、 pBR 322-R
と呼ばれるEcoRI部位を持たないクローンを選択した。

【００７８】1. 2 BamHI T-DNA断片のpBR 322-R への
クローニング P203（図４５）を単離し、BamHIにより分解した。T-DNA
の4.7kbp(キロベースペアー）の断片をアガロースゲル
電気泳動により単離し、pBR 322-RのBamHI部位に連結し
た。このプラスミドをE.coli HB101株に形質転換し、ア
ンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を用いて選
択した。陽性クローンが得られ、それをpks 169と名づ
けた。

【００７９】1. 3 オクトピンシンセターゼ遺伝子から
のEcoRI部位及び断片の除去 pKS 169をEcoRIで分解した。8.6 kbp(キロベースペア
ー）の断片をアガロースゲル電気泳動により単離精製し
た。この断片は除かれたocs遺伝子中に２個の小さな
（0.36kbp及び0.2kbp）断片を持っていた。

【００８０】1. 4 ファセオリン遺伝子DNA 断片及び、
カナマイシン耐性遺伝子を含むEcoRI断片の単離 pKS4-KB(図９) を精製し、EcoRIで分解した。ネオマイ
シンフォスフォトランスフェラーゼII（NPT II）をコー
ドしているカナマイシン耐性遺伝子を含む、1.85kbpのD
NA断片と3.0kbpのEcoRI／BamHIファセオリン遺伝子断片
をBamHI部位で連結して用いる為に4.8kbpの断片を単離
した。

【００８１】1. 5 ファセオリン遺伝子のオクトピンシ
ンセターゼ遺伝子への連結 ファセオリン／NPTII断片を実施例１．３で記述したEco
RI断片とEcoRI部位で連結した。連結したDNAを、HB101
に形質転換し、コロニーをアンピシリンとカナマイシン
で選択した。pKS-B17-KB3.0(図４６）と名ずけたコロニ
ーを選択した。このコロニーは正しい配置（すなわち、
ファセオリン遺伝子が、正しい方向とリーディングフレ
ームでocs遺伝子へ連結されている）を持つプラスミド
を保有している。このことは、少数のコロニーからのプ
ラスミドの制限地図により確認した。適当な領域の DNA
配列を構造確認の為に決定した。

【００８２】1. 6 BPTII、ファセオリン、及びocsDNA
を含むT-DNA 断片のpRK 290への移入 広い宿主範囲をもつプラスミドであるpRK290をBglIIで
分解後、T-DNA、NPTII遺伝子、及びpKS-B17-KB3.0から
のファゼオリンDNAを含む9.1kbpのBamHI断片へ連結し
た。上記のことは、pKS-B17-KB3.0をBamHIで部分分解
後、アガロースゲル電気泳動で他の６本のバンドから単
離することにより完遂した。連結し、E.coliK802株へ形
質転換の後、コロニーをカナマイシン及びテトラサイク
リンで選択した。要求される制限パターンを有するコロ
ニーを選択しpKS-os-KB 3.0と名づけた。

【００８３】1. 7 pTi 15955 上のオクトピンシンセタ
ーゼのオクトピンシンセターゼファセオリン融合タンパ
ク遺伝子への置換 A.tumefaciens （ストレプトマイシン耐性）、E.coli（p
KS-OSI-KB 3.0）、及びE.coli（pRK 2013）の三親交雑
により、我々はストレプトマイシン、カナマイシン、及
びテトラサイクリン耐性のコロニーを選択した。あるコ
ロニーをE.coli（pPH1J1）と交雑した。カナマイシン及
び、ゲンタマイシン耐性のコロニーを選択した。これ
は、p15955−12A、pTi15955（制限酵素地図作成及び、
電気泳動的に分画した制限断片のフィルターハイブリダ
イゼーション（実施例１９）によるocs遺伝子のEcoRI部
位へ設計したファセオリン遺伝子及び、カナマイシン耐
性遺伝子を持つ）をもつアグロバクテリウム・チューメ
ファシエンスを表している。類似した三親交雑はアグロ
バクテリウム・チューメファシエンス（pTi A66)で行わ
れている。結果として生ずるプラスミドpA66-12Aにより
形質転換されたシュート（shoots) は、前述のようにフ
ォセオリンを有することを示している。

【００８４】1. 8 クラウンゴールの形成及び発現 設計されたTiプラスミドを、 ヒマワリに接種した。組
織培養において、クラウンゴールが形成された。発現は
ランニングELISA及び電気泳動的に分けられたmRNAへの
フィルターハイブリダイゼーション（“ノーザンブロッ
ト”；実施例１９）らにより試験した。期待される大き
さのRNAをファセオリン及びオクトピンシンセターゼの
両方に対するハイブリダイゼーションプローブにより見
つけた。又、期待される大きさの RNAは全ポリ(A)5＋4
RNAの約 0.5％であった。ゴールより単離したポリ(A)5
＋4 RNAでファセオリンに対する抗体により沈澱する期
待される大きさのタンパクのインビトロ合成を行った。

【００８５】（実施例２）実施例１に似た融合タンパク
の遺伝子を、ファセオリンとノパリンシンターゼよりノ
パリンシンセターゼ遺伝子のプロモーターの支配下にお
いて構成した。それは、ノパリンシンセターゼのプロモ
ーター、ノパリンシンセターゼの最初の59個のアミノ酸
（最後の残基は合成して加えた）と１個のつぎ目のアミ
ノ酸をコードしている部分、及び最初の12個のアミノ酸
を除くすべてのファセオリン構造遺伝子を有する。構成
を開始するに先だち、pTiC58のT-DNA(pCF 44A、図８)
のクローンを、一番左のBglII部位から中ほどのHindIII
部位（T-DNA領域の外側）にかけて配列決定を行った。
これは、すべてのnos遺伝子を含んでいた（図５および
図６）。ノパリンシンセターゼの配列及びリーディング
フレームは、後に示すように、制限酵素ClaIにより切断
された部位の近くに見つかった。

【００８６】

【化６】

【００８７】ClaIによる切断で次のような末端を持つ断
片が生ずる。

【００８８】

【化７】

【００８９】実施例１の場合と同様に、続くファセオリ
ンのEcoRI部位：

【００９０】

【化８】

【００９１】は、次に示す構造に切断することができ
る。

【００９２】

【化９】

【００９３】次に示す２つのリンカー：

【００９４】

【化１０】

【００９５】は、アニールし、次に示す構造を形成し得
る。

【００９６】

【化１１】

【００９７】これは該DNA断片と連なり次に示す構造を
形成し得る。

【００９８】

【化１２】

【００９９】このリンカーの有するいくつかの機能を記
す：新しいアミノ酸が１つ導入される；ノパリンシンセ
ターゼの欠失した配列の一部分が再び構成されている；
２つの相反する制限部位が適合している；オープンリー
ディングフレームは保存されている。

【０１００】つまり、ファセオリン遺伝子のEcoRI／Bam
HI制限断片をリンカーによりEcoRI部位をClaI部位に変
換した後ノパリンシンセターゼ遺伝子のClaI部位へ結合
したのである。この融合遺伝子は、ノパリンシンセター
ゼのプロモーター、ノパリンシンセターゼの最初の58個
のアミノ酸、リンカー（これはノパリンシンセターゼ配
列の一部分を再構成し、かつ、新しいアミノ酸１個をそ
う入したもの）、及び最初の12個のアミノ酸残基を省く
すべてのファセオリンを含んでいる。

【０１０１】2. 1 リンカーの合成 次に示す２個のリンカーを合成した。

【０１０２】

【化１３】

【０１０３】これらを実施例１７の方法により合成し
た。これらのオリゴクレオタイドａ）とｂ）はアニール
して次の構造を形成する。

【０１０４】

【化１４】

【０１０５】2. 2 シャトルベクターの調製 pKS nop IV（構造は図８に記述してある）は、pRK 290
のBglII部位にノパリンのT-DNAをクローン化したもので
ある。そのノパリンのT-DNAは唯一ClaI部位を有する。
これは、nos中のClaI部位とnos遺伝子の外側下流部分の
ClaI部位との間が欠失した結果である（図７、図８）。

【０１０６】我々はpKS4-KB（図９）を精製し、EcoRIで
分解した。4.8kbpのkan／bean耐性断片をゲル電気泳動
により精製した。この断片はTn5のカナマイシン耐性遺
伝子（kan)のBamHI／EcoRI断片にBamHI部位で連結して
いるEcoRI／BamHIのファセオリンDNAの断片(kan／bean
中のbeanとして称される）を含んでいる。

