CN100424177C

CN100424177C - 融合杀虫基因cryci及其应用

Info

Publication number: CN100424177C
Application number: CNB2005100768233A
Authority: CN
Inventors: 郭三堆; 张锐; 武东亮
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2008-10-08
Anticipated expiration: 2025-06-17
Also published as: CN1782084A

Abstract

本发明提供了一个融合杀虫蛋白质基因cryci，该基因包含编码苏云金芽孢杆菌Cry 1A活性结构域和编码豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTI活性结构域的DNA序列；提供了该融合杀虫蛋白质基因的重组酵母和植物表达载体，重组酵母具有高效分泌表达融合杀虫蛋白质的特性，转基因植物也具有高效表达融合杀虫蛋白质的特性。所说表达载体转化酵母后，可产生对害虫，尤其是鳞翅目害虫有高杀虫性的融合杀虫蛋白质，并可被肠激酶酶解出两个活性杀虫蛋白质；所说表达载体转化植物后，可产生对害虫，尤其是鳞翅目害虫有高杀虫性的转基因植物及其后代，并可延缓鳞翅目害虫对Bt.Cry 1A杀虫蛋白产生抗性的进程。本发明特别提供了转cryci基因烟草和棉花。

Description

融合杀虫基因cryci及其应用

技术领域

本发明涉及一个编码融合蛋白质的DNA序列，即编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质和编码豇豆胰蛋白酶抑制剂以及将其进行连接的编码昆虫肠激酶切割序列的DNA序列，包含所说的DNA序列的植物表达载体，被所说的载体转化的植物细胞，以及由所说的细胞产生的对昆虫(特别是鳞翅目昆虫)表现有高抗性且昆虫难以对之产生耐受性的转基因植物及其后代，包括植物任何组织。

背景技术

利用生物技术手段可以获得对特定害虫有杀虫作用的转基因植物。其中，较为熟知的例子是应用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis，以下简称Bt.)的伴胞杀虫晶体蛋白基因。Bt.可产生对多种昆虫有杀虫作用的伴胞晶体蛋白质，这些蛋白质可以在低浓度情况下各自特异地杀死包括鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等一些作物害虫(Klausner，Bio/Technology 2：408-419)。这种生物杀虫剂对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且不会污染环境。

基于Bt.杀虫蛋白质的性质，多年前就已经生产了有关在商业上出售的含有Bt.产生的孢子及结晶蛋白质的商品杀虫制剂(商品名为DIPEL和THURICIDE)。这种商品杀虫剂可有效地对抗五十种以上的鳞翅目害虫(Wilcox，et al.，Protein Engineering，Inouye and Sarmg.(Eds.)AcademicPress，NY，1968)。然而，使用Bt.杀虫制剂的一个重要限制是由于所说的杀虫蛋白质或δ-内毒素容易在环境中被降解，使生产上需要重复施用这种杀虫制剂，大大增加了成本，从而为农业生产上的实际应用带来困难。

为解决这个问题，科学家们经过了一系列关于可以表达Bt杀虫蛋白质的抗虫转基因植物的研究(Umbeck等人，Bio/Technology，5：262-266，1987；Vaeck等人，Nature 328：33-37，1987；schhoff等人，Bio/Technology 5：807-813，1987；Barton等人，PCT 89004868；郭三堆等人，CN95119563.8)。最后，Perlak等(Bio/Technology 8：939-942，1990)和郭三堆等(CN 95119563.8，1995)利用Bt.杀虫蛋白基因，按照植物优化密码子，采用人工合成的方法，获得了可以在植物中高效表达的Bt.杀虫蛋白质基因。并进一步构建了高效植物表达载体，转入棉花、玉米、水稻等作物，获得了抗虫性稳定、抗虫率达80％以上的抗虫转基因作物。

另一类可用于抗虫转基因植物研究的生物分子是蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitors，以下简称PIs)。PIs是一类可以抑制蛋白酶水解活性的蛋白质，小到由十几个氨基酸组成，大到由几百个氨基酸组成。动物、植物和微生物中都含有PIs。自然界中存在的PIs有四大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂，巯基蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶制剂。在植物中还没有发现天冬氨酰蛋白酶抑制剂，它和金属蛋白酶抑制剂都基本上没有抗虫性，而在抗虫植物基因工程领域中，丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂被证明是很有研究和应用价值。其中，一个较为常见的例子是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpwa typsin inhibior，CpTI)。1987年，Hilder等首先报导了将CpTI基因导入烟草获得了高效表达CpTI的抗虫植株。用烟草夜蛾做杀虫实验，结果对烟草夜蛾抗性显著(Hilder，V.A.etc.Nature 330，160-163，1987)。

