CN100419083C

CN100419083C - 用混合双链寡核苷酸在植物中实现定点遗传改变的用途

Info

Publication number: CN100419083C
Application number: CNB988098679A
Authority: CN
Inventors: C·J·阿恩岑; P·B·基普; R·库马; G·D·梅
Original assignee: KIMEAGEN Inc
Current assignee: Valigen US Inc
Priority date: 1997-08-05
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2018-08-05
Also published as: CN1273606A; AU748015B2; EP1007712A1; JP2001512687A; KR20010022652A; CA2298886A1; US20090235395A1; US20030196218A1; AU8769598A; US7094606B2; NZ502929A; WO1999007865A1; US20150013032A1; US20060288442A1; EP1007712A4

Abstract

本发明涉及用大约25-30个碱基对的双链寡核苷酸在植物细胞中导入位点专一性遗传改变的用途。所述寡核苷酸可以通过机械(biolistic)系统输送或通过对植物原生质体进行电穿孔输送。然后，可以从所述改变过的细胞产生具有所述遗传改变的植物。在具体实施方案中，本发明涉及编码酸性转化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶、ACC含酶和ACC氧化酶或etr-1或etr-1的同系物的基因的改变，以及在所述基因上具有分离的点突变的植物。

Description

用混合双链寡核苷酸在植物中实现定点遗传改变的用途

1.发明领域

本发明领域涉及改良现有植物品系的方法，并涉及具有希望的性状的新品系的开发。通过重组DNA技术获得遗传改变过的植物的现有方法，能够将预先构建的外源基因导入随机的、特异位点，即所谓转基因。相反，本发明使得技术人员能够对植物的特定现存基因进行特殊改变。本发明使用具有混合的RNA-样核苷酸和DNA-样核苷酸的双链寡核苷酸实现所述改变，以下称之为“混合双链寡核苷酸”或MDON。

2.发明背景

2.1MDON及其实现特定遗传改变的用途

混合双链寡核苷酸(MDON)及其在真核细胞中实现遗传改变的用途披露于授予Kmiec的US5,565,350中(Kmiec I)。Kmiec I特别披露了具有两条链的MDON，其中，第一股链含有至少8个RNA-样核苷酸的两个片段，这两个片段由4到大约50DNA-样核苷酸的第三片段隔开，该片段被称为“插入DNA片段”。第一股链的核苷酸与第二股链的DNA-样核苷酸碱基配对。所述第一和第二股链还通过一段单链核苷酸额外连接在一起，以便所述第一和第二股链是单一寡核苷酸链的一部分。Kmiec I还披露了将特定遗传改变导入靶基因的方法。根据Kmiec I，选择所述RNA片段的序列，使其与靶基因的第一和第二片段的序列同源，即相同。所述插入DNA片段的序列与位于第一和第二片段之间的靶基因的序列同源，只有一个不同部位，该部位被称为“异源区”。该异源区可以进行插入或缺失，或者可以含有一个或几个与靶基因序列错配的碱基，以便实现取代。根据Kmiec I，由所述异源区指导对所述靶基因的序列进行改变，使得该靶基因变成与MDON的序列同源。Kmiec I特别披露了含有可用于MDON的核苷酸的核糖和2’-O甲基核糖，即2’-甲氧基核糖，并披露了可用作DNA-样核苷酸的含有天然存在的脱氧核糖的核苷酸。

申请日为1996年6月17日的美国专利申请流水号08/664,487，即现在的美国专利US5,731,181(Kmiec II)特别披露了用MDON在植物细胞中实现遗传改变，并且披露了可用于在特定靶基因上实现遗传改变的RNA-样和DNA-样核苷酸的类似物和衍生物的进一步例子。

披露具有插入DNA片段的MDON的用途的科技文献包括Yoon等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.93：2071-2076，和Cole-Straus，A.等，1996，科学273：1386-1389。据以上科技文献披露，用脂质体介导的输送可以获得在10个细胞中有大约有一个细胞发生突变的频率。不过，这些科技文献没有披露MDON可用于在植物细胞中产生遗传改变。