【０１０７】我々は、ClaIにより直線化したpKS-nop IV
をkan／bean断片及び、例2.1に示すリンカーを用いて連
結した。E.coli K802を形質転換し、カナマイシン及び
テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。二通りの配
置が存在し、その一つは、ファセオリンDNAがノパリン
シンセターゼ遺伝子に連結したものであり、もう一つ
は、カナマイシン耐性遺伝子がノパリンシンセターゼの
隣に連結したものであった。図１０に示した要求される
配置を持ったプラスミド、pNNN1、を保有する細胞を決
定する為に、 制限部位地図作成を用いた。

【０１０８】2. 3 pTiC58上のノパリンシンセターゼ遺
伝子の修飾されたファセオリンへの置換 アグロバクテリウム・チューメファシエンス−strR C5
8、E.coli(pRK 2013)、及びE.coli（PNNN1)の間の三親
交雑（従来技術のシャトルベクターの項を参照）を用い
て、構成物をTiプラスミドへ挿入した。

【０１０９】我々はストレプトマイシン、カナマイシ
ン、及びテトラサイクリンに耐性なアグロバクテリウム
・チューメファシエンス細胞を選択した。選択した形質
転換体をE.coli（pPHIJI）と交雑し、カナマイシン及び
ゲンタマイシン耐性コロニーを選択した。

【０１１０】2. 4 クラウンゴールの形成及び発現 ヒマワリに接種し組織培養中でクラウンゴールを形成さ
せた。発現の試験は、実施例１７及び２０で示したよう
にELISA及びmRNAへのハイブリダイゼーションにより行
った。

【０１１１】（実施例３）この実施例の目的は、ATG翻
訳開始信号から構造遺伝子の残りの部分へ連結すること
ができるEcoRI部位までの完全なファセオリン遺伝子の
コーディング配列の再構成である。5'末端にClaI部位を
構成する。そうすれば該遺伝子を容易に復元することが
できる。次に示す２個のオリゴ又クレオタイド配列を合
成した。

【０１１２】

【化１５】

【０１１３】これらはアニールして次に示す構造を形成
し得る。

【０１１４】

【化１６】

【０１１５】実施例１の場合と同様、 次に示すファセ
オリンのEcoRI部位：

【０１１６】

【化１７】

【０１１７】は、次の構造へ開裂し得る。

【０１１８】

【化１８】

【０１１９】この末端を前述の合成二本鎖ヌクレオタイ
ドリンカーへ連結するとコーディング配列の先頭のClaI
粘着末端よりの完全なファゼオリンのポリペプチドをコ
ードする遺伝子が生じる。

【０１２０】3. 1 リンカーの合成 実施例１７の方法により次の２個のリンカーを合成し
た。

【０１２１】

【化１９】

【０１２２】これらはアニールし、 次の構造を形成す
る。

【０１２３】

【化２０】

【０１２４】3. 2 pKS-nop IVにクローン化されている
ファセオリン遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子の完全
な構成 Cla Iで直線化したpKS-nop IVを実施例3.1で示した。ア
ニールしたリンカーとKS4-KB（実施例2.2を参照）由来
の精製kan／bean EcoRI断片とを連結した。E. coli K80
2 を形質転換し、テトラサイクリン及びカナマイシン耐
性コロニーを選択した。また、二種の配置が可能なので
あるが、ファセオリン遺伝子がノパリンシンセターゼ遺
伝子の隣に連結されたものはただ一つであった。正しい
配置のクローンをエンドヌクレアーゼ地図作成後に選択
した。

【０１２５】3. 3 クラウンゴール形成及び発現 実施例２１に示す大要に従って、相同部位組み換え及び
クラウンゴール組織培養の単離を行った。そして、クラ
ウンゴールにおけるファセオリン遺伝子の発現の試験
は、実施例１９及び２０と同様に行った。

【０１２６】（実施例４）ここに示す構成の目的は、ク
ラウンゴール細胞中での外来遺伝子の発現の為のpTi方
式に用いるシャトルベクターの構成方法を教えることに
ある。そこでは、外来遺伝子はnosプロモーターの支配
下にあり部分的に合成物を含む、また、ノパリンシンセ
ターゼをコードする部分は無くなっている。構成を開始
するに先だち、pTiC58T-DNA（pCF44A)クローンの配列を
nosプロモーターを見つけるべく決定した（図５および
６）。

【０１２７】4. 1 nosプロモーターの５′部分の単離 PCF44をXhoIで切り、再び連結し、それをpCF44Bと名ず
けた。それは次の構造をもつ。

【０１２８】

【化２１】

【０１２９】この新しいプラスミドのSstII断片を欠失
させる結果としてできたプラスミドpCF44Cは次のとおり
である。

【０１３０】

【化２２】

【０１３１】これをBgl IIで分解し、3.6kbp断片をpRK2
90のBgl II部位に挿入する。Grunstein-Hogness分析に
おいてＴ−ＤＮＡをハイブリダイゼーションする為に選
択したコロニーをpKS-nop Vと名づける。それをClaIで
分解し、再び連結しpKS-nop VIを形成する。

【０１３２】

【化２３】

【０１３３】これをClaIとSstIIで分解すると22Kbpの直
線化したビークル(Vehicle)と355bpの断片が得られる。
これらは、塩勾配遠心分離により容易に分けることがで
きる。該断片を、HinfIで分解後、149bpのSstII/HinfI
および208bpのClaI/HinfI断片をゲル電気泳道により単
離する。

【０１３４】4.2 リンカーの合成 実施例１７の方法により次の二つのリンカーを合成し
た。

【０１３５】

【化２４】

【０１３６】これらは、たがいにアニールし、次に示す
構造を形成する。

【０１３７】

【化２５】

【０１３８】この配列は、左側にHinfI部位を、そして
右側にNcoIおよびClaI部位を有する。交互の配列はNcoI
部位とClaI部位の間に、BclI部位を有するであろう。こ
の配列は下線で示したA-TベースペアーとGLベースペア
ーの置換を除くとＴ−ＤＮＡにおいて見つかったものと
一致する。

【０１３９】4.3 pNNN2の組み立て 22kbpのClaI／SstIIビークルを図１１に示すように149b
pのSstII／HinfI断片および合成リンカーにより連結す
ると次の構造を形成する。

【０１４０】

【化２６】

【０１４１】4.4 フォセオリン遺伝子の挿入および発
現 実施例4.3で構成したプラスミドpNNN2（図１１）をClaI
で切り、実施例4.2で合成したClaI／EcoRIリンカーおよ
びpKS4-KBから電気泳道的に精製したEcoRI／ClaI kan／
bean遺伝子の断片と混ぜて連結し、形質転換、単離、制
限地図作成を行う。適当なプラスミドpNNN4を実施例２
１、１９および２０に記載したように導入し、発現の試
験を行う。

【０１４２】4.5 イントロンを欠くフォセオリン遺伝
子の挿入および発現 実施例4.4に概略した手順をpcDNA31のpKS4-KBあるいはp
KS4-KBのpMC6-cDNA由来のアナログについての交換によ
り繰り返す。

【０１４３】4.6 フォセオリンcDNAの挿入および発現 この構成は、cDNA、一本鎖PstIリンカーおよびPstI kan
断片を使用することについて、実施例１０に類似してい
る。又、半合成nosプロモーターの使用については実施
例4.1、4.2および4.3に類似している。性格づけ、移
入、および発現試験については実施例4.4に記述したも
のと同様である。

【０１４４】実施例4.3で構成したプラスミド、pNNN2
（図１１）をClaIで切り、実施例4.2で合成したClaI／E
coRIリンカー、pKS4-KBかから単離し、電気泳動的に精
製した1.7kbpのEcoRI／PstI bean断片、電気泳動的に精
製した0.93kbpのPstI Tn5 kan断片、およびすでに実施
例１７の方法により合成した一本鎖ClaI／PstIリンカー
５’ＣＧＡＡＴＴ３’を混ぜ連結した。

【０１４５】（実施例５）この構成の目的は、EcoRI部
位からBamHI部位までのファセオリン遺伝子をP403のHin
dIII部位にまたがる活性Ｔ−ＤＮＡ遺伝子（このmRNA
は、地図上、1.6と記されている、図１参照）へ連結す
ることである。この配列（図１２および図１３参照）を
P401の右側にClaI部位のあるHindIII部位から決定した
(図１４参照)。HindIII部位とClaI部位の間から始まりH
indIII部位へ向かうオープンリーディングフレームがあ
る（図１４に地図で示される1450bpのmRNAを参照）。

【０１４６】このClaI部位は、HindIII部位に広がる遺
伝子のmRNAの翻訳されないリーダーの中にある。我々
は、p403の中央ClaI断片を切り省くことによりプロモー
タービークルを作成した。これは、中のClaI部位は、E.
coli株中でメチル化されていないか、EcoRI部位の隣のC
laI部位はメチル化されているので可能である。

