JPH05507194A

JPH05507194A - 新規のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子

Info

Publication number: JPH05507194A
Application number: JP91508154A
Authority: JP
Inventors: ペフエローエン，マルニクス; ランベール，バール; フアン・オーデンホーベ，カトリエン
Original assignee: プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー
Priority date: 1990-04-26
Filing date: 1991-04-24
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2018-03-17
Also published as: EP0528857A1; ATE212667T1; AU7752691A; JP3387495B2; EP0528857B1; DE69132913T2; US5466597A; DE69132913D1; ES2171391T3; PL295547A1; AU639788B2; WO1991016433A1; US5837237A; US5723756A; CA2079877C; CA2079877A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉａ株及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子本発明は、各々が、胞子形成中に結晶（それぞれＢｔｌ１０９Ｐ　結晶１及び“Ｂｔ１２６０結晶０）に封入される結晶化タンパク質（それぞれ’Ｂｔｌ１０９Ｐ結晶タンパク質”及び“Ｂｔ１２６０結晶タンパク質”）を生じる、Ｂａｃｔｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉａの新規の２株（’Ｂｔ１１０９Ｐ株”及び’ＢｔＩ２６０株＠）に関する。Ｂｔ１１０９Ｐ及びＢｔＩ２６０株は、１９９０年４月４日に、それぞれ寄託番号５８７０及び５８７１として、ブダペスト条約の規定に従りて、Ｄｅｕｔｓｃ’ｈｅａｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｒｕｒｅｎ（’ＤＳＭ’）。

Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ＩＢ、Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｖｒｅｔｇ、ＦｅｄｅｒａＩＲｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された。

本発明はさらに、鞘翅類（Ｃｏｌξｏｐｔｅｒａ）に対して活性であって、Ｂｔｒ１０９Ｐ又はＢｔｆ２６０株をそれ自体で、あるいは好ましくは活性成分としてＢｔｒ１０９Ｐ又はＢｔ１２６０結晶、結晶タンパク質、又はその活性成分を含有する殺虫剤組成物に関する。

本発明はさらに：１）Ｂｔｌ１０９Ｐ結晶中に見いだされる殺虫性タンパク質（“Ｂｔｌｔ０９Ｆプロトキシン１）をコードするＢｔ１１０９Ｐ株のゲノムからの“ｂｔｌ１０９Ｐ遺伝子°　：及び２）Ｂｔ１２６０結晶中に見いだされる殺虫性タンパク質（’Ｂｒ１２８０プロトキシン“）をコードする、Ｂｔ１２６０株のゲノムからの゛ｂｔ１２６０遺伝子”に関する。

Ｂｔ　１１０９Ｆ及びＢｔ１２６０プロトキシンは、それぞれそれらのＢｔｉ１０９Ｐ及びＢ　ｔ、　Ｉ　２６０結晶に封入される前にそれぞれそれらのＢｔｌ１０９Ｐ及びＢｔ１２６０株により産生されるタンパク質である。

本発明はさらに、それぞれＢｔ１１０９Ｐプロトキシン及びＢｔ１２６０プロトキシンから（例えば、トリプシン消化により）得られる’Ｂｔｌ１０９Ｐ毒素” 及び“ＢｔＴ２６０毒素。

に関する。Ｂｔ１１０９Ｆ及びＢｔＩ２６０毒素は、それぞれＢｔ　１１０９Ｆ株及びＢｔ１２６０株により産生される、それぞれＢｔｌ１０９Ｐ結晶及びＢｔＩ２６０結晶から遊離される殺虫剤的活性タンパク質である。各毒素は、鞘翅類に対する高度の活性を有する。Ｂｔ　Ｉ　１０９Ｐ及びＢｔ１２６０毒素は、鞘翅類に対して殺虫剤的に有効なそれぞれＢｔ１１０９Ｐ及びＢｔ１２６０プロトキシンの最小部分を表わすと考えられる。

本発明はさらに、植物細胞を形質転換するのに用い得るし、そして以下の：１）それぞれＢｔ１１０９Ｐ又はＢｔ　１２６０プロトキシンの殺虫剤的有効部分をコードするｂｔ１１０９Ｐ又はｂｔＩ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｂｔ１１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子”）の切頭部分；２）植物細胞における殺虫剤的に有効なりｔｒ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分の転写に適したプロモーター；及び３）植物細胞における殺虫剤的に有効なりｔＴ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子を発現するのに適した３゛末端転写体形成及びポリアデニル化シグナルを含有するキメラ遺伝子に関する。このキメラ遺伝子は、本明細書中では以後、一般的にｂｔｒ１０９Ｆ又はｂｔ［２６０キメラ遺伝子°と呼ぶ。好ましくは、殺虫剤的に有効なりｔｒ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分は、切頭ｂｔｌ１０９Ｆ又はｂｔＩ２６０遺伝子と選択可能なマーカー遺伝子との融合を包含するハイブリッド遺伝子としてのｂｔｌ１０９Ｐ又はｂｔ　［２６０キメラ遺伝子、例えばＢｔｌ１０９Ｐ−ＮＰＴｒ　Ｉ又！ｔＢｔ　Ｔ２６０−ＮＰＴＩ　Ｉ融合タンパク質をコードするｎｅｏ遺伝子（”ｂｔｌ１０９Ｐ−ｎｅｏ又はｂｔｌｌ）その核ゲノムが、殺虫剤的に有効なりｔｌ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分で形質転換される植物、例えばジャガイモ又はトウモロコシの細胞（“形質転換植物細胞“）：及び２）その核ゲノムが、殺虫剤的に有効なりｔ１１０９Ｐ又はｂｔ１２８０遺伝子部分を含有し、鞘翅類に耐性である、形質転換植物細胞から再生されるか又はそのように再生された植物から産生される植物じ形質転換植物°）に関する。

本発明はさらに、好ましくはエレクトロボレーシランによりｂｔｌ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０遺伝子の全部又は一部を保有するベクターで形質転換される旦。

ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｔｓ（’Ｂｔ’″）株に関する。

発明の背景Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓＬｓ　（’Ｂｔ”）は、胞子形成時に内因性結晶を産生ずるグラム陽性細菌である。結晶は、昆虫の幼虫に対して特異的に毒性であるタンパク質から成る。３つの異なるＢｔ病原型（Ｂｔ　ｐａｔｈｏｔｙｐｅ）：即ち、鱗翅類、例えばチ式つやガの幼虫に対して活性な病原型Ａ；ある種の双翅類、例えば力及びブユに対して活性な病原型Ｂ：及び鞘翅類、例えばカプトムシに対して活性な病原型Ｃが記載されている（Ｅｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６）。

その結晶が鞘翅類に対して毒性であるＢｔ株は、ＢｔＬｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓとして（米国特許第４．７６６．２０３号；欧州特許出願公開（“ＥＰ”）第１４９．１６２号）、ＢｔＭ−７又はＢｔ　ＳａｎＤｉｅｇｏとして（ＥＰ２１３．８１８；米ａｊＩ特許票４．７７１，１３１号）、並び１．：　Ｂ　ｔ　Ｓ　ｉとして（欧州特許出願（“ＥＰＡ“）第８８４０２１１５．５号）として記載されている。鞘翅類に対して毒性である他の２株、ＢｔＰＧＳＩ２０８及びＢｔＰＧＳＩ２４５も記載されてＬ’る（ＰＣＴ出願公開Ｗ０９０１０９４４５）。

慣用的水中発酵法を用いて大規模にＢｔ胞子を生産し得るという事実は、Ｂｔ細菌を、殺虫剤組成物供給源として商業的に魅力のあるものにする。

殺虫性タンパク賀をコードするいくつかのＢｔ株から得られる遺伝子断片は、植物を昆虫耐性にするために、これまで植物ゲノム中に同定され、組み込まれていた。しかしながら、植物におけるこのようなりｔ遺伝子断片の発現を得る方法は、簡単ではない。植物細胞中での殺虫性タンパク質の最適発現を達成するためには、その標的昆虫に対して実質的な毒性を保持するＢｔプロトキシンの水溶性部分をコードするように特異的方法で各Ｂｔ遺伝子断片を遺伝子操作する必要があることが判明した（ＥＰＡ８６３００２９１　１及びＥＰＡ８８４０２１１５．５；Ｌ９８６年１月２２日出願の米国特許出願第８２１，５８２号）。

発明の要約本発明に従って、病原型Ｃの２つの新規のＢｔ株、即ち５ｔｒＬＯ９Ｐ及びＢｔ　１２６０株が提供される。胞子形成中にそれぞれの株によって産生されるＢｔ［１０９Ｐ及びＢｔ１２６０結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、及び毒素、並びにＢｔ　Ｉ　１０９Ｐ及びＢｔＩ２６０プロトキシンの殺虫剤的有効部分は、各々殺虫活性を有し、したがって、一般に鞘翅類に対する、特にＡｇｅｌａｓｔｉｃａ　ａｌｎｉ。

５ｔｒｉｏｌａｔａ、Ｐｓｙｌｌｆｏｄｅｓｐｕｎｃｔｕｌａｔａ、Ｅｎｔｏｍｏｓｃｅｊｉｓ物の主な害虫であるコロラドポテトカプトムシＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａに対する殺虫剤組成物中に処方し得る。