作为生物杀虫剂，单一苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的杀虫活性较为专一，而且靶昆虫较易对之产生抗性(McGaughey W.H.，Science.229：193-195，1985)。而蛋白酶抑制剂则杀虫谱宽，而且害虫很难直接产生抗性。但其杀虫能力不如苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质。因而，为获得昆虫较难以对之产生抗性的，具有较强杀虫能力的转基因植物，郭三堆等人(ZL 98 1 02885)又尝试了使苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质及豇豆胰蛋白酶抑制剂两种杀虫基因在植物细胞内同时表达。这将在提高转基因植物抗虫能力的同时使昆虫对转基因植物产生耐受性的可能大大降低。但是，利用专利(ZL 981 02885)中所述的方法培养出来的转基因抗虫棉却出现了两个基因不同步表达的现象(康保珊等，棉花学报，17(3)：131-136，2005)，这样一来，增加了筛选两种杀虫基因同步高效表达转基因植株的难度。为了避免上述情况发生，本发明尝试了将Cry1A和CpTI两种蛋白质活性结构域编码序列用一段寡核苷酸连接起来，构建出一个自然界本不存在的融合基因，并将构建表达载体并转化植物，使转基因植物表达出一种具有Cry1A和CpTI两种蛋白质活性的融合蛋白质，这将能保证在转基因植物中，这两种杀虫机理不同的蛋白能以融合蛋白的形式达到完全同步表达，实现在提高转基因植物抗虫能力、拓宽其杀虫谱的同时，使昆虫对转基因植物产生耐受性的可能性降低。

发明内容

本发明提供了一种将Cry1A和CpTI两种蛋白质活性结构域编码序列进行融合，使之适合于在普通植物中表达的一种方案。根据这个方案，在本发明的一个实施方案的一个方面中，我们构建出针对鳞翅目害虫的一个融合杀虫蛋白质基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。此外，根据本发明的将两种杀虫蛋白活性结构域进行融合的方案，也可以利用SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，将其它类型的杀虫蛋白基因进行融合。但本领域的技术人员可以理解到，为本发明的目的，其它杀虫蛋白活性结构域编码序列可用SEQ ID NO：8的核苷酸序列或其功能等同物进行有效连接。

根据本发明的一个优选实施办法，所提供的融合杀虫蛋白质基因由三个部分组成：针对鳞翅目害虫有毒性作用的编码Bt.杀虫蛋白活性结构域的DNA序列；有广谱抗虫活性的编码豇豆胰蛋白酶抑制剂活性结构域的DNA序列；连接上述两段DNA序列的编码昆虫肠激酶(Enterokinase，EK)切割序列的寡核苷酸序列。

本发明所采用的Bt.杀虫蛋白质基因是中国专利95119563.8中所描述的，采用植物优化密码子人工合成而获得的。根据本发明的一个实施方案，该基因具有SEQ ID NO：1中64-1824或1-1824号核苷酸序列。

本发明还涉及豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI基因)。特别是为达到本发明的目的而经过修饰的该基因。

本发明所采用的CpTI基因是中国专利ZL 98102885中所描述的，通过PCR的方法获得的。根据本发明的一个实施步骤，该基因与天然CpTI基因的一个显著区别是基因内部不含有EcoRI位点；并且，本发明所提供的CpTI基因首先与肠激酶切割位点编码序列连接，连接体5’及3’端均带有合适的限制性酶切位点。其中，基因5’端带有XhoI位点，3’端带有SalI位点。

根据本发明的一个实施方案，所采用的肠激酶切割位点编码序列具有SEQ ID NO：1中1813-1830号核苷酸序列。所采用的CpTI基因具有SEQ ID NO：1中1831-2112号核苷酸序列。本发明所采用的CpTI基因编码的蛋白质属于T/T型双头胰蛋白酶抑制剂。即每个蛋白酶抑制剂分子含有两个胰蛋白酶的抑制活性中心。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及为在毕赤酵母中有效地表达上述融合杀虫蛋白质所需之调节及控制元件。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的融合杀虫基因酵母表达载体中，所说的5’端非编码区包括AOX1启动子及α因子分泌信号序列，3’端使用AOX1转录终止子。外源融合杀虫蛋白基因表达盒线性整合至毕赤酵母基因组后，在诱导条件下，可高效分泌表达融合杀虫蛋白。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及为在受体植物中有效地表达上述融合杀虫蛋白质所需之调节及控制元件。

为了使外源杀虫基因产物在植物细胞中在转录和翻译水平上获得有效表达，在包含编码区的外源DNA序列侧翼必须连接有适当的表达调节和控制元件。这些控制元件包括启动子、增强子、终止子，转录产物的末翻译部分、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。常用的植物细胞转录启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和根癌农杆菌T-DNA的胭脂氨酸合酶启动子。这些启动子在大多数植物细胞中都是有效的，但其插入位点和插入的拷贝数目不同，将对其下游的蛋白质编码序列的转录和翻译活性产生很大影响。

因而，本发明涉及翻译增强序列、在任何读码情况下均能正确终止的多联终止子序列、对转录过程得到的mRNA进行正确切割的加工序列等。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的融合杀虫基因植物表达载体中，所说的5’端非编码区由一个含加倍增强子的启动子序列，一个Ω序列和一个Kozak序列组成。本发明优选的是带有加倍增强子元件的CaMV 35s启动子。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列，该序列富集TTAAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al，Eur.J.Biochem.84：513-519，1987)。本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，Nucleic Acids Research 12：857-872，1984；Cell，44：283-292，1986)。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的融合杀虫基因植物表达载体中，所说的3’端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割和切割后加工序列和终止子。在本发明的一个优选的实施方案中，设计并合成了直接连接于杀虫融合基因3’端的多联终止子序列，在该核苷酸的短序列中，包括有三个分别位于不同读码框中的终止密码子。从而即使在对其左翼的结构基因序列的翻译过程出现错读，也将得以正确终止。另外，3’端正确切割和加工序列进一步保证了蛋白质翻译的正确终止。适用于本发明的融合杀虫基因高效植物表达载体还包括Nopaline(Nos)基因的终止子。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码序列之5’和3’端侧翼序列是以化学方法合成的。