【０１４７】ここで、ファセオリン遺伝子をClaI部位
に、ATGをもったまま連結する。これは、pKS4-3.0KBを
用いれば可能である。pBR322のClaI部位からファセオリ
ンのEcoRI部位に至る塩基配列を次に示す。

【０１４８】

【化２７】

【０１４９】オープンリーディングフレームおよびATG
に留意のこと。ClaI部位と翻訳開始信号(ATG)の間に
は、18bpがある。これをClaI部位からＴ−ＤＮＡ遺伝子
の開始までの12bpと比較する。

【０１５０】

【化２８】

【０１５１】再び、オープンリーディングフレームとAT
Gに留意のこと。このように、プロモータークローンのC
laI部位へファセオリン遺伝子を連結すると、T-DNA中で
活性ファセオリン遺伝子を作ることとなる。ファセオリ
ン遺伝子は本来生ずる末端の12残基のアミノ酸について
の２個のアミノ酸が交換されたこととなる。

【０１５２】5. 1 プロモータービークルの構成 pKSIII（T-DNAクローンp403 (図１参照)に対応するpRK2
90クローン）をClaIで分解し、再連結する。連結混合物
をK802に形質転換し、カナマイシン耐性により選択す
る。プラスミドは、「ミニプレップ」（minipreps) (少
量の培養細胞からプラスミドを調製すること）を行うこ
とにより単離する。又、構造を証明する為に制限地図作
成を行う。新ビークルpKS-ProIはHindIIIでは分解でき
ないが、ClaIにより線状化することができる（図１５)
。pKS-ProIを精製し、ClaIによる分解で線状分子を作
る。

【０１５３】5. 2 部分的ファセオリン遺伝子のカナマ
イシン耐性への連結 ５′側端を除く３′側への広範囲な部分のファセオリン
遺伝子を含む3.0kbpの断片をP7.2(図１６)（ファセオリ
ンゲノミッククローン177.4のpBR322サブクローンで構
造は実施例6.1に記述している。）のHindIIIとBamHI分
解物をアガロースゲル電気泳動から溶出して得た。これ
をpKS4（図２１）から同様に単離した。3.0kbpのカナマ
イシン耐性HindIII／BamHI断片及びHindIIIで線状化し
たpBR322と混ぜ連結した。アンピシリン耐性形質転換体
から単離したプラスミドの制限地図作成後、図９に示す
構造を持ったプラスミドをpKS4-KBとした。

【０１５４】5. 3 pKS4-3.0KBからの kan／bean断片の
精製 pKS4-KB(図９)をClaIで分解し、4.9kbp断片をアガロー
スゲル電気泳動により精製した。

【０１５５】5. 4 ClaI kan／bean耐性断片のClaI分解
pKS-Pro Ｉへの連結 pKS-Pro ＩをClaI分解で線状化し、実施例5.3 からのカ
ナマイシン耐性遺伝子／bean断片を一緒に連結し、K802
へ形質転換する。カナマイシン耐性形質転換体を選び
「ミニプレップ」により単離したプラスミドを適当な配
置を持つものを見つける為に制限地図作成を行った。該
プラスミドをpKS-Pro I-KB（図１７）とした。

【０１５６】5. 5 形質転換及び発現 pKS-Pro I-KBを持つ細胞をpTi15955、pTiA60あるいは他
の適当なTIPプラスミドを持つアグロバクテリウム細胞
と交雑する。カナマイシンで組み換え体を選択後、植物
に接種し、組織培養でクラウンゴールを形成させた。フ
ァセオリンの合成の試験は実施例１９及び２０に示すと
おりである。

【０１５７】（実施例６）この実施例は、他のさまざま
な例に示す、ベクターヘ、ファセオリン遺伝子を挿入す
る進んだ操作に先だって、豆（Phasealus vulgaris L.)
の種子の主要貯蔵タンパク質であるファセオリンの遺伝
子の操作を教える。

【０１５８】6. 1 ファセオリン遺伝子のサブクローニ
ング シャロン（Charon) 24A AG-PVPh 177.4（あるいは、17
7.4 ；S.M.Sun et. al(1981) Nature 289：37-41、J.L.
Slightom et.al(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80；図
１８）中の、ファセオリンのゲノミッククローンをBglI
I及びBamHIで消化した。ファセオリン遺伝子及び隣接配
列を持つ3.8kbp の断片をアガロースゲル電気泳動で単
離し、BamHIで線状化したpBR322と混ぜ連結した。混合
物をHB101に形質転換し、アンピシリン耐性、テトラサ
イクリン感受性コロニーを選択した。

【０１５９】これらのクローンから単離したプラスミド
の制限地図を作成した。図１９に示す構造を持つプラス
ミドを選択し、AG-pPVPh3.8（あるいは、代わりにP3.
8）とした。BglIIとBamHI部位が互いに連結したもの
は、両方の部位が消失する。

【０１６０】もう一つの177.4のサブクローンを次のよ
うに構成した。まず、EcoRI分解し、ファセオリン遺伝
子の３’側配列および５′側端以外のすべてを含む7.2k
bpの断片を単離し、HB101 形質転換体のアンピシリン選
択したものを制限地図作成後単離する。pBR322のHindII
I部位がファセオリン遺伝子の５′末端と３′末端の翻
訳されない領域に隣接しているような配置の挿入を有す
るプラスミドをAG-pPVPh7.2（あるいは、p7.2；図１
６；Sun et al. and Slightom et al.,Supra）とした。

【０１６１】6. 2 カナマイシン耐性遺伝子のクローニ
ング及び単離 pRZ102（R.A.Jorgenson et al.(1979) Molec. gen. Gen
et.177：65-72)（これはトランスポゾンTn5 を１コピー
持つColE１プラスミドである）を、BamHI及びHindIIIで
分解し、前もって同じ２つの酵素で線状化してあるpBR3
22と混ぜ、連結し、K802へ形質転換した。アンピシリン
及びカナマイシンの両方に耐性な形質転換体から単離し
たプラスミドの制限地図を作成し、図２１に示す構造を
もつものをpKS-4 とした。

【０１６２】6. 3 ファセオリン遺伝子とカナマイシン
耐性との結合 P3.8をClaIとBamHIで分解し、ファセオリン遺伝子とpBR
322の一部分の配列を含む4.2kbpの断片をアガロースゲ
ル電気泳動より単離した。これをpKS4（図２１）からの
カナマイシン耐性（ネオマイシンフォスフォトランスフ
ェラーゼII）遺伝子を持ったTn5のClaI／BamHI断片及び
ClaIですでに線状化したpBR322（図２０）と混ぜた。混
合物を連結し、K802へ形質転換した。アンピシリン及び
カナマイシン耐性コロニーを選択し、制限地図作成を行
った。図２２に示す構造をもつコロニーをpKS-KB 3.8と
した。もう一つの有用なプラスミド、pKS4-KBの構造は
実施例5.2 に示してある。

【０１６３】（実施例７）この実施例は、ファセオリン
のゲノミッククローンに対するcDNAクローンの置換以外
は、実施例５に述べた構成に類似している。この構成に
よりイントロンを欠失した遺伝子ができるだろう。

【０１６４】7. 1 pKS4-KB 2.4（pKS4-KB に類似）の
構成 pMC6をEcoRIとBamHIで分解した後、2.4kbpのファセオリ
ンcDNA断片を塩勾配遠心かゲル電気泳動により単離す
る。カナマイシン耐性遺伝子を含む1.9kbpの断片をpKS4
（図２１）のEcoRI及びBamHI分解から精製し、cDNA断片
及び、EcoRIで線状化したpBR322と混ぜ、連結し、K802
へ形質転換する。カナマイシン耐性コロニーを選択し、
プラスミドを単離し制限地図作成後、図２４に示すプラ
スミドをpKS4-KB2.4とした。

【０１６５】7. 2 Cla I kan／bean DNAのCla Iで分解
したpKS-Pro Iへの連結 pKS4-KB2.4をClaIで分解しClaIで線状化したpKS-proI
（図１５）と連結する。形質転換、選択、プラスミド単
離そして性格ずけの後、希望の構造（すなわち、ファセ
オリン配列がT-DNA プロモーターへ隣接している）をTi
プラスミドへ移入する。接種及び試験は実施例２１、１
９、及び２０に述べるとおりである。

【０１６６】（実施例８）この実施例は遺伝子からイン
トロンを除く方法を教える。これは、ゲノミックな環境
にcDNAを配置することと同じことである。制限酵素部位
は、処理されていない転写物（transcript) の５′及び
３′末端の両方のエクソン中に見出されるかあるいは特
異的変異により作られる。これらの部位はゲノミックク
ロン及びcDNAの両方に存在する。介在イントロンを含む
DNAを除き、対応するイントロンを含まないcDNAクロー
ン断片を２つの部位に橋渡しすることができる。逆の操
作も可能である：イントロンを含むゲノミック配列をcD
NA環境に配置することもできる。

