MX2011003616A - Manipulacion de glutamina sintetasas (gs) para mejorar la eficiencia de uso de nitrogeno y rendimiento de grano en plantas superiores. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos relacionados de la proteína GS. La invención proporciona secuencia genómica para el gen GS. La GS es responsable para controlar la eficiencia de utilización de nitrógeno en plantas. Se proporcionan secuencias de glutamina sintasa para mejorar el rendimiento del grano y crecimiento de la planta. La invención además proporciona casetes de expresión recombinantes, células hospederas y plantas transgénicas.

Description

MANIPULACIÓN DE GLUTAMINA SINTETASAS (GS) PARA MEJORAR LA EFICIENCIA DE USO DE NITRÓGENO Y RENDIMIENTO DE GRANO EN PLANTAS SUPERIORES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona -generalmente al campo de biología molecular.

ANTECEDENTES DE LA' INVENCIÓN El nitrógeno (N) es el nutriente inorgánico mucho más abundante tomado del suelo por las plantas para el crecimiento y desarrollo. Las raíces de maíz absorben mucho más del N del suelo en la forma de nitrato, la mayoría del cual- se transporta a la hoja para la reducción y asimilación. El nitrato se reduce a nitrito mediante la nitrato reductasa (NR) en el citosol y luego el nitrito se transporta en el cloroplasto donde se reduce mediante la nitrito reductasa (NiR) a amonio. El amonio se asimila en la glutamina mediante el sistema de glutamina sintasa-glutamato sintasa (Crawford y Glass, (1998) Trends in Plant Science 3:389-395). También, se ha conocido a lo largo del tiempo que cantidades significantes de N se pierden de las partes aéreas de la planta mediante la volatilización (Glyan' ko, y colaboradores, (1980) Agrokhimiya 8:19-26; Hooker y colaboradores, (1980) Agronomy Journal 72 (5) : 789-792; Silva y colaboradores, (1981) Crop Science 21 ( 6) : 13-916; Stutte y colaboradores, (1981) Crop Science 21 ( 4 ): 596-600 ; Foster y colaboradores, (1986) Annals of Botany 57 ( 3 ): 305-307 ; Parton y colaboradores, (1988) Agronomy Journal 80 (3) : 419-425; Kamiji y colaboradores, (1989) Japanese Journal of Crop Science 58(1): 140-142; Morgan y colaboradores, (1989) Crop Science 29 (3) : 726-731 ; O' Deen, (1989) Agronomy Journal 81 (6): 980-985; Guindo y colaboradores, (1994) Arkansas Farm Research 43(1): 12-13; Heckathom y colaboradores, (1995) Oecologia 101 (3) : 361-365; Cabezas y colaboradores, (1997) Revista Brasileira de Ciencia do Solo 21 ( 3 ) : 481-487 ) . La evidencia experimental admite la pérdida de N a través de amonio y no a través de óxidos de N (Hooker y colaboradores, 1980) . El tratamiento con químicos que inhiben las actividades de la glutamina o glutamato sintasa conduce a la pérdida incrementada de amonio a través de la volatilización (Foster y colaboradores, 1986) . La pérdida de N no solamente se limita a especies de C-3 ya que también se ha reportado que las plantas de C-4 pierden N a través de la volatilización (Heckathom y colaboradores, 1995) .

Varias líneas independientes de evidencia indican que la glutamina sintetasa (GS) se involucra en la formación de rendimiento y sus niveles de expresión afectan la eficiencia de uso de nitrógeno (NUE) en el maíz. La GS lleva a cabo dos funciones principales en las células de planta: (1) asimilar el amonio que resulta de la reducción de nitrato en forma orgánica durante la fase biosintética y (2) asimilar el amonio generado mediante la fotorrespiración, las deaminasas y la glutamato deshidrogenasa, por ejemplo, durante la germinación de la semilla y la senescencia de la hoja cuando las proteínas se remobilizan como fuente de N o se utilizan como fuente de energía. La GS citosólica es referida como GS1 y la forma plastidial como GS2. En un reporte reciente (Martin y colaboradores, (2006) The Plant Cell 18 ( 11 ): 3252-74 ) , se utilizó una estrategia genética inversa para mostrar que la GS de hecho es un factor limitante para el número de granos y peso del grano, ambos de los componentes de grano producidos en maíz. Los experimentos de mapeo de QTL anteriores también implicaron isozimas GS en la determinación del rendimiento y NUE (Galláis y Hirel, (2004) J Exp Bot. 55 (396) :295-306) . En otros experimentos, dos genes GS localizados en el cromosoma 1, incluyendo uno expresado en la raíz, muestra significante asociación (P=10~4) con biomasa a 1 y 5 mM de N aplicado (datos no mostrados) . Durante la senescencia de la hoja, la remobilización del N toma lugar de la fuente (hoja) a los tejidos absorbedores (granos en desarrollo) . Las proteínas se descomponen en amino-ácidos, las cuales luego se transportan a través del floema al tejido absorbedor. Las proteína del grano tiene en cuenta ~60-70% del N de la planta total en la madurez en el maíz, los cual significa 30-40% de N todavía permanece en el forraje. La presente invención involucra esfuerzos para sobre-expresar las isoformas citosólicas de la GS bajo el control de diferentes promotores en el maíz para mejorar la NUE y de esta manera el rendimiento del grano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polinucleótidos , polipéptidos relacionados y todas las variantes conservadoramente modificadas de las secuencias GS presentes. La invención proporciona secuencias para los genes GS . Se identificaron los genes GS 6 arabidopsis, 6 maíz, 4 arroz, 3 sorgo y 8 soja. La Tabla 1 lista estos genes y sus números de ID de secuencia.

TABLA 1 NÚMERO de ID de SECUENCIA IDENTIDAD SEQ ID NO: 1 Polinucleótido AT1 G48470 SEQ ID NO: 2 poüpóptido AT1 G48470 SEQ ID NO: 3 Polinucleótido AT1G66200 SEQ ID NO: 4 Polipéptido AT1 G66200 SEQ ID NO: 5 olinucleótido AT3G 7820 SEQ ID NO: 6 polipéptido AT3G17820 SEQ ID NO: 7 Polinucleótido AT5G16570 SEQ ID NO: 8 polipéptido AT5G16570 SEQ ID NO: 9 Polinucleótido AT5G35630 SEQ ID NO: 10 polipéptido AT5G35630 SEQ ID NO: 1 1 Polinucleótido AT5G37600 SEQ ID NO: 12 polipéptido AT5G37600 SEQ ID NO: 13 Polinucleótido GlT)0005x00 11 SEQ ID NO: 14 Polipéptido Gm0005x0011 1 SEQ ID NO: 15 Polinucleótido Gm0015x00387 SEQ ID NO: 16 Polipéptido Gm0015x00387 SEQ ID NO: 17 Polinucleótido Gm0030x00147 SEQ ID NO: 18 polipéptido Gm0030x00147 SEQ ID NO: 19 olinucleótido Gm0040x00114 SEQ ID NO: 20 poiipéptido Gm0040x00114 SEQ ID NO: 21 polinucleótido Gm0081 x00134 SEQ ID NO: 22 poiipéptido Gm0081 00134 SEQ ID NO: 23 polinucleótido Gm0136x00208 SEQ ID NO: 24 poiipéptido Gm0136x00208 SEQ ID NO: 25 Polinucleótido Gm0232x00015 SEQ ID NO: 26 Poiipéptido Gm0232x00015 SEQ ID NO: 27 polinucleótido Gm0271 x00039 SEQ ID NO: 28 Poiipéptido Gm0271 x00039 SEQ ID NO: 29 polinucleótido Os02g50240 SEQ ID NO: 30 poiipéptido Os02g50240 SEQ ID NO: 31 polinucleótido Os03g12290 SEQ ID NO: 32 oiipéptido Os03g12290 SEQ ID NO: 33 Polinucleótido Os03g50490 SEQ ID NO: 34 poiipéptido Os03g50490 SEQ ID NO: 35 Polinucleótido Os04g56400 SEQ ID NO: 36 oiipéptido Os04g56400 SEQ ID NO: 37 polinucleótido Sb01 g143820 SEQ ID NO: 38 poiipéptido Sb01g143820 SEQ ID NO: 39 Polinucleótido Sb04g133790 SEQ ID NO: 40 poiipéptido Sb04g133790 SEQ ID NO: 41 polinucleótido Sb06g147820 SEQ ID NO: 42 Poiipéptido Sb06g 147820 SEQ ID NO: 43 Polinucleótido ZmGSl-1 SEQ ID NO: 44 Poiipéptido ZmGS1 -1 SEQ ID NO: 45 Polinucleótido ZlT)GS1-2 SEQ ID NO: 46 poiipéptido ZmGS1 -2 SEQ ID NO: 47 Polinucleótido ZmGS1-3 SEQ ID NO: 48 poiipéptido ZmGS1 -3 SEQ ID NO: 49 Polinucleótido ZmGS1-4 SEQ ID NO: 50 Poiipéptido ZmGSl -4 SEQ ID NO: 51 Polinucleótido ZlTlGS1-5 SEQ ID NO: 52 poiipéptido ZmGS1 -5 SEQ ID NO: 53 Polinucleótido ZmGS2 SEQ ID NO: 54 Poiipéptido ZmGS2 Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido aislada que codifica la proteina GS . Una modalidad de la invención es un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51, 53; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:. 44, 46, 48, 50, 52 y 54 y (c) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 70% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51, 53, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima GS .

Las composiciones de la invención incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52 y 54 y (b) la secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 70% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52 y 54, en donde el polipéptido tiene actividad de enzima GS .

En otro aspecto, la presente invención se relaciona a un cásete de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico como es descrito. Adicionalmente, la presente invención se relaciona a un vector que contiene el cásete de expresión recombinante . Además, el vector que contiene el cásete de expresión recombinante puede facilitar la transcripción y traducción del ácido nucleico en una célula hospedera. La presente invención también se relaciona a las células hospederas capaces de expresar el polinucleótido de la presente invención. Se podrían utilizar un número de células hospederas, tales como pero no limitadas a, microbiana, mamífera, planta o insecto.

En todavía otra modalidad, la presente invención se dirige a una planta transgénica o células de planta, que contienen los ácidos nucleicos de la presente invención. Las plantas preferidas que contienen los polinucleótidos de la presente invención incluyen pero no están limitados a maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate, mijo perenne, miscanthus, triticale y mijo. En otra modalidad, la planta transgénica es una planta de maíz o células de planta. Otra modalidad es la semilla transgénica de la planta transgénica. Otra, modalidad de la invención incluye plantas que comprenden un polipéptido de GS de la invención operablemente enlazada a un promotor que conduce la expresión en la planta. Las plantas de la invención pueden tener la GS alterada como es comparada con una planta de control. En algunas plantas, la GS se altera en un tejido vegetativo, un tejido reproductivo, o un tejido vegetativo y un tejido reproductivo. Las plantas de la invención pueden tener por lo menos uno de los siguientes fenotipos que incluyen pero no limitados a: tamaño de hoja incrementado, tamaño de mazorca incrementado, tamaño de semilla incrementado, tamaño de endosperma incrementado, alteraciones en el tamaño relativo de embriones y endospermas que conducen a cambios en los niveles relativos de la proteína, aceite y/o almidón en las semillas, ausencia de espiguillas, ausencia de polen funcional que lleva espiguillas o tamaño de planta incrementado.

Otra modalidad de la invención serían plantas que se han modificado genéticamente en un sitio genómico, en donde el sitio genómico codifica un polipéptido de GS de la invención .

Se proporcionan métodos para incrementar la actividad de un polipéptido de GS en una planta. El método puede comprender introducir en la planta un polinucleótido de GS de la invención. Proporcionar el polipéptido puede disminuir el número de células en el tejido de la planta, modular el crecimiento de tejido y tamaño.

Se proporcionan métodos para reducir o eliminar el nivel de un polipéptido de GS en la planta. El nivel o actividad del polipéptido también se podría reducir o eliminar en tejidos específicos, causando GS incrementada en los tejidos. Reducir el nivel y/o actividad del polipéptido de GS incremente el número de células producidas en el tejido asociado .

Las composiciones además incluyen plantas y semillas que tienen un constructo de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos de interés operablemente enlazada a un promotor de la presente invención. En modalidades especificas, el constructo de DNA se integra establemente en el genoma de la planta. El método comprende introducir en una planta una secuencia de nucleótidos de interés operablemente enlazada a un promotor de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Alineación de secuencia de proteínas GS de Arabidopsis, soja, arroz, sorgo y maíz. La alineación de polipéptido de todas las 27 secuencias se muestra en la Figura 1. Se identificaron varias regiones de muy alta homología mediante esta alineación. Todos estos polipéptidos de diferentes especies (excepto la SEQ ID NO: 20) muestran una identidad de secuencia en el intervalo de 70-95% entre diferentes miembros. Debido a las varias inserciones, la SEQ ID NO: 20 muestra una identidad en el intervalo de 53-74% con diferentes polipéptidos GS de diferentes especies. Las SEQ ID NOS: 10, 18, 28, 36, 42 y 54 pertenecen al grupo GS2 (localizado en el cloroplasto) ya que en todo el polipéptido se identificó un péptido de dirección de cloroplasto claro.

Figura 2: Árbol filogenético de proteínas GS de Arabidopsis, arroz, soja, sorgo y maíz. El análisis de todos los 27 polipéptidos se muestran en la Figura 2. Z GS1-1/1-5, ZMGS1-3/1-4, Z GS1-2 y ZMGS2 junto con los miembros de otras especies se agruparon en cuatro diferentes clases. Hay una clase específica de soja con las SEQ ID NOS: 14, 22, 24 y 26.

Figura 3: Los análisis de expresión de genes GS del maíz se condujeron en una base de datos MPSS que consiste de más de 300 diferentes librerías de tejido. Se expresaron GS1-1 y GS2 predominantemente en las raíces y las hojas, respectivamente (Figura 3A) . La GS1-2 se expresa más o menos en todos los tejidos con una expresión ligeramente más alta en el polen (Figura 3A) . Se expresaron GS 1-3 y 1-4 a muy bajos niveles en la mayoría de los tejidos examinados mientras que GS1-5 se expresa a aproximadamente 100 ppm en las raíces (Figura 3A) . La GS1-1 mostró 15-20x de expresión más alta en la corteza de la raíz como es comparada con otras isoformas (Figura 3B) . Entres todas las isoformas, solamente GS 1-2 y 1-5 muestra la expresión en el intervalo de ~150-700 PPM en el pedicelo (Figura 3C) .

Figura 4: Actividad de GS en hojas de eventos T0 de ETX. Se determinó la actividad de enzima de GS en las hojas de eventos endogámicos T0 cultivados en campo (ETX) transformados con PHP32005, 32006, 32007, 32008, 38267, 28268 y 38269. Se resumen los resultados de los eventos individuales (Figura 4A, 4C) y promedios de todos los eventos (Figura 4B, 4D) en cada constructo. En el caso de ZM-GS1-3 de sobre-expresión de PHPs, la actividad más alta (en un promedio 12x más alto) se observó en PHP32008 (ZmPEPCI PR0:ZmGSl-3) seguido por PHP32007 (ZmUBI PR0:ZmGSl-3) donde la actividad fue ligeramente más alta que los controles en PHP32005 (pZmSSU PRO : ZmGSÍ-3 ) . En el caso de las muestras de hoja PHP32006 (ZmRM2 PRO: ZmGSl-3) , la actividad fue comparable al control como se esperaba de R 2 es un promotor preferido de raiz. En el caso de PHP32006, las raices de los eventos TI mostraron actividad de GS significantemente más alta como es comparado con los parientes no transgénicos . Para ZM-GS1-4, se observó la actividad de GS más alta en PHP38269 (pZM-PEPC : : Z -GS1-4 ) seguido por PHP38267 (pZM-UBI : : ZM-GS1-4 ) . En el caso de las muestras de hoja PHP32268 (ZmR 2 PRO:ZmGSl-4) la actividad fue comparable al control como se esperaba de RM2 es un promotor preferido de raiz. Las actividades promedio de todos los eventos en cada constructo se resumen en la Figura 4B y 4D.

Figura 5: La actividad de GS en las' raices y hojas de los eventos TI de maíz FAST todas las cinco isoformas ZM-GS1 también se sobre-expresaron en el sistema de maiz FAST (Atributos de Sistema de Análisis . Funcional) (ver, la Solicitud de Patente Norteamericana Número 10/367,417, presentada el 13 de Febrero del 2003) bajo el control de un promotor preferido de raiz (RM2) o constitutivo (UBI) . Las semillas transgénicas que segregan hemicigotos 1:1 y tipo silvestre se separaron utilizando ELISA y se plantaron en macetas de plástico de 4 pulgadas cuadradas rellenadas con Turface MVPMR y se seleccionaron 1 planta por maceta después de la emergencia. Tres semanas después de la germinación y crecimiento bajo condición de N normal, se cosecharon las hojas y raices para el análisis de la actividad de enzima de GS . Las actividades de GS en eventos individuales y el promedio de todos los eventos dentro de un PHP se muestran en las Figuras 5A, 5C y las Figuras 5B, 5D, respectivamente. En el caso de eventos transgénicos donde varias isoformas GS1 se conducen por un promotor preferido de raíz (RM2) , se observaron actividades de GS significantemente más altas en las raices como es comparada con los controles nulos (Figura 5A, 5B) . En el caso de un promotor constitutivo (UBI) conduce a eventos de isoformas GS1, se observó una actividad de GS más alta como es comparada con los controles nulos (Figura 5C, 5D) .

Figura 6: Tasa de crecimiento especifica mejorada en eventos TO de maíz FAST. Cinco isoformas de ZM-GS1 se sobre-expresaron en el sistema de maíz FAST bajo el control de un promotor preferido de raíz (RM2) o constitutivo (UBI). En un promedio, se generaron 10 eventos transgénicos independientes de cada constructo. (Ver, Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/367,417, presentada el 13 de Febrero del 2003) . En todos los eventos T0, las mediciones registradas incluyeron pero no se limitaron a tasa de crecimiento especifica, área total máxima, dias para mudar, número de semilla, longitud de mazorca y estimados de rendimiento. Los datos de la tasa de crecimiento especifica (SGR, medida desde 14-28 dias después de la germinación) de este experimento se muestran en la Figura 6. La mayoría de los eventos de cada uno de los 6 constructos (de entre un total de 10) probados mostraron significantemente mejor tasa de crecimiento específica como es comparado con los controles (0.00) (Figura 6A) . El PHP32772 (RM2 PRO : ZmGSl-4 ) se desempeñó mejor con un valor P >10~6 seguido por PHP32779 (R 2 PR0:ZmGSl-3) con un valor P >10"5 (Figura 6A) . Otros 4 constructos también muestran mejor SGR con un valor P que varía de 10"2 a 10"4) (Figura 6A) . La mayoría de los eventos en cada constructo se desempeñó significantemente mejor que el control (Figura 6B) . Más de 80% y 70% eventos excedieron el desempeño del control en PHP32779 y 32772, respectivamente (Figura 6B) .