为了提高本发明的融合杀虫基因在单子叶禾本科植物中的表达效率，可在结构基因与启动子序列之间加入适当大小的内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶基因的第一内含子(Gene andDevelopment 1：1183-1200，1987)、衍生于蓖麻油植物的过氧化氢酶基因的第一内含子(Tanaka et al.，Nucleic Acids Research 18：6767-6770，1990)等。

可使用本领域中已知的方法将本发明的适于在植物细胞中表达融合杀虫蛋白质的基因构建体连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Gene 103：1985)，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆酶切位点的一系列统称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)。尤其是植物表达载体pBIl01，pBIl21以及PBIl31系统(Jefferson，et al.，EMBO J.16：3901，1987)，等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述本发明融合杀虫基因构建体的载体是pUC19、PBIl21.1等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。

当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组的表达载体还进一步含有可选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有调节序列，以促使其在植物中的表达。适用的选择标记基因是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPT II)基因，包含于上述重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。

因此，根据本发明的另一个方面，本发明进一步提供适于在植物细胞中表达融合杀虫蛋白质及的植物表达载体，其中包含：

1).融合杀虫蛋白质基因表达盒；

a).5’端非编码区；

b).编码融合杀虫蛋白质的基因；

c).3’端非编码区。

2).来源于pBI 121.1的载体部分：

a).新霉素磷酸转移酶基因(NptII)表达盒；

b).起始复制子及与植物转化相关的左右边界序列等功能结构。

根据布达佩斯条约的规定；申请人已于2005年6月1日将转化到大肠杆菌DH 5a宿主细胞中的本发明构建的融合杀虫基因植物表达载体(pGBIf4ABC)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.1382。

通过本发明所提示的融合杀虫蛋白质的构建方案，所得到的符合SEQ ID NO.1的核苷酸序列，可以通过DNA重组技术链接到上面所描述的表达载体中，并使之转入并整合到植物基因组中。而且融合杀虫基因在目标植物中的表达可赋予该植物对害虫，尤其是针对鳞翅目害虫的杀虫性。

应该指出，上面所描述的表达载体是本发明的一个优选实施例，并未限制本发明。凡是应用本发明所描述的杀虫融合基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。尤其是该融合杀虫基因还可以通过与其它任何杀虫基因重组或协同，以获得杀虫能力更强、杀虫范围更宽或这两方面都得到加强的转基因植物。包括如下的实现方式：

1.与其它一种或几种杀虫基因重组，构建多种杀虫基因的表达载体并转入植物；

2.与其它一种或几种杀虫基因以相同或不同的方式融合，构建表达载体并转入植物；

3.与其它一种或几种杀虫基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分步到如同一种植物受体。

用相类似的方法，本发明构建的融合杀虫基因还可以与其它目的基因进行重组或协同，以达到具有除杀虫性以外的其它优良性状的转基因植物，如抗病、抗逆基因等。也包括利用选择标记基因而获得利于筛选转基因植株的转基因植物等，例如抗除草剂基因。

为了在植物细胞中特别是整株植物中表达融合杀虫蛋白质，以赋予整株植物及其种子和后代以杀虫能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的融合杀虫蛋白质的编码序列的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。

将携带外源基因的重组载体导人宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于1)使用农杆菌(Agrobacterium)作为植物病原体所介导的农杆菌转化法(Agrobacterium Mediated transformation)、2)物理法，如基因枪法(Particle Bombardment & particle gun & Gene gun)、电击融合法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretictransfection)等。3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等。4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等。5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。

本发明使用农杆菌转化法将融合杀虫基因转化模式植物烟草；同时使用种质系统转化法中改进的子房注射植物受精胚囊法(参见CN 95119563.8，1995；Zhou et al，Enzymol.Method.101：433-451，1983)转化棉花。

我们优选棉花作为融合杀虫基因转化的受体植物。棉花作为一种经济作物，我们无需考虑其作为食品的安全性问题；其次，在世界范围内被广泛种植的棉花每年因虫害造成的经济损失是十分巨大的；另外，目前已应用的单价抗虫棉面临着将来害虫对之产生耐受性的潜在危险和由于杀虫谱窄而导致棉田次要害虫上升为主要害虫。

因而，本发明涉及的融合杀虫基因，包含所说融合杀虫基因的植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞、组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物害虫具有控制和毒杀能力的转基因植物，特别是对鳞翅目昆虫例如棉铃虫等具有显著毒杀作用的转基因棉花。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了产生对鳞翅目有毒性且害虫对这种毒性较难以产生耐受性的植物的方法，该方法包括：

1).构建所说的融合杀虫基因植物表达载体；

2).用任何一种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对多种害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括任何部分的植物组织。

这里应特别指出的是，虽然在本发明下述实施例中以转基因棉花的产生举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的融合杀虫基因的DNA序列及携带该DNA序列的重组表达载体只用于转化和生产具有抗虫能力的转基因烟草和棉花。