【０１６７】ゲノミッククローンの中の断片をcDNAクロ
ーンを切り出した対応するすき間（gap)へ挿入する。こ
の後者の方法は類似しているが、イントロンがその変換
される断片を作るために選ばれる酵素に感受性な部位を
含むよりもしばしば、技術的にはより困難である。この
困難は部分分解の条件の注意深い選択とアガロースゲル
電気泳動による所望断片の精製により克服された。この
戦略をさらにねったものは、遺伝子内の個々のイントロ
ンを他のイントロンとエクソンとに影響を及ばさないで
操作すること、および不都合な介在する制限部位が上述
するようにイントロン内に存在するときの配列を段階的
に交換することを含む。

【０１６８】8. 1 ファセオリンのイントロンを含む断
片のcDNAとの置換 ファセオリン遺伝子及びその付近の配列のプラスミドク
ローンであるp3.8をEcoRIで部分分解、SacIで完全分解
し、pBR322ベクターと遺伝子の５′及び３′の両末端を
含む6.4kbpの断片をアガロースゲル電気泳動により単離
した。ファセオリンmRNAから作ったcDNAのpBR322プラス
ミドクローンであるpcDNA31をSacIで部分分解、EcoRIで
完全分解し、５′及び３′末端を除く全ファセオリンcD
NAを含む1.33kbpの断片をアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。これらの２つの断片を連結して、HB101へ
形質転換した。コロニーを選択し、細胞を増殖させ、プ
ラスミドを単離し、制限地図作成により、希望の構造を
もつプラスミドを決定した。このプラスミドをp3.8-cDN
Aとした（図２５) 。

【０１６９】8. 2 p3.8-cDNA の利用 次のことに留意のこと。p3.8-cDNA は他の実施例で用い
られているp3.8のようなゲノミックDNA源（source)の代
わりをすることができる。又、そのように使用したと
き、イントロンを欠いているという相違をもつ類似した
例となる。もしくは、この戦略はすでに作った構造から
イントロンを除くのに使うことができる。

【０１７０】（実施例９）この実施例はイントロンのな
い遺伝子の発現を教える。ファセオリンcDNAを実施例８
に述べたように調製する。遺伝子はイントロンを欠いて
いるがこれも又、使うことができる。

【０１７１】実施例８で教えたものと類似の構成を用い
る。pKS4-KB とpMC6を実施例８のようにEcoRIとSacIで
分解し、そこで示したようにcDNAを挿入したものをベク
ター及びファセオリンの５′及び３′末端部分を含むpK
S4-KB 断片に連結する。新プラスミド、pKS4-KBcをpKS4
-KBと類似した方法で構成に用いる。

【０１７２】（実施例１０）この実施例の目的はT-DNA
の中にT-DNA遺伝子のプロモーター支配下で、Phaseolus
vulgarisレクチンのcDNAを設置し、その構成物を植物
細胞へ移入し、植物組織でのこの構成物の発現を見つけ
ることである。

【０１７３】この構成には、制限酵素PstI及びHindIII
での分解により生じた粘着末端を接続する一本鎖リンカ
ーが使われている。下記のPstI部位とHindIII部位：

【０１７４】

【化２９】

【０１７５】が開裂すると次の末端を形成する。

【０１７６】

【化３０】

【０１７７】そして適当な配列のリンカーの存在下に混
ぜる。

【０１７８】

【化３１】

【０１７９】これらは、 互いに連結し、 次に示す構造
を形成し得る。

【０１８０】

【化３２】

【０１８１】HindIII部位が再び構成されたことに留意
のこと。

【０１８２】レクチンのcDNAをプラスミドクローン、 p
PVL134及びATCC39181より得る。pPVL134及びATCC39181
はポリＣ鎖をつけた２本鎖cDNAをPstIで切りポリＧ鎖を
つけたpBR322に挿入することにより構成した。このクロ
ーンはL.Hoffman et al.(1982) Nucleic Acids Res.10:
7819-7822により記述されたものと同種である。

【０１８３】10. 1 リンカーの合成 リンカー5’AGCTTGCA3’を実施例１７の方法により合成
する。

【０１８４】10. 2 レクチンcDNA及びカナマイシン耐
性遺伝子を含むクローンの構成 pPVL134をBclI及びPstIで分解し、レクチンのコーディ
ング配列、３′の翻訳されない領域及びC/G鎖を含む中
間の大きさの断片を電気泳動で分画後アガロースゲル電
気泳動から溶出することにより単離する。pBR 325をBcl
I及びHindIIIで分解し、一番大きな断片を塩勾配を通し
て、沈降させ単離する。BclI／HindIIIpBR 325断片をBc
lI／PstIレクチン断片及び例10.1で調製したPstI／Hind
IIIリンカーと混ぜ連結する。E.coli K802を形質転換
し、薬剤耐性及びレクチン配列の存在で選択する。その
ような、細胞から単離したプラスミドをIIcとする。IIc
をHindIII及びBamHI分解することにより生じた一番大き
な断片を前もってアガロースゲル電気泳動で単離したpK
S-4 のカナマイシン耐性遺伝子を持つHindIII／BamHI断
片（図２６)と混ぜ連結する。K802を形質転換し、コロ
ニーをカナマイシン耐性で選択する。プラスミドを単離
し制限地図を作成し、性格づけをする。希望のプラスミ
ドをPL-Bとする。

【０１８５】10. 3 pKS-pro IにおけるCla I部位のBam
HIへの変換 実施例5.1に示す構造をもつpKS-pro I（図１５参照）を
ClaIで分解する。この切断点は、1.6kbpの転写物のプロ
モーターとATG翻訳開始信号の間にある（図１参照）。
粘着末端を、DNAポリメラーゼIで埋めることにより平滑
末端に変える。BamHIリンカーをすき間に連結し、露出
したBamHI粘着末端を削り取り、連結し、K802へ形質転
換する。望むプラスミドpKS-pro IA（図２７）を持つコ
ロニーは「ミニプレップ」によるプラスミド単離および
制限酵素地図作成による性格づけの後選択される。

【０１８６】10. 4 レクチン及びカナマイシン耐性遺
伝子のpKS-pro IA への挿入 pL-B（実施例10.2）をBclI及びBamHIで分解し、カナマ
イシン耐性遺伝子及びレクチン配列をもつ断片を電気泳
動で分画後、アガロースゲルから溶出した。この断片を
BamHIで線状化した。pKS-pro IAと混ぜ連結した。連結
混合物をK802へ形質転換した、プラスミドをカナマイシ
ン耐性コロニーから単離し、制限地図作成により性格づ
けを行い、望みの構造をpLK-pro IA とした（図２
８）。

【０１８７】10. 5 植物中での発現 pLK-pro IAをK802 (pLK-proIA)、E.coli(2013)及びアグ
ロバクテリウム・チューメファシエンス(pTi 15955)(ス
トレプトマイシン耐性）の三親交雑（実施例２１）によ
りTiプラスミドへ移入する。pPH1J1のアグロバクテリウ
ムへの付加的、接合的移入の後、二重相同部位組み換え
体をカナマイシン、ストレプトマイシン、及びゲンタマ
イシン上で生育する細胞から選択する。レクチンは適当
な抗体を用いて、ELISA により見つける。

【０１８８】（実施例１１）この実施例の目的は、pTi
15955 及び他のオクトピンTiプラスミドのtms（「シュ
ーティング」ローカス（locus)）からtmr（「ルーティ
ング」ローカス（locus)）まで欠失しているTiプラスミ
ドを生み出すことである。この誘導体は有用である。な
ぜなら、これで形質転換した細胞の方が完全なtmsとtmr
遺伝子を持つpTi 15955で形質転換したものより容易に
完全な植物に再生するからである。

【０１８９】tms-tmr欠失pTi 15955は結局２つの方法で
変えられる。tms-tmrの不活性化及び外来遺伝子の挿入
である。これらの２つの変化が、T-DNAの違う所にある
ならば、各々の変化は異なるシャトルベクターによって
別々に挿入される。変化に依存する各々のシャトルベク
ターを独立に選択するには、少なくともアグロバクテリ
ウム中で２つの選択マーカーの使用が必要となるだろ
う。通常のカナマイシン耐性に加えてこの例では、pBR
325 由来のクロラムフェニコール耐性も用いる。

【０１９０】11. 1 クロラムフェニコール耐性遺伝子
クローンの構成 pBR325をHincIIで分解し、HindIIIリンカーと平滑末端
結合する。調製物をHindIIIで分解し、再結合し、クロ
ラムフェニコール耐性（cam)で選択したものを、pks-5
とする。これは、cam遺伝子をもつHindIII／BclI断片の
源となる（図２９）。