Figura 7: Los atributos agronómicos mejorados en eventos T0 FAST de PHP32743. La sobre-expresión de ZM-GS1-5 bajo el control de un promotor específico de raíz da por resultado el mejoramiento de varios atributos agronómicos en las mediciones fenómicas T0. Los resultados del promedio de nueve eventos para varias de estas variables se resumen en la Figura 7. Los múltiples eventos transgénicos de PHP32743 mostraron ~50% de incremento en la longitud de mazorca, ~25% de incremento en el número de semillas y estimados de rendimiento y ~18% de incremento en el área total máxima sobre el control.

Figura 8: Crecimiento mejorado y concentraciones de N en PHP32006 (pZMR 2 : ZmGSl-3 ) y PHP 32007 (pUBI : ZMGS1-3 ) en bajas condiciones de N. Las semillas de cruza de prueba de PHP32006 (Figura 8a) y 32007 (Figura 8b) se analizaron en invernadero en bajas condiciones de N. Se recolectaron los datos para el peso seco de raíz, peso seco de brote, peso seco total y N total. Cuatro de cada seis y 3 de cada 5 eventos fueron significantemente mejores (representado con un asterisco en la figura 8a y 8b) que el control nulo en todos los parámetros medidos en PHP32006 (Figura 8a) y 32007 (Figura 8b), respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos de que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. A menos de que sea mencionado de otra manera, las técnicas empleadas o contempladas en la presente son metodologías estándares bien conocidas para uno de habilidad ordinaria en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no limitantes. Lo siguiente se presenta a manera de ilustración y no se propone para limitar el alcance de la invención.

Las presentes invenciones ahora serán descritas más completamente después en la presente con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales algunas, pero no todas las modalidades de la invención son mostradas. En realidad, estas invenciones se pueden incorporar en muchas diferentes formas y no deben ser consideradas como limitadas a las modalidades expuestas en la presente; más bien, se proporcionan estas modalidades de modo que esta descripción cumplirá los requerimientos legales aplicables. Números similares se refieren a los mismos elementos en todas partes.

Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones expuestas en la presente vendrán a la mente de un experto en la técnica a la cual estas invenciones pertenecen teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos acompañantes. Por lo tanto, va a ser entendido que las invenciones no van se limitadas a las modalidades especificas divulgadas y aquellas modificaciones y otras modalidades se proponen para ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque términos específicos se emplean en la presente, estos se utilizan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación.

La práctica de la presente invención empleará, a menos de que sea indicado de otra manera, técnicas convencionales de tecnología botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y DNA recombinante, las cuales están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Langenheim y Thimann, BOTANY: PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John Wiley (1982); CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, volumen 1, Vasil, ed. (1984); Stanier y colaboradores, THE MICROBIAL WORLD, 5- edición, Prentice-Hall (1986); Dhringra y Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985); Maniatis y colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, vote. I and II, Glover, ed. (1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, Gait, ed. (1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, Hames y Higgins, eds . (1984) y las series METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick y Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Las unidades, prefijos y símbolos se pueden denotar en su forma aceptada SI. A menos de que sea indicado de otra manera, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por cualquiera de sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, de igual manera, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los términos definidos enseguida son más completamente definidos por referencia a la especificación en su totalidad.

En la descripción de la presente invención, los siguientes términos se emplearán y se proponen ser definidos como es indicado enseguida.

Por "microbio" se propone cualquier microorganismo (que incluye tanto microorganismos eucarióticos como procarióticos ) , tales como hongos, levadura, bacterias, actinomicetes, algas y protozoarios, así como otras estructuras unicelulares.

Por "amplificado" se propone la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o múltiples copias complementarias a la secuencia de ácido nucleico utilizando por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como una plantilla. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción de cadena de polimerasa (PCR), sistema de reacción de cadena ligasa (LCR) , amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, ississauga , Ontario) , sistemas de Q-Beta Replicasa, sistema de . amplificación basada en la transcripción (TAS) y amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) . Ver, por ejemplo, DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Persing y colaboradores, eds . , American Society for Microbiology, Washington, DC (1993) . El producto de amplificación es llamado un amplicón.

El término "variantes conservativamente modificadas" aplica a tanto las secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particular, las variantes conservativamente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o conservativamente modificadas de las secuencias de aminoácido. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en cada posición donde una alanina es especificada por un codón, el codón se puede alterar por cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación conservativamente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Uno de habilidad ordinaria reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el codón solamente para metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para la cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka y colaboradores, (1993) J. Gen. Microbiol. 139:425-32) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido de la presente invención, es implícito en cada secuencia de polipéptido descrito e incorporado en la presente por referencia.

En cuanto a las secuencias de aminoácido, uno de habilidad reconocerá que las sustituciones individuales, supresiones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera, adiciona o suprime un aminoácido sencillo o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" cuando la alteración da por resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. De esta manera, cualquiera número de residuos de aminoácido seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 1 a 15 pueden ser así alterados. De esta manera, por ejemplo, se pueden hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones. Las variantes conservativamente modificadas típicamente proporcionan actividad biológica similar como la secuencia de polipéptido no modificada de la cual se derivan. Por ejemplo, especificidad de sustrato, actividad de enzima o enlace de ligando/receptor generalmente es por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, de preferencia 60-90% de la proteina nativa para su sustrato nativo. Son bien conocidas en la técnica las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares.

Los siguientes seis grupos cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W) . Ver también, Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and Co. (1984) .

Como se utiliza en la presente, "que consiste esencialmente de" significa la inclusión de secuencias adicionales a un polinucleótido objetivo donde las secuencias adicionales no hibridan selectivamente, bajo condiciones de hibridación severas, al mismo cDNA como el polinucleótido y donde las condiciones de hibridación incluyen una etapa de lavado en 0.1 X SSC y dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 65°C.

Por "codificación" o "codificado," con respecto a un ácido nucleico especificado, se propone que comprende la información para la traducción en la proteina especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico, o pueden carecer de tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como en cDNA) . La información mediante la cual una proteina se codifica es especificada por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se codifica por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal". Sin embargo, las variantes del código universal, tal como se presenta en alguna planta, animal y mitocondria fungal, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao y colaboradores, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:2306-9) o el ciliado Macronucleus, se pueden utilizar cuando el ácido nucleico se expresa utilizando estos organismos.

Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera sintéticamente, la ventaja puede ser tomada de preferencias de codón conocidas del hospedero propuesto donde el ácido nucleico va a ser expresado. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente . invención se pueden expresar en las especies de planta tanto de monocotiledóneas como de dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para tener en cuenta las preferencias de codón especificas y las preferencias de contenido de GC de plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas como estas preferencias se han mostrado para diferir (Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-98 y en la presente incorporado por referencia) . De esta manera, el codón preferido de maiz para un aminoácido particular se podría derivar de secuencias de gen conocidas del maíz. La utilización de codón de maíz para 28 genes de las plantas de maíz se lista en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra.

Como se utiliza en la presente, "heterologo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina de una especie foránea, o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o sitio genómico por la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un gen estructural heterologo es de una especie diferente de aquella de la cual el gen estructural se derivó o, si es de la misma especie, uno o ambos se modifican sustancialmente de su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse de una especie foránea o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original por la intervención humana deliberada.

Por "célula hospedera" se propone una célula, la cual comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga de la invención, que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células hospederas pueden ser células procarióticas tal como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, planta, anfibio o mamífero. De preferencia, las células hospederas son células de la planta monocotiledonea o dicotiledónea, que incluyen pero no limitadas a maíz, sorgo, girasol, soja, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo, mijo perenne, myscanthus, triticale y tomate. Una célula hospedera monocotiledonea particularmente preferida es una célula hospedera de maíz.

El término "complejo de hibridación" incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico dúplex formada por dos secuencias de ácido nucleico de cadena sencilla selectivamente hibridadas entre si.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula, significa "transíección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástida o DNA mitocondrial ) , convertido en un replicón autónomo, o transientemente expresado (por ejemplo, mRNA transfectado) .

El término "aislado" se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteina, que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con ello como se encuentra en su ambiente que ocurre naturalmente. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su ambiente natural. Los ácidos nucleicos, que son "aislados", como se define en la presente, también son referidos como ácidos nucleicos "heterólogos" . A menos de que sea establecido de otra manera, el término "ácido nucleico GS" significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ( "polinucleótido GS") que codifica un polipéptido GS de longitud completa o longitud parcial.

Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en ya sea su forma de una sola o doble hebra, y a menos de que sea limitado de otra manera, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales en que ellos hibridan a los ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar a los nucleótidos que ocurren naturalmente (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido) .

Por "librería de ácido nucleico" se propone una colección de moléculas de DNA o RNA aisladas, que comprenden y representan sustancialmente la fracción transcrita completa de un genoma de un organismo especificado. La construcción de librerías de ácido nucleico ejemplares, tales como librerías genómicas y de cDNA, se enseña en las referencias de biología molecular estándares tales como Berger y Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, de la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987); Sambrook y colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2- edición, volúmenes. 1-3 (1989) y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel y colaboradores, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement).

Como se utiliza en la presente "operablemente enlazado" incluye la referencia a un enlace funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción del DNA correspondiente a la segunda secuencia. De manera general, operablemente enlazado significa gue las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, donde sea necesario unen a dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en la misma estructura de lectura.

Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye la referencia a las plantas completas, órganos de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células de planta y progenie de las mismas. La célula de planta, como se utiliza en la presente incluye, sin limitación, semillas, cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raices, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas . La clase de plantas, que se puede utilizar en los métodos de la invención, es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores disponibles a las técnicas de transformación, que incluyen tanto las plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas que incluyen especies del género: Cucúrbita , Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella , Vigna, Citrus, Linum, Geranium , Manihot, Daucus, Arabidopsis , Brassica , Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon , Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum , Heterocallis , Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus , Senecio, Salpiglossis , Cucumis, Browaalia , Glycine, Pisum, Phaseolus , Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Sécale, Allíum y Triticum . Una planta particularmene preferida es Zea mays.

Como se utiliza en la presente, "rendimiento" puede incluir la referencia a las medidas por acre de un cultivo de grano en la cosecha, como es ajustado para la humedad del grano (15% típicamente para el maíz, por ejemplo) . La humedad del grano se mide en el grano en la cosecha. El peso de prueba ajustado del grano se determina que es el peso en libras por medida, ajustado para el nivel de humedad del grano en la cosecha .

Como se utiliza en la presente, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que se hibridan, bajo condiciones de hibridación severas, a sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos como los nucleótidos que ocurren naturalmente y/o permitir la traducción en el mismo (s) aminoácido ( s ) como el (los) nucleótido (s) que ocurren naturalmente. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de una estructura nativa o heteróloga o gen regulador. A menos de que sea indicado de otra manera, el término incluye la referencia a la secuencia especificada asi como la secuencia complementaria de la misma. De esta manera, los DNAs o RNAs con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como aquel término se propone en la presente. Además, los DNAs o RNAs que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o . bases modificadas, tal como bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos como el término se utiliza en la presente. Será apreciado que una gran variedad de modificaciones se han hecho al DNA y RNA que sirve a muchos propósitos útiles conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. El término polinucleótido como se emplea en la presente abarca tales formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de DNA y RNA características de los virus y células, que incluyen Ínter alia, células simples o complej as .

Los términos "polipéptido, " "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a polímeros de' aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como a polímeros de aminoácido que ocurren naturalmente.

Como se utiliza en la presente "promotor" incluye la referencia a una región de DNA corriente arriba desde el comienzo de la transcripción e involucrado en el reconocimiento y enlace de RNA polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de planta. Los promotores de planta ejemplares incluyen, pero no están limitados a, aquellos que se obtienen de las plantas, virus de planta y bacterias que comprenden genes expresados en las células de planta tales como Agrobacterium o Rhizobium . Ejemplos son promotores que preferencialmente inician la transcripción .en ciertos tejidos, tales como hojas, raices, semillas, fibras, vasos de xilema, traqueidas o esclerénquima . Tales promotores son referidos como "tejido -preferido". Un promotor especifico de "tipo de célula" principalmente conduce la expresión en ciertos tipos de célula en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raices u hojas. Un promotor "inducible" o "regulable" es un promotor, que está bajo control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor desarrolladamente regulado, por ejemplo, un promotor que conduce la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores de tejido preferido, específicos de tipo de célula, desarrolladamente regulados e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor, el cual se activa bajo condiciones mucho más ambientales.

El término "polipéptido GS" se refiere a una o más secuencias de aminoácidos. El término también es inclusivo de fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteínas o proproteínas) de los mismos. Una "proteína GS" comprende un polipéptido GS. A menos de que sea establecido de otra manera, el término "ácido nucleico GS" significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido") que codifica un polipéptido GS .

Como se utiliza en la presente "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula se deriva de una célula asi modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresa genes nativos que son anormalmente expresados de otra manera, bajo expresado o no expresado en todo como un resultado de la intervención humana deliberada; o puede tener expresión reducida o eliminada de un gen nativo. El término "recombinante" como se utiliza en la presente no abarca la alteración de la célula o vector mediante eventos que ocurren naturalmente (por ejemplo, mutación espontánea, transformación natural/transducción/-transposición) tales como aquellos que ocurren sin la intervención humana deliberada.

Como se utiliza en la presente, un "cásete de expresión recombinante" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados, los cuales permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cásete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, DNA mitocondrial, DNA de plástida, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico que se transcribe y un promotor.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido que ocurre naturalmente y, a menos de que sea limitado de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar como los aminoácidos que ocurren naturalmente.

El término "selectivamente híbrida" incluye la referencia a la hibridación, bajo condiciones severas de hibridación, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo de ácido nucleico especificada a un grado detectablemente mayor (por ejemplo, por lo menos 2 veces arriba del antecedente) que su hibridación a secuencias de ácido nucleico no objetivas y a la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivos. Las secuencias selectivamente de hibridación típicamente tiene aproximadamente por lo menos 40% de identidad de secuencia, de preferencia 60-90% de identidad de secuencia y mucho más de preferencia 100% de identidad de secuencia (es decir, complementaria) entre sí.

Los términos "condiciones severas" o "condiciones severas de hibridación" incluyen la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo, a un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces arriba del antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la severidad de la hibridación y/o condiciones de lavado, las secuencias objetivo se pueden identificar que pueden ser hasta 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajusfar para permitir que alguna desigualación en las secuencias de modo que los grados inferiores de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Óptimamente, la sonda es aproximadamente 500 nucleótidos en longitud, pero puede variar en gran medida en longitud de menos de 500 nucleótidos al igual que la longitud completa de la secuencia objetivo.

Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de 'ión de Na, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ión de Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores tal como formamida o Denhardt's. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C y un lavado en SSC de IX a 2X (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de moderada severidad ejemplares incluyen la hibridación de formamida al 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en SSC de 0.5X a IX a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en SSC de 0. IX a 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función de lavados post-hibridación, los factores críticos que son la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem. , 138:267-84: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% de GC) - 0.61 (% de form) -500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de guanosina y nucleotidos de citosina en el DNA, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a una sonda perfectamente igualada. La Tm se reduce por aproximadamente 1°C para cada 1% de desigualación; de esta manera, las condiciones de Tm, hibridación y/o lavado se pueden ajustar para hibridar secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con >90% de identidad se buscan, la Tra se puede disminuir a 10°C. Generalmente, se seleccionan condiciones severas que son aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una resistencia iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a l, 2, 3 o 4°C más bajo que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) . Utilizando la ecuación, composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, aquellos de habilidad ordinaria entenderán que las variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado son descritas inherentemente. Si el grado deseado de resultados de desigualación en una Tm de menos que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) es preferido incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guia amplia a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, parte I, capitulo 2', "Overview of principies of hybridization and the strategy of ácido nucleico probé assays", Elsevier, Nueva York (1993); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, capitulo 2, Ausubel y colaboradores, eds, Greene Publishing and iley-Interscience, Nueva York (1995). A menos de que sea establecido de otra manera, en la presente solicitud se define la alta severidad como hibridación en SSC de 4X, Denhardt's 5X (Ficoll 5 g, polivinilpirrolidona 5 g, albúmina de suero bovino 5 g en 500 mi de agua), 0.1 mg/ml de DNA de esperma de salmón hervido y fosfato de Na 25 mM a 65°C, y un lavado en SSC 0.1 X, SDS al 0.1% a 65°C.

Como se utiliza en la presente, "planta transgénica" incluye la referencia a una planta, que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra establemente dentro del genoma tal que el polinucleótido se pasa a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante . "Transgénico" se utiliza en la presente para incluir cualquier célula, linea celular, callo, tejido, parte de planta o planta, el genotipo de la cual se ha alterado por la presencia del ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente de esta manera alterados asi como aquellos creados mediante los cruses sexuales o propagación asexual del transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente no abarca la alteración del genoma (cromosomal o extra-cromosomal) mediante métodos de reproducción de planta convencionales o mediante eventos que ocurren naturalmente tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante , transposición no recombinante o mutación espontánea.

Como se utiliza en la presente, "vector" incluye la referencia a un ácido nucleico utilizando en la transfección de una célula hospedera y en la cual se puede insertar un polinucleótido . Los vectores son frecuentemente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en la misma.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial".

Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un cDNA de longitud completa o secuencia de gen o el cDNA completo o secuencia de gen.

Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" propone incluir la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido se puede comparar a una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparada a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser 30, 40, 50, 100 o más grande. Aquellos de habilidad en la técnica entienden que para evitar una alta similitud a una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido una sanción de espacio se introduce típicamente y es sustrae del número de igualaciones .

Son bien conocidos en la técnica los métodos de alineación del nucleótido y secuencias de aminoácidos para comparación. El algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, (1981) Adv. Appl . Math 2:482, puede conducir la alineación óptima de secuencias para la comparación; mediante el algoritmo de alineación de homología (GAP) de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53; mediante la búsqueda para el método de similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:2444; mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no limitados a: CLUSTAL en el programa PC/Gen por Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA en el Wisconsin Genetics Software PackageMR, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCGMR (Accelrys, Inc., San Diego, CA) ) . El programa CLUSTAL es bien descrito por. Higgins y Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y colaboradores, (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-55 y Pearson y colaboradores, (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. El programa preferido a utilizar para la alineación global óptima de múltiples secuencias es PileUp (Feng y Doolittle, (1987) J. Mol . Evol . , 25:351-60 que es similar al método descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 y por la presente incorporado por referencia) . La familia BLAST de programas que se pueden utilizar para las búsquedas de similitud de base de datos incluyen: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótido contra secuencias de base de datos de nucleótido; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótido contra secuencias de base de datos de proteína; BLASTP para secuencias de consulta de proteína contra secuencias de base de datos de proteína; TBLASTN para secuencias de consulta de proteína contra secuencias de base de datos de nucleótido; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótido contra secuencias de base de datos de nucleótido. Ver, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Capítulo 19, Ausubel y colaboradores, eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995).