因此，使用具有本发明所描述的特征的融合杀虫基因表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的导入了外源融合杀虫基因的，具有杀伤或控制植物敏感害虫之能力的植物，其后代及其种子和植物部分，均包括在本发明之内。

附图说明

本发明给出了九张附图。

附图1说明了融合杀虫基因植物表达载体pGBIf4ABC的构成。在该载体中，主要包括两个基因表达盒：1个是标记基因nptII的表达盒，由nptII基因及其5’端的Nos启动子和3’端的Nos终止子组成；另1个是融合杀虫基因表达盒，由融合杀虫基因cryci及其5’非编码区(包括带加倍增强子的35S启动子，Ω序列和Kozak序列)和3’非编码区(包括切割加工序列和Nos终止子)组成。这两个表达盒以同向串联的方式连接在一起。

附图2说明了融合杀虫基因酵母表达载体pPIC9KBC的构成。在表达载体pPIC9K的多克隆位点插入了融合基因。其5’端包括AOX1启动子及α因子分泌信号序列，3’端使用AOX1转录终止子。

附图3为重组酵母表达产物的SDS-PAGE分析结果，其中第1泳道为蛋白分子量标记，第2泳道为对照KM71诱导培养液上清，未出现目的带，第3、4泳道为重组酵母诱导培养液上清，出现了与预期大小相符的目的带。

附图4为重组酵母诱导表达产物肠激酶酶解分析结果，第1泳道为蛋白分子量标记，第2泳道为未酶解的重组酵母诱导表达的融合蛋白，第3泳道为酶解后的重组酵母诱导表达的融合蛋白，经酶解后出现了大小分别为65KD和10KD的两条蛋白带。

附图5为转基因烟草植株的Southern Blot结果。EcoRI和Hind III为融合杀虫基因cryci及其表达调控元件两端的位点，转基因植株中预期的杂交带应与转化质粒pGBIf4ABC所切的带大小相同，为3.4kb。CK+泳道为酶解质粒pGBIfABC，CK-泳道为酶解非转基因烟草基因组DNA，1-7泳道为酶解非转基因烟草基因组DNA。1、4、5、6泳道均出现了与预期大小3.4kb相符的杂交条带。

附图6为转基因烟草Western Blot结果。CK+泳道为标准的BT Cry1A蛋白，CK-泳道为非转基因烟草粗蛋白，1-7泳道为转基因烟草粗蛋白。1、5、6泳道均出现了与融合杀虫蛋白预期大小75KD相符的免疫杂交条带。

附图7转基因棉花PGR检测结果。泳道1的模板为质粒pGBIf4ABC，泳道2的模板为非转基因棉花基因组DNA，泳道3-11为转基因棉花基因组DNA，泳道12为DNA分子量标记。泳道3-11均出现了与预期大小1.1kb相符的杂交条带。

附图8为转基因棉花斑点杂交分析结果。A6为质粒pGBIf4ABC，A5为非转基因棉花基因组DNA，其余为转基因棉花基因组DNA。A3、A4、B1、B2、B4、C2、C4、C5、C6均表现出较强的杂交信号。

附图9转基因棉花室内抗棉铃虫实验结果。取转基因棉花幼嫩叶片放置在培养皿中，用湿棉球保持叶片清鲜，每叶接2日龄的棉铃虫12头，4天后观察杀虫结果并照相记录。1为非转基因棉花叶片，2为非转融合杀虫基因cryci棉花叶片。

具体实施方式

给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

实施例一：编码CpTI活性结构域DNA序列的获得

及其与编码肠激酶切割序列的寡核苷酸片段的连接

1.1编码CpTI活性结构域DNA序列cpti的获得

以本实验室构建的质粒pG4AC为模板，用合成引物SEQ ID NO.3和SEQID NO.4进行PCR扩增，结果得到282bp的DNA片段，PCR产物经加磷补平后，电泳回收纯化。载体pUC19经EcoRI和HindIII双酶切后，用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow大片段补平，电泳回收2.7kb大片段。将282bp的CpTI基因与此2.7kb片段连接后，转化DH5α感受态细胞，经Cracking筛选，得到重组子定名为pGCI。用BamHI+SalI和PstI+SalI进行双酶切鉴定，证实了282hpPCR产物的插入。

1.2编码肠激酶切割序列的寡核苷酸片段与cpti的连接

化学合成所设计的单链寡核苷酸片段SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，将两个片段等摩尔进行退火处理，获得Xho I接头。同时将质粒pGCI用BamHI和Pst双酶切并脱磷后电泳回收约2.9kbDNA片段，与Xho I接头连接，转化大肠杆菌后，得到重组质粒pGC2，经Xho和SalI双酶切及Xhol单酶切鉴定，证明带有肠激酶切割位点编码序列的XhoI接头已插入到CpTI基因的5’端。以pGC2为模板，进行序列测定，证明该质粒中带有正确的CpTI基因片段，并且肠激酶切割位点编码序列正确地连接到CpTI基因的5’端。PGC2中所克隆CPTI基因序列见SEQ ID NO.7。