さらに本発明に従って、植物細胞ゲノムを、殺虫剤的に有効なりｔ１１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分、好ましくは切頭ｂｔ１１０９Ｆ又はｂｔ１２６０遺伝子で形質転換する。この形質転換は、ｂｔ　［１０９Ｐ又はｂｔ１２６０キメラ遺伝子を用いて実施するのが好ましい。その結果形質転換された植物細胞を用いて、植物組織のいくつか又は全部の植物細胞が＝１）それらのゲノム中の安定挿入物として殺虫剤的に有効なりｔｌ上」」」又はｂｔｒ２６０遺伝子部分を含有し、並びに２）そのそれぞれのＢｔ１１０９Ｐ又はＢｔ１２６０プロトキシン、好ましくはそのそれぞれのＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０毒素の殺虫剤的有効部分を産生ずることにより殺虫剤的有効なり１ｒ１０９Ｆ又はｂｔｒ２６０遺伝子部分を発現し、それにより植物を鞘翅類に対して耐性にする形質転換植物を生産し得る。本発明の形質転換植物細胞はさらに、再生のために、このような殺虫性Ｂｔタンパク賀を産生ずるのに用い得る。

さらに本発明に従って、殺虫剤的に有効なりｔｌ１０９Ｐ又より、鞘翅類に対して植物を耐性にさせる方法が提供される。

これに関しては、植物細胞がｂｔｌ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０キメラ遺伝子で形質転換されるのが好ましい。

さらに本発明に従ッテ、Ｂｔｌ１０９Ｆ及びＢｔ１２６０プロトキンン、このようなプロトキシンの殺虫剤的有効部分、そしてＢｔｌ１０９Ｐ及びＢｉＩ３（３ ’Ｑ毒素、並びにｂｔｒさらに本発明に従って、好ましくはエレクトロポレーシタンにより、ＢｔＴ１０９Ｐ又はＢｔｉ２６０プロトキシンの全部又は殺虫剤的有効部分をコードするｂ　ｔ　Ｉ　１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子の全部又は一部を保有するベクターでＢｔ株は形質転換される。

さらに本発明に従９て、殺虫剤組成物、及び殺虫剤組成物を用いて鞘翅類を制御する方法が提供されるが、この場合、殺虫剤組成物は５ｔ１２６０又はＢｔ１１０９Ｐ株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分を包含する。

発明の詳細な説明本発明に従って、慣用的方法により、それぞれ寄託番号５８７０としてＤＳＭに寄託されたＢｔ１１０９Ｐ株、及び寄託番号５８７１としてＤＳＭに寄託されたＢｔ１２６０株から、例えば、Ｂｔ　Ｉ　１０９Ｆ及びＢｔ　１２６０結晶は、それらのそれぞれの株の胞子形成培養物から単離しくＭａｈｊｌｌｏｎとＤｅｌｃｏｕｒ、１９８４）、次いで、Ｈ’ｏｆｔｅら（１９８６）の方法によりそれぞれのプロトキシンをこれらの結晶から単離し得る。プロトキシンを用いて、慣用的方法で、これらのプロトキシンに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製し得る（Ｈ’ｏｆｔｅ　ｅｔ　ａｔ。

１９８８）。次に、Ｂｔｌ１０９Ｆプロトキシンのプロテアーゼ消化により（例えばトリプシン消化により）Ｂｔ　ｒ１０９１’毒素を得る。ＢｔＩ２６０毒素は、Ｂｔ１２８０プロトキシンのプロテアーゼ消化により（例えばトリプシン消化により）得られる。

ｂｔ１１０９Ｆ及びｂｔｒ２６０遺伝子も、慣用的方法で、それらのそれぞれの株から単離し得る。例えば、ｂｔｒ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子は、米国特許出願業８２１．５８２号、及び欧州特許出願第８６３００２９１．１号及び欧州特許出願第８８４０２１１５．５号（これらの記載内容は、参考として本明細書中に含めるものとする）に記載された手法を用いて、そのそれぞれのＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔ１２６０株中で確認される。好ましくは、ｂｔｒ１０９Ｆ及びｂｔｒ２６０遺伝子は：１つ又はそれ以上の制限酵素を用いてそれらのそれぞれのＢｔ１１０９Ｆ及びＢｔ１２６０株から全ＤＮＡを消化し：そのようにして産生されたＤＮＡ断片を５〜１０ＫｂのＤＮＡ画分にサイズ分画し；このような画分をクローニングベクターに連結し；大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）をクローニングベクターで形質転換して；クローンを好適なりＮＡプローブでスクリーニングすることによって確認する。ＤＮＡプローブは、１）鞘翅類に対する別の結晶プロトキシンをコードするｂｔ遺伝子、例えば、欧州特許出願第８８４０２１１５．５号に及びＨ’ｏｆｔｅら（１９８７）により記載されたｂｔ１３遺伝子の高度保存領域から、又は２）その配列が固定化プロトキシンの気相シーケンシングにより確定されるそれぞれｂｔｌ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０遺伝子によりコードされるプロトキシンのＮ−末端アミノ酸配列に基づいて構築される（ＥＰＡ８８４０２１１５．５）。

あるいは、Ｂｔ１１０９Ｆ’又はＢｔ１２６０株の全ＤＮＡから調製された５〜１０Ｋｂｌｉ片を、好適な発現ベクター中に連結し、大腸菌（旦、ｃｏｌｔ）中で形質転換し得る。次に、毒素に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて、Ｂｔ１１０９Ｆ又はＢｔ１２６０毒素の発現のために、慣用的＝＋ｏニーイムノプローブ法（Ｆｒｅｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ。

１９８６）により、コロニーをスクリーニングし得る。

そのようにして確認されたｂ　ｔ　Ｉ　１０９Ｐ及びｂｔ１２８０遺伝子を、次に、慣用的方法（ＭａｘａｍとＧ１１ｂｅｒｔ。

１９８０）で各々シー、ケンシングして、ＤＮＡ配列を得る。サザーツブａットにおｌするハイブリダイゼーシタンは、これらの遺伝子が、鞘翅類に対する活性を有するプロトキシン及び毒素をコードする前記の遺伝子（Ｈ’ｏｆｔｅとＷｈｉｔｅｌｅｙ。

１９８９）とは異なることを示す。

そのプロトキシンの殺虫剤的有効部分をコードする各々の遺伝子の殺虫剤的有効部分、及びまさしくその毒素をコードする配列決定された遺伝子の各々の切頭部分は、慣用的方法で、遺伝子がシーケンシングされた後に各遺伝子から作られる。

Ｂｔｌ１０９Ｐ及びＢｔ　１２６０ブロトキ′シン及び毒素のアミノ酸配列はさらに、それらのそれぞれのｂｔｌ１０９Ｆ及びｂｔ１１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子のｓ部分°という用語は、それぞれのＢｔｌ１０９Ｐ又は９ｔ１２６０プロトキシンより少ないアミノ酸を有するがしかし依然としてｗ４Ｍｉ類に対して毒性であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。

ｂ　ｔ　Ｉ　１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子のこのような部分は、プロトキシンの少なくとも１つのトリプシン切断部位に向かって切頭されたＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔ１２６０プロト牛シンをコードし得る（米国特許出願ｊ１８２１．５８２号；欧州特許出願筒８６３００２９１．１号）。

大１１４Ｍ及Ｃ１植物中７！ｂ　ｔ　Ｉ　Ｌ　０９Ｐ又１ｔｂ　ｔ　Ｉ　２６０ノ全ｆＫ又は殺虫剤的有効部分を発現するために、好適な制限部位を導入し、各遺伝子又は遺伝子部分の側面（ｆｌａｎｋｉｎｇ）に位置させる。これは、十分公知の手法を用いた特定部位の突然変異誘発により実施し得る（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ　ａｔａｌ、、１９８７；５ｔａｎｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）。

そのそれぞれのＢｔｆ１０９Ｆ又ハＢ　ｔ　ｆ　２６　Ｑフａ　トキ’ｉ植物細胞の核ゲノム中に安定に挿入され、そのようにして形質転換された細胞を慣用的方法で用いて、昆虫耐性である形質転換植物を作る。これに関しては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍプラスミドを用いて植物細胞を形質転換し、その後、例えば欧州特許出願公開束１１６．７１８号、及び欧州特許出願公開束２７０．８２２号、ＰＣＴ出履公ＭＷＯ８４１０２，９１３、欧州特許出願筒８７４００５４４．０号、並ヒｌ＝Ｇ　ｏ　ｕ　ｌ　ｄら（１９９０）（これらの記載内容は、参考として本明細誉中に含めるものとする）に記載された上記の手法を用いて形質転換植物を形質転換植物細胞から再生し得る。好ましいＴｉ−プラスミドベクターは、各々、Ｔｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの末端配列（ｂｏｒｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）間に、あるい直接的遺伝子移動（例えば欧州特許出願公開束２３３．２４７号に記載されているような）、花粉媒介形質転換（例えば、欧州特許出願公開束２７０，３５６号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ３５１０１８５８、及び米国特許第４，６８４．８１１号に記載されているような）、植物ＲＮＡウィルス媒介形質転換（例えば欧州特許出願公開束６７．５５３号及び米国特許第４．４０７．９５６号に記載されているような）、リポソーム媒介形質転換（例えば米国特許第４．５３６，４７５号に記載されているような）、並びにその他の方法、例えばトウモロコシのある系統を形質転換するための最近記載された方法（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）を用いて、他の種類のベクターを用いて植物細胞を形質転換し得る。