本说明书中使用的术语MDON应当被理解成与在其它地方所使用的术语“嵌合突变载体”、“嵌合修复载体”、和“嵌合质体”同义。

2.2转基因植物细胞和由转基因植物细胞产生植物

在由Kmiec I和II所披露的用于将MDON输入靶细胞的技术中，最适用于植物细胞的技术是原生质体的电穿孔。业已报导了某些双子叶植物种由原生质体培养物再生可育植株的例子，例如，烟草(Nicotiana tobacum)，US5,231,019和Fromm，M.E.等，1988，自然312，791，和大豆品种(Glycine max)，授予Widholm，J.M.的WO92/17598。不过，尽管Prioli，L.M.等，生物技术7，589，Shillito，R.D.等1989，生物技术7，581报导了用非转化细胞进行了成功地分离，但由转化的原生质体培养物再生可育的单子叶植物被认为是不可能用常规技术实现的。通常，单子叶植物的转化原生质体产生不能再生的组织，或者如果该组织被再生的话，所得到的植物是不育的。

业已开发了将千碱基大小的质粒DNA导入具有完整或部分完整细胞壁的植物细胞获得转化的植物细胞的其它技术。US4,945,050，US5,100,792和US5,204,253涉及通过将质粒附着在微粒上，然后弹射推进通过细胞壁将质粒输入完整植物细胞的方法，该细胞在下文中被称为“粒子轰击转化的”细胞。例如，US5,489,520披露了由粒子轰击转化的细胞再生可育玉米植株。用于将质粒DNA导入具有完整细胞壁的植物细胞悬浮液的其它技术，包括用碳化硅纤维刺穿细胞壁，参见授予Coffee R.和Dunwell，J.M.的US5,302,523。

在授予Krzyzek，Laursen和P.C.Anderson的US5,384,253中披露了对具有复杂的细胞壁的玉米细胞进行电穿孔的技术。该技术使用内果胶裂合酶(E.C.3.2.1.15)和内切聚半乳糖醛酸酶(E.C.4.2.2.3)的组合产生比真正的原生质体能更容易再生成可育植物的转化感受态细胞。不过，该技术被报导仅适用于来自品系A188×品系B73的杂交的F1细胞系。

3.发明概述

本发明提供了使用MDON的新方法，该方法特别适用于所述植物细胞，如玉米、小麦、稻、莴苣、马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花细胞。

因此，本发明的一个方面是将MDON附着在颗粒上的技术，该颗粒能够弹射通过细胞壁，将MDON释放在细胞内，以便在该植物细胞的靶基因上产生突变。能够通过该技术导入的突变是能在合适条件下赋予突变的细胞生长优势的突变，和能导致通过肉眼检查可检测到的表型的突变。所述突变被称为“可选择的突变”。

在另一种实施方案中，本发明包括通过一种过程将除可选择的突变之外的突变导入植物细胞的靶基因的方法，该方法包括将能在植物细胞中导入可选择的突变的第一MDON和能导致不可选择的突变的第二MDON的混合物导入的步骤。

本发明还包括按照本发明的上述实施方案突变的细胞培养，以便获得能产生种子的植物(上文称之为“可育植物”)，并由该可育植物产生种子和其它植物。

本发明还包括可以通过本发明方法生产的具有新的特征的可育植物。

4.发明详述

4.1重组诱发性寡核碱基和混合双链寡核苷酸

本发明可以用具有在Kmiec I或Kmiec II中披露的结构和化学特性的MDON实现，以上文献被收作本文参考文献。Kmiec I和/或Kmiec II的MDON含有两个互补链，其中之一含有至少一段RNA-型核苷酸(“RNA片段”)，该片段与另一股链的DNA-型核苷酸碱基配对。

Kmiec II披露可以用含有嘌呤和嘧啶碱基的非核苷酸取代核苷酸。普通转让的申请日为1998年5月12日的美国专利申请流水号09/078,063和申请日为1998年5月12日的流水号09/078,064(以上专利分别被全文收作本文参考文献)披露了可用于本发明的其它分子。本文所说的“重组诱发性寡核碱基(recombinagenicoligonucleobase)”是指可用于本发明的分子。重组诱发性寡核碱基包括MDON，在Kmiec II中披露的含有非核苷酸的分子，以及在上述普通转让的专利申请中披露的分子。