【０１９１】11. 2 欠失及び cam遺伝子をもつT-DNA
のpBR322クローンの構成 P203のHindIII完全分解BamHI部分分解から、9.2 kbpの
線状DNA 断片を単離する。cam遺伝子をもつ断片を、pKS
-5から単離し、9.2kbpの線状断片と混ぜ、連結し、E.co
liに形質転換する。そして、クロラムフェニコール耐性
で選択したものをpKS-Oct. Cam 203とする（図３０）。

【０１９２】pKS-Oct. Cam 203は現在、多数のpTi 1595
5 の欠失TL変異の構成に使えるプラスミドである。それ
は、TLの右手の腕及び右腕の左への耐性遺伝子を含む。
我々はTLの種々の左腕をCam遺伝子の左（HindIII部位）
へ付けることができる。簡単に言えば、もし、p102を付
けたら、欠失は5.2kbpでtmsとtmrのすべてを含むことに
なる。もし、p103を付けたら欠失は3.2kbpとなり、tms
の一部分とすべてのtmrを含むことになる。図１参照。

【０１９３】pKS-oct.Cam 203をHindIIIで分解する。p1
02あるいはp103を、HindIIIで分解し、2.2kbpあるいは
2.0kbpのT-DNA断片を単離し、線状化したpKS−oct. Cam
203と連結し、形質転換し、生ずるpKS-oct. delII（図
３１）あるいはpKS-oct. delI（図３２）をそれぞれ単
離する。これらの構成を接合、相同部位組み換え及び、
クロラムフェニコール耐性の選択によりアグロバクテリ
ウム・チューメファシエンスに移す。もしくは、BamHI
で、もっているプラスミド構成を線状化し、pRK290のBg
lII部位に連結するという。確立された方法を使えば構
成をpRK 290に移すことができる（図３３）。

【０１９４】（実施例１２）この実施例において、tmr
中のHpaI部位からtml中のSmaI部への間のT-DNAの欠失に
よりTiプラスミドを変異させる。修飾され得るTiプラス
ミドは、pTi 15955、pTiB6、pTiA66及びその他である。
この組み立ては、図３４に図解してある。

【０１９５】12. 1 cam遺伝子の単離 pKS-5(図２９)をHindIIIとBclIで分解する。実施例１１
で教えたように、最小の断片をアガロースゲルで分画
後、 単離する。

【０１９６】12. 2 欠失のあるT-DNAのpBR322クローン
の構成 T-DNA の右手の腕の欠失をp203のSmaI部位にBglII部位
を挿入することにより構成する（図１参照）。p203をSm
aIで分解し、BglIIリンカーを連結する。そしてBglIIで
分解し、再連結する。そしてK802へ形質転換する。（変
化した構成においては、BamHIリンカーをBglIIリンカー
の代わりに用いて適当なBamHI部分分解産物を単離す
る。）生じたプラスミドをp203-BglIIとする。そしてそ
れをBglIIとHindIIIで分解する。断片を含む大きなBglI
I／HindIIIベクターを実施例12.1に示したクロラムフェ
ニコール耐性断片と連結する。K802へ形質転換後、クロ
ラムフェニコール耐性を選択する。結果として生じたプ
ラスミドをp2fとする（図３４）。

【０１９７】12. 3 T-DNAの左手の腕の欠失したクロー
ンの構成 Hpa I分解及びHindIIIリンカーとの連結によりp202のHpa
I部位にHindIII部位を挿入する。HindIII分解によりHin
dIII粘着末端を露出させた後、HindIII末端を持つ2kbp
のHpaI断片を単離する。HindIIIで分解したHindIII末端
のHpaI断片をK802へ形質転換する。所望の構造をもつコ
ロニーを単離し、性格ずけをした後、そのプラスミドを
p3eとした（図３５）。

【０１９８】12. 4 T-DNA 欠失クローンの構成 クローンの左手の腕を、電気泳動後、アガロースゲルか
ら溶出し、p3eのHindIII分解物の2kbpの断片を精製する
ことにより得た。p2fをHindIIIで切りアルカリフォスフ
ァターゼ処理後、2kbp断片と混ぜ連結し、K802を形質転
換する。そしてクロラムフェニコール耐性で選択する。
プラスミドを個々のコロニーから単離し、制限地図作成
により性格ずけをした。望みの二つ連なった配置で２つ
の腕を持っているプラスミドを選択し、pKS−oct. delI
IIとした（図３６）。

【０１９９】pKS-oct. delIIIをアグロバクテリウム・
チューメファシエンスへ交雑により移し、相同部位組み
換え体をクロラムフェニコールで選択した。ヒマワリと
タバコの根と葉茎に他の例に示したものと同様に、接種
し、腫瘍の生成をオパインについて試験した。

【０２００】（実施例１３）この実施例は実施例１２の
変形例であり、tmrとtmlの欠失を構成することを教え
る。

【０２０１】13. 1 BglII部位でのクロラムフェニコー
ル耐性断片の構成 pBR325をHincIIで分離し、BglIIリンカーを平滑末端連
結しBglII分離後、再連結する（図３７）。クロラムフ
ェニコール耐性をK802あるいはGM33の形質転換した後、
選択する。結果として生じたプラスミド、pKS-6 cam遺
伝子をもつBglII／BclI断片の源となる。

【０２０２】13. 2 tmr、tml欠失クローンの構成 p203をHpaIとSmaIで分解する。BglIIリンカーの平滑末
端連結の後、BglII粘着末端を露出させる為に、BglIIで
分解する。再連結し、K802へ形質転換する。望みの構造
を同定し、p2とした（図３８）。

【０２０３】13. 3 T-DNA 欠失クローン（pKS-oct. de
lIIIa)の構成 cam 遺伝子をもつBglII断片をpKS-6から単離し、BglIIで
切ったp2へ連結する。K802の形質転換後、クロラムフェ
ニコール耐性を選択した。結果として生じるプラスミド
をpKS-oct. delIIIa(図３９）とし、実施例12.4に記述
しているように試験する。

【０２０４】（実施例１４）この構成の目的は、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子の挿入による、tmrローカス
のHpaI部位のみにおける変異の例を与えることである。
この遺伝子は、pKS-6からのBglII／BclI断片として単離
し、p203のHpaI部位をBglII部位に変えた後でそこに連
結する。

【０２０５】14. 1 HpaI部位のBglII部位への変換 p203をHpaIで分解しBglIIリンカーを連結する。BglIIで
分解し、再連結する。K802を形質転換後、コロニーBglI
I部位の挿入について制限地図作成により選別し、選択
する（図４０）。

【０２０６】14.2 cam遺伝子の単離 pKS-6をBglII及びBclIで分解する。最小の断片をアガロ
ースゲル電気泳動より単離する。

【０２０７】14.3 変異したT-DNA クローンの構成 実施例14.1で得た修飾されたp203をBglIIで分解し、実
施例14.2で精製したcam遺伝子と連結し、K802へ形質転
換する。クロラムフェニコール耐性を選択し、プラスミ
ドを単離し、制限酵素地図作成により性格ずけを行い、
pKS-oct. tmrとする（図４１）。

【０２０８】（実施例１５）この実施例における再生
は、Riに基礎をおくTIP により引き起こされるニンジン
の腫瘍を含む。そしてこの例は本質的にM.D.Chilton et
al.(1982) Nature 295：432-434 により示されたのと
同様に遂げられる。

【０２０９】15. 1 毛根（hairy root)における感染 ニンジンの平板(disk)に0.1mlの水の中で10594バクテリ
アを接種する。得られたルート(root)の端の1.5cm部分
を切りとり、ホルモンを欠く固体（1〜1.5％寒天）Moni
er培地（D.A.Tepfer and J. C.Tempe (1981) C.R.Hebd.
Seanc. Acad.Sci.Paris 295：153-156)に置く。そして
25℃から27℃の暗所で成育させる。

【０２１０】バクテリアの混じっていない培養物を２〜
３週間ごとに移し、ホルモンと寒天を欠くMonier培地に
おいてサブカルチャーとする。

【０２１１】15. 2 根（root）の植物への再生 実施例9.1 における培養根組織を0.36μM 2,4-D 及び0.
72μM キネチン（kinetin)を含む固体（0.8 ％寒天) Mo
nier培地に置く。４週間後、生じたカルス組織をホルモ
ンを欠く液体Monier培地に移す。振とう器（150rpm）で
22℃〜25℃にて保温している間にカルスは懸濁培養（こ
こから卵が分化する）へ分離していく。これをホルモン
を欠くMonier培地の入ったペトリ皿に移すと植物へ成長
する。これらの小植物を徐々に、湿気の少ない環境にさ
らして「鍛えた」後に、温室あるいは庭園の土壌へ移
す。

【０２１２】15. 3 毛ではない（non-hairy)根のベク
ターの使用 機能するtmr遺伝子を持たない、Tiが基礎となっている
ベクターを実施例15.1及び15.2に示したRiが基礎となっ
ているベクターのかわりに用いる。適当な欠失の構成は
実施例１２、１３及び１４に示してある。