その結果生じた形質転換植物を慣用的植物品種改良計画に用いて、同一の特徴を有するさらに形質転換された植物を生産し得るし、あるいは同−又は関連の植物種の他の変種に殺虫剤的に有効なり　ｔ　Ｉ　ＩＱ９Ｆ又はｂｔ１２８０遺伝子部分を導入し得る。形質転換植物から得られる種子は、安定したゲノム挿入物として殺虫剤的に有効なりｔｒ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分を含有する。

形質転換植物の細胞を慣用的方法で培養して、鞘翅類に対する慣用的殺虫剤組成物中に用いるために回収し得る、それぞれのＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔ１２６０プロトキシンの、好ましくはそれぞれのＢ　ｔ　Ｉ　１０９Ｐ又はＢｔ１２６０毒素の殺虫剤的有効部分を生成し得る（米国特許出願第８２１．５８２号；欧州特許出願筒８６３００２９１．１号）。

殺虫剤的に有効なりｔｒ１０９Ｆ又はｂｔＴ２６０遺伝子部分、好ましくは切頭ｂｔｌ１０９Ｆ又はｂｔＩ２６０遺伝子は、遺伝子の挿入部分が、植物細胞における遺伝子部分の発現を指示し得るプロモーターの下流（即ち、３′）に、そしてその制御下にあるように植物細胞ゲノムに挿入する。これは、植物細胞ゲノムにｂｔｌ１０９Ｐ又はｂｔｒ２６０キメラ遺伝子を挿入することにより達成するのが好ましい。好ましいプロモーターとしては：単離物ＣＭ　１８４１　（Ｇａｒｄｎｅｒ　ａｔａｌ、、１９８１）、ＣａｂｂＢ−３（Ｆｒａｎｃｋ　ｅｔａｌ、、１９８０）、及びＣａｂｂＢ−Ｊ　Ｉ　（ＨｕｌｌとＨｏｗｅ　Ｉ　１，１９８７）のカリフラワーモザイクウィルスの強構成性（Ｓｔｒｏｎｇ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）３５Ｓブｏ−ｖ−−ター　（−３５Ｓ）ｏモーター”　）　ＨＭヒｊ、：Ｔ−ＤＮＡのそれぞれ１′及び２′遺伝子の発現を駆動するＴＲ１’　プロモーター及びＴＲ２’プロモーター（それぞれ°Ｔｋｌ′ＴＲ２’プロモーター　ＴＲ２’　プロモーター”）（Ｖｅｌｔｅｎｅｔ　ａｌ、、１９８４）が挙げられる。あるいは、構成性でなく、むしろ植物の１つ又はそれ以上の組織又は器官（例えば、葉及び／又は根）に特異的であって、それにより挿入玉二上上且亙ユ又はｂｔｒ２８ｏｆｆｉ伝子部分が特定の［織又は器官の細胞中でのみ発現されるプロモーターを用い得る。例えば、ｂｔｒ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分は、植物（例えばジャガイモ、トウモロコシ、アブラナ、及びイネ）それ自体の、あるいは米国特許出願第８２１．５８２号及び欧州特許出願第８６３００２９１．１号に開示されているようなマメのような別の植物のりブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターのような光誘導性プロモーターの制御下に遺伝子部分を置くことにより、上記の植物の葉において選択的に発現される。あるいは、発現が誘導される（例えば温度又は化学的因子により）プロモーターを用いる。

殺虫剤的に有効なりｔｌ１０９Ｐ又はｂｔＴ２６０遺伝子部分は、遺伝子の挿入部分が好適な３′末末端転写節シグナル（即ち、転写物形成及びポリアデニル化シグナル）の上流にあるように、植物ゲノム中に挿入する。これは、好ましくは、植物ゲノムにｂｔｌ１０９Ｆ又はｂｔ１２６０キメラ遺伝子を挿入することにより達成する。好ましいポリアデニル化及び転写物形成シグナルは、形質転換植物細胞中で３′−未翻訳ＤＮＡ配列として作用するオクトビンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）％及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔｅｎと５ｃｈｅ１１．１９８５）のシグナルを包含する。

選択可能なマーカー遺伝子として番、同一プロモーターと同じ転写単位で、及びその制御下で、殺虫剤的に有効なｙエユ１０９Ｐ又はｂｔ１２８０遺伝子部分を植物ゲノムに挿入するのが好ましい。それにより、その結果生じるハイブリッドｂｔ１１０９Ｐ又はｂｔ１２６０マーカー遺伝子は、融合タンパク質として形質転換植物中で発現される（米国特許出願第８２１，５８２号；欧州特許出願８８６３００２９１．１号；Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７）ｏこの結果は、好ましいられる任意の慣用的マーカー遺伝子を用い得る。好適な選択可能なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン耐性をコードする１土！遺伝子が挙げられる（Ｒｅｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４：欧州特許出願第８７４００５４４．０号；米国特許出願第８２１．５８２号；欧州特許出願第８８３００２９１．１号）。それにより、殺虫剤的に有効なりｔｒ１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子部分及びマーカー遺伝子（例えば、ｂ　ｔ　Ｉ　１０９Ｐ−ｎｅｏ又はｂ　ｔ　１２６０−ｎｅｏハイブリッド遺伝子）は、融合タンパク質として形質転換植物中で発現される（米国特許出願第８２１　５８２号；欧州特許出願第８６３００２９１．１号；Ｖａｅｃｋ　ａｔ　ａｌ、、１９８７）。

鞘翅類毒素をコードするｂｔ１１０９Ｐ又はｂｔ１２６０遺伝子の全部又は殺虫剤的有効部分を用いて、鱗翅類又は鞘翅類に対する殺虫活性を有するグラム陽性細菌、例えば旦、ｔｈｕｒｆｎ　ｆｅｎｓｊｓを形質転換することもできる。

それにより、鱗翅類及び鞘翅類害虫をともに駆除する又は別の鞘翅類害虫を駆除するのに有用な形質転換Ｂｔ株を産生じ得る。

好適なりローニングビヒクルに組み込まれたｂｔｌ１０９Ｐ又はｂｔｉ２８０遺伝子の全部又は一部による細菌の形質転換は、慣用的方法で、好ましくは１９８９年１２月に出願されたＰＣＴ特許出願　ｐｃＴ／Ｅｐ８９１０１５３９に記載されているようなエレクトロボレーシラン法を用いて、実施し得る。

Ｂｔ１１０９Ｐ又＋ｔＢｔＩ２６０株はさらに、１つ又はそれ以上の外来Ｂｔ遺伝子、例えば：ｂｔ２遺伝子（米国特許出願基８２１　５８２号；欧州特許出願宵８６３００２９１　１号、）、又は鱗翅類に対して活性なりｔプロトキシンの全部又は殺虫剤的有効部分をコードする別のＢｔ遺伝子；及び／又はｂｔ１３遺伝子（欧州特許出願第８８４０２１１５．５号）、あるいは鞘翅類に対して活性なりｔプロトキシンの全部又は殺虫剤的有効部分をコードする別のＢｔ遺伝子、例えばｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子又はｂｔＰＧｓＩ２４５遺伝子（欧州特許出願８８９４００４２８．２号、ＰＣＴ出願公開Ｗ０９０１０９４４５）の全部又は殺虫剤的有効部分で形質転換される。それにより、より広範囲の害虫、例えば鱗翅類（Ｌｅｐｔｄｏｐｔｅｒａ）及び／又は別の鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）をも駆除するのに有用な形質転換まれた外来Ｂｔ遺伝子の全部又は一部によるＢｔ１１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０株の形質転換は、十分公知の方法で、好ましくは慣用的エレクトロボレーシコンを用いて実施し得る（Ｃｈａｓｓｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）。

Ｂｔｌ１０９Ｆ及びＢｔｒ２６０株の各々を慣用的方法（Ｄｕｌｍａｇｅ、１９８１）により発酵させて、高収率の細胞を提供し得る。十分理解される遍切な条件下（Ｄｕｌｍａｇｅ、１９８１）で、ＢｔＮ１０９Ｐ及びＢｔ夏２６０株は各々胞子形成して、それらのそれぞれのＢｔｒ１０９Ｐ及びＢｔ１２６０結晶タンパ結晶タンパ重質提供する。

Ｂｔ１１０９Ｐ及びＢｔ１２６０株、結晶プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤有効部分、好ましくはそれらのプロトキシンは、各々、鞘翅類に属する害虫を制御するために用いられる殺虫剤組成物中の活性成分として眉い得る。例えば、Ｂｔｒ１０９ｆ’及びＢｔ１２６０結晶をＢｔ　Ｉ　１０９Ｐ及びＢｔＩ２６０株の胞子形成済培養から単離しくＭａｈｉｌｌｏｎとＤｅｌｃｏｕｒ、１９８４）％次にそれぞれのプロトキシンを、Ｈ’ｏｆｔｅら（１９８６）の方法に従ってこれらの結晶から単離し得る。