在一种优选实施方案中，通过用氟、氯或溴官能团取代2’-羟基或者在2’-O上增加一个取代基使得MDON的RNA-型核苷酸抗Rnase。合适的取代基包括由Kmiec II中披露的取代基，C_1-6烷烃。其它取代基包括US5,334,711(Sproat)披露的取代基和由EP629387和EP679657(均为Martin申请)披露的取代基，以上专利被收作本文参考文献。在本文中，核糖核苷酸的2’-氟、氯或溴衍生物或具有用在Martin申请或Sproat中披露的取代基取代过的2’-OH的核糖核苷酸被称为“2’-取代核糖核苷酸”。在本文中，术语“RNA-型核苷酸”是指通过未取代的磷酸二酯键或由Kmiec I或Kmiec II披露的任何非天然键连接在MDON的其它核苷酸上的2’-羟基或2’-取代核苷酸。在本文中，术语“脱氧核糖型核苷酸”是指具有2’-H的核苷酸，它可以通过未取代的磷酸二酯键或由Kmiec I或Kmiec II披露的任何非天然键连接在MDON的其它核苷酸上。

本发明的一种具体实施方案包括仅仅通过未取代的磷酸二酯键连接的MDON。另一种实施方案包括由取代的磷酸二酯键、磷酸二酯键衍生物和Kmiec II披露的非磷基键实现的连接。另一种特定实施方案包括MDON，其中，每一个RNA-型核苷酸是2’-取代核苷酸。2’-取代核糖核苷酸的特定优选实施方案是2’-氟，2’-甲氧基，2’-丙氧基，2’-烯丙氧基，2’-羟乙氧基，2’-甲氧乙氧基，2’-氟丙氧基，和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2’-取代核糖核苷酸的更优选的实施方案是2’-氟，2’-甲氧基，2’-甲氧乙氧基，和2’-烯丙氧基取代的核苷酸。在一种实施方案中，所述MDON寡聚体是通过未取代的磷酸二酯键连接的。

尽管更容易合成仅具有单一类型2’-取代RNA-型核苷酸的MDON，本发明可以用具有两种或两种以上类型RNA-型核苷酸的MDON实现。通过在两个RNA型三核苷酸之间导入脱氧核苷酸引起的间断不会影响RNA片段的功能，因此，术语RNA片段包括这种“间断RNA片段”。非间断RNA片段是指连续的RNA片段。在另一种实施方案中，RNA片段可以含有交替的Rnase抗性和未取代的2’-OH核苷酸。本发明的MDON优选具有少于100个的核苷酸，更优选少于85个核苷酸，但超过50个核苷酸。所述第一和第二股链是沃森-克里克碱基配对的。在一种实施方案中，MDON的链是通过一个诸如单链6、5或4核苷酸的接头共价连接的，因此，所述第一和第二股链是具有单一3’和单一5’末端的单寡核苷酸链的片段。可以通过添加“发卡帽”保护所述3’和5’末端，以便3’和5’末端核苷酸与相邻核苷酸是沃森-克里克配对的。可以在所述第一和第二股链的远离3’和5’末端的接合处添加第二个发卡帽，以便稳定所述第一和第二股链之间的沃森-克里克配对。

所述第一和第二股链含有两个与靶基因的两个片段同源的区域，即，与所述靶基因有相同的序列。一个同源区含有RNA片段的核苷酸，并可以含有连接DNA片段的一个或几个DNA-型核苷酸，还可以含有不在插入DNA片段内的DNA-型核苷酸。以上两个同源区由一个具有不同于所述靶基因的序列的区域(被称为“异源区”)分离，并各自与该异源区相邻。所述异源区可以包括一个、两个或三个错配的核苷酸。所述错配的核苷酸可以是连续的或由一个或两个与所述靶基因同源的核苷酸分离。另外，所述异源区还可以含有一个、两个、三个或五个或更少核苷酸的插入。另外，MDON的序列与所述靶基因的序列的差别在于从MDON上缺失了一个、两个、三个、或五个或更少的核苷酸。在这种情况下，所述异源区的长度和位置被视为所述缺失的长度，即使没有MDON的核苷酸处在所述异源区之内。与以上两个同源区互补的靶基因的两个片段之间的距离在希望一个或多个取代时与所述异源区的长度相同。当所述异源区含有一个插入片段时，所述同源区在MDON中的间隔距离大于其互补的同源片段在所述基因中的间隔距离，而且，当所述异源区编码一个缺失时，可以采用一个转变。