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch, supra, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximizan el número de igualaciones y minimizan el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los espacios menores. Se permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe obtener un beneficio del número de sanción de creación de espacio de igualaciones para cada espacio insertado. Si una sanción de extensión de espacio mayor que cero se selecciona, GAP debe, además, obtener un beneficio para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio por defecto y los valores de sanción de extensión de espacio en la Versión 10 de la Wisconsin Genetics Software PackageMR son 8 y 2, respectivamente. Las sanciones de creación de espacio y extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 100. De esta manera, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio y extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o mayores.

GAP presenta un miembro de la familia de alineaciones mejores. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor "calidad. GAP representa cuatro figuras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El porcentaje de Identidad es el por ciento de los símbolos que actualmente se igualan. El porcentaje de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 de la Wisconsin Genetics Software PackageMR es BLOSUM62 (ver, Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89 : 10915 ) .

A menos de que sea establecido de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando el conjunto BLAST 2.0- de programas utilizando parámetros de error (Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402) .

Como aquellos de habilidad ordinaria en la técnica entenderán, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas se pueden modelar como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, que pueden ser tractos homopoliméricos , repeticiones o regiones a corto plazo enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad se pueden alinear entre las proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína son completamente diferentes. Se puede emplear un número de programas de filtro de baja complejidad para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, la SEG ( ooten y Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie y States, (1993) Comput . Chem. 17:191-201) se pueden emplear filtros de baja complejidad solos o en combinación.

Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluyen la referencia a los residuos en las dos secuencias, las cuales son las mismas cuando se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a las proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren mediante sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Donde difieren las secuencias en las sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias, que difieren mediante tales sustituciones conservativas, son las que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Típicamente esto involucra anotar una sustitución conservadora como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. De esta manera, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se da un registro de 1 y una sustitución no conservadora se da un registro de cero, una sustitución conservadora se da un registro entre cero y 1. Se calcula el registro de las sustituciones conservativas, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, EUA) .

Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado a la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntico o residuo de aminoácido ocurren en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, dividir el número de posiciones igualadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia .

El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50-100% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 50% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 60% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 70%, más de preferencia por lo menos 80%, más de preferencia por lo menos 90% y mucho más de preferencia por lo menos 95%, comparado con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos utilizando parámetros estándares. Uno de habilidad reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótido al tomar en cuenta la degeneración de codón, similitud de aminoácido, posicionamiento de marco de lectura y los similares. La identidad sustancial de secuencias de aminoácido para estos propósitos normalmente significa la identidad de secuencia de entre 5.5-100%, de preferencia por lo menos 55%, de preferencia por lo menos 60%, más de preferencia por lo menos 70%, 80%, 90% y mucho más de preferencia por lo menos 95%.

Otra indicación que las secuencias de nucleótido son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones severas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de aminoácidos que conducen a la variedad en la secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo aminoácido, por lo tanto es posible que la secuencia de DNA podría codificar para el mismo polipéptido pero no se hibridan entre sí bajo condiciones severas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea utilizando la degeneración del codón máximo permitido por el código genético. Una indicación que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que el polipéptido, el cual primero codifica el ácido nucleico, es el reactivo inmunológicamente cruzado con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

El término "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55-100% de identidad de secuencia a una secuencia de referencia de preferencia por lo menos 55% de identidad de secuencia, de preferencia 60%, de preferencia 70%, más de preferencia 80%, mucho más de preferencia por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia a la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación especificada. De preferencia, la alineación óptima se conduce utilizando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, supra. Una indicación que dos secuencias de péptido son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con los anticuerpos producidos contra el segundo péptido. De esta manera, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por una sustitución conservadora. Además, un péptido puede ser' sustancialmente idéntico a un segundo péptido cuando difiere por un cambio no conservador si el epítope que el anticuerpo reconoce es sustancialmente idéntico. Los péptidos, los cuales son "sustancialmente similares" comparten secuencias como, es notado en lo anterior excepto que las posiciones de residuo, que no son idénticas, pueden diferir por los cambios de aminoácido conservativos.

La invención divulga polinucleótidos y polipéptidos GS. Los nucleótidos y proteínas novedosas de la invención tiene un patrón de expresión el cual indica que regulan el transporte de amonio y de esta manera desempeñan una función importante en el desarrollo de la planta. Los polinucleótidos son expresados en varios de tejidos de la planta. Los polinucleótidos y polipéptidos de esta manera proporcionan una oportunidad para manipular el desarrollo de la planta para alterar la semilla y desarrollo del tejido vegetativo, sincronización o composición. Esto se puede utilizar para crear una planta con composición de N alterada en la fuente y la absorción. Ácidos Nucleicos La presente invención proporciona, ínter alia, ácido nucleicos aislados de RNA, DNA y análogos y/o quimeras de los mismos, que comprenden un polinucleótido GS.

La presente invención también incluye polinucleótidos optimizados para la expresión en diferentes organismos. Por ejemplo, para la expresión del polinucleótido en una planta de maíz, la secuencia se puede alterar para tener en cuenta preferencias de codón especificas y para alterar el contenido de GC ya se de acuerdo con Murray y colaboradores, supra. La utilización de codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz se lista en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra.

Los ácidos nucleicos GS de la presente invención comprenden polinucleótidos GS aislados que son inclusivos de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido GS y conservativamente modificado y variantes polimórficas del mismo; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con polinucleótidos de (a) o (b) ; (c) secuencias complementarias de polinucleótidos de (a) o (b) .

Construcción de Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden hacer utilizando (a) métodos recombinantes estándares, (b) técnicas sintéticas, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención serán clonados, amplificados o de otra manera construidos de un hongo o bacteria .

Los t ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multi-clonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa pueden ser insertados en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido . También, las secuencias traducibles se pueden insertar para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención - que excluye la secuencia de polinucleótido - es opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Las secuencias adicionales se pueden adicionar a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menos la longitud de su polinucleótido de la presente invención es menor que 20 pares de kilobases, frecuentemente menor que 15 kb, y frecuentemente menor que 10 kb. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen tales vectores como: M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-C V, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI y II, pOPRSVI CAT, pOPl3 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMCI neo, pOG44, pOG45, pFM^GAL, pNEG GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSIox y lambda MOSEIox. Los vectores opcionales para la presente invención, incluyen pero no están limitados a, lambda ZAP II y pGEX. Para una descripción de varios ácidos nucleicos ver, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) ; y, Amersham Life Sciences, Inc, Catalog 97 (Arlington Heights, IL) .

Métodos Sintéticos para la Construcción de Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden preparar mediante la síntesis química directa por métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang y colaboradores, (1979) Meth. Enzy ol. 68:90-9; el método de fosfodiéster de Brown y colaboradores, (1979) Meth. Enzymol. 68:109-51; el método de dietilfosforamidita de Beaucage y colaboradores, (1981) Tetra. Letts. 22 (20 ): 1859-62 ; el método de fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage y colaboradores, supra, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado, por ejemplo, como es descrito en Needham-VanDevanter y colaboradores, (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68 el método de soporte sólido del Número de Patente Norteamericana 4,458,066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de cadena sencilla. Esto puede ser convertido en DNA de cadena doble mediante la hibridación con una secuencia complementaria o mediante la polimerización con un DNA polimerasa utilizando la cadena sencilla como una plantilla. Uno de habilidad reconocerá que mientras que la síntesis de DNA se limita a las secuencias de aproximadamente 100 bases, las secuencias más largas se pueden obtener por la ligación de secuencias más cortas.

UTRs y Preferencia de Codón En general, la eficiencia de traducción se ha encontrado que es regulada por elementos de secuencia específicos en la región 5' no codificada o no traducida (5' UTR) del RNA. Los motivos de la secuencia positiva incluyen secuencias de consenso de iniciación de traducción (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15:8125) y la estructura de tapa de RNA de metil GpppG 5<G> 7 (Drummond y colaboradores, (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Los elementos negativos incluyen estructuras de tronco-vuelta de 5' UTR intramoleculares estables (Muesing y colaboradores, (1987) Cell 48:691) y secuencias de AUG o marcos de lectura abierta cortos por una AUG apropiada en la UTR 5' (Kozak, supra, Rao y colaboradores, (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284). Por consiguiente, la presente invención proporciona regiones UTR 5' y/o 3' para la modulación de traducción de secuencias de codificación heterologas.

Además, los segmentos de codificación de polipéptido de los polinucleótidos de la presente invención se pueden modificar para alterar el uso del codón. La utilización de codón alterado se puede emplear para alterar la eficiencia de traducción y/o para optimizar la secuencia de codificación para la expresión en un hospedero deseado o para optimizar el uso del codón en una secuencia heteróloga para la expresión en el maiz. La utilización de codón en las regiones de codificación de los polinucleótidos de la presente invención se puede analizar estadísticamente utilizando paquetes de software comercialmente disponibles tal como "Preferencia de Codón" disponible de la Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group. Ver, Devereaux y colaboradores, (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395 o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). De esta manera, la presente invención proporciona una característica de frecuencia de uso de codón de la región de codificación de por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. El número de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que se puede utilizar para determinar la frecuencia de uso del codón puede ser cualquier número entero de 3 al número de polinucleótidos de la presente invención como es proporcionado en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ejemplar de secuencias para el análisis estadístico puede ser por lo menos 1, 5, 10, 20, 50 o 100.

Entremezclado de Secuencia La presente invención proporciona métodos para el entremezclado de secuencia utilizando polinucleótidos de la presente invención, y composiciones que resultan de los mismos. El entremezclado de secuencia se describe en la Publicación de PCT Número 96/19256. Ver también, Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 94:4504-9 y Zhao y colaboradores, (1998) Nature Biotech 16:258-61. Generalmente, el entremezclado de secuencia proporciona un medio para generar librerías de polinucleótidos que tienen características deseadas, que se pueden seleccionar o clasificar. Las librerías de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencia relacionados, que comprenden regiones de secuencia, que tienen identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar homologamente in vi tro o in vivo. La población de polinucleótidos recombinados de secuencia comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseadas o ventajosas y que se pueden seleccionar por una selección adecuada o método de clasificación. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo capaz de ser seleccionadas para o detectar en un sistema de clasificación, y pueden incluir propiedades de: una proteina codificada, un elemento transcripcional , una transcripción que controla la secuencia, procesamiento de RNA, estabilidad de RNA, conformación de cromatina, traducción y otra propiedad de expresión de un gen o transgén, un elemento de replicación, un elemento de enlace de proteina, o los similares, tal como cualquier característica la cual confiere una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una Km y/o Koat alterada sobre la proteína de tipo silvestre como se proporciona en la presente. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado del entremezclado de secuencia tendrá una afinidad de enlace de ligando mayor que el polinucleótido de tipo silvestre no entremezclado. En todavía otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado del entremezclado de secuencia tendrá un pH óptimo alterado como es comparado con el polinucleótido de tipo silvestre no entremezclado. El incremento en tales propiedades puede ser por lo menos 110%, 120%, 130%, 140% o mayor que 150% del valor de tipo silvestre.

Casetes de Expresión Recombinantes La presente invención además proporciona casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un cDNA o una secuencia genómica que codifica un polipéptido lo suficiente para codificar una proteina activa de la presente invención, se puede utilizar para construir un cásete de expresión recombinante que se puede introducir en la célula hospedera deseada. Un cásete de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido de la presente invención operablemente enlazado a las secuencias reguladoras de iniciación transcripcional las cuales dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera propuesta, tal como tejidos de una planta transformada.

Por ejemplo, los vectores de expresión de planta pueden incluir (1) un gen de planta clonado bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de planta también pueden contener, si es deseado, una región reguladora promotora (por ejemplo, una que confiere expresión inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o desarrolladamente o específica/selectiva de célula o tejido), un sitio de inicio de iniciación de transcripción, un sitio de enlace de ribosoma, una señal de procesamiento de RNA, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadenilación .

' Se puede emplear un fragmento promotor de planta el cual dirigirá la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores son referidos en la presente como promotores "constitutivos" y son activos bajo condiciones mucho más ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1' o 2' derivados de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor de alcohol de cinamil deshidrogenasa (Patente Norteamericana Número 5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus de mosaico de la coliflor (Ca V) , como es descrito en Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-2; actina del arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU (Last y colaboradores, (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-30) e histona H3 del maíz (Lepetit y colaboradores, (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85 y Atanassvoa y colaboradores, (1992) Plant Journal 2 ( 3 ) : 291-300 ) ; promotor ALS , como es descrito en la Solicitud de PCT Número WO 96/30530 y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de la planta conocidos por aquellos de habilidad. Para la presente invención la ubiquitina es el promotor preferido para la expresión en 'plantas monocotiledóneas .

Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido especifico o puedé ser de otra manera bajo el control ambiental o de desarrollo más preciso. Tales promotores son referidos aquí como promotores "inducibles". Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen el ataque patógeno, condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, el cual es inducible por la hipoxia o estrés por frió, el promotor Hsp70, el cual es inducible por estrés por calor y el promotor PPDK, el cual es inducible por luz.

Ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solamente, o preferencialmente, en ciertos tejidos, tales como hojas, raices, frutas, semillas o flores. La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su ubicación en el genoma. De esta manera, un promotor inducible puede llegar a ser completamente o parcialmente constitutivo en ciertas ubicaciones.

Si la expresión del polipéptido es deseada, es deseable generalmente incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de polinucleótido . La región de poliadenilacion se puede derivar de una variedad de genes de planta o del T-DNA. La secuencia de extremo 3' que se adiciona se puede derivar de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o alternativamente de otro gen de la planta o menos de preferencia de cualquier otro gen eucariótico. Ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no están limitados a, regiones de terminación y/o poliadenilacion 3' tales como aquellas del gen Agrobacterium tumefaciens de nopalina sintasa (nos) (Bevan y colaboradores, (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); el gen inhibidor II de proteinasa de papa (PINII) (Keil y colaboradores, (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50 y An y colaboradores, (1989) Plant Cell 1:115-22) ay el gen CaMV 19S (Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Una secuencia de intrón se puede adicionar a la región no traducida 5' o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol . La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en tanto los constructos de expresión de la planta como de animal se han mostrado para incrementar la expresión del gen en tanto los niveles de mRNA como de proteina hasta 1000 veces (Buchman y Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; CalMs y colaboradores, (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Tal aumento de intrón de la expresión del gen es típicamente más grande cuando es colocado cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. Son conocidos en la técnica el uso de intrones de maíz intrón 1, 2 y 6 de AdM-S, el intrón Bronze-1. Ver generalmente, THE AIZE HANDBOOK, Capítulo 116, Freeling and albot, eds . , Springer, Nueva York (1994) .

Las secuencias de señal de planta, que incluyen, pero no limitadas a, secuencias de DNA/RNA que codifican el péptido de señal que dirigen proteínas a la matriz extracelular de la célula de planta ( Dratewka-Kos y colaboradores, (1989) J. Biol. Che . 264:4896-900), tal como el gen de extensión Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose y colaboradores, (1991) Gene 99:95-100); péptidos de señal que dirigen proteínas a la vacuola, tal como el gen de esporamina de camote (Matsuka y colaboradores, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:834) y el gen de lectina de cebada (Wilkins y colaboradores, (1990) Plant Cell, 2:301-13); péptidos de señal que causan que las proteínas sean secretadas, tal como aquellas de PRIb (Lind y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:1 19, y por la presente incorporada por referencia) o péptidos de señal que dirigen proteínas a las plástidas tales como aquellos de enoil de colza-Acp reductasa (Verwaert y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 26:189-202) son útiles en la invención. La secuencia de señal de alfa amilasa de cebada fusionada al polinucleótido GS es el constructo preferido para la expresión en el maíz para la presente invención.

El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención típicamente comprenderá un gen marcador, el cual confiere un fenotipo seleccionable en células de la planta. Usualmente, el gen marcador seleccionable codificará resistencia a antibiótico, con genes adecuados que incluyen genes que . codifican para la resistencia a la espectinomicina antibiótica (por ejemplo, el gen aada) , el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica para la resistencia de estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica kanamicina o resistencia a geneticina, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica para la resistencia a higromicina, genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS) , en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia en particular la mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta y el gen ALS codifica resistencia al herbicida clorsulfuron .

Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido que induce tumor (Ti) de Agrobacterium turnefaciens descritos por Rogers y colaboradores, (1987) Meth. Enzymol. 153:253-77. Estos vectores son vectores de integración de la planta en que sobre la transformación, los vectores integran una porción del DNA del vector en el genoma de la planta hospedera. Los vectores de A. turnefaciens ejemplares útiles' en la presente son plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl y colaboradores , (1987) Gene 61:1-1 1 y Berger y colaboradores, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 86:8402-6. Otro vector útil en la presente es el plásmido pBI101.2 que es disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) .

Expresión de Proteínas en Células Hospederas Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteína de la presente invención en una célula recombinantemente diseñadas tales como bacterias, levadura, insecto, mamífero o de preferencia células de planta. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, ubicación y/o tiempo), debido a que se han alterado genéticamente a través de la intervención humana para hacerlo asi .

Se espera que aquellos de habilidad en la técnica sean expertos en los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina de la presente invención. No serán hechos los intentos para describir en detalle los varios métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas.

En resumen breve, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente invención típicamente será lograda mediante el enlace operablemente, por ejemplo, el DNA o cDNA a un promotor (que es ya sea constitutivo o inducible) , seguido por la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en ya sea procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión del DNA que codifica una proteína de la presente invención. Para obtener la expresión de alto nivel de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contienen, al mínimo, un promotor fuerte, tal como ubiquitina, para dirigir la transcripción, un sitio de enlace de ribosoma para la iniciación traduccional y un terminador de transcripción/traducción. Los promotores constitutivos son clasificados como que proporcionan un intervalo de expresión constitutiva. De esta manera, algunos son promotores constitutivos débiles y otros son promotores constitutivos fuertes. Generalmente, por "promotor débil" se propone un promotor que conduce la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por "bajo nivel" se propone a niveles de aproximadamente 1/10,000 transcriptos a aproximadamente 1/100,000 transcriptos a aproximadamente 1/500,000 transcriptos. A la inversa, un "promotor fuerte" conduce la expresión de una secuencia de codificación a un "alto nivel" o aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1,000 transcriptos.

Uno de habilidad reconocerá que las modificaciones se podrían hacer a una proteína de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones se pueden hacer para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula objetivo en una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas para aquellos de habilidad en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina adicionada al término amino para proporcionar un sitio de iniciación o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poly His) colocados en ya se al término para crear sitios de restricción convenientemente localizados o codones de terminación o secuencias de purificación.

Expresión en Procariotas Las células procarióticas se pueden utilizar como hospederos para la expresión. Las procariotas mucho más frecuentemente se representan por varias cepas de E. coli; sin embargo, también se pueden utilizar otras cepas microbianas. Las secuencias de control procarióticas comúnmente utilizadas que se definen en la presente incluyen promotores para la iniciación de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias del sitio de enlace de ribosoma, incluyen tales promotores comúnmente utilizados como los sistemas promotores de beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang y colaboradores, (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y colaboradores, (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) y el promotor P L derivado de lambda y el sitio de enlace de ribosoma del gen de N (Shimatake y colaboradores, (1981) Wature 292:128). También es útil es la inclusión de marcadores de selección en vectores de DNA transíectados en E. coli. Ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican la resistencia a ampicilina, tetraciclina o c1oranfenicol .