实施例二：融合杀虫基因及其植物表达载体构建

2.1带有融合杀虫基因表达盒的构建

本实施例所构建的融合杀虫基因表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的带有加倍增强子的35S启动子、Ω序列及kozak序列，3’端的多联终止序列、切割加工序列以及NOS终止子。这些表达调控元件除355启动子和增强子之外都是通过化学方法人工合成的(详见中国专利CN 951 19563.8，1995)。在本实验室所保存的带有人工合成的Bt.杀虫蛋白基因表达盒的质粒pG4AB中包括有这些元件。

用XhoI与SalI酶切质粒pGC2，电泳回收约300bP的CpTI基因片段。将此片段连接到经Xho I单酶切的质粒PG4AB上，得到重组质粒pGf4ABC，经XhoI和EcoRI双酶切鉴定，证明CPTI以正确的方向连接到GFM CryIA的3’端，至此融合杀虫基因CryCI已经按预先设计的方案构建成功，并且该融合基因受植物高效表达调控元件的控制。

2.2融合杀虫基因植物表达载体的构建

用HindIII和EcoRI双酶切切下pGf4ABC中约3.5kb的融合杀虫基因表达盒，克隆到经HindIII和EcoRI双酶切后回收的pBI121.1大片段上，获得重组质粒pGBIf4ABC。这就是所构建的融合杀虫基因的植物表达载体。其质粒图谱见附图1。

实施例三：融合杀虫基因在毕赤酵母中的功能鉴定

3.1融合杀虫基因酵母表达载体的构建

3.1.1Ω序列和Kozak序列的去除及与NCoI接头的连接

本实施例采用Invitrogene公司生产的毕赤酵母(P ichia)表达试剂盒，并采用其分泌型表达载体(pPIC9K)。质粒pPIC9K上含有一个270bp的a因子分泌信号，最终翻译成90个氨基酸的信号肽，携带目的蛋白分泌到酵母细胞外。所以构建表达载体时，需要将外源基因编码区的5’端连接到a因子分泌信号的3’端，并且必须在一个读码区内，否则会造成移码，目的蛋白得不到表达。实施例二中构建的融合杀虫基因克隆载体pGf4ABC在起始密码子与355启动子之间有一个68bp的Ω序列和Kozak序列，需将此序列去除，方可将融合基因的起始密码子与a因子的3’端连接。否则，可能会造成非正常翻译或翻译终止而影响外源基因的表达。

化学合成所设计的单链寡核苷酸片段SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，将两个片段等摩尔进行退火处理，获得Nco I接头。将质粒pGf4ABC用BamHI和Pstl(部分酶切)双酶切后回收去掉Ω序列和Kozak序列后的约6.0kb的载体片段，与NcoI接头连接，转化大肠杆菌DH5a，得到质粒pGf4ABC(Ω^-)，用NcoI和SacI进行双酶切鉴定，结果表明Ω序列和Kozak序列已被NcoI接头代替。

用Ncol和Sacl双酶切质粒pGf4ABC(Ω^-)，Klenow修平两端后，电泳回收约2.4Kb的融合基因片段，平端接连到经SnaBI酶切的载体pPIC9K上，得到融合杀虫基因分泌型酵母表达载体pPIC9KBC。其质粒图谱见附图2。

3.2酵母转化及筛选

质粒pPIC9KBC经电激转化酵母细胞后，通过同源重组，目的基因可以整合到酵母基因组中(Sreekrishna等人，J.Basic Microbiol.，28：265-278，1988)。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOXI(乙酸氧化酶)启动子可以启动其下游基因的表达(Ellis等人，Mol.Cell.Bio，5：1111-1121，1985)，而且a因子信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，最终分泌到胞外。外原蛋白经过这样的代谢途径可以进行翻译后修饰，例如糖基化、二流键的形成等，从而得到具有生物活性的蛋白。

首先用SalI消化质粒pPIC9KBC，使之线性化，酚/氯仿抽提纯化后，电激转化酵母受体菌his4KM71。由于载体中没有酵母复制起始子，所以HIS4基因必须整合进酵母基因组中才能表达，即只有整合了表达载体的酵母细胞才能在不加组氨酸(His)的基本培养基(MD)上生长，因此可以用基本培养基MD进行转化子筛选。由于菌株KM71的甲醇利用型为Mut^s(Methanol utilization slow)，在以甲醇为唯一碳源的培养基上，该菌株不会生长或生长极慢，当用pPIC9KBC进行转化后，仍表现为Mut^s，故免去了对转化子进行Mut表型的筛选。对获得的His⁺Mut^s转化子用融合基因检测引物(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11)直接进行PCR筛选，获得重组酵母。

3.3融合杀虫基因在重组酵母中的表达及功能鉴定

3.3.1融合杀虫蛋白的诱导表达

将重组酵母与未转化酵母菌株KM71(对照)接种于BMGY培养基(以甘油为碳源)中培养，待其生长至饱和状态(OD₆₀₀＝10～20)，移BMGY，加入诱导培养基BMMY(甲醇为诱导物)诱导表达。诱导培养5-7天后，取上清进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮兰染色，结果重组酵母表达出了约75KD的融合杀虫蛋白，而对照K M71无融合蛋白表达，见附图3。