【０２１３】（実施例１６）この例における再生は、Ti
に基礎をおくTIPにより引き起こされたタバコの腫瘍を
含む。又、この例は本質的にK.A.Barton et al.(1983)
Cellに示されたものと同様に遂げられる。

【０２１４】16. 1 クラウンゴールの感染 タバコ組織を、最初、A.C.Braun (1956) Canc.Res. 16:
53-56により表わされた転化した茎の一部分を用いる方
法により形質転換する。茎を７％市販クロロックス（Ch
lorox)および80％エタノールの溶液で表面殺菌し、殺菌
した蒸留水で洗い、１cmの断片に切り端を上にして、寒
天で固化したホルモンを欠くMS培地（T.Murashige and
F.Skoog (1962) Physiol. Plant.15：473-497 ）の入っ
たペトリ皿に置く。切り取った茎の表面に注射器の針で
穴をあけ、バクテリアを注入することにより接種を行
う。茎を25℃で１日あたり16時間光にあたるようにし
て、培養する。発育したcalliを茎切片の表面から取り
去り0.2mg/mlのカルベニシリンを含みホルモンを欠く固
体MS培地に置き、続いて、約１ヶ月の周期で３回、新し
いカルベニシリン入りMS培地に移す。そして、 バクテ
リアに支配され続けているかどうか、確認する為の試験
を行う。無菌の組織を補足物を欠いた固体MS培地上で前
述の培地条件で保存する。（25℃、16時間：８時間
明：暗）。

【０２１５】16. 2 形質転換した組織の培養 A. Binns and F.Meins（1979）Planta 145：365 −369
で示されたようにして、形質転換した無菌組織からクロ
ーンを得る。ナフタレン酢酸（NAA) 0.02mg／l入りの液
体MS培地で、2、3日間、25℃、135 rpmで振とう培養す
ることにより、カルス（calli）を懸濁細胞に変換す
る。そして、543 及び 213μmのステンレススチールメ
ッシュで、順番にろ過する。通過したろ液を濃縮し、0.
5％溶解した寒天(melted agar)、2.0 mg／l NAA、0.3mg
／lキネチン、0.4g／l Difco 酵母エキスを含む５mlのM
S培地に約８×10534 細胞／mlの濁度でプレーティング
する。直径１mmになったコロニーを外科用メス針 Scalp
el pointで拾い、2.0mg／l NAA、0.3mg／lキネチンを含
む固体MS培地へ置き、成育させる。生じたカルスを小片
に分割し、形質転換した表現型について試験する。

【０２１６】16. 3 植物の再生 形質転換した植物を 0.3mg／lのキネチンを含む固体MS
培地に置き、実施例16.1に示したように培養する。形成
した葉茎（Shoot)を1/10 強度のMS培地塩、0.4mg／lチ
アミンを含み、ショ糖及び、ホルモンを欠く固体（1.0
％寒天）培地（pH7.0）に置き根を出させる。根が出た
小植物を培養して成長させ、実施例15.2のように鍛え、
温室或いは、庭園の土壌に移す。

【０２１７】16. 4 使用ベクター 実施例16.1、16.2及び16.3に示した方法は、機能するtm
r遺伝子を欠くTiに基礎を置くベクターに適している。
適当な欠失の構成は、実施例１２、１３及び１４に示し
てある。これらの方法は、Riに基礎を置くベクターを用
いる場合も効果的である。実施例16.1に示した転化した
茎の切片の感染に関する方法はしばしばTIPで形質転換
したセルライン（cell line)を作るのに有用である。

【０２１８】（実施例１７）これまでの実施例で用いた
DNA断片の化学合成の手法は、DNA合成の専門家によく知
られた多くの手法を利用している。ヌクレオシドの修飾
は、H.Schallor etal.(1963) J. Amer. Chem. Soc. 8
5：3820及び H.Buchi and H.G.Khorana (1965) J.Amer.
Chem. Soc.87：2990らにより示されている。デオキシ
ヌクレオシドフォスフォルアミダイトの調製は S. L. B
eaucage and M.H.Caruthers (1981) Tetrahedron Lett.
22: 1859 により示されている。固相樹脂の調製は、S.
P.Adams et al.(1983) J.Amer. Chem. Soc.により示さ
れている。二本鎖合成リンカーの形成に有用なハイブリ
ダイゼーション課程は、J.J.Rossi et al.(1982) J.Bio
l.Chem. 257:11070により示される。

【０２１９】（実施例１８）ファセオリンは、Phaseoli
s vulgaris.の最も豊富な貯蔵タンパクである（全種子
タンパクの約50％）。機能するファセオリン遺伝子のア
ルファルファへの移入、及び貯蔵ファセオリンへのファ
セオリンmRNAの翻訳は重要な経済的価値を持つ。なぜな
ら、家畜飼料として、用いる葉に貯蔵タンパクを導入す
ることになるからである。アルファルファは牛の飼料と
なり、生育も早く、リゾビウムの共生によりチッ素固定
が可能で、クラウンゴールの感染ができ、単細胞或いは
プロトプラストから植物体を再生することができる。こ
れらのことから、アルファルファはファセオリン遺伝子
を移入し、発現されるのに価値ある植物だといえる。こ
の例は、発現し得るファセオリン遺伝子をアルファルフ
ァに導入することを教える。

【０２２０】18. 1 シャトルベクターの構成 遺伝的に手を加えたアグロバクテリウムのプラスミド
（後述）を持つクラウンゴール組織からアルファルファ
を再生させる。最初の段階として、我々はT-DNAプロモ
ーターの支配下にあるファセオリン構造遺伝子に連結し
ているtmr ５−４及びtms ５−T-DNA 変異を持つ「シャ
トルベクター」を構成する。この構成を、機能するネオ
マイシンフォスフォトランスフェラーゼ(NPTII) 構造遺
伝子（カナマイシン耐性）を下流に持つノパリンシンセ
ターゼプロモーター（M.D.Chilton、et al.(18 January
1983）15th Miami Winter Symposium により報告され
ている、又、J.L.Marx(1983) Science 219：830及びR.H
orsch et al.(18 January 1983）15th Miami Winter Sy
mposium参照)に順に連結する。この構成の形式は実施例
１に示してある。

【０２２１】18. 2 アグロバクテリウム及び植物細胞
への移入 “シャトルベクター”を型にはまった手法（実施例２
１)によりpTi 15955 のようなTiプラスミドをもつアグ
ロバクテリウム株へ形質転換する。組み換えプラスミド
を持つバクテリアを選択し、細胞壁を再生するアルファ
ルファプロトプラスト（Marton et al.(1979) Nature 2
77：129-131；G.J. Wullems et al.(1981)Proc. Nat'l
Acad. Sci (U.S.A.) 78：4344-4348 ；R.B.Horsch and
R.T.Fraley (18 January 1983）15th Miami Winter Sy
mposium）と一緒に培養する。培養中細胞は成長し、生
じたカルスについてスーザンブロッティング (実施例１
９)により適当なmRNAの存在を、そしてELISA 試験（実
施例２０)(J. L. Marx(1983)Science 219 ：830 ；R.B.
Horschand R.T.Fraley(18 January 1983) 15th MiamiWi
nter Symposium参照）により適当なタンパクの存在を試
験する。

【０２２２】18. 3 植物再生 それから、A.V.P Dos Santos et al.(1980) Z. Pflanze
nphysiol.99：261-270、T.J.McCoy and E.T.Bingham(19
77) Plant. Sci.Letters 10：59-66 and K.A.Walker et
al.(1979) Plant Sci. Letters 16：23-30らによりす
でに用いられたのと同様の方法により、カルス組織から
アルファルファを再生させる。それからこれらの再生植
物を新しい商品変種についての基礎を形成する型にはま
った植物育種の手法により栽培する。

【０２２３】（実施例１９）全ての例においてＲＮＡを
次に示す手順により抽出し分画し発見する。

【０２２４】19.1 ＲＮＡの抽出 この手順はSilflow et al.（1981）Biochemistry 13：2
725-2731の修飾型である。塩化セシウム遠心分離のかわ
りに、塩化リチウム沈澱を代用するのは、Murray et a
l.(1981）J.Mol.Evol.17：31-42 に示されている。2M塩
化リチウムに加えて2M尿素を沈澱に用いることはRhodes
（1975）J.Biol.Chem. 25：8088-8097より採用した。