El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés en la célula hospedera apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de plásmido o de origen de fago. Las células bacterianas apropiadas son infectadas con partículas del vector de fago o transfectadas con DNA del vector de fago desnudo. Si se utiliza un vector de plásmido, las células bacterianas son transfectadas con el DNA del vector de plásmido. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención son disponibles utilizando Bacillus sp. y Salmonella (Palva y colaboradores, (1983) Gene 22:229-35; Mosbach y colaboradores, (1983) Nature 302:543-5). El vector de plásmido pGEX-4T-l de Farmacia es el vector de expresión de E. coli preferido para la presente invención.

Expresión en Eucariotas Una variedad de sistemas de expresión eucariótica tal como levadura, líneas de célula de insecto, células de planta y mamífero, son conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Como es explicado brevemente enseguida, la presente invención se puede expresar en estos sistemas eucarióticos . En algunas modalidades, las células de la planta transformadas/transfectadas, como es discutido infra, se emplean como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la presente invención.

Es bien conocida la síntesis de proteínas heterólogas en la levadura. Sherman y colaboradores, ETHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es un trabajo bien reconocido que describe los varios métodos disponibles para producir la proteina en _la levadura. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharomyces cerevisiae y Píchia pastoris . Son conocidos en la técnica los vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia y disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen) . Los vectores adecuados usualmente tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa y un origen de replicación, secuencias de terminación y los similares como sea deseado.

Una proteína de la presente invención, una vez expresada, se puede aislar de la levadura al lisar las células y al aplicar técnicas de aislamiento de proteína estándar a los lisados o las pelotillas. El monitoreo del proceso de purificación se puede realizar al utilizar técnicas de manchado de Western o radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo estándares.

Las secuencias que codifican proteínas de la presente invención también se pueden ligar a varios vectores de expresión para el uso en transfectar cultivos de célula de, por ejemplo, mamífero, insecto u origen de la planta. Los sistemas celulares de mamífero frecuentemente estarán en la forma de monocapas de células aunque también se pueden utilizar suspensiones celulares de mamífero. Se han desarrollado en la técnica un número de líneas celulares hospederas adecuadas capaces de expresar proteínas intactas, e incluye las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o promotor pgk ( fosfoglicerato quinasa) ) , un aumentador (Queen y colaboradores, (1986) Immunol. Rev. 89:49) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de RNA, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición poly A T Ag grande SV40) y secuencias de terminación transcripcionales . Son disponibles otras células de animal útiles para la producción de proteínas de la presente invención, por ejemplo, de la American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7-edición, 1992) .

Los vectores apropiados para expresar proteínas de la presente invención en células de insecto son usualmente derivadas del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insecto adecuadas incluyen larvas de mosquito, gusano de seda, gusano soldado, polilla y líneas celulares de Drosophila tal como un línea celular de Schneider (ver, por ejemplo, Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353- 65) .

Al igual gue con la levadura, cuando se emplean células hospederas de animal o planta superiores, las secuencias de terminación de poliadenilación o transcripción se incorporan típicamente en el vector. Un ejemplo de una secuencia de terminación es la secuencia de poliadenilación del gen de hormona de crecimiento bovino. También se pueden incluir las secuencias para el empalme preciso del transcripto. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague y colaboradores, (1983) J. Virol. 45:773-81). Adicionalmente , las secuencias de gen para controlar la replicación en la célula hospedera se pueden incorporar en el vector tales como aquellas encontradas en los vectores de tipo de virus de papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector," en DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, volumen II, Glover, ed., IRL Press, Arlington, VA, páginas 213-38 (1985)).

Además, se puede utilizar el gen para GS colocado en el vector de expresión de la planta apropiado para transformar células de la planta. El polipéptido luego se puede aislar del callo de la planta o se pueden utilizar las células transformadas para regenerar plantas transgénicas. Tales plantas transgénicas se pueden cosechar, y los tejidos apropiados (semilla u hojas, por ejemplo) se pueden someter a la extracción de proteína a gran escala y técnicas de purificación .

Métodos de Transformación de Planta Numerosos métodos para introducir genes foráneos en las plantas son conocidos y se pueden utilizar para insertar un polinucleótido GS en una planta hospedera, que incluye protocolos de transformación de la planta biológicos y físicos. Ver, por ejemplo, Miki y colaboradores, "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants," en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BI0TECHNOL0GY, Glick y Thompson, eds . , CRC Press, Inc., Boca Ratón, páginas 67-88 (1993). Los métodos seleccionados varían con la planta hospedera, e incluyen métodos de transfección química tal como fosfato de calcio, transferencia de gen mediado por microorganismo tal como Agrobacterium (Horsch y colaboradores, (1985) Science 227:1229-31), electroporación, microinyección y bombardeo biolístico .

Los casetes y vectores de expresión y métodos de cultivo in vitro para la célula de la planta o transformación y regeneración del tejido de las plantas son conocidos y disponibles. Ver, por ejemplo, Gruber y colaboradores, "Vectors for Plant Transíormation" , en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, supra, páginas 89-119.

Los polinucleótidos o polipéptidos aislados se pueden introducir en la planta por una o más técnicas típicamente utilizadas para el suministro directo en las células. Tales protocolos pueden variar dependiendo del tipo de organismo, células, planta o célula de la planta, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la modificación del gen. Los métodos adecuados para transformar células de la planta incluyen microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334 y Patente Norteamericana Número 6,300,543), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 83:5602-560'6, transferencia de gen directa (Paszko ski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración de partícula balística (ver, por ejemplo, Sanford y colaboradores, Patente Norteamericana Número 4,945,050; WO 91/10725 y McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926). También ver, Tomes y colaboradores, Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microproj ectile Bombardment , páginas 197-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, eds . Gamborg and Phillips, Springer-Verlag Berlín Heidelberg Nueva York, 1995; Patente Norteamericana Número 5,736,369 (meristema) ; Weissinger y colaboradores, (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford y colaboradores, (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores, (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); O 91/10725 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 y Gordon-Kamm y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren y Hooykaas, (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebier y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet y colaboradores, (1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores, páginas. 197-209 Longman, NY (polen) ; Kaeppler y colaboradores, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por hisker) ; Patente Norteamericana Número 5,693,512 (sonicación) ; D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores, (1996) Nature Biotech. 14:745-750; Transformación de maíz mediada por Agrobacterium (Patente Norteamericana Número 5,981,840); métodos de whisker de carburo de silicio (Frame y colaboradores, (1994) Plant J. 6:941-948); métodos láser (Guo y colaboradores, (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicación (Bao y colaboradores, (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer y Finer, (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10; Amoah y colaboradores, (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos de polietileniglicol (Krens y colaboradores, (1982) Nature 296:72-77) ; protoplastos de células monocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar utilizando la electroporación (Fromm y colaboradores, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:5824-5828) y microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185), todas de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Transformación mediada por Agrobacterium El método mucho más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de la tierra patogénicas de la planta, las cuales genéticamente transforman células de la planta. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, llevan genes responaables para la transformación genética de las plantas. Ver, por ejemplo, Kado, (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1. Las descripciones de los sistemas de vector de Agrobacterium y métodos para la transferencia de gen mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber y colaboradores, supra; iki y colaboradores, supra y Moloney y colaboradores, (1989) Plant Cell Reports 8:238.

De manera similar, el gen se puede insertar en la región T-DNA de un plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefaciens o A. rhizogenes, respectivamente. De esta manera, los casetes de expresión se pueden construir como en lo anterior, utilizando estos plásmidos. Muchas secuencias de control se conocen que cuando son acopladas a una secuencia de codificación heteróloga y son transformadas en un organismo hospedero muestran fidelidad en la expresión del gen con respecto a la especificidad del tejido/órgano de la secuencia de codificación original. Ver, por ejemplo, Benfey y Chua, (1989) Science 244:174-81. Las secuencias de control particularmente adecuadas para el uso en estos plásmidos son promotores para la expresión especifica de hoja constitutiva del gen en las varias plantas objetivo. Otras secuencias de control útiles incluyen un promotor y un terminador del gen nopalina sintasa (NOS) . El promotor NOS y el terminador se presentan en el plásmido pARC2, disponible de la American Type Culture Collection and designated ATCC 67238. Si tal sistema se utiliza, el gen de virulencia (vir) de ya sea el plásmido Ti o Ri también debe estar presente, ya sea junto con la porción T-DNA, o por la vía de un sistema binario donde el gen vir está presente en un vector separado. Tales sistemas, vectores para el uso en los mismos, y métodos para transformar células de la planta son descritos en la Patente Norteamericana Número 4,658,082; Solicitud de Patente Norteamericana Número de Serie 913,914, presenta el 1 de Octubre de 1986, como es referenciada en la Patente Norteamericana Número 5,262,306, presenta el 16 de Noviembre de 1993 y Simpson y colaboradores, (1986) Plant Mol. Biol. 6:403-15 (también referenciada en la patente ?306), todas incorporadas por referencia en su totalidad.

Una vez construidos, estos plásmidos se pueden colocar en A. rhizogenes o A. turnefaciens y estos vectores utilizados para transformar células de especies de la planta, las cuales son ordinariamente susceptibles a la infección de Fusarium o Alternaría. Varias de otras plantas transgénicas también son contempladas por la presente invención que incluyen pero no limitadas a soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, plátano, café, apio, tabaco, caupi, algodón, melón, mijo perenne, myscanthus, triticale y pimienta. La selección de ya sea A. turn faciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que es transformada de tal modo. En general A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunos gimnospermas , y unas pocas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, ciertos miembros de los Liliales y Arales) son susceptibles a la infección con A. tumefaciens. A. rhizogenes también tiene una amplia gama de hospederos, que abarcan la mayoría de dicotiledóneas y algunos gimnospermas, que incluyen miembros de la Leguminosae, Compositae y Chenopodiaceae . Las plantas monocotiledóneas ahora pueden ser transformadas con algunos éxitos. La Solicitud de Patente EP Número 604 662 Al divulga un método para transformar monocotiledóneas utilizando Agrobacterium. La solicitud de Patente EP Número 672 752 Al divulga un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium utilizando el escutelo de embriones inmaduros. Ishida y colaboradores, discute un método para transformar maiz al expone embriones inmaduros a A. tumefaciens (Nature Biotechnology 1 : 745-50 (1996)).

Una vez transformadas, estas células se pueden utilizar para regenerar plantas transgénicas . Por ejemplo, las plantas enteras se pueden infectar con estos vectores al herir la planta y luego al introducir el vector en el sitio de la herida. Cualquier parte de la planta puede ser herida, incluyendo hojas, tallos y raices. Alternativamente, el tejido de la planta, en la forma de una explanta, tal como el tejido cotiledonario o discos de hoja, se pueden inocular con estos vectores, y cultivar bajo condiciones, que promueven la regeneración de la planta. Las raices o brotes transformados mediante la inoculación del tejido de la planta con A. rhizogenes o A. tumefaciens, que contienen la codificación del gen para la enzima de degradación fumonisina, se puede utilizar como una fuente de tejido de la planta para regenerar las plantas transgénicas resistentes a fumonisina, ya sea por la vía de embriogénesis u organogénesis somática. Ejemplos de tales métodos para regenerar el tejido de la planta se divulgan en Shahin, (1985) Theor. Appl. Genet. 69:235-40; Patente Norteamericana Número 4,658,082; Simpson y colaboradores, supra y Solicitud de Patente Norteamericana Números de Serie 913,913 y 913,914, ambas presentadas el 1 de Octubre de 1986, como es referenciado en la Patente Norteamericana Número 5,262,306, presenta el 16 de Noviembre de 1993, las descripciones completas en las mismas se incorporan en la presente por referencia.

Transferencia de Gen Directa A pesar del hecho de que la gama de hospedero para la transformación mediada por Agrobacterium es amplia, algunas de las principales especies de cultivo de cereal y gimnospermas han sido generalmente recalcitrantes a este modo de transferencia de gen, aunque algunos éxitos se han logrado recientemente en el arroz (Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6:271-82). Varios métodos de la transformación de la planta, colectivamente referidos como transferencia de gen directa, se han desarrollado como una alternativa para la transformación mediada por Agrobacterium.

Un método generalmente y aplicable de la transformación de la planta es la transformación mediada por microproyectiles, donde el DNA se lleva sobre la superficie de los microproyectiles que miden aproximadamente 1 a 4 m.

El vector de expresión se introduce en los tejidos de la planta con un dispositivo biolistico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s lo cual es suficiente para penetrar las paredes y membranas de la célula de la planta (Sanford y colaboradores, (1987) Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206 y Klein y colaboradores, (1992) Biotechnology 10:268).

Otro método para el suministro físico del DNA a las plantas es la sonicación de células objetivo como es descrito en Zang y colaboradores, (1991) BioTechnology 9:996. Alternativamente, se han utilizados fusiones de liposoma o esferoplasto para introducir los vectores de expresión en las plantas. Ver, por ejemplo, Deshayes y colaboradores, (1985) EMBO J. 4:2731 y Christou y colaboraodres, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:3962. También se ha reportado la captación directa del DNA en los protoplastos utilizando la precipitación de CaCl2, alcohol polivinílico o poli-L-omitina. Ver, por ejemplo, Hain y colaboradores, (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161 y Draper y colaboradores, (1982) Plant Cell Physiol. 23:451.

También se ha descrito la electroporación de los protoplastos y células enteras y tejidos. Ver, por ejemplo, Donn y colaboradores, (1990) in Abstracts of the Vllth Int'I. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, página 53; D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-505 y Spencer y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 24 : 51-61.

Incremento de la Actividad y/o Nivel de un Polipéptido GS Se proporcionan métodos para incrementar la actividad y/o nivel del polipéptido GS de la invención. Un incremento en el nivel y/o actividad del polipéptido GS de la invención se puede lograr al proporcionar a la planta un polipéptido GS. El polipéptido GS se puede proporcionar al introducir la secuencia de aminoácidos que codifican el polipéptido GS en la planta, introducir en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido GS o alternativamente al modificar un sitio genómico que codifica el polipéptido GS de la invención.

Como es discutido en otras partes en la presente, son conocidos en la técnica muchos métodos para proporcionar un polipéptido a una planta que incluye, pero no limitado a, la introducción directa del polipéptido en la planta, introducir en la planta ( transientemente o establemente) un constructo de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima de GS . También se reconoce que los métodos de la invención pueden emplear un polinucleótido que no es capaz de dirigir, en la planta transformada, la expresión de una proteina o un RNA. De esta manera, el nivel y/o actividad de un polipéptido GS se puede incrementar al alterar el gen que codifica el polipéptido GS o su promotor. Ver, por ejemplo, Kmiec, Patente Norteamericana Número 5,565,350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868. Por lo tanto, se proporcionan plantas mutagenizadas que llevan mutaciones en los genes GS, donde las mutaciones incrementan la expresión del gen GS o incrementan la actividad de enzima de GS del polipéptido GS codificado.

Reducción de la Actividad y/o Nivel de un Polipéptido GS Se proporcionan métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido GS de la invención al transformar una célula de planta con un cásete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido GS. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido GS directamente, al prevenir la transcripción o traducción del RNA mensajero de GS, o indirectamente, al codificar un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen GS que codifica un polipéptido GS. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica, y cualquier método se puede utilizar en la presente invención para inhibir la expresión de un polipéptido GS .

De acuerdo con la presente invención, la expresión de un polipéptido GS se inhibe si el nivel de proteina del polipéptido GS es menor que 70% del nivel de proteina del mismo polipéptido GS en una planta que no se ha modificado genéticamente o mutagenizado para inhibir la expresión de aquel polipéptido GS. En modalidades particulares de la invención, el nivel de proteina del polipéptido GS en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5% o menor que 2% del nivel de proteina del mismo polipéptido GS en una planta que no es un mutante o que no se ha modificado genéticamente para inhibir la expresión de aquel polipéptido GS. El nivel de expresión del polipéptido GS se puede medir directamente, por ejemplo, al analizar el nivel del polipéptido GS expresado en la célula de planta o planta, o indirectamente, por ejemplo, al medir la actividad de enzima de GS del polipéptido GS en la célula de planta o planta o al medir la GS en la planta. Los métodos para realizar tales ensayos son descritos en otra parte en la presente.

En otras modalidades de la invención, la actividad de los polipéptidos GS se reduce o se elimina al transformar una célula de planta con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido GS . La actividad de enzima de GS de un polipéptido GS se inhibe de acuerdo con la presente invención si la actividad de enzima de GS del polipéptido GS es menor que 70% de la actividad de enzima de GS del mismo polipéptido GS en una planta que no se ha modificado para inhibir la actividad de enzima de GS de aquel polipéptido GS. En modalidades particulares de la invención, la actividad de enzima de GS del polipéptido GS en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10% o menor que 5% de la actividad de enzima de GS del mismo polipéptido GS en una planta que aquel no se ha modificado para inhibir la expresión de aquel polipéptido GS . La actividad de enzima de GS de un polipéptido GS es "eliminada" de acuerdo con la invención cuando no es detectable por los métodos de ensayo descritos en otra parte en la presente. Los métodos para determinar la actividad de enzima de GS de un polipéptido GS son descritos en otra parte en la presente.

En otras modalidades, la actividad de un polipéptido GS se puede reducir o eliminar al interrumpir el gen que codifica el polipéptido GS . La invención abarca plantas mutagenizadas que llevan mutaciones en los genes GS, donde las mutaciones reducen la expresión del gen GS o inhiben la actividad de enzima de GS del polipéptido GS codificado. De esta manera, se pueden utilizar muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido GS .

Además, se puede utilizar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido GS. Ejemplos no limitantes de los métodos para reducir o eliminar la expresión de los polipéptidos GS se dan enseguida. 1. Métodos Basados en Polinucleótido: En algunas modalidades de la presente invención, una planta se transforma con un cásete de expresión que es capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido GS de la invención. El término "expresión" como se utiliza en la presente se refiere a la biosintesis de un producto de gen, que incluye la transcripción y/o traducción del producto de gen. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de por lo menos un polipéptido GS es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de RNA que inhibe la transcripción y/o traducción de por lo menos un polipéptido GS de la invención. La "expresión" o "producción" de una proteina o polipéptido de una molécula de DNA se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia de codificación para producir la proteina o polipéptido, mientras que la "expresión" o "producción" de una proteina o polipéptido de una molécula de RNA se refiere a la traducción de la secuencia de codificación de RNA para producir la proteina o polipéptido .

Ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido GS se dan enseguida. i. Supresión/Cosupresión de Sentido En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido GS se puede obtener mediante la supresión o cosupresión de sentido. Para la cosupresión, un cásete de expresión es diseñado para expresar una molécula de RNA que corresponde a todo o parte de un RNA mensajero que codifica un polipéptido GS en la orientación de "sentido". La sobre expresión de la molécula de RNA puede dar por resultado la expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, múltiples lineas de planta transformadas con el cásete de expresión de cosupresión se clasifican para identificar aquellas que muestran la inhibición más grande de la expresión del polipéptido GS.