所述MDON的RNA片段各自是一个同源区的一部分，即在序列上与一段靶基因片段相同的区域，所述片段一起优选含有至少13个RNA-型核苷酸，并优选16-25个RNA-型核苷酸或更优选18-22个RNA-型核苷酸或最优选20个核苷酸。在一种实施方案中，所述同源区的RNA片段由一个间插DNA片段分离并与该片段相邻，即“连接”。在一种实施方案中，所述异源区的每一个核苷酸是所述间插DNA片段的核苷酸。含有MDON的异源区的间插DNA片段被称为“增变片段”。

普通转让的美国专利申请流水号09/078,063(申请日1998年5月12日)和流水号09/078,064(申请日1998年5月12日)披露了一种双链重组诱发性寡核碱基，其中，一股链的序列与靶基因的序列相同，并且仅有互补链的序列含有一个异源区。这种结构会产生一个或几个错配的碱基或“异源双链”结构。被用于本发明的异源双链重组诱发性寡核碱基的异源区位于含有所述脱氧核苷酸的链上。在一种实施方案中，所述异源区位于含有5’末端核苷酸的链上。

4.2由MDON导入的突变的位点和类型

通常，用于植物细胞的MDON的设计必须在由Kmiec I和II中披露的设计基础上进行改进。在哺乳动物和酵母细胞中，由MDON导入的在一个位点上与靶基因不同的遗传学改变是用一个互补于MDON在错配位置上的核苷酸的核苷酸取代靶基因的错配位置上的核苷酸。相反，在植物细胞中，可以在互补于含有所述DNA增变片段的链上的错配位置的5’末端的一个碱基的核苷酸处发生变化。所述靶基因的核苷酸被在所述错配位置上互补于DNA增变片段核苷酸的核苷酸取代。因此，突变的靶基因在两个位置上与MDON不同。

通过MDON导入靶基因的突变位于靶基因片段之间，它与MDON同源区的核糖核苷酸部分同源，下文称之为“RNA片段”。所导入的具体突变取决于所述异源区的序列。可以通过使用分别含有一个插入或缺失的异源区将一个插入或缺失导入所述靶基因。可以通过使用在MDON的异源区上具有一个错配的MDON获得在靶基因上的一个取代。在最常见的实施方案中，所述错配能将靶基因现有的碱基转换成互补于MDON的错配碱基的碱基。所述靶基因上的取代位置可以在相当于错配的位置上，或者更常见的是取代位于紧挨着所述错配位置的5’末端的靶链的位置上，即互补于MDON紧挨着MDON的错配碱基的3’末端的位置上。

错配导致的取代的每一个位点的相对频率是特定基因和细胞类型的特征。因此，本领域技术人员可以理解的是，当取代的位置对实施本发明重要时，通常要指明确定在具体目标基因上的取代位点的初步研究。

4.3通过微载体和微纤维输送MDON

通过弹射穿透用金属微载体(微球体)将大型DNA片段导入具有纤维素细胞壁的植物细胞的用途是相关技术领域中的技术人员所熟知的(以下称之为biolistic输送)。US4,945,050，US5,100,792和US5,204,253涉及用于筛选弹射目的的微载体和装置的一般技术。

用于将DNA片段附着在微载体上的条件不适用于MDON。本发明提供了用于将足够数量的MDON附着到微载体的技术，以便可以采用biolistic输送。在一种合适的技术中，按顺序加入冰镇微载体(60mg/ml)，MDON(60mg/ml)，2.5M氯化钙和0.1M亚精胺；轻轻搅拌该混合物，例如，通过涡旋搅拌10分钟，并在室温下放置10分钟，然后将微载体稀释在5倍体积的乙醇中，离心，并重新悬浮在100％乙醇中。使用如下附着溶液的浓度可以获得良好的结果：8-10μg/μ1微载体，14-17μg/ml MDON，1.1-1.4M氯化钙和18-22mM亚精胺。在以下条件下获得了最佳结果：8μg/μl微载体，16.5μg/ml MDON，1.3M氯化钙和21mM亚精胺。