【０２２５】組織を、ポリトンあるいはグラウンドグラ
スホモジナイザーを用いて、４〜５倍容量の冷50mM Tri
s・Cl（pH8.0 ）（４％p-アミノサリシル酸、１％トリイ
ソプロピルナフタレンスルホン酸、10mM ジチオスレイ
トール（新しく作る）および10mMメタバイ亜硫酸ソーダ
（新しく作る）を含む）中でホモジナイズした。 オク
タノールは泡立ちを制御するのに必要に応じて用いられ
た。１％8-ヒドロキシキノリンを含む等量のトリス飽和
フェノールをホモジェネートに加え、乳濁するまで振
る。そして20000〜30000gで4℃15分間遠心分離した。上
層の水層をクロロホルム／オクタノール（24：1）で１
回抽出し、上記のように遠心分離した。それから濃塩化
リチウム―尿素を最終濃度がそれぞれ2Mとなるように加
え、混合物を20℃で数時間静置した。そうしてＲＮＡ沈
澱物を遠心分離で落とし、ペレットを分散させる為に2M
塩化リチウムで洗浄した。沈澱物を70％エタノール−0.
3M酢酸ナトリウムで洗い、澄んだ溶液になるよう殺菌水
に溶かした。２分の１容量のエタノールを加え、混合物
を氷中１時間、放置した。その後、遠心分離し、余分な
多糖類を除いた。ＲＮＡ沈澱物をそれから、回収し、
水、あるいは殺菌済無塩、ポリ（Ｕ）緩衝液に再び溶解
した。

【０２２６】19.2 ポリ（Ｕ）／セファデックスクロマ
トグラフィー ２つのポリ（Ｕ）セファデックス（商標：Pharmacia,In
c.,Uppsala,Sweden）緩衝液を用いた。一つは、無塩
で、20mM Tris、1mM EDTAおよび0.1％SDSを含んでい
る。もう一つは、一つめの緩衝液に0.1Mの塩化ナトリウ
ムを加えたものである。A42605において、良好な会合を
起こすために、2x貯蔵緩衝液を作ることが必要である。
そして一部分に塩を加えるべきである。最終濃度にあわ
せてから、緩衝液をオートクレーブにかける。ポリ
（Ｕ）セファデックスは、Bethesda Research laborato
riesより得た。100μgの期待されるポリ（Ｕ）ＲＮＡに
ついて1gのポリ（Ｕ）セファデックスを用いた。ポリ
（Ｕ）セファデックスを、無塩のポリ−Ｕ緩衝液に水和
し、ジャケットをつけたカラムに流し込む。温度を、60
℃に上げ、カラムを無塩緩衝液で260mm におけるベース
ラインが平滑になるまで洗った。最終的には、カラムを
塩を含むポリ（Ｕ）緩衝液で40℃で平衡化する。

【０２２７】濃度が500μg／ml以下のＲＮＡを無塩緩衝
液中で65℃、５分間加熱した。その後、冷却し、塩化ナ
トリウムを0.1Mの濃度になるように加えた。それから光
学濃度が安定なベースラインまで落ちるまで、流速1ml
／min 以下で流したカラムにＲＮＡを移す。それから、
カラム温度を60℃まで上げ、ＲＮＡを無塩ポリ（Ｕ）緩
衝液で溶出させた。ＲＮＡは普通３倍のカラム容量で洗
い出される。溶出したＲＮＡを用いやすい容量まで２級
ブタノールで濃縮し、10mMになるように塩化ナトリウム
を加えた後、２倍容量のエタノールを加え沈澱させる。
エタノール沈澱物を水に溶かし、ＮＨ445-酢酸塩を0.1M
になるよう加える。そしてエタノールで再び沈澱させ
る。最終的に、ＲＮＡを殺菌水に再溶解し、-70℃にお
いて保存する。

【０２２８】19.3 ホルムアルデヒドＲＮＡゲル 用いる方法は Thomas (1980) Proc. Nat'l.Acid. Sci.
（U.S.A.）77：5201および Hoffman、et al.（1981）J.
Biol. Chem.256：2597によるものである。20mMリン酸
ナトリウム（pH6.8 〜7.0 ）を含む0.75〜1.5％のアガ
ロースゲルを固めた。もし高分子の集合したバンドが現
れたら、６％あるいは2.2Mのホルムアルデヒド（36％の
貯蔵溶液を用いる）を加えて、実験をやり直した。ホル
ムアルデヒドを、アガロースに65℃まで冷やしてから加
えた。ホルムアルデヒドを加えると臭化エチヂウムによ
り発見が困難になる。泳動緩衝液は10mMリン酸ナトリウ
ム（pH6.8 〜7.0 ）である。電気泳動に先だち、ＲＮＡ
を最終濃度６％ホルムアルデヒド、50％ホルムアミド、
20mMリン酸ナトリウム緩衝液および５mMＥＤＴＡの変性
緩衝液で処理した。ＲＮＡを緩衝液中60℃で10〜20分間
保温した。保温は停止緩衝液の添加に停止した。20μl
のサンプルについて、4μl 50％グリセロール、10mMＥ
ＤＴＡ５mMリン酸ナトリウムそしてブロムフェノールブ
ルーを加えた。浸水した電気泳動を用いる。ゲルを浸す
前にＲＮＡをロードした。そして125mA で５分間ゲルの
中にいれた。それからゲルを水に浸し、電流を30mA（夜
通し）あるいは50mA（６〜８時間）に下げる。緩衝液を
循環させ、低温室で電気泳動を行った。

【０２２９】19.4 “ノーザン”ブロット もし、特異的なＲＮＡを発見するためにブロットするゲ
ルならば染色しなかった。しかし、分離したマーカーの
レーンは染色に用いた。染色は0.1M酢酸ナトリウム中５
μg/ml臭化ブロマイドで行い、脱染は、0.1M酢酸ナトリ
ウム中数時間行った。染色の前に、５〜10分間60〜70℃
の水で処理すると視認が容易になった。ブロットするゲ
ルを15分間10ｘ標準サリンクエン酸（SSC）―３％ホル
ムアルデヒドに浸した。もし、大きなＲＮＡに切れ目を
入れるために50mM水酸化ナトリウム中10〜30分間処理し
た。もし、 基礎処理を用いたのなら、ブロットする前
に、ゲルを中和し、ＳＳＣ―ホルムアルデヒドに浸すべ
きである。ＲＮＡのニトロセルロースへの転移は標準方
法により行った。プレハイブリダイゼーションを42℃で
最低４時間、50％ホルムアルデヒド、10％硫酸デキスト
ラン、5xＳＳＣ、5xデンハート、100μg/ml変性キャリ
アーＤＮＡ、20μg/mlポリ（Ａ）、40mMリン酸ナトリウ
ム（pH6.8から7.0）、0.2％ＳＤＳ中で行った。ハイブ
リダイゼーションをプローブと同じ緩衝液に加え、一晩
保温して行った。プローブは大体5x10554 c.p.m.／ml以
上の濃度で用いた。ハイブリダイゼーション後、ニトロ
セルロースを、42℃で2xＳＳＣ、25mMリン酸ナトリウ
ム、5mMＥＤＴＡ、2mMピロリン酸ナトリウム溶液を用い
て何度も洗った。最後に、64℃で20分間1xＳＳＣで洗っ
た。 もし、オートラジオグラフィーに際して、フィル
ターが乾燥していなくて、また、プローグ１mMＥＤＴＡ
により64℃で広範囲に洗ったことで除かれているのな
ら、最上の結果が得られた。

【０２３０】（実施例２０）“ウェスタン”ブロット
（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、抗原を発
見するために行う）は、本質的にはR.P.Legocki and D.
P.S.Verma （1981）Analyt. Biochem.111 ：385-392 に
示されているのと同様に行った。マイクロ―ＥＬＩＳＡ
（enzyme-linked immnno- sorbant assay）を96個のウ
ェル（well）をもつImmulon-２型プレートを用いて次に
示すステップにより行った。

【０２３１】20.1 プレートへの抗体の結合 一日目、ウェルをコーティング緩衝液で１：1000に希釈
した。抗体（ウサギ抗ファセオリンIgG ）でコート（co
at）した。200μl／wellで37℃で２〜４時間、保温し
た。プレートをサランラップでおおった。それから、プ
レートをリン酸緩衝液サリン―ツィーン（ＰＢＳ−Twee
n ）で３回洗った。各々の洗いのステップは５分間あけ
た。それから１％のボバインセーラムアルブミン（ＢＳ
Ａ）を洗いのために加え、20分間放置してから捨てた。
洗いはＰＢＳ−Tween を用いて５回以上、行った。

【０２３２】20.2 組織のホモジェナイジング 組織を、小片に切ってから、ポリトロンにより１ｇの組
織／mlリン酸緩衝液サリン−ツィーン−２％ポリビニル
ピロリドン−40（ＰＢＳ−Tween−２％ＰＶＰ−40）の
条件でホモジェナイズした。すべてのサンプルは、破砕
前後およびファセオリン標準曲線の作成の前後に氷中で
保存した。組織のホモジェネートで標準曲線を作成し
た。そして、組織に依存するファセオリンの回収をチェ
ックするために緩衝液で標準曲線を作った。ホモジェナ
イズしたサンプルを、遠心分離した後、各々のサンプル
のうち100 μlをウェルに入れ、４℃で一晩放置した。
失敗を避けるために各々のサンプルについて２個同じこ
とをした。保温中、プレートはシールした。