3.3.2融合杀虫蛋白的肠激酶酶解分析

取含有融合杀虫蛋白的培养物上清，经硫酸铵沉淀并透析后，用肠激酶进行酶解，经SDS-PAGE电泳，发现融合杀虫蛋白被降解为约65kD和约10kD的两个蛋白，见附图4，分别与GFM Cry1A和CpTI的分子量相同，说明该融合杀虫蛋白可被肠激酶准确地切割。

3.3.3融合杀虫蛋白的杀虫活性分析

将重组酵母菌株pPIC9K/KM71(有融合蛋白表达)与非转化酵母菌株KM71(对照)的诱导培养物上清，经硫酸铵沉淀及透析后，加入到棉铃虫饲料中，用棉铃虫初孵幼虫进行杀虫活性测定，结果表明，用含有融合杀虫蛋白的饲料饲喂棉铃虫，棉铃虫的校正死亡率为78.3％，而对照为4，4％，说明酵母中表达的融合杀虫蛋白对棉铃虫具有毒杀作用，即融合杀虫基因已在重组酵母中正确表达，并具有生物学功能。

实施例四：融合杀虫基因植物表达载体向模式植物烟草中的导入及鉴定

4.1表达载体向农杆菌中的转化

提取质粒pGBIf4ABC，纯化后，取2μg用冻融法转化农杆菌LBA4404，挑取在卡那霉素平板上长出的菌落，用碱裂解法提取质粒，用EcoRI和Hind III进行双酶切鉴定，结果与图30相同，表明质粒pGBIf4ABC已转入农杆菌LBA4404。

4.2烟草的转化

培养带有质粒pGBIf4ABC的农杆菌，以烟草NC89无菌苗叶片为转化受体，共培养3天后，转到选择培养基中继续培养。十天后，转化叶片开始长出愈伤组织，而对照非转化叶片则逐渐变黄，最后死亡。再培养两周后，愈伤组织开始分化芽。待芽长到2-3cm时转入生根培养基中。十二天后，抗性芽开始生根。当再生植株长到7～8cm时，移入塑料钵中，获得烟草转化植株。

4.3转基因烟草的分子检测

4.3.1转基因烟草的PCR检测

提取烟草转化植株叶片总DNA作为模板，用融合基因检测引物(SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11)进行PCR扩增，琼脂糖电泳在2.1kb的位置出现全长融合杀虫基因条带，初步证明融合杀虫基因已经转入烟草植株中。

4.3.2转基因烟草的Southern Blot检测

取烟草转化植株20μg基因组DNA，用EcoRI和Hind III，于37℃酶切过夜，酚：氯仿抽提后，乙醇沉淀，以非转基因植株为阴性对照，质粒pGBIf4ABC/EcoRI+Hind III为阳性对照，上样电泳。转膜后，以GFM cryIA基因Pstl 1.4kb片段为探针杂交。EcoRI和HindIII为融合杀虫基因cryCI及其表达调控元件两端的位点，转基因植株中预期的杂交带为3.4kb，应与转化质粒pGBIf4ABC所切的带大小相同。Southernblot结果见附图5，在1、4、5、6泳道均出现了大小与预期相符的杂交带，进一步证明了融合杀虫基因已整合到转基因烟草植株中。

4.3.3转基因烟草中融合杀虫蛋白的表达检测

由于Bt晶体蛋白和CpTI都是碱溶性蛋白，放用PH9.5的CBS液提取上文所述转基因烟草植株的总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后转膜，用Bt晶体蛋白抗体进行免疫印迹。结果见附图6，在1、5、6泳道均出现了大小约为75kD的免疫杂交带，，正好是GFM CryIA(约65kD)与CpTI(约10kD)之和，表明融合杀虫基因cryci已经在转基因烟草中表达出了融合蛋白。

取转基因烟草叶片提取粗蛋白，用Bt晶体蛋白抗体为一抗，进行ELISA检测，融合蛋白表达量可达到1.43ug/g鲜重。

4.4转基因烟草对敏感棉铃虫和抗性棉铃虫的杀虫活性鉴定

取转基因烟草叶片，用2日龄的敏感棉铃虫进行杀虫试验，转基因烟草的校正死亡率[注：校正死亡率％＝(供试株幼虫死亡率％-对照幼虫死亡率％)/(1-对照幼虫死亡率％)×100％]可达90％以上。

进一步取转融合杀虫基因烟草植株与转单BT基因(GFM cry1A)烟草植株叶片，用对Bt杀虫蛋白(Cry1A)已产生抗性的棉铃虫进行生物学杀虫实验，结果转单BT基因(GFM cry1A)烟草对抗性棉铃虫的校正死亡率只有22.2％，而转融合杀虫基因的烟草对抗性棉铃虫的校正死亡率仍可达77.7％。说明转融合杀虫基因的烟草可能会延缓害虫对其产生抗性的进程。

4.5转基因烟草的CpTI抑制活性检测

根据标准样品(大豆胰蛋白酶抑制剂)的OD₂₅₄值分别计算其Trypsin剩余活力，做出“标准样品量——剩余活力”的标准曲线。用同样的方法测出待测植物样品中的trypsin剩余活力，对照标准曲线，即可得知在所测定的30ul转基因植物蛋白提取液中CPTI对应于标准样品的含量。经检测，在融合杀虫基因cryci高效表达的转基因烟草中，表达出的融合蛋白具有对trypsin的抑制能力，即融合杀虫蛋白中的CpTI片段保持了原有的活力，由此可以推断，转基因烟草的杀虫活性并非是由GFM Cry1A单独作用的结果，而是融合蛋白的两部分共同作用的结果。进一步可以得出结论，此融合蛋白不经蛋白酶消化也具有杀虫活性。