还可以用微纤维穿透细胞壁和细胞膜将MDON导入植物细胞，以便实施本发明。授予Coffee等的US5,302,532披露了用30×0.5μm和10×0.3μm碳化硅纤维实现Black Mexican Sweet的悬浮玉米培养物的转化。任何能用于导入DNA、用微纤维转化植物细胞的机械技术均可用于输送MDON进行衍变。

进行MDON的微纤维输送的一种合适的技术如下文所述。将无菌微纤维(2μg)悬浮在含有大约10μg MDON的150μl植物培养基中。让悬浮培养物沉淀，并将等体积的沉积细胞和无菌纤维/MDON悬浮液涡旋搅拌10分钟，并铺平板。根据具体的性状马上加入选择培养基或者推迟大约120小时之后加入。

可用于将MDON输入衍变细胞核基因的技术也可用于导致植物细胞的质体基因的衍变。通过质体的biolistic输送，接着再进行质粒的不合规则的重组插入所进行的质体转化为本领域技术人员所熟知。Svab，Z.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87，8526-8530。初步的实验证实，转化的频率低于细胞核转化频率的10倍到100倍。随后的实验证实，通过使用显性选择性状可以实现质体转化频率与细胞核转化频率相当，所述选择性状如细菌氨基糖苷3’-腺苷转移酶基因，该基因能产生壮观霉素抗性。Svab，Z.&Maliga，P.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90，913-917。

根据本发明，可以用上述相同技术将进行质体基因衍变的MDON导入质体。当希望导入的突变是一种选择突变时，可以单独使用MDON。当所希望的突变是非选择性的时，可将相关MDON与能导入一个选择性质体突变的MDON一起导入，例如，psbA基因上的能产生三嗪抗性的突变，或与能产生一种选择性状的线性或环状质粒组合。

上述技术可适用于除MDON之外的重组诱发性寡核碱基。

4.4原生质体电穿孔

在另一种实施方案中，可以通过对源于植物部分的原生质体进行电穿孔将重组诱发性寡核碱基输送到该植物细胞中。所述原生质体是通过用本领域技术人员熟知的技术，通过对植物部分，特别是叶片进行酶促处理而产生的。例如，参见Gallois等，1996，分子生物学方法55，89-107(Humana出版社，Totowa，NJ)。在电穿孔之前，所述原生质体不需要在生长培养基中培养。

电穿孔的合适条件为在0.3ml的总体积中有3×10⁵原生质体，MDON的浓度为0.6-4μg/ml。

4.5导入突变

本发明可用于在植物细胞中实现遗传改变，本文称之为“衍变”。在一种实施方案中，所述植物细胞具有细胞壁，即不是原生质体。

将MDON用于衍变植物细胞的方法可以通过同时导入一种性状而获益，该性状有利于区分和分离(以下称之为“选择”)业已导入了MDON的细胞和未导入MDON的细胞。在本发明的一种实施方案中，所述选择是通过形成MDON和质粒的混合物而实现的，该质粒能导致产生一种选择性状的基因的瞬时表达，即允许在某种条件下存活的基因，例如，卡那霉素抗性基因。在上述条件下，消除缺乏所述选择性状的细胞可以消除未导入MDON的细胞。用瞬时表达质体导入选择性状可以通过反复使用一种标准化选择程序将多个遗传变化连续导入植物细胞。

在另一种实施方案中，可以用衍变导入一种选择性状。制备能在第一个靶基因上导致选择突变的第一MDON和能在第二靶基因上导致非选择突变的第二MDON的混合物。根据本发明，至少大约1％的具有所述选择突变的细胞还在所述第二靶基因上含有一个突变，该突变是由第二MDON导入的。更常见的是，至少大约10％的具有所述选择突变的细胞还在所述第二靶基因上具有一个突变。