【０２３３】20.3 酵素の結合 一晩保温後、抗原を捨て、ウェルをＰＢＳ−Tweenで５
回洗う。各々の洗いの間に５分間の間隔をおいた。結合
物（ウサギ抗ファセオリンIgG アルカリフォスファター
ゼ結合）をＰＢＳ−Tween−２％ＰＶＰ（0.2 ％ BSAを
含む）で１：3000に希釈し、150μlを各ウェルに加え
た。そして、37℃で３〜６時間保温した。保温後、結合
物を捨て、ウェルをＰＢＳ−Tweenで５回洗う。各々の
洗いの間に５分間の間隔を置く。

【０２３４】20.4 分析 分析を始める直前に、p−ニトロフェニルフォスフェイ
トの５mgの錠剤（Sigmaより得た。そして暗所で凍結保
存）を、10 mlの基質に加え、錠剤が溶解するまで攪拌
する。200μlの室温溶液をすばやく各ウェルに加える。
反応を種々の時間（例えば、t＝０、10、 20、 40、 6
0、 90、 120 分）においてdynatech micro-elisa read
er 用いて測定する。p−ニトロフェニルフォスフェート
（無色）がアルカリフォスファターゼにより無機リン酸
とｐ−ニトロフェノールに加水分解されるとｐ−ニトロ
フェノールが溶液に黄色を与える。それは、410nmにお
けるスペクトロメトリカリーによむことができる。発見
できる最小量は0.1ng より小である。

【０２３５】（実施例２１）三親交雑は、一般的に、次
に示すように行われた。当業者に知られた他の変法も用
いることができる。E.coli K802（pRK290に基礎をおく
シャトルベクター）をE.coli（pRK2013）およびストレ
プトマイシンに耐性なA.tumefaciens株と交雑した。pRK
2013は、シャトルベクターを持つ株に移り、Agrobacter
iumへ移入するためのシャトルベクターを作った。スト
レプトマイシンおよびシャトルベクターが耐性である薬
剤（だいたいカナマイシンか、クロラムフェニコール）
の両方を含む培地で成育するものの中からシャトルベク
ター配列を有する。Agrobacterium の細胞を選択した。
これらの細胞とE.coli（pPH1J1）との交雑によりAgroba
cterium細胞にpPH1J1が移った。pPH1J1とpRK290に基礎
を置くシャトルベクターは同一細胞内に長時間、共在す
ることができない。ゲンタマイシン（pPH1J1が耐性遺伝
子をもつ）を含む培地で成育させれば、pRK290配列の欠
落した細胞を選択することができた。ストレプトマイシ
ンおよびゲンタマイシンおよびカナマイシンあるいはク
ロラムフェニコールに耐性な細胞のみがシャトルベクタ
ーと二重相同部位組み換えをおこしたTiプラスミドを持
ち望みの構成をもっている。

【図面の簡単な説明】

【図１】pTi 15955のＴ−ＤＮＡ領域を示す説明図であ
る。

【図２】オクトピシンセターゼ遺伝子の塩基配列図であ
る。

【図３】ファセオリン遺伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列
の一部を示す図である。

【図４】ファセオリン遺伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列
の一部を示す図である。図３と図４とでファセオリン遺
伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列を示す。

【図５】ノパリンシンセターゼ遺伝子の完全塩基配列の
一部を示す図である。

【図６】ノパリンシンセターゼ遺伝子の完全塩基配列の
一部を示す図である。

【図７】pKS-nop IVの構造を示す説明図である。

【図８】pKS-Nop IVKB3.8の作成と構造を示す説明図で
ある。

【図９】pKS4-KBの構造を示す説明図である。

【図１０】シャトルベクターpNNN1の構造を示す説明図
である。

【図１１】pNNN2の作成とその構造を示す説明図であ
る。

【図１２】p401の右側にclaI部位のあるHindIII部位か
らの塩基配列の一部を示す説明図である。

【図１３】p401の右側にclaI部位のあるHindIII部位か
らの塩基配列の一部を示す説明図である。図１１と図１
２とで、p401の右側にclaI部位のあるHindIII部位から
の塩基配列を示す。

【図１４】pTi 15955の構造を示す説明図である。

【図１５】pKS-Pro I の作成を示す説明図である。

【図１６】p7.2の構造を示す説明図である。

【図１７】pKS-Pro I-KBの構造を示す説明図である。

【図１８】ファセオリン貯蔵タンパク遺伝子の構造を示
す説明図である。

【図１９】p3.8の構造を示す説明図である。

【図２０】pBR322の構造を示す説明図である。

【図２１】pKS-4の構造を示す説明図である。

【図２２】pKS-KB3.8の構造を示す説明図である。

【図２３】pKS4-KB2.4の作成手順を示す説明図である。

【図２４】pKS4-KB2.4の構造を示す説明図である。

【図２５】ファセオリンンの遺伝的環境へのファセオリ
ンｃＤＮＡのクローニングを示す説明図である。

【図２６】pL-Bの作成を示す説明図である。

【図２７】pKS-ProIAの構造を示す説明図である。

【図２８】pLK-ProIAの構造を示す説明図である。

【図２９】pKS-5の作成を示す説明図である。

【図３０】pKS-oct.Cam203の作成を示す説明図である。

【図３１】pKS-oct.del IIの構造を示す説明図である。

【図３２】pKS-oct.del Iの構造を示す説明図である。

【図３３】pRK290の構造を示す説明図である。

【図３４】p2fの作成を示す説明図である。

【図３５】p3eの作成を示す説明図である。

【図３６】pKS-oct.del IIIの作成を示す説明図であ
る。

【図３７】pKS-6の作成を示す説明図である。

【図３８】p2の作成を示す説明図である。

【図３９】pKS-oct.del IIIaの作成を示す説明図であ
る。

【図４０】p203のHpaI部位のBglII部位への変換を示す
説明図である。

【図４１】pKS-oct.tmrの構成を示す説明図である。

【図４２】実施例１１、１２、１４のプラスミドの構造
を示す説明図である。

【図４３】遺伝子コードを説明する説明図である。

【図４４】大腫瘍遺伝子の塩基配列図である。

【図４５】p203の構造を示す説明図である。

【図４６】pKS-B17-KB3.0の構造を示す説明図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ティモシー シー．ホール アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53711 マジソン，ノース フィットニー ウェ イ 210 (72)発明者 ジェリー エル．スライトム アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53714 マジソン，レタナ ドライブ 5010 (72)発明者 デニス ダブリュ．サットン アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53558 マックファーランド，アルベン アベニ ュー 5611 (72)発明者 ノリモト ムライ アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53703 マジソン，ウエスト ゴーラム ストリ ート 138

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (a)Ｔ−ＤＮＡプロモーターを含むＴ−
   ＤＮＡへ植物構造遺伝子を挿入し、該プロモーターと該
   植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植
   物細胞内で植物構造遺伝子が発現するような位置と方向
   にあり、それにより、Ｔ−ＤＮＡと植物構造遺伝子との
   結合を形成する工程、次いで、(b)該Ｔ−ＤＮＡ／植物
   構造遺伝子の結合物を植物細胞に移入する工程、を包含
   する植物細胞の遺伝的修飾方法。
2. 【請求項２】 前記工程(b)の実行後に、さらに、(c)前
   記Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺伝子結合物を含
   む植物細胞内での植物構造遺伝子の発現を検知する、請
   求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記植物構造遺伝子は１つあるいはそれ
   以上のイントロンを含む、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記植物構造遺伝子は種子貯蔵タンパク
   をコードしている、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記植物構造遺伝子はファセオリンをコ
   ードしている、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造
   遺伝子結合物は前記工程(b)に先立ってシャトルベクタ
   ーの一部分として保存され複製される、請求項１に記載
   の方法。
7. 【請求項７】 前記工程(b)のプロモーターはtmr、tm
   l、tms、ノパリンシンセターゼ、オクトピンシンセター
   ゼおよび"1.6"転写物からなる群から選択される、請求
   項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ構造遺
   伝子へ融合されており、そのことにより前記Ｔ−ＤＮＡ
   構造遺伝子／植物構造遺伝子結合物がＴ−ＤＡにコード
   されるタンパクと植物のタンパク配列とを含む融合タン
   パクをコードする、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記細胞は双子葉植物からのものであ
   る、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記双子葉植物はコンポジテあるいは
    レグミノシの一員である請求項９に記載の方法。