本発明の殺虫剤、特に抗鞘翅順組成物は、活性成分としてＢｔ　１１０９Ｐ及びＢｔｒ２６０株、又は好ましくはそのそれぞれの結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又はそのプロトキシンの殺虫剤的有効部分を、好適な担体、希釈剤、乳化剤、及び／又は分散剤とともに用いて、慣用的方法で処方し得る。この殺虫剤組成物は、水和剤、ペレット、顆粒、又はダストとして、あるいは発泡体、ゲル、懸濁液、濃縮物等として水性又は非水性溶媒を伴う液体処方物として処方し得る。

このような組成物中のＢｔｌ１０９Ｐ及びＢｔ１２５Ｑ株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分の濃度は、処方物の性質及びその意図される使用方法に依る。一般に、本発明の殺虫剤組成物は、本組成物の使用により鞘翅類に対して２〜４遍間ジャガイモ畑を防御するために用い得る。さらに長期間（例えば全成育時季中）防御するためには、さらに組成物を定期的に適用する必要がある。

本発明に従って昆虫、特に鞘翅類を制御する方法は、好ましくは、保護すべき場所（領域）に殺虫可能量のＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔ１２６０結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、を適用することを包含する。保護すべき場所は、例えば害虫又は成育に適した野菜の生息地、あるいは野菜を栽培する領域を含む。

Ｂｔｒ１０９Ｐ及びＢｔｒ２６０プロトキシン又は毒素を生成するために、Ｂｔｌ１０９Ｆ及びＢｔＩ２８０株の細胞を、好適な培地上で慣用的方法で増殖させ、次いで、慣用的方法、例えば酵素分解又は洗剤等を用いて溶解する。次に、クロマトグラフィー、抽出、電気泳動等のような標準技法によりプロトキシンを分離し、精製する。次に、プロトキシンのトリプシン消化により毒素を生成することができる。

Ｂｔ　ｒ　１０９Ｐ又はＢｔ１２６０細胞を収穫し、次に保護すべき場所に無傷で、生きたもの又は死んだもの、好ましくは死んだものを使用する。これに関しては、精製ｇｔｌ１０９Ｆ又はＢｔ１２６０株（生きたもの又は死んだもの）、特に９０．０〜９９．９％Ｂｔ１１０９Ｆ又はＢｔｒ２６０株である細胞塊（ｃｅｌｌ　ｍａｓｓ）を用いるのが好ましい。

Ｂｔ１１０９Ｆ又はＢｔ１２６０細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、又は殺虫剤的有効プロトキシン部分を、特定の使用に依って、任意の数の慣用的添加剤（湿濁又は乾燥）を用いて、種々の方法で、殺虫剤組成物中に処方し得る。

添加剤としては、湿潤剤、洗剤、安定剤、付着剤、散布剤、増量剤が挙げられる。このような組成物の例としては、ペースト、散粉用粉剤、水和剤、顆粒、毒餌、及びエアゾール組成物が挙げられる。他のＢｔ細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び殺虫剤的有効プロトキシン部分、並びにその他の殺虫剤、並びに殺真菌剤、殺生物剤、除草剤、及び肥料を、ＢｔｌＬＯ９Ｐ又はＢｔ１２８０細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分とともに用いて、別の利点又は利益を提供する。このような殺虫剤組成物は慣用的方法で調製し得るし、使用するＢｔ１１０９Ｐ又はＢｔ１２６０細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分の量は、種々の因子、例えば標的にする害虫、使用する組成物、組成物を適用する領域の種類、及び主な気象条件に依る。一般に、Ｂｔｒ１０９１’又はＢｔ１２６０プロトキシン、殺虫剤的有効プロトキシン部分及び／又は毒素の濃度は、処方物の少な（とも約０．１重量％〜約１００重量％、しばしば約０．１５重量％〜約０．８重量％である。

実際には、保護領域、即ちこのようなプロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分を適用した領域で、数種類の昆虫がＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔ１２６０プロトキシン、毒素、殺虫剤的有効プロトキシン部分、又はその混合物を食する。あるいは、数種類の昆虫がａｔ１１０９Ｐ又はＢｔ１２６０株、あるいはその形質転換体の無傷の生細胞を食し、したがって、昆虫はいくつかの株のプロトキシンを摂取して、死亡するか損傷を受ける。

以下の実施例で本発明をさらに説明する。実施例で言及される図面及び配列表を以下に示す。

及びＢｔＰＧＳＩ２０８　Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養物の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる全タンパク質パターン０　”ＭＷ”は、分子量マーカーを示す。

図２−　プローブとしｒｂ　ｔ　１３遺伝子（”ｃｒｙｌＩＩＡ’遺伝子）の内部断片を含有するＢｔＳｌ株のゲノムの１．４６ＫｂＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＶ断片と、ＢｔＳｌ、ＢｔＰＧＳ１２０８、Ｂｔｌ１０９Ｐ、及びＢｔｒ２６０株から調製されたＥｅｏＲＩ消化全ＤＮＡとの低厳格条件下でのノ＼イブリダイゼーシＪンパターン。

図３−　プローブとしてｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子（’ｃｒｙｌｌｌＢ’遺伝子）の内部断片を含有するＢｔＰＧＳＩ２０８株のゲノムの１．３８ＫｂＥｃｏＲＶ−Ｎｃｏ１断片と、ＢｔＳｌ、ＢｔＰＧＳＩ２０８、Ｂｔ１１０９Ｐ、　及びＢｔ　１２６（Ｎ１ｃから調製されたＮＩａｌＶ消化全ＤＮＡとの低厳格条件下での）１イブリダイゼーシヨンノくターン。プローブ断片を”Ｐ　（Ａ）で、又はジオキシゲニン（Ｂ）で標識した（Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ　Ｎｏｎ−Ｒａｄｔｏａｃｔｉｖｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ）　。

ドされたＢｔ１１０９Ｐプロトキシンの誘導アミノ酸配列は、本ＤＮＡ配列の下に存在する。Ｂｔ　１１０９Ｐ毒素をまさにコードする切頭ｂｔ１１０９Ｐ遺伝子は、ヌクレオチド位置３９７からヌクレオチド位置２１７９のＴＡＡ終止コドンまで伸びると思われる。

配列番号　２−ｂｔ１２６０遺伝子の部分ＤＮＡ配列。コードされたＢｔＩ２６０プロトキシンの誘導部分アミノ酸配列は、本ＤＮＡ配列の下に存在する。

実施例中で別記しないかぎり、組換えＤＮＡの製造及び操作法はすべて、ＭａｎｆａｔｆｓらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）に記載されている標準手法により実施する。

実施例１：Ｂｔｌ１０９Ｐ及びＢｔ　Ｉ２６０株の特性ら単離し、寄託番号５８７０として、１９９０年４月４日にＤＳＭに寄託した。

離し、寄託番号５８７１として、１９９０年４月４日にＤＳＭに寄託した。

各棟を、慣用的標準培地、好ましくはＬＢ培地（Ｂ　ａ　ｃ　ｔ　。

−トリプトン　１０　ｇ／Ｉ　、酵母菌抽出物　５ｇ／Ｉ。

ＮａＣｊ　１０ｇ／ｊ、及び寒天　１５　ｇ／Ｉ　）上で、好ましくは２８℃で培養し得る。長期間保存するためには、等量の胞子−結晶懸濁液と等量の５０％グリセロールを混合し、これを−７０℃で保存するか、又は胞子懸濁液を凍結乾燥する。

胞子形成のためには、Ｔ３培地（トリプトン　３ｇ／ｊ、トリプトース　２　ｇ／Ｉ　、酵母菌抽出物　１．５　ｇ／Ｉ　、５ｍｇＭｎＣｊ　、０．０５Ｍ　Ｎａ２ＰＯ４，ｐＨ８，８、及び１．５％　寒天）を用いて２８℃で２４時間おき、その後４℃で保存するのが好ましい。その増殖期中、Ｂｔ１１０９Ｆ及びＢｔ　Ｉ２６０株の各々は、任意の嫌気条件下でも増殖するが、しかし胞子形成は好気条件下でしか起きない。

各棟の滅菌は、１２０℃（１気圧）で２０分間、オートクレーブ処理して実施する。このような処理は、全体的に胞子、並びに結晶Ｂｔｌ１０９Ｆ及びｎｔ１２６０プロトキシンを不活性化する。ＵＶ照射（２５４ｎｍ）は、胞子を不活性化するが、プロトキシンは不活性化しない。

栄養物含有寒天（’ＮＡ”、Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａ　ｔａｒ　ｉｅｓ、Ｄａ　ｔ　ｒｏ　ｉ　ｔ、Ｍｌ、ＵＳＡ）上で１日培養後、各々のＢｔｒ１０９Ｆ及びＢｔ１２８０株のコロニーは、不規則縁（ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ｅｄｇｅｓ）を有する不透明白色コロニーを形成する。