本发明的该实施方案的一种用途是研究目标基因的功能。提供能导致选择突变的MDON和能导致会“剔除”目标基因(例如插入一个终止密码子或移码突变)的突变的MDON的混合物。可以从具有所述选择突变的群体中回收业已剔除了一个或几个拷贝的目标基因的细胞。可将所述细胞再生成植物，以便可以测定所述目标基因的功能。

可以通过任何突变导致一种选择性状，该突变能导致一种表型改变，这种改变能在合适的选择条件下产生选择生长优势或便于观察的表型改变，如生长在愈伤组织中的植物细胞颜色的改变。所述选择性状本身可以是一种需要的性状，例如，除草剂抗性，或所述选择性状仅仅可用于促进具有通过衍变导入的非选择性状的植物的分离。可以用能导致希望的突变的MDON和能导致选择突变的MDON的混合物将需要的非选择性状导入细胞，然后在所述选择条件下培养。根据该方案进行的选择，所具有的优点是能确保每一个选择的细胞不仅接收了所述MDON的混合物，而且接收了该混合物的细胞随后容易通过MDON进行衍变。

还可将能在合适条件下导致致死表型改变的突变(被称为负选择突变)用于本发明中。所述突变能导致负的选择性状，负的选择性状可以通过制备衍变细胞的复制平板进行选择，选择一个复制件，并从非选择的复制件中回收具有理想性状的衍变细胞。

4.6能够衍变以便产生选择性状的特定基因

在本发明的一种实施方案中，利用MDON将突变导入乙酰乳酸合酶(ALS)基因，该基因又被称为乙酰羟基氨基酸合酶(AHAS)基因。磺酰脲除草剂和咪唑啉除草剂是野生型ALS酶的抑制剂。业已披露了能使植物抗磺酰脲和咪唑啉的作用的显性突变。参见US5,013,659和US5,378,824(Bedbrook)和Rajasekaran K.等1996，分子育种2，307-319(Rajasekaran K.)。Bedbrook在表2中披露了被证实能使得酵母ALS酶抗磺酰脲除草剂的若干突变(以下称之为“Bedbrook”突变)。Bedbrook指出，每一个Bedbrook突变在被导入植物ALS基因之后能使得植物抗磺酰脲和咪唑啉除草剂。已经了解到，在大多数植物中，编码ALS的基因是重复的。可将突变导入任一个ALS基因的任何等位基因。

事实上，已证实3个Bedbrook突变能在植物中产生除草剂抗性，即取代Pro→Ala¹⁹⁷，Ala→Asp²⁰⁵和Trp→Leu⁵⁹¹。Rajasekaran报导突变Trp→Ser⁵⁹¹能产生对磺酰脲和咪唑啉的抗性，而Ser→Asn⁶⁶⁰能导致对咪唑啉除草剂的抗性。用Bedbrook的序列编号将Rajasekaran的结果报导在本文中。本领域技术人员可以理解的是，不同植物的ALS基因具有不同长度。为清楚起见，采用这样一种编码系统，其中，在每一种物种中，同源位点用相同的位点编号表示。因此，所标明的突变位点是由它周围的序列决定的。例如，Rajasekaran的突变Trp→Ser⁵⁹¹位于棉花ALS基因的563号残基，不过被标明为Bedbrook的591号位点，因为突变的Trp是由Bedbrook的表2中环绕Trp⁵⁹¹的序列环绕的。根据本发明，对位于位点660或在Bedbrook的表2中(该表被收作本文的参考文献)列出的一个位点上的天然存在的氨基酸的任何取代可被用于在植物的ALS基因中产生选择突变。

在本发明的另一种实施方案中，所述选择突变可以是在编码光合系统II的D1亚基的叶绿体基因psbA上的突变，参见Hirschberg，J.等1984，Z.Natursch39，412-420和Ohad，N.，&Hirschberg，J.，植物细胞4，273-282。据Hirschberg，J.等报导，突变Ser→Gly²⁶⁴会导致对诸如2-氯-4-乙基氨基-6-异丙基氨基-s-三嗪(阿特拉津)的三嗪除草剂的抗性。PsbA基因上的能导致阿特拉津除草剂抗性的其它突变披露于Erickson J.M.等的文章中，1989，植物细胞1，361-371(以下称之为“Erickson突变”)，该文献被收作本文参考文献。当需要将第二种新的性状导入叶绿体时，优选使用由Erickson突变引起的选择性状。