El polinucleótido utilizado para la cosupresión puede corresponder a todo o parte de la secuencia que codifica el polipéptido GS, todo o parte de la región no traducida 5' y/o 3' de un transcripto del polipéptido GS, o todo parte de tanto la secuencia de codificación como las regiones no traducidas de un transcripto que codifica un polipéptido GS. En algunas modalidades donde el polinucleótido comprende todo o parte de la región de codificación para el polipéptido GS, el cásete de expresión es diseñado para eliminar el codón de inicio del polinucleótido · de modo que ningún producto de proteina será traducido .

La cosupresión se puede utilizar para inhibir la expresión de los genes de la planta para producir plantas que tienen niveles de proteina no detectables para las proteínas codificadas por estos genes. Ver, por ejemplo, Broin y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión también se puede utilizar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana Número 5,942,657. Los métodos para utilizar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas son descritoe en Flavell y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:3490-3496; Jorgensen y colaboradores, (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen y Carrington, (2001) Plant Physíol. 126:930-938; Broin y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu y colaboradores, (2003) Phytochemistry 63:753-763; y Patentes Norteamericanas Números 5,034,323, 5,283, 184 y 5,942,657, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. La eficiencia de la cosupresión se puede incrementar al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' a la secuencia de sentido y 5' de la señal de poliadenilación . Ver, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número 2002/0048814, incorporada en la presente por referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótido tiene identidad de secuencia sustancial a la secuencia del transcripto del gen endógeno, óptimamente mayor que aproximadamente 65% de identidad de secuencia, más óptimamente mayor que aproximadamente 85% de identidad de secuencia, mucho más óptimamente mayor que aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Ver, Patentes Norteamericanas Números 5,283,184 y 5,034,323, incorporadas en la presente or referencia . ii. Supresión de Sentido- En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión del polipéptido GS se puede obtener mediante la supresión de sentido. Para la supresión de sentido, el cásete de expresión es diseñado para expresar una molécula de RNA complementaria a todo o parte de un RNA mensajero que codifica el polipéptido GS. La sobre expresión de la molécula de RNA de sentido puede dar por resultado la expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, múltiples lineas de planta transformadas con el cásete de expresión de supresión de sentido se clasifican para identificar aquellas que muestran la inhibición más grande de la expresión del .polipéptido GS.

El polinucleótido para el uso en la supresión de sentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica el polipéptido GS, todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto GS o todo o parte del complemento de tanto la secuencia de codificación como las regiones no traducidas de un transcripto que codifica el polipéptido GS . Además, el polinucleótido de sentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia objetivo) o parcialmente complementario (es decir, menor que 100% idéntico al complemento de la secuencia objetivo) a la secuencia objetivo. La supresión de sentido se puede utilizar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana Número 5,942,657. Además, las porciones de los nucleótidos de sentido se pueden utilizar para interrumpir la expresión del gen objetivo. Generalmente, se pueden utilizar las secuencias de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o mayor. Los métodos para utilizar la supresión de sentido para inhibir la expresión de los genes endógenos en plantas son descritos, por ejemplo, en Liu y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y Patentes Norteamericanas Números 5,759,829 y 5,942,657, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. La eficiencia de la supresión de sentido se puede incrementar al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' a la secuencia de sentido y 5' de la señal de poliadenilación. Ver, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número 2002/0048814, incorporada en la presente por referencia. iii. Interferencia de RNA de Doble Hebra En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido GS se puede obtener mediante la interferencia de RNA de doble hebra (dsRNA) . Para interferencia de dsRNA, una molécula de RNA de sentido similar aquella descrita en lo anterior para la cosupresión y una molécula de RNA de anti-sentido que es completamente o parcialmente complementaria a la molécula de RNA de sentido se expresan en la misma célula, dando por resultado la inhibición de la expresión del RNA mensajero endógeno correspondiente.

La expresión del sentido y moléculas de sentido se puede realizar al diseñar el cásete de expresión para comprender tanto la secuencia de sentido como una secuencia de sentido. Alternativamente, se pueden utilizar los casetes de expresión separados para el sentido y secuencias de sentido. Múltiples lineas de planta transformadas con el cásete de expresión de interferencia de dsRNA o casetes de expresión luego se clasifican para identificar lineas de planta que muestran la inhibición más grande de la expresión del polipéptido GS. Los métodos para utilizar la interferencia de dsRNA para inhibir la expresión de los genes de la planta endógenos son descritos en aterhouse y colaboradores, (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95:13959-13964, Liu y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y O 99/49029, WO 99/530rokc50 , WO 99/61631 y WO 00/49035, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. iv. Interferencia de RNA de Horquilla e Interferencia de RNA de Horquilla que Contiene Intrón En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido GS se puede obtener mediante la interferencia de RNA de horquilla (hpRNA) o interferencia de RNA de horquilla que contiene intrón (ihpRNA) . Estos métodos son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de genes endógenos. Ver, Waterhouse y Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet . 4:29-38 y las referencias citadas en la misma.

Para la interferencia de hpRNA, el cásete de expresión es diseñado para expresar una molécula de RNA que híbrida con sí mismo para formar una estructura de horquilla que comprende una región de vuelta de una sola hebra y un tronco emparejado de bases. La región de tronco de pares de bases comprende una secuencia de sentido que corresponde a todo o parte del RNA mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión va a ser inhibida y una secuencia de sentido que es completamente o parcialmente complementaria a la secuencia de sentido. Alternativamente, la región de tronco de pares de base puede corresponder a una porción de una secuencia promotora que controla la expresión del gen que es inhibido. De esta manera, la región de tronco de pares de base de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia de RNA. Las moléculas de hpRNA son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de los genes endógenos y la inter erencia de RNA que induce es heredada por generaciones subsecuentes de las plantas. Ver, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz, (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97:4985-4990; Stoutjesdijk y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 and aterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Los métodos para utilizar la interferencia de hpRNA para inhibir o silenciarla expresión de los genes son descritos, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz, (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97:4985-4990; Stoutjesdijk y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini y colaboradores, BMC Biotechnology 3:7 y Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número 2003/0175965, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Un ensayo transiente para la eficiencia de los constructos de hpRNA para la expresión del gen silencioso in vivo se ha descrito por Panstruga y colaboradores, (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporada en la presente por referencia.

Para ihpRNA, las moléculas de interferencia tienen la misma estructura general como para hpRNA, pero la molécula de RNA adicionalmente comprende un intrón que es capaz de ser empalmado en la célula en la cual el ihpRNA es expresado. El uso de un intrón minimiza el tamaño de la vuelta en la molécula de RNA de horquilla después del empalme, y este incrementa la eficiencia de la interferencia. Ver, por ejemplo, Smith y colaboradores, (2000) Wature 407:319-320. De hecho, Smith y colaboradores, muestra 100% de supresión de la expresión del gen endógeno utilizando la interferencia mediada por ihpRNA. Los métodos para utilizar la interferencia de ihpRNA para inhibir la expresión de los genes de la planta endógenos son descritos, por ejemplo, en Smith y colaboradores, (2000) Nature 407:319-320; Wesley y colaboradores, (2001) Plant J. 27:581-590; ang y Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse y Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295 y Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número 2003/0180945, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.

El cásete de expresión para la interferencia de hpRNA también puede ser diseñado tal que la secuencia de sentido y la secuencia de sentido no corresponden a un RNA endógeno. En esta modalidad, el sentido y secuencia de sentido flanquean una secuencia de vuelta que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a todo o parte del RNA mensajero endógeno del gen objetivo. De esta manera, es la región de vuelta que determina la especificidad de la interferencia de RNA. Ver, por ejemplo, WO 02/00904, Mette y colaboradores, (2000) EMBO J 19:5194-5201; Matzke y colaboradores, (2001) Curr. Opin. Genet . Devei 11:221-227; Scheid y colaboradores, (2002) Proc. Nati. Acad. Sd. , EUA 99:13659-13662; Aufsaftz y colaboradores, (2002) Proc. Nat'l Acad. Sci. 9 ( ): 16499-16506; Sijen y colaboradores, -Curr. Biol. (2001) 11:436-440), incorporadas en la presente por referencia. v. Interferencia Mediada por Amplicón Los casetes de expresión de amplicón comprenden una secuencia derivada del virus de planta que contiene todo o parte del gen objetivo pero generalmente no todos de los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permiten que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden ser ya sea de sentido o de sentido en relación con la secuencia objetivo (es decir, el RNA mensajero para el polipéptido GS) . Los métodos para utilizar los amplicones para inhibir la expresión de los genes de la planta endógenos son descritos, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí y Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362 y Patente Norteamericana Número 6,646,805, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia . vi . Ribozimas En algunas modalidades, el polinucleotido expresado por el cásete de expresión de la invención es RNA catalítico o tiene actividad de ribozima específica para el RNA mensajero del polipéptido GS . De esta manera, el polinucleotido causa la degradación del RNA mensajero endógeno, dando por resultado la expresión reducida del polipéptido GS . Este método es descrito, por ejemplo, en la Patente Norteamericana Número 4,987,071, incorporada en la presente por referencia. vii. RNA de Interferencia Pequeña o Micro RNA En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido GS se puede obtener mediante la interferencia de RNA por la expresión de un gen que codifica un micro RNA (miRNA) . Los miRNAs son agentes reguladores que consisten de aproximadamente 22 ribonucleótidos . Los miRNA son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de los genes endógenos. Ver, por ejemplo, Javier y colaboradores, (2003) Nature 425:257-263, incorporada en la presente por referencia.

Para la interferencia de miRNA, el cásete de expresión es diseñado para expresar una molécula de RNA que se modela en un gen miRNA endógeno. El gen miRNA codifica un RNA que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleotidos que es complementaria a otro gen endógeno (secuencia objetivo) . Para la supresión de la expresión de GS, la secuencia de 22 nucleotidos se selecciona de una secuencia de transcripto GS y contiene 22 nucleotidos de la secuencia GS en la orientación de sentido y 21 nucleotidos de una secuencia de sentido correspondiente que es complementaria a la secuencia de sentido. Las moléculas miRNA son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de los genes endógenos y la interferencia del RNA que induce es heredada por generaciones subsecuentes de las plantas . 2. Inhibición Basada en Polipéptido de Expresión de Gen En una modalidad, el polinucleótido codifica una proteina GS que enlaza a un gen que codifica un polipéptido GS, dando por resultado la expresión reducida del gen. En modalidades particulares, la proteina GS se enlaza a una región reguladora de un gen GS. En otras modalidades, la proteina GS se enlaza a un RNA mensajero que codifica un polipéptido GS y previene su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para la dirección de proteínas GS se han descrito, por ejemplo, en Patente Norteamericana Número 6,453,242, y métodos para utilizar proteínas GS para inhibir ¦ la expresión de los genes en las plantas son descritos, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número 2003/0037355, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. 3. Inhibición Basada en Polipéptido de la Actividad de Proteína En algunas modalidades de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que enlaza por lo menos un polipéptido GS y reduce la actividad de enzima de GS del polipéptido GS. En otra modalidad, el enlace del anticuerpo da por resultado la rotación incrementada del complejo GS de anticuerpo mediante mecanismos de control de calidad celular. La expresión de anticuerpos en las células de planta y la inhibición de las rutas moleculares mediante la expresión y enlace de anticuerpos a proteínas en células de planta son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Conrad and Sonnewald, (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporada en la presente por referencia. 4. Interrupción Géníca En algunas modalidades de la presente invención, la actividad de un polipéptido GS se reduce o se. elimina al interrumpir el gen que codifica el polipéptido GS . El gen que codifica el polipéptido GS se puede interrumpir por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, en gen se interrumpe mediante la etiquetacion de transposón. En otra modalidad, el gen se interrumpe al mutagenizar plantas utilizando mutagénesis aleatoria u objetiva, y seleccionar las plantas que tienen actividad de enzima de GS reducida . i. Etiquetación de Transposón En una modalidad de la invención, la etiquetación de transposón se utiliza para reducir o eliminar la actividad de GS de uno o más polipéptidos GS. La etiquetación de transposón comprende insertar un transposón dentro de un gen GS endógeno para reducir o eliminar la expresión del polipéptido GS. "Gen GS" se proporciona para dar a entender el gen que codifica un polipéptido GS de acuerdo con la invención .

En esta modalidad, la expresión de uno o más polipéptidos GS se reduce o se elimina al insertar un transposón dentro de una región reguladora o región de codificación del gen que codifica el polipéptido GS . Un transposón que está dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3' , un promotor o cualquier otra secuencia reguladora es un gen GS se puede utilizar para reducir o eliminar la expresión y/o actividad del polipéptido GS codificado .

Los métodos para 1ß· etiquetación de transposón de los genes específicos en las plantas son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Maes y colaboradores, (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti, (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner y colaboradores, (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat y colaboradores, (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai y colaboradores, (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice y colaboradores, (1999) Genetics 153:1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu en genes seleccionados se ha descrito en Bensen y colaboradores, (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena y colaboradores, (1996) Science 274:1537-1540 y Patente Norteamericana Número 5,962,764, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. ii. Plantas Mutantes con Actividad Reducida También son conocidos en la técnica los métodos adicionales para disminuir o eliminar la expresión de los genes endógenos en las plantas y se pueden aplicar de manera similar con la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como la mutagénesis inducida con metanosulfonato de etilo, mutagénesis de supresión y mutagénesis de supresión de neutrón rápido utilizada en un sentido genético inverso (con PCR) para identificar lineas de planta en las cuales el gen endógeno se ha suprimido. Para los ejemplos de estos métodos ver, Ohshima y colaboradores, (1998) Virology 243:472-481; Okubara y colaboradores, (1994) Genetics 137:867-874 y Quesada y colaboradores, (2000) Genetics 154:421-436, cada una de las cuelas se incorpora en la presente por referencia. Además, un método rápido y automatizable para la clasificación de mutaciones químicamente inducidas, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), utilizando HPLC desnaturalizante o digestión de endonucleasa selectiva de productos PCR seleccionados también es aplicable con la presente invención. Ver, McCallum y colaboradores, (2000) Nat. Biotechnol . 18:455- 457, incorporada en la presente por referencia.

Las mutaciones que impactan la expresión del gen o que interfieren con la función (actividad de enzima de GS) de la proteína codificada son bien conocidas en la técnica. Las mutaciones insercionales en los exones de gen usualmente dan por resultado mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente efectivos en inhibir la actividad de enzima de GS de la proteína codificada. Se han descrito los residuos conservados de los polipéptidos GS de la planta adecuados para la mutagénesis con el objetivo de eliminar la actividad de enzima de GS . Tales mutantes se pueden aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y mutaciones en diferentes sitios de GS se pueden apilar mediante cruzamiento genético. Ver, por ejemplo, Gruis y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

En otra modalidad de esta invención, se pueden utilizar mutantes dominantes para activar el silenciamiento del RNA debido a la inversión del gen y recombinación de un sitio de gen duplicado. Ver, por ejemplo, Kusaba y colaboradores, (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

La invención abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos GS. Son conocidos en la técnica los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótido genómica en una planta e incluyen, pero no están limitados a, el uso de vectores de RNA:DNA, vectores mutacionales de RNA : DNA, vectores reparación de RNA: DNA, oligonucleótidos mezclados dúplex, oligonucleótidos auto-complementarios de RNA: DNA y oligonucleobases recombinogénicas . Son conocidos en la técnica tales vectores y métodos de uso. Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Números 5,565,350; 5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972 y 5,871,984, cada una de las cuales se incorporan en la presente referencia. Ver también, O 98/49350, O 99/07865, O 99/25821 y Beetham y colaboradores, (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 96:8774-8778, cada una de las cuelas se incorpora en la presente por referencia . iii. Modulación de la actividad de enzima de GS En métodos específicos, el nivel y/o actividad de un regulador GS en una planta se disminuye al incrementar el nivel o actividad del polipéptido GS en la planta. Los métodos para incrementar el nivel y/o actividad de los polipéptidos GS en una planta son discutidos en otra parte en la presente. De manera breve, tales métodos comprenden proporcionar un polipéptido GS de la invención a una planta y de esta manera incrementar el nivel y/o actividad del polipéptido GS. En otras modalidades, una secuencia de nucleótido GS que codifica un polipéptido GS se puede proporcionar al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido GS de la invención, expresar la secuencia GS, incrementar la actividad del polipéptido GS y de esta manera disminuir la captación de amonio o transporte en la planta o parte de la planta. En otras modalidades, el constructo de nucleótido GS introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta .

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado a utilizar para modular el nivel/actividad de una enzima GS en la planta. Los promotores ejemplares para esta modalidad se han divulgado en otra parte en la presente.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen un número modificado de células cuando es comparado con el número de células de un tejido de la planta de control. En una modalidad, la planta de la invención tiene un nivel incrementado/actividad del polipéptido GS de la invención y asi tiene un transporte de Amonio incrementado en el tejido de la planta. En otras modalidades, la planta de la invención tiene un nivel reducido o eliminado del polipéptido GS de la invención y asi tiene un NUE incrementado en el tejido de la planta. En otras modalidades, tales plantas tiene establemente incorporado en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotido GS de la invención operablemente enlazado a un promotor que conduce la expresión en la célula de planta. iv. Modulación del Desarrollo de Raíz Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de raíz en una planta. Por "modular el desarrollo de raíz" se propone cualquier alteración en el desarrollo de raíz de la planta cuando es comparado con una planta de control. Tales alteraciones en el desarrollo de raíz incluyen, pero no están limitadas a, alteraciones en la tasa de crecimiento de raiz primaria, el peso de raiz fresca, el grado de formación de raiz lateral y adventicia, el sistema de vasculatura, desarrollo de meristema o expansión radial.

Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de raiz en una planta. Los métodos comprenden modular el nivel y/o actividad del polipéptido GS en la planta. En un método, se proporciona una secuencia GS de la invención a la planta. En otro método, se proporciona la secuencia de nucleotido GS al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleotido GS de la invención, al expresar la secuencia GS y de esta manera modificar el desarrollo de raíz. En todavía otros métodos, el constructo de nucleótido GS introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta.

En otros métodos, el desarrollo de raíz se modula al alterar el nivel o actividad del polipéptido GS en la planta. Una disminución en la actividad de GS puede dar por resultado por lo menos una o más de las siguientes alteraciones al desarrollo de raíz, que incluyen, pero no limitadas a, meristemas de raíz más grandes, incremento en el crecimiento de raíz, expansión radial aumentada, un sistema de vasculatura aumentado, ramificación de raíz incrementada, raíces más adventicias y/o un incremento en el peso de raíz fresca cuando es comparado con una planta de control.

- Como se utiliza en la presente, "crecimiento de raíz" abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema de raíz en diferentes etapas de su desarrollo en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se va a entender que el crecimiento de raíz aumentado puede resultar del crecimiento aumentado de una o más de sus partes que incluyen raíces primarias, raíces laterales, raíces adventicias, etc.