各棟の細胞（１，７〜２．４ｘ５．６〜７．７．２３０ｍのグラム陽性ロッド）は、ＮＡ上で２８℃で３日間の培養後に胞子形成する。胞子形成中に生成された結晶タンパク質は、Ｂｔｌｌｉ）９Ｐ株中の扁平四辺形結晶中に、Ｂｔｘ２６０株においては小菱形結晶中に封入される。さらに、旦、ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　Ｈ抗血清（！ｎａｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ、ＦｒａｎｃｅのＨ，ｄｅ　Ｂａｒｊａｃによる）を用いた血清型分け（ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ）により、両株を特性付ける。

Ｂｔｒ１０９Ｐは血清型　Ｈ３０３ｂに属し、Ｂｔす。Ｂｔ１２６０は、血清！ＩＨ１８に属し、Ｂｔｋｕｍａｍｏｔｏｅｎｓｉｓを用いて凝集力価３．２００である。

実施例２：Ｂｔｆ１０９Ｆ及びＢｅ　１２６０結晶の特性Ｂｔ１１０９Ｐ及ＣＦＢｔ１２６０株を、Ｔ３培地上で２８℃で４８〜７２時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をリン酸塩緩衝塩水Ｃ０ｘｏｉｄ　Ｌｔｄ、。

Ｂａｓ　ｉｎｇｓｔｒｏｋｅ、　Ｈａｍｐｉｈｉ　ｒｅ、　Ｕ、に、から入手した“ＰＢＳ”）中に集めた。その結果生じた水性胞子−結晶懸濁液を遠心分離し、ベレットをＰＢＳ中に再懸濁して、再遠心分離し、ベレットをさらに再懸濁した。

Ｂｔ　Ｉ　１０９Ｆ及びＢｔ１２６０株の胞子形成培養の全タンパク質パターンを、Ｌａｍｂｅｒｔら（１９８７）により、ＣｒｙＴ　Ｉ　ＩＡ又はＣｒｙｌｌ夏Ｂ結晶タンパク質を産生ずる他のＢａｌｌｌｕｓ株と比較した。この比較のために、各棟の洗浄済胞子−結晶混合液のアリコートを遠心分離し、上溝を捨てて、ベレットを試料緩衝混合液中に溶解させた。結晶タンパク質を含有する抽出物を１２，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、１９７０）上で分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルー　Ｒ−２５０で染色した。この分析結果から、Ｂｔ　Ｉ　１０９Ｐ株の胞子−結晶中においては、１つの主バンド（分子量６５．５ｋＤａ）と２つの小バンド（分子量７２．４　ｋＤａ及び４９．１ｋＤａ）が、また、Ｂｔ１２６０株の胞子−結晶中においては、分子量約６５ｋＤａ及び約３０ｋＤａの２つの主バンドの存在が明らかにされた。さらに、Ｂｔｌ１０９Ｐ及びＢｔ１２６０の全体的タンパク質パターンは、ＢｔＳｌの全体的タンパク質パターンとは明らかに異なる。

実施例３＋Ｂｔ１１０９Ｆ及びＢｔＩ２６０結晶タンパク質の殺虫活性実施例２の場合と同様に、雨林を、　Ｔ、培地上で２８℃で４８〜７２時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をＰＢＳ　（リン酸塩緩衝塩水）中に集めた。その結果生じた胞子−結晶懸濁液を遠心分離し、ベレットを再懸濁して、再遠心分離し、上溝除去後、ベレットをさらに再懸濁した。ベレットをする水性溶液中で一夜インキユベートした。遠心分離後、上溝を回収し、２株のそれぞれの結晶タンパク質の抽出物のタンパク質含量を測定した。

ジャガイモの葉を標準胞子−結晶混合液か又は結晶タンパク質溶液の水性希釈液中に浸し、次に２時間思乾した。初齢のコロラドジャガイモカプトムシ幼虫を処理葉上に置き、３日後に幼虫の死亡率を測定した。これらの結果を、ＢｔＳｌ（ＤＳＭから入手。寄託番号４２８８）の胞子−結晶混合液か又は可溶化結晶タンパク質で処理した葉を摂食した幼虫の死亡率と比較して、これを参照法として用いた可溶化結晶タンパク質（μｇ）／溶液（ｍＡ　）として、又は浸漬−懸濁液中の胞子−結晶数として表わされるＬＣ５０（５０％致死濃度）を、プロビット分析（Ｆｊｎｎｅｙ、１９７１）により算出した。９５％信頼区間及びプロビットラインを含めた結果を、以下の表１及び２に要約する。

表１：Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの幼虫に対する、Ｂｔｌ１０９Ｐ株、Ｂｔ　７２６０株、ＢｔＳａｎ　Ｄｉｅｇｏ株（ＮＲＲＩ、寄託番号Ｂ−１５９３９）、及びＢｔＳｌＬ株（参照法）から得た可溶化結晶タンパク質の毒性の比較。

表２：Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒａａ　ｄｅｃｅｍｌｉｍｅａｔａの幼虫に対する、Ｂｔ１１０９Ｐ株、Ｂｔ１２６０株、及びＢｔＳｌ株（参照法）から得た胞子− 結晶混合液の毒性の比較。

実施例４：ｂｔ１１０９Ｐ及びｂｔ１２６０遺伝子の同定それぞれＢｔｌ１０９Ｐ及びＢｔＩ２６０株から得られたａｌ、、１９８７）を用いてＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（Ｅｎｇｖａ　１１とＰｅ５ｃｅ、１９７８）により検出した。これらの株の全ＤＮＡを調製し、次いで制限酵素ＮＩａｌ’Ｖ及びＥｃｏＲＴでＤＮＡを消化することにより、それらのそれぞれの株におけるｂ　ｔ　ｒ　１０９Ｐ及びｂｔ１２６０遺伝子を同定した。

ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡは、ｂｔ１３遺伝子を含有するＢｔＳｉ株（欧州特許出願第８８４０２１１５．５号）のゲノムから得られる３２Ｐ標識り、４６ＫｂＰｓｔＩ−ＥｃｏＲｖ断片でプローブするサザーンブロッティングにより分析した。

プローブとのハイブリダイゼーシ運ン後、低厳格条件（２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、６８℃で２ｘ１５分）下でブａ−）トを洗浄し、現像した。オートラジオグラム（図２）は、ｂｔｌ１０９Ｐ遺伝子のみがｂｔ１３遺伝子に関連することを示す。プローブとのハイブリダイゼーシ傍ンパターンはさらに、ｂｔｌ１０９Ｐ遺伝子がｂｔ１３遺伝子とは明らかに異なることを、モしてＢｔｒ２５Ｑ株のゲノムが、用いた実験条件下でｂｔ１３　（ｃｒｙ■ｒ　ＩＡ）のＩ’ｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＶプローブ断片に関連するＤＮＡ配列を含有しないことを示した（図２）。

Ｎ１ａｌＶ−消化ＤＮＡは、ｂｔＰＧｓｉｒ２０８又はｃｒｙｌｌｒＢ遺伝子を含有するＢｔｐＧｓｒ２０８株（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９０１００２４４号）のゲノムから得られる３２Ｐ標識化又はジゴキシゲニン（非放射性標識キット、Ｂｏｅｈｒｔｎｇａｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１．３８Ｋｂ　ＥｃｏＲＶ−Ｎｃｏｌ断片でプローブするサザーンブロッティングにより分析した。プローブとのハイブリダイゼーシ厘ン後、低厳格条件（２ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，１％ＳＤＳ、６８℃で２×１５分）下でプロットを洗浄し、現像した。結果（図３）は、ｂｔＩ２６０遺伝子のみがｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子に関連することを示す。プローブとのハイブリダイゼーシ舊ンパターンはさらに、ｂｔＥ２６０遺伝子がｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子とは明らかに異なることを、モしてｂｔｒ１０９Ｐ遺伝子株が、用いた実験条件下でｂｔＰＧｓＩ２０８遺伝子にかすかに関連するのみであるＤＮＡ配列を含有することを示した（図３）。

実施例５：ｂｔ１１０９Ｆ遺伝子のクローニング及び発現ｂｔｌ１０９Ｐ遺伝子を単離するために、Ｂｔ１１０９Ｐ株から得られる全ＤＮＡを調製した。次いで、全ＤＮＡを消化及びＢＡＰ−処理クローニングベクターｐＵｃ１９（Ｙａｎｊｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ａｔ　ａｌ、、１９８５）に連結した。次に、ベクターを含有する組換え大腸菌クローン’ｐＵＣ，ｃｒｙ■Ｉ　ｒＤＨｄｌ’を、プローブとしてｂｔ１３遺伝子の内部１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片（欧州特許出願公開第３０５．２７５号）を用いてスクリーニングして、ｂｔ１１０９Ｆ遺伝子を含有するクローンを確認した。