科技文献中包含能产生选择性状的其它突变的进一步报导。Ghislain M.等1995，植物杂志8，733-743披露了发生在Nicotianasylvestris二氢二吡啶甲酸合酶(DHDPS，EC4.2.1.52)基因上的Asn→Ile¹⁰⁴突变，该突变能产生对S-(2-氨基乙基)L-半胱氨酸的抗性。Mourad，G.，&King，J.1995，植物生理学109，43-52披露了发生在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苏氨酸脱水酶上的突变，该突变能导致对L-O-甲基苏氨酸的抗性。Nelson，J.A.E.等1994，分子细胞生物学14，4011-4019披露了用Pro取代S14/rp59核糖体蛋白的C-末端Leu，可导致对翻译抑制剂crytopluerine和吐根碱的抗性。在本发明的另一种实施方案中，可将上述每一种突变用于产生一种选择性状。Ghislain，Mourad和Nelson中的每一个被收作本文参考文献。

4.7能够突变以便产生需要的非选择性状的基因

例1雄性不育性

用包括玉米(Zea maize)、番茄和大部分其它蔬菜在内的杂交种子，常规种植某些商业种植的植物。杂交种子的生产需要用仅来自另一个纯合系的花粉对一个纯合系的植株进行授粉，即不存在自花授粉。从纯合的亲本植株上清除产生花粉的器官的工作，是一项繁重和花费较大的过程。因此，能诱导雄性不育性即抑制花粉产生或功能的突变，可以避免对所述过程的需要。

业已鉴定了花粉成熟或功能所必需的，但对植物的其它过程不重要的若干基因。查耳酮合酶(chs)是类黄酮合成的关键酶，类黄酮是存在于花和花粉中的色素。在矮牵牛中通过导入chs反义表达基因抑制chs，会导致植物的雄性不育性。Van der Meer，I.M.等，1992，植物细胞4，253-262。在大部分植物中存在一个chs基因家族。例如，参见Koes，R.E.等，1989，植物分子生物学12，213-226。类似地，通过插入转座因子破坏玉米中的查耳酮合酶基因会导致雄性不育性。Coe，E.H.，遗传学杂志72，318-320。Franken，P.等，1991，EMBO杂志10，2605-2612披露了玉米查耳酮合酶和重复基因whp的结构。通常，在植物中，多基因家族的每一个成员仅在有限范围的组织中表达。因此，本发明的该实施方案要求在具有多拷贝查耳酮合酶基因的物种中，鉴定在花药中表达的特定chs基因，并且通过导入移码和一个或几个框内终止密码子破坏该基因，或者破坏其启动子。

在番茄中业已证实产生花粉所必需的第二个基因，被称为Lat52。Muschietti J.等，1994，植物杂志6，321-338。Lat52是与胰蛋白酶抑制剂相关的分泌型糖蛋白。业已在玉米(被称为Zm13，Hanson D.D.等，1989，植物细胞1，173-179；Twell D.等，1989，分子基因遗传学217，240-245)，稻(被称为Ps1，Zou J.等，1994，美国植物学杂志81，552-561)和橄榄(被称为Ole eI，Villalba，M.等，1993，欧洲生物化学杂志276，863-869)中鉴定了Lat52的同系物。因此，本发明的该实施方案提供了一种通过导入一个移码、一个或几个框内终止密码子破坏Lat52/Zm13基因或其同系物或通过破坏其启动子获得雄性不育性的方法。

业已鉴定了对花粉生产必需的第三个基因是编码苯丙氨酸铵盐裂合酶(PAL，EC4.3.1.5)的基因。PEL是产生苯基类丙酮和类黄酮的关键酶。因为苯基类丙酮是木质素的前体，它可能是产生抗病性的重要成分，在所述优选实施方案中，鉴定了仅在花药中表达的PAL异构酶，并将其破坏，以便获得雄性不育性。