实施例五植物受精胚囊注射法转化棉花

编码融合杀虫蛋白质的基因在植物中的高效表达对于产生转基因植物是最为关键的，但是外源基因转化植物是否能获得成功，也是致关重要的环节。在本发明之前，本领域科技人员熟知的利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法等方法转化植物虽然有许多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不仅受到实验室条件和昂贵的仪器及费用极高等的限制，更重要的是上述方法都有一个不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生产上发挥着重要作用的优良植物品种，由于基因型的不同，不能通过愈伤途径再生成植株；或再生植株极为困难。在这样时情况下，本实验室通过植物受精胶囊注射转化的技术或称植物受精胶囊注射转化法(CN 95119563.8)，成功地获得了具有高抗虫能力的抗虫转基因棉花。虽然本发明优选棉花作为子房注射外源基因转化植物受精胶囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因转化植物受精胚囊技术的优点在于：1).适合于所有植物的基因型；2).方法简单，有效；3).不受实验室条件、仪器的限制，且费用低；4)速度快，一年内即可获得转基因植物种子及后代。

在本实例中，子房注射外源基因转化植物受精胚囊的方法，是在棉花开花授粉后的大约10-24小时之间。如在珠心孔道封闭之前，用微量注射系统将外源基因溶液注射到子房内，外要材料即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被吸收整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合过程。

棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度，在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花瓣不易张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即当天开花的晚6点钟左右花粉管进人胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花瓣连同雄蕊剥去露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，我们设计的微量注射系统吸取预冷的外源基因溶液，从抹掉幼铃的顶端，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的插入空间，缓慢将注射装置内的外源溶液注射到插入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔道在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中而实现其整合。一般注射的外源基因溶液为10ul，总量约为0.25-0.5ug。当然，对于不同的作物可根据其子房内胚珠数目的多少，适当地增加或减少外源基因的注射量。外源基因注射后为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将所说注射外源基因的幼铃所在的枝条顶端摘掉，以保持幼铃的充分营养，从而将有利于成铃和铃内种子的发育。

实施例6转融合杀虫基因棉花的分子生物学检测及酶活和抗虫性测试

应用实施例4.3的方法，对所获得的转基因棉花植株分别进行了PCR、斑点杂交分析以及抗棉铃虫实验。其中PCR检测的引物为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。这些结果证实了融合杀虫基因已转入到了棉花基因组中并获得了高效表达。其PCR检测结果见附图7，斑点杂交分析结果见附图8，抗棉铃虫实验结果见附图9。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>融合杀虫基因cryci及其应用