そのようにして確認したＤＮＡ断片を、次に、ＭａｘａｍとＧｉ　１ｂｅｒ　ｔ　（１９８０）に従ってシーケンシングした（配列番号１）。

そのＤＮＡ配列の分析に基づいて、適切な制限酵素で遺伝子を切断して、Ｂｔｌ１０９Ｐ毒素をコードする切頭ｂｔ１１０９Ｐ遺伝子を生成する。

実施例６＋ｂｔ１２６０遺伝子のクローニング及び発現消化ＤＮＡをシダ糖勾配上でサイズ分画し、５ｋｂ〜１０ｋｂの範囲の断片を１３ｇ１ｌｌ−消化及びＢＡＰ−処理クローニングベクターｐＥｃＯＲ２５１（寄託番号４７１１でＤＳＭに寄託）に連結する。次に、組換え大腸菌クローンを、プローブとしてｂｔＰＧｓＩ２Ｑ８遺伝子の内部Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲＶＤＮＡ断片（欧州特許出願公開ｊｌｆ３８２．９９０号）を用いてスクリーニングして、ｂｔＩ２６０遺伝子を含有するクローンを確認した。

ｂｔｒ２６Ｑ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、次に、ＭａｘａｍとＧ１１ｂｅｒｔ　（１９８０）に従ってシーケンシングした（配列番号２）６そのＤＮＡ配列の分析に基づいて、適切な制限酵素で遺伝子を切断して、ＢｔＩ２６０毒素をコードする切頭ｂｔ１２６０遺伝子を生成する。

実施例７：ｂｔ１１０９Ｐ−ｎｅｏハイブリッド遺伝子及びｂｔＴ２８０−ｎｅｏハイブリッド遺伝子の構築米国特許出願第８２１．５８２号、並びに欧州特許出願ｊ１８８４０２１１５．５号及び欧州特許出願第８６３００２９１．１号の手法に従って、実施例５及び６から得られる切頭ｂｔｌ１０９Ｐ及びｂｔ１２６０遺伝子を各々ｎｅｏ遺伝子に融合させて、対応するハイブリッド遺伝子を生成する。

実施例８：大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）へのｂｔｌ１０９Ｐ及び大腸菌及び植物中で、実施例５．６、及び７から得られたｂｔ１１０９Ｐ遺伝子及びｂｔ１２６０遺伝子、切頭互−ｔｌ−８８４０２１１５，５号に記載の手法により、大腸菌中に異なる遺伝子カセットを作製する。

植物中での主要発現を可能にするために、各々切頭（ｔｒｕｎ、ｃａｔｅｄ）及び／又は１１イブリツド遺伝子の１つを含有するカセットを、各々、中間植物発現ベクター（本ベクターのＴ−ＤＮＡ末端配列間）に挿入し、各々、植物発現ベクター中の転写体形成及びポリアデニル化シグナルに融合し、各々、３５Ｓ３転写体（ＨｕｌｌとＨｏｗｅ　Ｉ　１．　Ｌ　９８７）を駆動するカリフラワーモザイクウィルス由来プロモーター、又はオクトピンＴｔ−プラスミド（Ｖｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｔ、。

１９８４）のＴＲ−ＤＮＡから得られる２°プロモーターのような構成プロモーターの制御化に置き、各々、オクトピンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）の３′末端のような、植物中で作用し得る３′末端転写体形成及びポリアデニル化シグナルに融合させる。

標準手法（Ｄｅｂｌａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５）をプラスミドｐＧｖ２２６０（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７）を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株Ｃ５８ＣＩＲｉｆＲ（米国特許出願第８２１．５８２号；欧州特許出願東８６３００２９１．１号）中にトランスファーさせる。

スペクチノマイシン耐性に関する選択により、ｐＧＶ２２６０及びそれぞれの中間植物発現ベクターから成る同時組み込みプラスミドを得る。次に、これらの組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の各々を用いて、切頭ｂｔ１１０９Ｐ遺伝子、切頭ｂｔ１２６０遺伝子、ｂｔｌ１０９Ｐ−ｎ、　ｅ　ｏハイブリッド遺伝子、及びｂｔ１２６０−ｎｅｏ／Ｓイブリッド遺伝子が翼なるジャガイモ植物体細胞中に含有され、発現されるように、異なるジャガイモ植物体（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）を形質転換する。

実施例９：ジャガイモ植物体における切頭ｂｔ１１０９Ｐ及びｂｔ１２６０遺伝子並びにｂ　ｔ　ｒ　１０９Ｐ−ｎｅｏ及びｂｔ１２８０−ｎｅｏハイブリッド遺伝子の発現実施例８の形質転換ジャガイモ植物体細胞から生じる形質転換ジャガイモ植物体の葉における切頭ｂｔｌ１０９Ｐ及び類に対する殺虫活性を、これらの葉の上で摂食したＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ幼虫の成長率及び死亡率を記録して評価する。これらの結果を、非形質転換ジャガイモ植物体から得られる葉を摂食した幼虫の成長率と比較する。欧州特許出願第８８４０２１１５．５号、米国特許出願第８２１．５８２号、及び欧州特許出願宵８６３００２９１．１号に記載されているのと同様にして、毒性検定を実施する。有意に高い死亡率は、非形質転換植物の葉を摂食した幼虫よりも切頭ｂｔｒ１０９Ｐ遺伝子、切頭ｂｔｒ−２６０遺伝子、ｂｔＩ１０９１’−ｎｅｏハイブリッド遺伝子、又はｂｔｆ２６０−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を含有する形質転換ジャガイモ植物体の葉上で摂食した幼虫の間で得られた。

言うまでもなく、本発明はＢｔｌ１０９Ｐ　（ＤＳＭ５８７０）株及びＢｔｒ２６０（ＤＳＭ　５８７１）株に限定されない。むしろ、本発明はさらに、Ｂｔ　Ｉ　１ｏ９Ｆ又はＢｔ１２６０結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又は毒素と実質的に同一の特性、特に殺虫特性を有する結晶、結晶タンパク賀、プロトキシン又は毒素を産生するＢｔ１１０９Ｐ又はに関しては、Ｂｔｌ１０９Ｐ及びＢｔ１２６０株の変種は、全タンパク質パターンが図１に示すＢｔｌ１０９Ｐ株又はＢｔ１２６０株のタンパク質パターンと実質的に同一である変種を包含する。

本発明は、切頭ｂｔｔ１０９Ｐ又はｂｔ１２８０遺伝子で形質転換されるジャガイモ植物体にも限定されない。本発明は、殺虫剤的に有効なりｔｒ１０９Ｆ又はｂｔ１２６０遺伝子部分で形質転換される任意の単子葉植物又は双子葉植物、例えばトマト、タバコ、ナタネ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ属、テンサイ、及びその他の植物を包含する。

Ｔｊ−プラスミドの使用に限定されない。植物細胞形質転換のためのその他の公知の技法、例えばリポソームによる、エレクトロボレーシーンによる、あるいは植物ウィルス又は花粉を基礎にしたベクター系による方法が、このような遺伝子部分で単子葉植物及び双子葉植物を形質転換するために用い得る。例伝子部分を用いて、Ｆｒｏｍｍら（１９９０）、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９Ｑ）　、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、及びＤａｔｔａら（１９９０）が記載しているような方法により選択されたある系統のトウモロコシ及びコメ植物を形質転換し得る。

さらに、ＢｔｌｌＯ！１１及びＢｔ１２５Ｑ株中に天然に存在し、それぞれ天然ＢｔｌＬＯ９Ｐ及びＢｔ１２８０プロトキシン、毒素、及び殺虫剤的有効プロトキシン部分、をコードするもの以外のＤＮＡ配列を、植物及び細菌を形質転換するために用い得る。これに関しては、これらの遺伝子の天然ＤＮＡ配列を：１）いくつかのコドンを同一アミノ酸又は他の、好ましくは等価のアミノ酸をコードする別のコドンと置換し；及び／又は２）いくつかのコドンを欠失又は付加することにより修飾し得るが、但し、このような修飾は、特に、コードされたＢｔ１１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０プロトキシン、ａｔ１１０９Ｐ又はＢｔＩ２８０プロトキシンの殺虫剤的有効部分、あるいはＢｔｌ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０毒素の特性、特に殺虫特性を実質的には変えない。

さらに、本発明は、他の外来ＤＮＡ、特に大腸菌以外の植物及び微生物を形質転換するのに適したベクターのＤＮＡに関連して前記のＤＮＡ配列を含有するその他のＤＮＡ組換え体を包含する。これに関しては、本発明は、前記のｂ　ｔ　ｒ　１０９Ｐ及ミドに限定されず、むしろ本発明は、それらの等催物であるＤＮＡ配列を含有する任意のＤＮＡ組換え体を包含する。さらに、本発明は、ｂｔ１１０９Ｐ遺伝子又はｂｔ１２６０遺伝子の全部又は一部を含有し、その遺伝子の全部又は一部が発現され、上記の微生物から回収され、あるいは植物細胞にトランスファーされ得る条件下で微生物（例えば、Ｂａｃｆ　Ｉ　ｌｕｓ母薗）を形質転換するのに適した全ＤＮＡ組換え体に関する。

以下に、本明細書中で引用した参考文献を列挙するニー　（ｈａｓ＠ｙ　＠ｔ　ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．コＯコ−３０９（１９８ｇ） −（ｋｔｔａ　Ｓ、、Ｐａｔａｒｈａｎｓ　入、、Ｄａｔｔａ　ＩＣ，ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕｇ　工、。