Son bien conocidos en la técnica los métodos para medir tales alteraciones de desarrollo en el sistema de raíz. Ver, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número 2003/0074698 y erner y colaboradores, (2001) PNAS 18:10487-10492, ambas de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado a utilizar para modular el desarrollo de raíz en la planta. Los promotores ejemplares para esta modalidad incluyen promotores constitutivos y promotores preferidos de raiz. Los promotores preferidos de raíz ejemplar se han divulgado en otra parte en la presente.

Estimular el crecimiento de raiz e incrementar la masa de raíz al disminuir la actividad y/o nivel del polipéptido GS también encuentra uso en mejorar la erectibilidad de- una planta. El término "resistencia a la fijación" o "erectibilidad" se refiere a la habilidad de una planta para fijarse por sí misma a la tierra. Para las plantas con un hábito de crecimiento erecto o semi-erecto, este término también se refiere a la habilidad de mantener una posición vertical bajo condiciones adversas (ambientales) . Este rasgo se relaciona al tamaño, profundidad y morfología del sistema de raíz. Además, estimular el crecimiento de raíz e incrementar la masa de raíz al disminuir el nivel y/o actividad del polipéptido GS también encuentra uso en promover la propagación in vítro de explantas .

Además, la producción de biomasa de raíz superior debido a un nivel y/o actividad disminuida de la actividad de GS tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto indirecto de producción de los compuestos producidos por las células de raíz o células de raíz transgénicas o cultivos de células de las células de raíz transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos de raíz es shikonina, el rendimiento del cual se puede aumentar ventajosamente por los métodos.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen desarrollo de raíz modulado cuando es comparado con el desarrollo de raíz de una planta de control. En algunas modalidades, la planta de la invención tiene un nivel incrementado/actividad del polipéptido GS de la invención y tiene crecimiento de raíz aumentado y/o biomasa de raíz. En otras modalidades, tales plantas han incorporado establemente en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido GS de la invención operablemente enlazado a un promotor que conduce la expresión en la célula de planta. v. Modulación del Desarrollo de Brote y Hoja También se proporcionan métodos para modular el desarrollo del brote y la hoja en una planta. Por "modular el desarrollo del brote y/o la hoja" se propone cualquier alteración en el desarrollo del brote y/o la hoja de la planta. Tales alteraciones en el desarrollo del brote y/o la hoja incluyen, pero no están limitados a, alteraciones en el desarrollo del meristema del brote, en el número de hojas, tamaño de hoja, vasculatura de hoja y tallo, longitud de internodo y senescencia de la hoja. Como se utiliza en la presente, "desarrollo de hoja" y "desarrollo de brote" abarcan todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema de hoja y el sistema de brote, respectivamente, en diferentes etapas de su desarrollo, tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se conocen en la técnica los métodos para medir tales alteraciones de desarrollo en el sistema de brote y hoja. Ver, por ejemplo, Werner y colaboradores, (2001) PNAS 98:10487-10492 y Publicación de Solicitud de Patente. Norteamericana Número 2003/0074698, cada una de las cuelas se incorpora en la presente por referencia.

El método para modular el desarrollo del brote y/o la hoja en una planta comprende modular la actividad y/o nivel de un polipéptido GS de la invención. En una modalidad, se proporciona una secuéncia GS de la invención. En otras modalidades, se puede proporcionar la secuencia de nucleótido GS al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido GS de la invención, expresar la secuencia GS y de esta manera modificar el desarrollo del brote y/o la hoja. En otras modalidades, el constructo de nucleótido GS introducido en - la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta.

En modalidades especificas, el desarrollo del brote o la hoja se modula al incrementar el nivel y/o actividad del polipéptido GS en la planta. Un incremento en la actividad de GS puede dar por resultado por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo del brote y/o la hoja, que incluye, pero no limitado a, número de hojas, superficie de la hoja, vasculatura, longitud de internodo y senescencia de la hoja, cuando es comparado con una planta de control.

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado a utilizar para modular el desarrollo del brote y la hoja de la planta. Los, promotores ejemplares para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores preferidos del brote, promotores preferidos del meristema del brote y promotores preferidos de la hoja. Los promotores ejemplares se han discutido en otra parte en la presente.

Como es discutido en lo anterior, la modulación de la actividad de GS en la planta modula tanto el crecimiento de raíz como del brote. De esta manera, la presente invención además proporciona métodos para alterar la relación de raiz/brote. El desarrollo del brote o la hoja se pueden además modular al incrementar el nivel y/o actividad del polipéptido GS en la planta.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen desarrollo del brote y/o la hoja modulado cuando es comparado con una planta de control. En algunas modalidades, la planta de la invención tiene un nivel incrementado/actividad del polipéptido GS de la invención. En otras modalidades, la planta de la invención tiene un nivel/actividad disminuida del polipéptido GS de la invención . vi. Modulación del Desarrollo de Tejido Reproductivo Se proporcionan métodos para modular el desarrollo del tejido reproductivo. En una modalidad, se proporcionan métodos para modular el desarrollo floral en una planta. Por "modular el desarrollo floral" se propone cualquier alteración en una estructura de un tejido reproductivo de la planta como es comparado con una planta de control en la cual la actividad o nivel del polipéptido GS no se ha modulado. "Modular el desarrollo floral" además incluye cualquier alteración en el tiempo del desarrollo de un tejido reproductivo de la planta (es decir, un retraso o un tiempo acelerado del desarrollo floral) cuando es comparado con una planta de control en la cual la actividad o nivel del polipéptido GS no se ha modulado. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en el tamaño, forma, número o ubicación de los órganos reproductivos, el periodo de tiempo de desarrollo que estas estructuras forman o la habilidad de mantener o proceder a través del proceso de florecimiento en tiempos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios a los tipos o formas de las células que constituyen los órganos reproductivos .

El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende modular la actividad de GS en una planta. En un método, se proporciona una secuencia GS de la invención. Se proporciona una secuencia de nucleótido GS al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido GS de la invención, expresar la secuencia GS, y de esta manera modificar el desarrollo floral. En otras modalidades, el constructo de nucleótido GS introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta .

En métodos específicos, el desarrollo floral se modula al incrementar el nivel o actividad del polipéptido GS en la planta. Un incremento en la actividad de GS puede dar por resultado por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, que incluyen, pero no limitadas a, florecimiento retardado, número reducido de flores, esterilidad masculina parcial y conjunto de semilla reducido, cuando es comparado con una planta de control. Inducir el florecimiento retardado o inhibir el florecimiento se puede utilizar para aumentar el rendimiento en los cultivos de forraje tal como alfalfa. Son conocidos en la técnica los métodos para medir tales alteraciones de desarrollo en el desarrollo floral. Ver, por ejemplo, Mouradov y colaboradores, (2002) The Plant Cell S111-S130, incorporada en la presente por referencia.

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado a utilizar para modular el desarrollo floral de la planta. Los promotores ejemplares para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores preferidos de brote y promotores preferidos de inflorescencia.

En otros métodos, el desarrollo floral se modula al disminuir el nivel y/o actividad de la secuencia GS de la invención. Tales métodos pueden comprender introducir una secuencia de nucleótido GS en la planta y disminuir la actividad del polipéptido GS. En otros métodos, el constructo de nucleótido GS introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta. Disminuir la expresión de la secuencia GS de la invención puede modular el desarrollo floral durante periodos de estrés. Tales métodos son descritos en otra parte en la presente. Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen el desarrollo floral modulado cuando es comparado con el desarrollo floral de una planta de control. Las composiciones incluyen plantas que tienen un nivel/actividad disminuida del polipéptido GS de la invención y que tienen un desarrollo floral alterado. Las composiciones también incluir plantas que tienen un nivel/actividad disminuida del polipéptido GS de la invención en donde la planta mantiene o procede a través del proceso de florecimiento en tiempos de estrés.

También se proporcionan métodos para el uso de las secuencias GS de la invención para incrementar la eficiencia del uso de nitróqeno. El método comprende disminuir o incrementar la actividad de las secuencias GS en una planta o parte de planta, tal como las raices, brotes, células epidérmicas, etc.

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado a utilizar para manipular la expresión de GS . Los promotores ejemplares de esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, y promotores preferidos de raíz o brote u hoja. vii. Método de Uso para polinucleótidos promotores GS .

Los polinucleótidos que comprenden los promotores GS divulgados en la presente invención, asi como variantes y fragmentos de los mismos, son útiles en la manipulación genética de cualquier células hospedera, de preferencia célula de planta, cuando se ensamblan con un constructo de DNA tal que la secuencia promotora se enlaza operablemente a una secuencia de nucleótido que comprende un polinucleótido de interés. De esta manera, se proporcionan los polinucleótidos promotores GS de la invención en casetes de expresión junto con una secuencia de polinucleótido de interés para la expresión en la célula hospedera de interés. Las secuencias promotoras GS de la invención se expresan en una variedad de tejidos y asi las secuencias promotoras pueden encontrar uso en regular la expresión temporal y/o espacial de los polinucleótidos de interés.

Se conocen en la técnica las regiones promotoras híbridas sintéticas. Tales regiones comprenden elementos promotores corriente arriba de un polinucleótido operablemente enlazado al elemento promotor del otro polinucleótido. En una modalidad de la invención, la expresión de secuencia heteróloga se controla mediante un promotor híbrido sintético que comprende las secuencias promotores GS de la invención, o una variante o fragmento de los mismos, operablemente enlazados a un (unos) elemento (s) promotor (es) corriente (s) arriba de un promotor heterólogo. Los elementos promotores corriente arriba que están involucrados en el sistema de defensa de la planta se han identificado y se pueden utilizar para generar un promotor sintético. Ver, por ejemplo, Rushton y colaboradores, (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:311-315. Alternativamente, una secuencia promotora GS sintética puede comprender duplicaciones de los elementos promotores corriente arriba encontrados dentro de las secuencias promotoras GS .

Se reconoce que la secuencia promotora de la invención se puede utilizar con sus secuencias de codificación GS nativas. Un constructo de DNA que comprende el promotor GS operablemente enlazado con su gen GS nativo se puede utilizar para transformar cualquier planta de interés a llevar aproximadamente un cambio fenotipico deseado, tal como, modulación de raíz, brote, hoja, floral y desarrollo embrionario, tolerancia al estrés y cualquier otro fenotipo descrito en otra parte en la presente.

Las secuencias y métodos del nucleotido promotor divulgados en la presente son útiles en regular la expresión de cualquier secuencia de nucleotido heterologa en una planta hospedera a fin de variar el fenotipo de una planta. Varios cambios en el fenotipo son de interés que incluyen modificar la composición de ácido graso en una planta, alterar el contenido de aminoácido de una planta, alterar un mecanismo de defensa patógena de lá planta y los similares. Estos resultados se pueden lograr al proporcionar la expresión de productos heterólogos o incrementar la expresión de productos endógenos en las plantas. Alternativamente, los resultados se pueden lograr al proporcionar una reducción de expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan por resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Los genes de interés son un reflejo de los mercados comerciales e intereses de aquellos involucrados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de cambio de interés, y como naciones en desarrollo abren los mercados mundiales, también surgirán nuevos cultivos y tecnologías. Además, ya que su entendimiento de atributos y características agronómicas tales como el rendimiento e incremento de la heterosis, la selección de genes para la transformación cambiará por consiguiente. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes involucrados en la información, tal como GSs, aquellos involucrados en la comunicación, tal como quinasas y aquellos involucrados en el servicio de limpieza, tal como proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de los transgenes, por ' ejemplo, incluyen genes que codifican atributos importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedad, resistencia a herbicida, esterilidad, características de grano y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, generalmente, aquellos involucrados en el aceite, almidón, carbohidrato o metabolismo de nutriente así como aquellos que afectan el tamaño del núcleo, carga de sacarosa y los similares.

En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar en combinación ("apilado") con otras secuencias de polinucleótido de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de cualquier de uno o más de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de atributos deseados, que incluyen pero no limitados a atributos deseables para alimento animal tal como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente Norteamericana Número 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes Norteamericanas Números 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802 y 5,703,409); lisina de alto contenido de cebada (Williamson y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106 y WO 98/20122) y proteínas de alto contenido de metionina (Pedersen y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71:359 y Musumura y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidad incrementada (por ejemplo, proteínas almacenadas modificadas (Solicitud de Patente Norteamericana Número de Serie 10/053,410, presenta el 7 de Noviembre del 2001) y tiorredoxinas (Solicitud de Patente Norteamericana Número de Serie 10/005,429, presenta el 3 de Diciembre del 2001)), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con atributos deseables para resistencia a insectos, enfermedad o herbicida (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes Norteamericanas Números 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de destoxificación de fumonisina (Patente Norteamericana Número 5,792,931); genes de resistencia a la avirulencia y enfermedad (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; indrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a la resistencia a herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) y resistencia a glifosato (gen EPSPS) ) y atributos deseables para procesar o productos del proceso tal como alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente Norteamericana Número 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes desaturasa de ácido graso (Patente Norteamericana Número 5,952,544; O 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa) , almidón sintasas (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) y enzimas de desramificadión de almidón (SDBE) ) y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente Norteamericana Número 5,602,321 ; beta- cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert y colaboradores, (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitar la expresión de polihidroxi-alcanoatos (PHAs) ) , las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Un experto también podría combinar los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que afectan los atributos agronómicos tal como esterilidad masculina (por ejemplo, ver, Patente Norteamericana Número 5,583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento o atributos de tecnología de transformación tal como regulación del ciclo celular o dirección del gen (por ejemplo, O 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

En una modalidad, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de la planta y/o rendimiento del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que dan por resultado sistemas de raíz primarios o laterales mejorados. Tales genes incluyen, pero no limitados a, transportadores de nutrientes/agua e inducir el crecimiento. Ejemplos de tales genes, incluyen pero no están limitados a, membrana de plasma de maíz H+-ATPasa (MHA2) (Frías y colaboradores, (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding y colaboradores, (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que activan el ciclo de división celular en las células apicales de raíz (Cheng y colaboradores, (1995) Plant Physiol 108:881); genes de glutamina sintetasa del maíz (Sukanya y colaboradores, (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff y colaboradores, (1997) J. Biol. Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter y colaboradores, (1997) Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter y colaboradores, (1997) Plant Physiol 114:493-500 y referencias sitadas en la misma) . La secuencia de interés también puede ser útil en expresar las secuencias de nucleótido de sentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de raíz.

Los atributos adicionales, agronómicamente importantes tales como aceite, almidón, y contenido de proteína se pueden alterar genéticamente además de utilizar métodos de reproducción tradicionales. Las modificaciones incluyen incrementar el contenido de ácido oleico, aceites saturados o insaturados, incrementar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales, y también la modificación de almidón. Las modificaciones de proteína de hordotionina son descritas en las Patentes Norteamericanas Números 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389, incorporadas en la presente por referencia. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrito en la Patente Norteamericana Número 5,850,016 y el inhibidor de quimotripsina de la cebada, descrito en illiamson y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Los derivados de las secuencias de codificación se pueden hacer mediante mutagénesis dirigida al sitio para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido de lisina de alto contenido de cebada (BHL) se deriva del inhibidor de quimotripsina de cebada, Solicitud de Patente Norteamericana Número de Serie 08/740,682, presentada el 1 de Noviembre del 1996 y O "98/20133, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Otras proteínas incluyen proteínas de planta ricas en metionina tal como de semilla de girasol (Lilley y colaboradores, (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utílízation in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Apple hite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), páginas 497-502; incorporadas en la presente por referencia); maíz (Pedersen y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71:359; ambas de las cuales se incorporan en la presente por referencia) y arroz (Musumura y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporada en la presente por referencia) . Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Harinoso 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semilla y factores de transcripción .

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a pestes que tienen mayor arrastre de rendimiento tales como gusano de raíz, gusano cortador, Barrenador Europeo del Miaz y los similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, genes de proteina tóxicos de Bacillus thuringiensis (Patentes Norteamericanas Números 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881 y Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109) y las similares.

Los genes que codifican atributos de resistencia a la enfermedad incluyen genes de destoxificación, tal como contra fumonosina (Patente Norteamericana Número 5,792,931); genes de resistencia (R) a la avirulencia (avr) y enfermedad (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432 y Mindrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089) y los similares.

Los atributos de resistencia a herbicida pueden incluir genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS) , en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintasa (ALS) que contienen mutaciones que conducen a tal resistencia,- en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , los genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica la resistencia a los antibióticos de kanamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS codifican la resistencia al herbicida clorsulfurón .

Los genes de esterilidad también se pueden codificar en un cásete de expresión y proporcionar una alternativa al desespigamiento físico. Ejemplos de genes utilizados de tal manera incluyen genes preferidos de tejido masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina tal como QM, descritos en la ' Patente Norteamericana Número 5,583,210. Otros genes incluyen cinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos a ya sea el desarrollo gametofítico masculino o femenino.

La calidad del grano se refleja en los atributos tales como niveles y tipos de aceites, saturados e insaturados, calidad y cantidad de aminoácidos esenciales, y niveles de celulosa. En el maíz, las proteínas de hordotionina modificadas son descritas en la Patentes Norteamericanas Números 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389.

Los atributos comerciales también se pueden codificar en un gen o genes que podrían incrementar por ejemplo, el almidón para la producción de etanol, o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tal como es descrito en la Patente Norteamericana Número 5,602,321. Los genes tales como ß-Cetotiolasa, PHBasa (polihidroxiburirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (ver, Schubert y colaboradores, (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilita la expresión de polihiroxialcanoatos (PHAs) .

Los productos exógenos incluyen enzimas de planta y productos así como aquellos de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y los similares. En nivel de proteínas, particularmente proteínas modificadas que tienen distribución de aminoácido mejorada para mejorar el valor nutriente de la planta, se puede incrementar. Esto se logra mediante la expresión de tales proteínas que tienen contenido de aminoácidos aumentado.