<130>融合杀虫基因cryci及其应用序列表

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2112

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

atggactgca ggccatacaa ctgcttgagt aacccagaag ttgaagtact tggtggagaa 60

cgcattgaaa ccggttacac tcccatcgac atctccttgt ccttgacaca gtttctgctc 120

agcgagttcg tgccaggtgc tgggttcgtt ctcggactag ttgacatcat ctggggtatc 180

tttggtccat ctcaatggga tgcattcctg gtgcaaattg agcagttgat caaccagagg 240

atcgaagagt tcgccaggaa ccaggccatc tctaggttgg aaggattgag caatctctac 300

caaatctatg cagagagctt cagagagtgg gaagccgatc ctactaaccc agctctccgc 360

gaggaaatgc gtattcaatt caacgacatg aacagcgcct tgaccacagc tatcccattg 420

ttcgcagtcc agaactacca agttcctctc ttgtccgtgt acgttcaagc agctaatctt 480

cacctcagcg tgcttcgaga cgttagcgtg tttgggcaaa ggtggggatt cgatgctgca 540

accatcaata gccgttacaa cgaccttact aggctgattg gaaactacac cgaccacgct 600

gttcgttggt acaacactgg cttggagcgt gtctggggtc ctgattctag agattggatt 660

agatacaacc agttcaggag agaattgacc ctcacagttt tggacattgt gtctctcttc 720

ccgaactatg actccagaac ctaccctatc cgtacagtgt cccaacttac cagagaaatc 780

tatactaacc cagttcttga gaacttcgac ggtagcttcc gtggttctgc ccaaggtatc 840

gaaggctcca tcaggagccc acacttgatg gacatcttga acagcataac tatctacacc 900

gatgctcaca gaggagagta ttactggtct ggacaccaga tcatggcctc tccagttgga 960

ttcagcgggc ccgagtttac ctttcctctc tatggaacta tgggaaacgc cgctccacaa 1020

caacgtatcg ttgctcaact aggtcagggt gtctacagaa ccttgtcttc caccttgtac 1080

agaagaccct tcaatatcgg tatcaacaac cagcaacttt ccgttcttga cggaacagag 1140

ttcgcctatg gaacctcttc taacttgccc tccgctgttt acagaaagag cggaaccgtt 1200

gattccttgg acgaaatccc accacagaac aacaatgtgc cacccaggca aggattctcc 1260

cacaggttga gccacgtgtc catgttccgt tccggattca gcaacagttc cgtgagcatc 1320

atcagggctc ctatgttctc ttggatacac cgtagtgctg agttcaacaa catcatcgca 1380

tccgatagta ttactcaaat ccctgcagtg aagggaaact ttctcttcaa cggttctgtc 1440

atttcaggac caggattcac tggtggagac ctcgttagac tcaacagcag tggaaacaac 1500

attcagaata ggaggtatat tgaagttcca attcacttcc catccacatc taccagatat 1560

agagttcgtg tgaggtatgc ttctgtgacc cctattcacc tcaacgttaa ttggggtaat 1620

tcatccatct tctccaatac agttccagct acagctacct ccttggataa tctccaatcc 1680

agcgatttcg gttactttga aagtgccaat gcttttacat cttcactcgg taacatcgtg 1740

ggtgttagaa actttagtgg gactgctgga gtgattatcg acagattcga gttcattcca 1800

gttactgcaa cactcgaggc tgaagatgat gatgataaga ccatgaggat ggatttgaag 1860

cacctcggaa gtaatcatca tgatgactca agcgatgaac cttctgagtc ttcagaacca 1920

tgctgcgatt catgcatctg cactaaatca atacctcctc aatgccattg tacagatatc 1980

aggtggaact cgtgtcactc ggcttgcaaa tcctgcatgt gtacacgatc aatgccaggc 2040

aagtgtcgtt gccttgacat tgctgatttc tgttacaaac cttgcaagtc cagggatgaa 2100

gatgatgagt aa 2112

<210>2

<211>703

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Met Asp Cys Arg Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val

1 5 10 15

Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser

20 25 30

Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly

35 40 45

Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser

50 55 60

Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg

65 70 75 80

Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu

85 90 95

Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala

100 105 110

Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn

115 120 125

Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln

130 135 140

Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu

145 150 155 160

His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly

165 170 175

Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu

180 185 190

Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu

195 200 205

Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln

210 215 220

Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe

225 230 235 240

Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu

245 250 255

Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser

260 265 270

Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His

275 280 285

Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg

290 295 300

Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly

305 310 315 320

Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn

325 330 335

Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr

340 345 350

Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile

355 360 365

Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly

370 375 380

Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg

405 410 415

Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly

420 425 430

Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val

465 470 475 480

Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser

485 490 495

Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Arg Tyr Ile Glu Val Pro Ile His

500 505 510

Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser

515 520 525

Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe

530 535 540

Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser

545 550 555 560

Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu

565 570 575

Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile

580 585 590

Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu

595 600 605

Asp Asp Asp Asp Lys Thr Met Arg Met Asp Leu Lys His Leu Gly Ser

610 615 620

Asn His His Asp Asp Ser Ser Asp Glu Pro Ser Glu Ser Ser Glu Pro

625 630 635 640

Cys Cys Asp Ser Cys Ile Cys Thr Lys Ser Ile Pro Pro Gln Cys His

645 650 655

Cys Thr Asp Ile Arg Trp Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys

660 665 670

Met Cys Thr Arg Ser Met Pro Gly Lys Cys Arg Cys Leu Asp Ile Ala

675 680 685

Asp Phe Cys Tyr Lys Pro Cys Lys Ser Arg Asp Glu Asp Asp Glu

690 695 700

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ggatcctact gcagcatgga tttgaag 27

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

gtcgacctca tcatcttcat ccc 23

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gatctcgagg ctgaagatga tgatgataag tcca 34

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

agctccgact tctactacta ctattc 26

<210>7

<211>300

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ctcgaggctg aagatgatga tgataagtcc agcatggatt tgaagcacct cggaagtaat 60

catcatgatg actcaagcga tgaaccttct gagtcttcag aaccatgctg cgattcatgc 120

atctgcacta aatcaatacc tcctcaatgc cattgtacag atatcaggtg gaactcgtgt 180

cactcggctt gcaaatcctg catgtgtaca cgatcaatgc caggcaagtg tcgttgcctt 240

gacattgctg atttctgtta caaaccttgc aagtccaggg atgaagatga tgaggtcgac 300

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

gatcccatgg actgca 16

<210>9

<211>8

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

ggtacctg 8

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

ccatacaact gcttgagtaa ccca 24

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

ctcatcatct tcatccctgg 20

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

ggttacactc ccatcgacat ctcc 24

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

ccataggcga actctgttcc gtc 23

Claims

1. 编码融合杀虫蛋白质的基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2. 包含权利要求1的基因的酵母表达载体pPIC9KBC，该载体是将权利要求1中所述的基因插入经SnaBI酶切的载体pPIC9K上构建而成，其具体结构见附图2。

3. 包含权利要求1的基因的植物表达载体pGBIf4ABC，该载体由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.1382的大肠杆菌菌株所携带，其具体结构见附图1。

4. 产生对鳞翅目害虫有杀虫性且害虫对这种杀虫性较难以产生耐受性的植物的方法，该方法为将权利要求3所述的包含权利要求1的基因的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得所述植物。

5. 根据权利要求4的方法，其中导入的植物细胞可以源于任何部分的植物组织。

6. 根据权利要求4的方法，其中所说的植物是烟草或棉花。