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−Ｄｕｌｍａｇａ、）ｉ、Ｔ、、”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔａｒｉａ　ｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔｓ” 　ｉｎ　里弧匹共虹ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　Ｃｒｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｉ！ｄ、　Ｐａｐａｒｉｚａｓ、　Ｄ、Ｃ，。

Ｏｓｍｕｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ、＋７＋、ＵＳＡ、ｐｐ＋　１２９−１４１（１９８１）。

−Ｅｌｌａｒ、Ｄ、Ｊ＋、Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｂ、Ｈ，、Ｄｒｏｂｎｉｅｖｓｋｉ、Ｓ、入、ａｒｎｄＨａｉｄａｒ、Ｍ、Ｚ、、ｉｎ　！’Ｆ’ｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　入ｐｐｌｉａｄ　ａｓｐｅｃｔｓｏｆ　工ｎｖａｒｔｅｂｒａｔａ　ＰａｔＪｚｏｌｏｇｙ”−Σｄ、Ｓａｍｓｏｎ、Ｒ，入、。

Ｖｌａｋ、Ｊ、Ｍ＋ａｎｃｌ　Ｐｅｔａｒｓ、Ｄ、（１９８１５）　ｐｐ、７− １０゜ｌＪａｇａｎｉｎｇｅｎ、　Ｆｏｕｎｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈ＠ｆｏｕｒｔｈ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｏｑｉｕｍ　ｏｆ工ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔａ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ＋−Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐｅ５ｃｅ、　５ｃａｎｄ、　Ｉｍｕｎｏｌ、　５ｕｐｐｌ−７（１９７ｇ）−Ｆｉｎｎｅｙ、　Ｐｒｏｈｉｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅυｎｉｖａｒｇｉｔｙ　Ｉ’ｒａｓｓ　（１９７１）−Ｆｒａｎｃｋ、　Ｇｕｉｌｌｅｙ、　、７ｏｎａｒｄ、　ｌ’ｕｃｈａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｈｉｒｔｈ、　Ｃａ１ｌ旦、　２８５−２９４　（１９８０） −ｌ”ｒａｎｃｈ、Ｂ、？、、Ｍａｕｌ、ＨＮ、ａｎｄ　Ｍａｕｌ、Ｇ、Ｇ、。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　１５６．４１７４２］　（１９８６）−Ｆｒｏｗｎ　Ｍ、、Ｍｏｒｒｉｓｈ　Ｆ、、入ｒｍｓｔｒｏｎｇ　Ｃ，、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｒ，。

丁ｈｏｍａｓ　：１．　ａｎｄ　Ｋｌｅｉｎ　Ｔ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｔｉ、Ｆｌコ３−８３９（１９９０）　。

−Ｇａｒｄｎｅｒ、　Ｈｏｖａｒｔｈ、Ｈａｈｒ＋、Ｂｒｏｗｎ−Ｌｕａｄｉ、　５ｈｅｐａｒｄ　ａｎｄＭａｓｒ＋ｉｎｇ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９．　２８７１−２８１１７−Ｇｉ＠ｌｔｎ、Ｊ、、Ｄａ　Ｂａｕｋａｌａｅｒ、Ｍ、、５ｅｕｒｉｎｃｋ、Ｊ、。

Ｄｅｂｏ＠ｅｋ、Ｆ−＃　り＠　Ｇｒ＠ｖ＊、Ｆｆ−７ｘＡ關ｅｒｓ、ａ、、ＶＩＬｎＭｏｎｔａｇｕ、Ｍ、ａｎｄ　５ｃｈａｌｌ、Ｊ−、ＥＭＢＯ：！　ユ、！１３５−５１４５（１９８４）。

−Ｇｏｒｄｏｎ−Ｘａｍｍ　Ｗ、、Ｓｐ＠ｎｃ＠ｒ　Ｍ、、Ｍａｎｇａｎｏ　Ｍ、、　λｄａｍｓ’！’、。

Ｄａｉｎ＊ｓ　Ｒ，、５ｔａｒｔ　Ｗ、、Ｏ’Ｂｒ１ｅｎ　Ｊ、、Ｃｈａｍｂｅｒｓ　Ｓ、。

入ｄａｍｓ　Ｗ、、Ｗｉｌｌｅｔｓ　Ｈ，、Ｒｌｃｅ　Ｔ、、Ｍａｃｋｅｙ　Ｃ，、ＸｒｕｅｇｅｒＲ，、Ｋａｕｓｃｈ　入、ａｎｄ　Ｌａｍａｕｘ　Ｐ、、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　ヱ。

６０３−６１８　（１９９０）。

−Ｇｏｕｌｄ＠ｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　９５．４２６−４３４　（１９９１）−−Ｈ６ｆｔｅ、Ｒ，、Ｄａ　Ｇｒｅｖａ、Ｈ，、５ｅｕｒｉｎｃｋ、Ｊ、、Ｊａｎｓａｎｓ。

Ｓ、、Ｍａｈｉｌｌｏｎ、Ｊ、、’Ａｍｐ＠、Ｖａｎｄａｋａｒｃｋｈｏｖａ、Ｊ。

Ｖａｎｄａｒｂｒｕｇｇｅｎ、Ｈ，、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、、　ＺＪ山ｅａｕ、Ｍ、ａｎｄＶａｅｃｋ、　Ｍ、、　Ｔｈｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６１．２７３−２８０　（１９８６）−Ｈ６ｆｔｅ、Ｈ，，５ｅｕｒｉｎｃｋ、Ｊ、、Ｖａｒｘ　Ｈｏｕｔｖｅｎ　人、ａｎｄ　Ｖａｅｃｋ。

Ｈ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｘ互、７１８３　（１９８７）−Ｈ６ｆｔａ、Ｈ，、Ｄｉｓｓ”ａｒｔａｔｉｏｎ　ｔｈｅｓｉｓ　ａｔ　ｔｈ＠５ｔａｔａｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｈｅｎｔ、　Ｂｅ１ｇ１ｕ！１１（１９８８）。

−Ｈ６ｆｔｅ、　Ｈ，、Ｖａｎ　Ｒｉｇ、　Ｊ、、　Ｊａｎｓｅｎｓ、　Ｓ、、　Ｖａｎ　Ｈｏｕｔｖｅｎ。

入、、Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ、Ｈ，ａｎｄ　Ｖａｅｃｋ、に−ｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５４．２０１０−２０１７　（１９８８）−Ｈ６ｆｔｅ　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｈｉｔａｌｅｙ　Ｈ’、Ｒ，、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ５３、−２４２ −２５５　（１９８９）。

−Ｈｕｌｌ　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｌｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８６．　４Ｂ２−４９３　（１９Ｂフン−Ｌａａ＋ｕ＋ｌｉ　Ｖ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０ −６８５　（１９７０）−Ｌａｍｂａｒｔ、Ｂ、、Ｌｅｙｎｓ、Ｆ、、Ｖａｎ　Ｒｏｏｙｅｎ、Ｌ、、Ｇｏｓｓｅｌ！、−Ｆ、、Ｐａｐｏｎ、Ｙ、ａｎｄ　Ｓｗｉｎｇｓ、Ｊ、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５３．　１８６６−１１１７１　（１９８７）−Ｍａｈｉｌｌｏｎ、Ｊ、ａｎｄ　Ｄｅｌｃｏｕｒ、Ｊ、、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｍｔｈｏｄｓ　ユ、６９−７３　（１９８４）−Ｍａｘａｍ、入、Ｍ、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

並、　４９９−５６０　（１９８０）。

配列表 −０ｄｅｌｌ、　Ｊ、？、、　Ｎａｇｙ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｍ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３＠３゜８１０−８１２　（１９８５）。

−Ｒａ１ｓｓ、　Ｂ、、　Ｓｐｒａｎｇｓｓｌ、　Ｒ，、Ｗｉｌｌ、Ｆｌ、　ａｎｄ　５ｃｈａｌｌａｒ。

Ｈ，、Ｇａｎ＠　３０．　２１７−２２３　（１９８４）。

−Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　Ｌ、Ｔａｒａｄａ　Ｒ，、工ｚａｖａ　Ｔ、ａｎｄ　Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｈ，。

Ｎａｔｕｒａ　３３ｇ、　２７４−２７６　（１９８９）。

−５ｔａｎｓｓｅｎｓ　Ｐ、、ＭｃＫ＠ｏｖｎ　Ｙ、、Ｆｒ１ｅｄｒｉｃｈ　ＩＣ，ａｎｄ　Ｆｒ１ｔｚ）（、Ｊ、　（１９８ｇ）　、　”Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌ＠ｏｔｉｄａ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈ＠ｐＭＡ／ｃ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ”、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎ　ｔｈａ　ｃｏｌｌ＠ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｃａｄｕｒｅｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ＥＫＢＯ１ａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｕｒｓｅ　ｏｎ　”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎａｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎａａｒｉｎｇ’　ｉｎ　Ｊｕｌｙ　１９８７　ａｔ　ｔｈａ　Ｍａｘ　ＰｌａｎｃｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆＩｌ！ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ＋−５ｔａｎｓｓ＠ｎｓ　Ｐ、、０ｐｉｏ＋ｍａｒ　Ｃ，、ＭｃＫｅａｖｎ　Ｙ、、Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ、。