Esta invención puede ser mejor entendida por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que otras modalidades de la invención se pueden practicar sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención como es divulgado y reclamado en la presente.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Identificación y análisis filogenético de secuencias GS de Arabidopsis, soja, arroz, sorgo y maíz Se empleó una rutina para identificar todos los miembros de una familia de genes de glutamina sintetasa (GS) de especies dadas. Primero, se preparó un conjunto diverso de los miembros disponibles conocidos de la familia de genes como secuencias de proteina de fuentes públicas y patentadas. Luego, como en el ejemplo del maíz, .estas secuencias de consulta de proteina se buscaron utilizando un algoritmo BLAST contra una combinación de conjuntos de datos genómicos o de transcripto, de secuencia de nucleótidos, patentados y públicos y se identificó un conjunto no redundante de candidato GS o 'aciertos' . Estas secuencias se combinaron con cualquiera de las secuencias de la familia de genes del maíz existentes, y luego se curaron y se editaron para llegar a un nuevo conjunto de trabajo del gen GS del maíz único o secuencias de transcripto y sus traducciones. Esta búsqueda para los miembros de la familia de genes se repitió. Si nuevas secuencias se recuperaron que fueron únicas (no las mismas igualaciones génicas) , el proceso se repitió hasta la terminación, que es hasta que no se encontraron nuevas y distintas secuencias de nucleótidos. De esta manera se determinó que la familia de genes GS del maíz consistió de 6 miembros. Ocho y 3 distintas secuencias de soja y sorgo se encontraron, respectivamente. Sin las secuencias del genoma completo del maíz o soja disponibles, los investigadores fueron menos certeros del tamaño de la familia de gene exacto, que fueron para Arabidopsis (6 miembros) y arroz (4 miembros) . La disponibilidad de las secuencias del genoma completo para Arabidopsis y arroz simplificó la búsqueda, ayudaron también mediante la disponibilidad de bastantes modelos de gen maduros y anotaciones para estas especies. Todas las IDs de Secuencia junto con la identidad de anotación se catalogaron en la Tabla 1. La alineación de polipéptido de todas las 27 secuencias se muestra en la Figura 1. Varias regiones de muy alta homología se identificaron por esta alineación. Todos estos polipéptidos de diferentes especies (excepto la SEQ ID NO: 20) muestra una identidad de secuencia en el intervalo de 70-95% entre diferentes miembros. Debido a varias inserciones, la SEQ ID NO: 20 muestra una identidad en el intervalo de 53-74% con diferentes polipéptidos GS de diferentes especies. Las SEQ ID NOS: 10, 18, 28, 36, 42 y 54 pertenecen al grupo GS2 (cloroplasto-localizado) como en todos los polipéptidos se identificó un péptido de dirección de cloroplasto claro. Los análisis filogenéticos de todos los 27 polipéptidos se muestran en la Figura 2. Claramente, ZMGS1-1/1-5, ZMGS 1-3/1-4, ZMGS1-2 y Z GS2 junto con miembros de otras especies se agruparon en cuatro diferentes clases. Parece una clase especifica de soja- con las SEQ ID NOS: 14, 22, 24 y 26.

Ejemplo 2: Análisis de Expresión MPSS de diferentes isoformas GS del Maíz Los análisis de expresión de Secuenciación de Signatura Masivamente Paralela (MPSS) se realizaron para la expresión de isoforma GS de una base de datos del maíz que consiste de más de 300 librerías de tejido. Los resultados de estos análisis se resumen en la Figura 3. GS1-1 y GS2 se expresaron predominantemente en las raíces y hojas, respectivamente (Figura 3, panel superior) . GS1-2 se expresa más o menos en todos los tejidos con una expresión ligeramente más alta en el polen (Figura 3, panel superior). GS1-3 y 1-4 se expresan en niveles muy bajos en la mayoría de los tejidos examinados mientras que GS 1-5 se expresa a ~100 ppm (pares por millón) en las raíces (Figura 3, panel superior) . GS 1-1 mostró 15-20 veces la expresión del nivel más alto en la corteza de raíz como es comparado con otras isoformas (Figura 3, panel central) . Entre todas las isoformas, solamente GS 1-2 y 1-5 se expresan en el pedicelo (Figura 3, panel inferior) Ejemplo 3: Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas mediante la Transformación mediada por Agrobacterium Varios factores se transformaron en maíz (endogámicos FAST/GS3xGF o ETX) mediante la transformación mediada por Agrobacterium. La descripción de estos vect se proporciona en la Tabla 2.

TABLA 2 Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con una secuencia de sentido de la secuencia GS de la presente invención, de preferencia el método de Zhao se emplea (Patente Norteamericana Número ' 5, 981, 840 y Publicación de Patente de PCT W098/32326, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente por referencia) . De manera breve, los embriones inmaduros se aislan del maíz y los embriones contactados con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir las secuencias GS de sentido a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa los embriones de preferencia se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivación) . De preferencia los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido después de la etapa de infección. Después de este periodo de co-cultivación una etapa de "reposo" opcional se contempla. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en la presencia de por lo menos un antibiótico conocido para inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de planta (etapa 3: etapa de reposo) . De preferencia los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivan en medio que contiene un agente selectivo y el callo transformado en crecimiento se recupera (etapa 4: la etapa de selección). De preferencia, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de células transformadas. El callo luego se regenera en las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y de preferencia los callos cultivos en medio selectivo se cultivan en medio sólido para regenerar las plantas. Las plantas se monitorean y se registran para una modulación en el desarrollo del tejido.

Los embriones del maíz inmaduros de plantas donadoras de invernaderos se bombardean con un plásmido que contiene la secuencia GS operablemente enlazada al promotor constitutivo o específico de tejido (Vilardell y colaboradores, (1990) Plant Mol Biol 14:423-432) y el gen marcador seleccionable PAT, el cual confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Alternativamente, se proporciona el gen marcador seleccionable en un plásmido separado. La trans ormación se realiza como sigue. Recetas de los medios se muestran enseguida.

Preparación del Tejido Objetivo: Los mazorcas se despinochan y esterilizan en la superficie en el blanqueador CloroxMR al 30% más Micro detergente al 0.5% durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan al lado del eje del embrión hacia abajo (lado del escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, en medio 560Y-durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en la preparación para el bombardeo.

Preparación de DNA: Un vector de plásmido que comprende la secuencia GS operablemente enlazada a un promotor de ubiquitina se hace. Este DNA de plásmido más el DNA de plásmido que contiene un marcador seleccionable PAT se precipita en pelotillas de tungsteno 1.1 µ?t? (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación de CaCl2 como sigue: 100 µ? de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µ? (1 µg) de DNA en solución reguladora de Tris EDTA (1 µg de DNA total) 100 µ? de CaCl2 2.5 M 10 µ? de espermidina 0.1 M Cada reactivo se adiciona secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras que se mantiene en el formador de vórtice de multitubo. La mezcla final se sónica de manera breve y se deja incubar bajo el formador de vórtice constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugan de manera breve, se remueve el líquido, se lavan con 500 mi de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente el líquido se remueve, y 105 µ? de etanol al 100% se adiciona a la pelotilla de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo con pistola de partícula, las partículas de tungsteno/DNA se sonican de manera breve y 10 µ? se manchan en el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con Pistola de Partícula: Las placas de muestra se bombardean al nivel #4 con pistola de partícula #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/DNA preparadas.

Tratamiento Subsecuente: Después del bombardeo, los embriones se conservan en medio 560Y durante 2 días, luego se transfieren al medio de selección 560R que contiene 3 mg/litros de Bialaphos y subcultivados cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo resistentes a la selección se transfieren al medio 288J para iniciar la regeneración de planta. Después de la maduración de embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren al cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas de desarrollo se transfieren al medio libre de hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas son bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en cajones semilleros (equivalente a 2.5" por maceta) que contienen tierra para macetas y crecen durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente crecen 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y crecen hasta la madurez. Las plantas se monitorean y se registran para la tolerancia de sequía incrementada. Los ensayos para medir la tolerancia de sequía mejorada son rutinas en la técnica e incluyen, por ejemplo, rendimientos de capacidad de mazorca con núcleo bajo condiciones de sequía cuando es comparado con las plantas de maíz de control bajo condiciones ambientales idénticas. Alternativamente, las plantas transformadas se pueden monitorear para una modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una disminución en la formación de espiguilla en la mazorca) . SVer, por ejemplo, Bruce y colaboradores, (2002) Journal of Experimental Botany 53:1-13.

Medios de Bombardeo y de Cultivo: El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 ml/1 de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 120.0 g/1 de sacarosa, 1.0 mg/1 de 2,4-D y 2.88 g/1 de L-prolina (presentado a volumen con D-I H20 después del ajuste a pH 5.8 con KOH) ; 2.0 g/1 de GelriteMR (adicionado después de llevar a volumen con D-I H20) ; y 8.5 mg/1 de nitrato de plata (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) . El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/1 de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 30.0 g/1 de sacarosa y 2.0 mg/1 de 2,4-D (presentado a volumen con D-I H20 después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/1 de GelriteMR (adicionado después de llevar a volumen con D-I H20) y 0.85 mg/1 de nitrato de plata y 3.0 mg/1 de bialaphos (ambos adicionados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) .

El medio de regeneración de planta (288J) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución madre de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotinico, 0.02 g/1 de HC1 de tiamina, 0.10 g/1 de HC1 de piridoxina y 0.40 g/1 • de glicina presenta a volumen con D-I H20 purificado) (Murashige y Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/1 de mio-inositol, 0.5 mg/1 de zeatina, 60 g/1 de sacarosa y 1.0 ml/1 de ácido abscisico 0.1 mM (presentado a volumen con D-I H20 purificado después del ajuste a pH 5.6); 3.0 g/1 de GelriteMR (adicionado después de llevar a volumen con D-I H20) y 1.0 mg/1 de ácido indolacético y 3.0 mg/1 de bialaphos (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C) . El medio libre de hormonas (272V) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución madre de vitaminas MS (0.100 g/1 de ácido nicotinico, 0.02 g/1 de HC1 de tiamina, 0.10 g/1 de HC1 de piridoxina y 0.40 g/1 de glicina presentada a volumen con D-I H20 purificado), 0.1 g/1 de mio-inositol y 40.0 g/1 de sacarosa (presentada a volumen con D-I H20 purificado después del ajuste a pH 5.6) y 6 g/1 de bactoMR-agar (adicionado después de llevar volumen con D-I H20 purificado), esterilizado y enfriado a 60°C.

Ejemplo 4: Transformación de Embrión de Soja Los embriones de soja se bombardean con un plásmido que contiene secuencias GS de sentido operablemente enlazadas a un promotor de ubiquitina como sigue. Para inducir embriones somáticos, cotiledóneas, 3-5 mm en longitud disecados de las semillas inmaduras, esterilizadas en la superficie del cultivar de soja A2872, se cultivan en la luz u oscuridad a 26°C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios luego se extirpa y se colocan en un medio liquido adecuado. Después de la selección repetida para las agrupaciones de embriones somáticos que se multiplicaron tan pronto, embriones de etapa globular, las suspensiones se mantienen como es descrito enseguida.

Los cultivos de suspensión embriogénicos de soja se pueden mantener en 35 mi de medio liquido en un agitador giratorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes en un programa de dia/noche de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio liquido.

Los cultivos de suspensión embriogénicos de soja luego se pueden transformar por el método de bombardeo con pistola de partícula (Klein y colaboradores, (1987) Nature (Londres) 327:70-73, Patente Norteamericana Número 4,945,050). Un instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) se puede utilizar para estas transformaciones.

Un gen marcador seleccionadle que se puede utilizar para facilitar la transformación de la soja es un transgen compuesto del promotor 35S del Virus el Mosaico de la Coliflor (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz y colaboradores, (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de nopalina sintasa del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . El cásete de expresión que comprende una secuencia GS de sentido operablemente enlazada al promotor de ubiquitina se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento luego se puede insertar en un sitio de restricción único del vector que lleva el gen marcador.

A 50 µ? de una suspensión de partículas de oro 1 µp? de 60 mg/ml se adiciona (en orden): 5 µ? de DNA (1 µ?/µ?) , 20 µ? de espermidina (0.1 M) y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de particular luego se agita durante tres minutes, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas de DNA luego se lavan una vez en 400 µ? de etanol al 70% y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de DNA/partícula se puede sonicar tres veces durante un segundo cada una. Cinco microlitros de las partículas de oro recubiertas con DNA luego se cargan en cada disco macro portador.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas de antigüedad se coloca en una caja de petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual se remueve del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, aproximadamente 5-10 placas de tejido se bombardean normalmente. La presión de ruptura de membrana se establece a 1100 psi, y la cámara se evacúa a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir en la mitad y se coloca nuevamente en líquido y se cultiva como es descrito en lo anterior.

Cinco a siete días del post-bombardeo, el medio líquido se puede intercambiar con medio fresco y once a doce días del post-bombardeo con medio fresco que contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo puede ser semanalmente refrescado. Siete a ocho semanas del postbombardeo, el tejido, verde, transformado se puede observar creciendo de agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada nueva línea se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego se pueden subcultivar y mantener como agrupaciones de embriones inmaduros o regenerados en plantas enteras mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales. Ejemplo 5: Transformación de Tejido del Meristema de Girasol Los tejidos del meristema de girasol se transforman con un cásete de expresión que contiene secuencias GS de sentido operablemente enlazadas a un promotor de ubiquitina como sigue (ver también, Patente EP Número 0 486233, incorporada en la presente por referencia y Malone-Schoneberg y colaboradores, (1994) Plant Science 103:199-207). Las semillas de girasol maduras {Helianthus annuus L.) son descascarilladas utilizando una trilladora de trigo de una sola cabeza. Las semillas se esterilizan en la superficie durante 30 minutos en una solución blanqueadora CloroxMR al al 20% con la adición de dos gotas de TweenMR 20 por 50 mi de solución. Las semillas se enjuagan dos veces con agua destilada estéril.

Las explantas del eje embriónico divididas se prepararan mediante una modificación de procedimientos descritos por Schrammeijer y colaboradores, (Schrammeijer y colaboradores, (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Las semillas se colocan en agua destilada durante 60 minutos después del procedimiento de estabilización en la superficie. Las cotiledóneas de cada semilla luego se rompen, produciendo una fractura limpia en eí plano del eje embriónico. Después de la excisión de la punta de raíz, las explantas se dividen en dos longitudinalmente entre las hojas primordiales. Las dos mitades se colocan, reducir la superficie hacia arriba, en medio GBA que consiste de elementos minerales de Murashige y Skoog (Murashige y colaboradores, (1962) Physiol. Plant., 15:473-497), adiciones de vitamina de Shepard (Shepard, (1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), 40 mg/1 de sulfato de adenina, 30 g/1 de sacarosa, 0.5 mg/l de 6-bencil-aminopurina (BAP) , 0.25 mg/1 de ácido indol-3-acético (IAA), 0.1 mg/1 de ácido giberélico (GA3) , pH 5.6 y 8 g/1 de Phytagar.

Las explantas se someten al bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Treinta a cuarenta explantas se colocan en un circulo al centro de una placa de 60 X 20 mm para este tratamiento. Aproximadamente 4.7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1.8 mm se resuspenden en 25 mi de solución reguladora TE estéril (Tris HC1 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) y 1 .5 mi de alícuotas se utilizan por bombardeo. Cada placa se bombardeo dos veces a través de una criba nytex de 150 mm colocada 2 cm arriba de las muestras en un dispositivo de aceleración de partícula PDS 1000MR.

La cepa EHA105 de Agrobacterium turnefaciens desarmada se utiliza en todos los experimentos de transformación. Un vector de plásmido binario que comprende el cásete de expresión que contiene el gen GS operablemente enlazado al promotor de ubiquitina se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium por la via de la congelación-descongelación como es descrito por Holsters y colaboradores, (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Este plásmido además comprende un gen marcador seleccionable de kanamicina (es decir, nptll) . Las bacterias para los experimentos de transformación de planta se cultivan durante la noche (28 °C y agitación continua de 100 RPM) en medio YEP liquido (10 gm/1 de extracto de levadura, 10 gm/1 de BactoMRpeptona y 5 gm/1 de NaCl, pH 7.0) con los antibióticos apropiados requeridos para la cepa bacteriana y mantenimiento del plásmido binario. La suspensión se utiliza cuando alcanza una OD6oo de aproximadamente 0.4 a 0.8. Las células de Agrobacterium se forman en pelotillas y se resuspenden en una ??e?? final de 0.5 en un medio de inoculación comprendido de MES 12.5 mM pH 5.7, 1 gm/1 de NH4C1 y 0.3 gm/1 de MgS04.

Los explantas frescamente bombardeadas se colocan en una suspensión de Agrobacterium, se mezclan, y se dejan sin alterar durante 30 minutos. Las explantas luego se transfieren al medio GBA y se co-cultivan, reducir la superficie hacia abajo, a 26°C y 18 horas al día. Después de tres días de co- cultivación, las explantas se transfieren a 374B (medio GBA que carece de reguladores de crecimiento y un nivel de sacarosa reducido de 1%) suplementado con 250 mg/1 de cefotaxima y 50 mg/1 de sulfato de kanamicina. Las explantas se cultivaron durante dos a cinco semanas en selección y luego se transfirieron al medio 374B fresco que carece de kanamicina durante una a dos semanas de desarrollo continuo. Las explantas con áreas resistentes a antibióticos, de diferenciación de crecimiento que no producen brotes adecuados para la escisión se transfieren al medio GBA que contiene 250 mg/1 de cefotaxima durante un segundo tratamiento de fitohormona de 3 días. Las muestras de hoja de los brotes resistentes a kanamicina, verdes se analizan para la presencia de NPTII mediante ELISA y para la presencia de la expresión transgénica al analizar una modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una alteración de tamaño y apariencia del brote y meristemas florales) .

Los brotes positivos NPTII se injertan al extracto de raíz de la plántula de girasol de crecimiento in vitro PioneerMR híbrido 6440. Las semillas esterilizadas en la superficie se germinan en medio 48-0 (media resistencia de sales de Murashige y Skoog, sacarosa al 0.5%, gelriteMR al 0.3% pH 5.6) y crecimiento bajo condiciones descritas para el cultivo de la explanta. La porción superior de las plántulas se remueve, un corte vertical de 1 cm se hace en el hipocótilo, y el brote transformado insertado en el corte. El área complete se envuelve con parafilmMR para asegurar el brote. Las plantas injertadas se pueden transferir a la tierra después de una semana de cultivo in vi tro. Los injertos en la tierra se mantienen bajo condiciones de alta humedad seguidos por una lenta aclimatización al ambiente de invernadero. Los sectores transformados de las plantas TO (generación parental) que maduran en el invernadero se identifican mediante ELISA NPTII y/o mediante el análisis de la actividad de GS de extractos de hojas mientras que las semillas transgénicas cosechadas de las plantas TO positivas NPTII se identifican mediante el análisis de actividad de GS de pequeñas porciones de cotiledóneas de semilla seca.

Un protocolo de transformación de girasol alternativo permite la recuperación de la progenie transgénica sin el uso de la presión de selección química. Las semillas son descascarilladas y esterilizadas en la superficie durante 20 minutos en una solución blanqueadora de CloroxMR al 20% con la adición de dos a tres gotas de TweenMR 20 por 100 mi de solución, luego se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se colocan en la oscuridad a 26°C durante 20 horas sobre papel filtro humedecido con agua. Las cotiledóneas y radicales de raíz se remueven, y las explantas del meristema se cultivan en 374E (medio GBA que consiste de sales MS, vitaminas Shepard, 40 mg/1 de sulfato de adenina, sacarosa al 3%, 0.5 mg/1 de 6- BAP, 0.25 mg/1 de IAA, 0.1 mg/1 de GA y Phytagar al 0.8% a pH 5.6) durante 24 horas bajo la oscuridad. Las hojas primarias se remueven para exponer el meristema apical, alrededor de 40 explantas se colocan con el domo apical hacia arriba en un circulo de 2 cm en el centro de 374M (medio GBA con Phytagar al 1.2%) y luego se cultivan en el medio durante 24 horas en la oscuridad.

Aproximadamente 18.8 mg de partículas de tungsteno 1.8 µ?? se resuspenden en etanol absoluto 150 µ?. Después de la sonicación, 8 µ? de esto se deja caer en el centro de la superficie del macroportador . Cada placa se bombardea dos veces con discos de ruptura de 650 psi en el primer estante al vacío con pistola de helio de 26 mm de Hg.

El plásmido de interés se introduce en la cepa EHA105 Agrobacterium tumefaciens por la vía de la congelación descongelación como es descrito previamente. La pelotilla de bacterias de crecimiento durante la noche a 28 °C en un medio YEP líquido (10 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de BactoMRpeptona y 5 g/1 de NaCl, pH 7.0) en la presencia de 50 Ug/l de kanamicina se resuspende en un medio de inoculación (12.5 mM 2-mM 2- (N-morfolino) ácido etanesulfónico, MES, 1 g/1 de NH4C1 y 0.3 g/1 de MgS04 a pH 5.7) para alcanzar una concentración final de 4.0 a ??ß??- Las explantas bombardeadas con partículas se transfieren al medio GBA (374E) y una gota de suspensión de bacterias se coloca directamente en la parte superior del meristema . Las explantas se co-cultivan en el medio durante 4 días, después de lo cual las explantas se transfieren al medio 374C (GBA con sacarosa al 1% y no BAP, IAA, GA3 y suplementado con 250 µ?/ml de cefotaxima) . Las plántulas se cultivan en el medio durante aproximadamente dos semanas bajo 16 horas al día y condiciones de incubación a 26°C.

Las explantas (alrededor de 2 cm de largo) de dos semanas de cultivo en medio 374C se clasifican para una modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una alteración del tamaño y apariencia del brote y meristemas florales) . Después de que las explantas positivas (es decir, una disminución en la expresión GS) se identifican, aquellos brotes que fallan para exhibir una disminución en la actividad de GS se descargan y cada explanta positiva se subdivide en explantas nodales. Una explanta nodal contiene por lo menos un nodo potencial. Los segmentos nodales se cultivan en medio GBA durante tres a cuatro días para promover la formación de retoños auxiliares de cada nodo. Luego se transfieren al medio 374C y se dejan desarrollar durante cuatro semanas adicionales. Los retoños en desarrollo se separan y se cultivan durante cuatro semanas adicionales en medio 374C. Las muestras de hojas acumuladas de cada brote recientemente recuperado se clasifican de nuevo por el ensayo de actividad de proteína apropiado. En este momento, los brotes positivos recuperados de un solo nodo generalmente se habrán enriquecido en el sector transgénico detectado en el ensayo inicial antes del cultivo nodal.

Los brotes recuperados positivos para una expresión GS disminuida se injertan al extracto de raíz de la plántula de girasol cultivo in vitro de PioneerMR híbrido 6440. Los extractos de raíz se preparan de la siguiente manera. Las semillas son descascarilladas y esterilizadas en la superficie durante 20 minutos en una solución blanqueadora de CloroxMR al 20% con la adición de dos a tres gotas de T eenMR 20 por 100 mi de solución y se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se germinan en el filtro humedecido con agua durante tres días, luego se transfieren en medio 48 (sal MS de mediana concentración, sacarosa al 0.5%, gelriteMR al 0.3% pH 5.0) y crecimiento a 26°C bajo la oscuridad durante tres días, luego se incuban en condiciones de cultivo a 16 horas al día. La porción superior de las plántulas seleccionadas se remueve, un corte vertical se hace en cada hipocótilo, y un brote transformado se inserta en un corte V. El área de corte se envuelve con parafilmMR. Después de una semana de cultivo en el medio, las plantas injertadas se transfieren a la tierra. En las primeras dos semanas, se mantienen bajo condiciones de alta humedad para aclimatarse a un ambiente de invernadero.

Ejemplo 6: Análisis moleculares para la expresión transgénica Todos los eventos TO y TI transgénicos se caracterizaron a nivel molecular mediante cebadores de PCR específicos de transgén utilizando genómicos y RT-PCR. Los eventos de expresión de una sola copia y transgén fueron avanzados para experimentos adicionales. La expresión de actina se utilizó como un control interno en todas las reacciones de PCR. En la mayoría de los casos la expresión de transgén fue como se esperaba de la especificidad promotora utilizada para conducir el transgén.

Ejemplo 7: Actividad de la enzima glutamina sintasa (GS) en plantas transgénicas Las actividad de glutamina sintasa se midió indirectamente por el ensayo transferasa mostrado enseguida.

Arsenato Gln + NH2OH ? ?-GlutairiiIhidroxamato + |\]H ADP, n2+ 3 ?-glutamilhidroxamato (?-GHA) así producido se mide con FeCl3 acidificado, el cual produce un color café que se absorbe máximamente en longitud de onda 540 nm.

La actividad de enzima de GS se determinó en las hojas de eventos transgénicos TO cultivados en campo transformados con PHP32005, 32006, 32007, 32008, 38267, 28268 y 38269 en un endogámico, ETX. Los resultados de los eventos individuales (Figura 4A, 4C) y promedios de todos los eventos (Figura 4B, 4D) para cada constructo se resumen. En el caso de ZM-GSl-3 la sobre-expresión de PHPs, la actividad más alta (en un 12x promedio más alto) se observó en PHP32008 (ZmPEPCI PR0:ZmGSl-3) seguido por PHP32007 (ZmUBI PR0:ZmGSl-3) donde la actividad fue ligeramente más alta que los controles en PHP32005 (pZmSSU PRO : ZmGSl-3 ) . En el caso de las muestras de hoja PHP32006 (ZmRM2 PR0:ZmGSl-3) la actividad fue comparable al control como se esperaba debido a RM2 en un promotor preferido de raiz. Las raices de estos eventos, sin embargo, mostraron la actividad de GS significantemente más alta como es comparado con los parientes no transgénicos . En el caso de ZM-GS1-4 de sobre-expresión de PHPs la actividad de GS más alta se observó en PHP38269 (pZM-PEPC : : ZM-GS1- ) seguido por PHP38267 (pZM-UBI : : ZM-GS1-4 ) . En el caso de las muestras de hoja PHP32268 (ZmRM2 PRO:ZmGSl-4) la actividad fue comparable al control, como es esperado debido al promotor RM2 es un promotor preferido de raiz. Las actividades promedio de todos los eventos en cada constructo se resumen en la Figura 4B y 4D.

Como es descrito en la Tabla 2, todas las cinco isoformas Z -GS1 también se sobre-expresaron en el sistema de maíz FAST bajo el control de promotores preferidos de raiz (RM2) o constitutivos (UBI ) . Las semillas TI de todos estos eventos transgénicos junto con las semillas de segregación no transgénicas se cultivaron en Turface. Tres semanas después de la germinación, las hojas y las raices se cosecharon para los análisis de la actividad de enzima de GS . Los resultados de estos experimentos se resumen en la Figura 5. Para los eventos transgénicos con varias isoformas GS1 se condujeron por un promotor preferido de raiz (RM2), se observaron actividades de GS significantemente más altas en las raices como es comparado con los controles nulos (Figura 5A, 5B) . En el promotor constitutivo (UBI) se conducen eventos de isoformas GS1, la actividad de GS se incrementó como es comparado con los controles nulos (Figura 5C, 5D) .

Ejemplo 8: Tasa de crecimiento especifico mejorado (SGR) en eventos FAST TO Como es descrito en la Tabla 2, todas las cinco isoformas ZM-GS1 también se sobre-expresaron en el sistema de maiz FAST bajo el control de promotores preferidos de raiz (RM2) o constitutivos (UBI). En un promedio, 10 eventos transgénicos independientes se generaron para cada constructo. En todos los eventos TO, las mediciones registradas incluyeron pero no ' se limitaron a la tasa de crecimiento especifico, área total máxima, días para mudar, número de semilla, longitud de mazorca y rendimiento estimado. Los datos de la tasa de crecimiento especifica (SGR, medido de 14-28 dias después de la germinación) de este experimento se muestran en la Figura 6. La mayoría de los eventos de cada uno de los 6 constructos (de cada 10 totales) probados mostraron significantemente mejor tasa de crecimiento específico como es comparado con los controles (0.00) (Figura 6, panel superior). PHP32772 (RM2 PRO:ZmGSl-4) se realizó mejor con un valor P >10"6 seguido por PHP32779 (RM2 PRO:ZmGSl-3) con un valor P 10"5 (Figura 6a). Otros 4 constructos también muestran mejor SGR con un valor P que varia de 10"2 a 10"4 (Figura 6A) . La mayoría de los eventos en cada constructo se realizó significantemente mejor que el control (Figura 6B) . Por ejemplo, más de 80% y 70% de los eventos excedieron el desempeño del control en PHP32779 y 32779, respectivamente (Figura 6B) .

Ejemplo 9; Atributos agronómicos mejorados en .los eventos FAST T0 de PHP32743 ( ZM-RM2-PRO : M-GS1-5 ) La sobre-expresión de ZM-GS1-5 bajo el control de un promotor específico de raíz dio por resultado el mejoramiento de varios atributos agronómicos en las mediciones fenómicas T0. Los resultados del promedio de nueve eventos para varias de estas variables se resumen en la Figura 7. Múltiples eventos transgénicos de PHP32743 mostraron -50% de incremento en la longitud de mazorca, -25% de incremento en el número de semilla y rendimiento estimado y -18% de incremento en el área total máxima sobre el control .

Ejemplo 10: Crecimiento mejorado y concentraciones de N en PHP32006 (pZMRM2 : ZmGSl-3) y PHP32007 (pUBI : ZMGS1-3 ) en bajas condiciones de N Para probar el efecto de la actividad de GS incrementada en el desempeño de la planta, es decir, la alteración en la tasa de crecimiento, la concentración de N en la planta y el N acumulado total, las plantas se cultivaron en un sistema de semi-hidroponia similar a aquel descrito por Tollenaar y Migus (Tollenaar y Migus, (1984) Can J. Plant Sci . 64:465-485) . Las semillas transgénicas de los cruses de prueba que segregan hemicigoto : tipo silvestre 1:1 para pRM2 : ZMGS1-3 y pUBI : ZMGS1-3 se separaron utilizando un marcador de semilla y se plantaron, dos semillas en cada maceta de plástico de 4 pulgadas cuadradas rellenadas con Turface MVPMR y seleccionaron 1 planta por maceta después de la emergencia. Estas se regaron cuatro veces un dia con 400ml de solución nutriente (KN03 1 mM, MgS04 2mM, CaCl2 1 mM, KH2P04 0.5m , KCI 3mM, Sprint330 83 ppm, H3B0 3 µ?, MnCl2 1 µ?, ZnS04 1 µ , CuS04 0.1 µ?, Na o04 0.1 µ? y suficiente H2S04 para obtener un pH de 5.5) . Nueve días después de la plantación, las plántulas se removieron de la maceta, el material de enraizamiento se lavó de las raices, las raices y los brotes se separaron y las partes de planta se secaron a 70 °C durante 70 hr. Se determinaron los pesos de raíz, brote y secado total, las plantas secas se molieron a un polvo fino y aproximadamente 35 mg de tejido se utilizó para determinar el N reducido total mediante el método micro-Kjeldahl (Yasuhura ¦ y Nokihara, (2001) J Agrie Food Chem 49:4581-4583) . Los datos se analizaron como es descrito (Loussaert, (1992) Agron J. 84:256-259) y los parámetros medios transgénicos comparados con los parámetros medios nulos correspondientes. Fueron 9 replicados de cada combinación de tratamiento. Los datos para el peso seco de raíz, peso seco del brote, peso seco total y N total se recolectaron y se resumieron en la Figura 8. Cuatro de cada seis y 3 de cada 5 eventos significantemente se superaron (representado con asterisco en las Figuras 8a y 8b) el control nulo para todos los parámetros medidos en PHP32006 (Figura 8a) y 32007 (Figura 8b), respectivamente. Ejemplo 12: Variantes de Secuencias GS A. Secuencias de Nucleótidos Variantes de GS Que NO Alteran la Secuencia de Aminoácidos Codificada Las secuencias de nucleótidos GS se utilizan para generar secuencias de nucleótidos variantes que tienen la secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta con aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de nucleótidos cuando es comparado con la secuencia de nucleótidos ORF no alterada de partida de la SEQ ID NO correspondiente. Estas variantes funcionales se generan utilizando una tabla de codón estándar. Mientras que la secuencia de nucleótidos de las variantes se altera, la secuencia de aminoácidos codificada por las estructuras de lectura abierta no cambia.

B. Secuencias de Aminoácidos Variantes de Polipéptidos GS Las secuencias de aminoácidos variantes de los polipéptidos GS se generan. En este ejemplo, un aminoácido se altera. Específicamente, las estructuras de lectura abierta se revisan para determinar la alteración del aminoácido apropiado. La selección del aminoácido a cambio se hace al consultar la alineación de proteína (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de gen de varias especies) . Un aminoácido se selecciona que es' considerado que no está bajo alta presión de selección (no conservado altamente) y que es más bien fácilmente sustituido por un aminoácido con características químicas similares (es decir, cadena lateral funcional similar) . Utilizando la alineación de proteína expuesta en la Figura 1, un aminoácido apropiado puede ser cambiado. Una vez que el aminoácido objetivo se identifica, el procedimiento resumido en la siguiente sección C se sigue. Las variantes que tienen aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico se generan utilizando este método.

C. Secuencias de Aminoácidos Variantes Adicionales de Polipéptidos GS En este ejemplo, las secuencias de proteína artificiales se crean que tienen que tienen 80%, 85%, 90% y 95% de identidad con relación a la referencia de secuencia de proteína. Este último esfuerzo requiere identificar regiones conservadas y variables de la alineación expuesta en la Figura 1 y luego la aplicación juiciosa de una tabla de sustituciones de aminoácido. Estas partes serán discutidas en más detalle enseguida.

En gran medida, la determinación de que las secuencias de aminoácidos se alteran se hace basadas en las regiones conservadas entre la proteina GS o entre los otros polipéptidos GS. Basada en la alineación de secuencia, las varias regiones del polipéptido GS que probablemente se pueden alterar se representan en letras minúsculas, mientras que las regiones conservadas se representan por letras mayúsculas. Se reconoce que las sustituciones conservadoras se pueden hacer en las regiones conservadas enseguida sin alterar la función. Además, uno de habilidad entenderá que las variantes funcionales de la secuencia GS de la invención pueden tener menores alteraciones de aminoácido no conservadas en el dominio conservado.

Las secuencias de proteínas artificiales luego se crean que son diferentes de las originales en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95% y 95-100% de identidad. Los puntos medios de estos intervalos son dirigidos, con latitud liberal de más o menos 1%, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos se efectuarán mediante un escripto Perl usual. La tabla de sustitución se proporciona enseguida en la Tabla 3.

Tabla 3. Tabla de Sustitución Primero, cualquiera de los aminoácidos conservados en la proteina que no deben ser cambiados se identifican y se "marcan" para el aislamiento de la sustitución. La metionina de inicio, por supuesto será adicionada a esta lista automáticamente. Enseguida, los cambios se hacen.

H, C y P no se cambian en cualquier circunstancia. Los cambios ocurrirán con isoleucina primero, intercambiado de N-terminal a C-terminal. Luego leucina, y asi sucesivamente la lista hasta que el objetivo deseado se alcanzó. Las sustituciones de número provisional se pueden hacer para no causar reversión de los cambios. La lista se ordena de 1-17, asi se inicia con tantos cambios de isoleucina como sea necesario antes de leucina, y asi sucesivamente hacia abajo a la metionina. Claramente muchos aminoácidos de esta manera no necesitarán ser cambiados. L, I y V involucrarán una sustitución 50:50 de las dos sustituciones óptimas alternativas.

Las secuencias de aminoácidos variantes están escritas como salida. El scripto Perl se utiliza para calcular las identidades de por ciento. Utilizando este procedimiento, las variantes de los polipéptidos GS se generan que tienen aproximadamente 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de aminoácidos al inicio de la secuencia de nucleótidos ORF inalterada de la SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta especificación son indicativas del nivel de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada por referencia.

La invención se ha descrito con referencia a varias modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, debe ser entendido que muchas variaciones y modificaciones se pueden hacer mientras que permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleotido aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a. un polinucleotido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia, como es determinado por el algoritmo GAP bajo parámetros de error, a la secuencia de longitud completa de un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 43, 45, 47, 49, 51 y 53; en donde el polinucleotido codifica un polipéptido que funciona como un modificador de GS; b. un polinucleotido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52 y 54; c. un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 43, 45, 47, 49, 51 y 53; y d. un polinucleotido que es complementario al polinucleotido de (a) , (b) o (c) .

2. Un cásete de expresión recombinante, caracterizado porque comprende el polinucleotido de la reivindicación 1, en donde el polinucleotido es operablemente enlazado, en orientación de sentido, a un promotor.

3. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el cásete de expresión de la reivindicación 2.

4. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende el cásete de expresión recombinante de la reivindicación 2.

5. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea .

6. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.

7. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijos, cacahuate, mijo perenne, myscanthus, triticale y cacao.

8. Una semilla transgénica, caracterizada porque es de la planta transgénica de la reivindicación 4.

9. Un método para modular la GS en una planta, caracterizado porque comprende: a. introducir en una célula de planta un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 operablemente enlazado a un promotor; ¦b. cultivar la célula de planta bajo condiciones de crecimiento de la célula de planta; y c. regenerar una forma de planta de la célula de planta; en donde la GS en la planta se modula.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, soja, alfalfa, cebada, cañóla, cacao, algodón, mijos, myscanthus, cacahuate, arroz, centeno, sorgo, caña de azúcar, mijo perenne, triticale y trigo.

11. Un método para disminuir la actividad de polipéptido de enzima de GS en una célula de planta, caracterizado porque comprende: a. proporcionar una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos del complemento de la SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53; b. proporcionar una célula de planta que comprende un mRNA que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 43, 45, 47, 49, 51 y 53; e c. introducir la secuencia de nucleótidos de la etapa (a) en la célula de planta, en donde la secuencia de nucleótidos inhibe la expresión del mRNA en la célula de planta.

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula de planta es de una monocotiledónea .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la monocotiledónea es maíz, soja, alfalfa, cebada, cañóla, cacao, algodón, mijos, myscanthus, cacahuate, arroz, centeno, sorgo, caña de azúcar, mijo perenne, triticale o trigo.

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula de planta es de una dicotiledónea .

15. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la actividad de enzima de GS en la planta se incrementa.

16. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene vigor de plántula incrementado.

17. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene emergencia de seda aumentada.

18. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene asimilación de nitrógeno aumentada en las raices.

19. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene el número de semilla incrementado por planta.

20. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene el tamaño y masa de semilla incrementada.

21. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene semilla con tamaño de embrión incrementado.

22. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene asimilación de nitrógeno incrementada en la hoja.

23. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene tamaño de mazorca incrementado.

24. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene eficiencia de utilización de nitrógeno aumentada.

25. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene remobil-ización de nitrógeno incrementada durante la senescencia .

26. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta tiene remobilización de nitrógeno incrementada durante el desarrollo del grano.