Ｚａｂｅａｕ　Ｍ、ａｎｄ　Ｆ’ｒｉｔｚ　Ｈ，Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ川、　４４４１−４４５４　（１９８う）。

−Ｖ、ａ４ＩＣｋ、　Ｍ、、　Ｒａｙｎａｅｒｔｓ、λ＋、　Ｈ６ｆｔｅ、　Ｈ −、Ｊａｎｓｅｎｓ、　Ｓ、。

ｆ）ｅ　Ｂａｕｃｋ＊１ｅｔｒ、Ｎ、、Ｄｓ７ａｎ、Ｃ，、Ｚａｂｅａｕ、Ｍ、、ＶａｒｘＭｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、’ａｎｄ　Ｌａａｍａｎｓ、Ｊ、、Ｎａｔｕｒａ　３２７コ３−３７（１９８７）。

−Ｖ＠１ｔｅｎ、　：１．、　Ｖｅｌｔｅｎ、Ｌ、、Ｍａｉｎ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｓｃｈ＊ｌｌ、　Ｊ、。

ＥとＢＯＪ　：ｌ、２７２コー２７３０　（１９８４）。

−Ｖｅｌｔｅｎ、Ｊ、ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ貝、　６９８１−６９９８（１９１１５）−Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｒｒａ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、。

Ｄ、７７トウエア：ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔｌｏ一般的情報ｉ）出願人：Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｖｉ）現出願データ二人手不可能ｖｉｉ）先願データ：欧州特許出願第９０’４０３７２４．９号、欧州特許出願第配列の特徴　：　ヌクレオチド１〜２３２：ｂｔｒ１０９Ｐ遺伝子（Ｓ）の５′　（上流）配列；ヌクレオチド２３１〜（下流）配列配列の性質　：　ｂｔｌ１０９Ｐ遺伝子は鞘翅類に対する７２ｋＤ殺虫性結晶タンパク質毒素をコードする。

配列番号　＝　２配列の型　：　核酸及び対応するタンパク質配列の長さ　：　１２９１塩基対鎖の数　：　２本鎖トポロジー　：　直鎖状仮想的配列　：　いいえアンチセンス　：　いいえ起源　：Ａ、生物芯　：　Ｂａｃｆｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｆｓ　ｖａｒ、ｋｕｍａｍｏｔｏａＢ０株名　：　ＢｔＩ２６０（ＤＳＭ寄託番号５８７１）配列の特徴　：　ヌクレオチド２〜１０４５：Ｂｔ１２６０殺虫性タンパク質のＣ末端をコードするｂｔＩ２６０遺伝子の５′末末端列（アミノ酸の番号付けは不完全である）配列の性質　：　ｂｔｒ２６０遺伝子は鞘翅類に対する６６ｋＤ殺虫性タンパク質毒素をコードする。

要　約寄託番号５８７０及び５８７１でＤＳＭに寄託された２つの新規のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株は、胞子形成中に新規の結晶タンパク賀を産生ずるが、これは鞘翅類に対して毒性であり、新規の遺伝子によりコードされている。

結晶タンパク質はプロトキシンを含有し、これはトリプシン消化生成物として毒素を生成し得る。ゲノムがいずれかの株に由来するＤＮＡ配列で形質転換され、それぞれのプロトキシンの殺虫剤的有効部分をコードし、又はそれぞれの毒素をコードする植物は、鞘翅類に耐性である。各棟を、それ自体、又はその結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分を、鞘翅類を駆除するための殺虫剤組成物中の活性成分として用い得る。

国際調査報告２−一一、ム一　＆ｌ＋　ＰＣＴ／ＥＰ　９１１００７９１田腔唄審輯去ｌｓ＋−−ｉ−一一−＾−−１１−巴−曙−曙ｌ−１１−ＰＣＴ／ＥＰ９１１００７９１ＷＯ−ＡＩ−９００９４４！５　２！−０８−９０ＡＵ−Ａ１．−５０４７６／９０　’　Ｏ５−０９−９０ＥＰ−ＡＩ−：ｅ２９９０　２２−ＯＥＩ −９０εＰ−ＡＩ−：、ニア６０４　１θ−】Ｑ−８９ＪＰ−Ａ２−　２＋）０５８７４　１Ｏ−０１−９０ｕ５−Ａ−４９９６１９！　２６−０２−９１ＥＰ −Ａ：ｌニー１４２９２４　２９−０５−８５　ＡＵ−Ａｔ−？、：４７３／ｅ４　２Ｂ−０３−１１１３

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＢｔＩ１０９Ｐ株又はＢｔＩ２６０株、特に精製形態の、特に純度９０．０〜９９．９％のＢｔＩ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０株の細胞。
２．ＢｔＩ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又は毒素。
３．ｂｔＩ１０９Ｐ遺伝子、ｂｔＩ２６０遺伝子、殺虫剤的に有効なｂｔＩ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０遺伝子部分、切頭ｂｔＩ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０遺伝子、ｂｔＩ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０キメラ遺伝子、又はｎｅｏ遺伝子のような選択可能マーカー遺伝子とそれらとのハイブリッド。
４．ＢｔＩ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、及び毒素、並びにＢｔＩ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０プロトキシンの殺虫剤的有効部分から成る群から選択される活性成分を含有する、特に鞘翅類に対する殺虫剤組成物。
５．請求項３記載の遺伝子、遺伝子部分、切頭遺伝子、キメラ遺伝子、又はハイブリッドによって特徴付けられる形質転換微生物、特に大腸菌。
６．殺虫剤的に有効なｂｔＩ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０遺伝子部分、切頭ｂｔＩ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０遺伝子、ｂｔＩ１０９Ｐ又はｂｔＩ２６０キメラ遺伝子、あるいはｎｅｏ遺伝子のような選択可能マーカー遺伝子とそれらとのハイブリッドによって特徴付けられる形質転換植物細胞又はその培養物。
７．請求項６記載の植物細胞から成る植物又はその種子。
８．請求項６記載の遺伝子部分、切頭遺伝子、キメラ遺伝子、又はハイブリッドを、内部に組み込んで含有する植物ゲノム。
９．その細胞が請求項８記載の植物ゲノムを有する植物組織。
１０．植物に請求項８記載の植物ゲノムを提供することを特徴とする鞘翅類に対して植物を耐性にさせる方法。
１１．植物、及びそのゲノム中に安定に組み込まれ、昆虫に対して毒性のタンパク質の形態で内部で発現し得る異種遺伝物質を含有する前記植物の生殖物質、例えば種子の製造方法において、ａ）前記タンパク質を発現しない出発植物細胞又は植物組織から前記異種遺伝物質を含有する形質転換植物細胞又は植物組織を製造し；ｂ）再生植物又はその植物の生殖物質、あるいは前記異種遺伝物質を含有する形質転換植物細胞又は植物組織から再生植物又はその植物の生殖物質又はその両方を製造し；ｃ）任意に、前記再生植物又は生殖物質、あるいはその両方を生物学的に複製する非生物学的工程を包含し、前記異種遺伝物質を含有する前記形質転換植物細胞又は植物組織の前記製造工程が、前記出発植物細胞又は植物組織を請求項６記載の遺伝子部分、切頭遺伝子、又はハイブリッド、並びに、前記植物細胞又は植物組織における遺伝子部分、切頭遺伝子、又はハイブリツドの発現を可能にして形質転換植物細胞又は植物組織中で、及び、世代を通じて産生される前記植物及び生殖物質中で遺伝子部分、切頭遺伝子又はハイブリッドの安定した組み込みを引き起こし得る調節要素、で形質転換することを特徴とする方法。
１２．害虫、特に鞘翅類、特にＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ａｇｅｌａｓｔｉｃａａｌｎｉ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｌｕｔｅｏｌａ、Ｈａｌｔｉｃａｔｏｍｂａｃｉｎａ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｌｉｔｏｒ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ、Ｔｒｉｂｏｌｅｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍ、Ｄｉｃｌａｄｉｓｐａａｒｍｉｇｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｉｓｐａ　ｓｅｒｉｃａ、Ｏｕｌｅｍａ　ｏｒｙｚａｅ、Ｃｏｌａｓｐｉｓｂｒｕｎｎｅａ、Ｌｉｓｓｏｒｈｏｒｐｔｒｕｓｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａｓｔｒｉｏｌａｔａ、Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓｐｕｎｃｔｕｌａｔａ、Ｅｎｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ　ａｅｎｅｕｓ、Ｃｅｕｔｏｒｙｎｃｈｕｓ　ｓｐ．、Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、及びＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａｕｎｄｕｌａｔａの制御方法であって、害虫を請求項４記載の殺虫剤組成物に接触させることを特徴とする方法。
１３．好ましくはエレクトロポレーションにより、請求項３記載の遺伝子、遺伝子部分、又は切頭遺伝子で形質転換されるＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ。
１４．ＢｔＩ１０９Ｐ又はＢｔＩ２６０株を培養し、次に、任意に結晶を単離し、精製し、次いで任意に結晶からプロトキシンを単離し、精製して、次に任意にプロトキシンをトリプシン消化して毒素を形成する工程を特徴とする、請求項２記載の結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又は毒素の製造方法。