例2改变块茎的糖代谢

一旦收获之后，马铃薯块茎在储存期间会遇到病害、缩水和发芽。为了避免以上损失，储存温度被降低到35-40°F。不过，在低温下，块茎中的淀粉会转化成糖，这一过程被称为“冷甜化”，它会降低块茎的商业和营养价值。对冷甜化过程来说有两种酶是重要的：酸性转化酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。Zrenner，R.等，1996，植物198，246-252和Spychalla，J.P.等，1994，植物生理学杂志144，444-453。马铃薯酸性转化酶的序列披露于EMBL数据保藏号X70368(序列1)中，而马铃薯UDP葡萄糖焦磷酸酶的序列由Katsube，T.等披露，1991，生物化学30，8546-8551，因此，本发明的该实施方案提供了通过导入移码、一个或几个框内终止密码子破坏酸性转化酶或UDP葡萄糖焦磷酸酶基因或通过破坏其启动子防止冷甜化的方法。

例3减轻由于PPO导致的收获后褐变

多酚氧化酶(PPO)是高等植物中酶促褐变的主要原因。PPO能催化单酚转化成邻二酚和邻二羟基酚再转化成邻醌。所述醌产物随后聚合并与细胞蛋白中的氨基酸基团反应，由此导致变色。由PPO导致的褐变问题通常通过向食品中添加亚硫酸盐来解决，而亚硫酸盐业已被证实与某些可能的健康危害和消费者反感相关。PPO通常起着保护植物不受病原体或昆虫类害虫危害的作用，因此，对于植物的生活力来说并不重要。因此，本发明的该实施方案提供了通过导入移码、一个或几个框内终止密码子破坏PPO基因或通过破坏其启动子，在苹果、葡萄、鳄梨、梨和香蕉中预防酶促褐变的方法。

植物基因组中的PPO基因的数量是可变的；在番茄和马铃薯中，PPO形成一个多基因家族。Newman，S.M.等，1993，植物分子生物学21，1035-1051，Hunt M.D.等1993，植物分子生物学21，59-68；Thygesen，P.W.等，1995，植物生理学109，525-531。葡萄仅含有一个PPO基因。Dry，I.B.等，1994，植物分子生物学，26，495-502。当目标植物种含有多拷贝的PPO基因时，重要的是能够破坏在商业制品中正常表达的PPO基因。例如，在可收获大小的马铃薯中仅有一个PPO基因，该基因被称为POT32，其序列的GENBANK保藏号为U22921(序列2)中，该序列被收作本文参考文献。业已对其它马铃薯PPO异构酶进行了测序，并对其序列进行了保藏，以便本领域技术人员可以设计出能专门使POT32失活的MDON。

例4减少饲料作物和木浆中的木质素

木质素是一种复杂的异源芳族聚合物，它可以使高等植物防水并加强其细胞壁。木质素是由苯基类丙酮单木质素的自由基随机聚合而成。由于从木浆中清除木质素会涉及到资金和环境代价，木质素对造纸业造成了严重问题。类似地，饲料作物的木质素含量限制了其对反刍动物的消化能力。事实上，业已在高粱(Porter，KS等，1978，作物科学18，205-218)和玉米(Lechtenberg，V.L.等1972，Agron，J.64，657-660)中鉴定了具有降低的木质素含量的天然发生的突变，被称为“brown mid-rib”，并尝试用它饲养家畜。

玉米中的brown mid-rib突变涉及O-甲基转移酶基因。Vignol，F.，1995，植物细胞7，407-416。业已克隆了多种植物的O-甲基转移酶基因：Burgos，R.C.等，1991，植物分子生物学17，1203-1215(白杨)；Gowri，G.等，1991，植物生理学97，7-14(苜蓿)和Jaeck，E.等，1992，分子植物微生物相互作用4，294-300(烟草)(序列3和序列4)，因此，本发明的一个方面是破坏O-甲基转移酶基因，以便在玉米或高粱的任何栽培种中以及在其它饲料作物种中和在用于生产木浆的植物中再现brown mid-rib表型。

参与木质素生产的第二个基因是肉桂醇脱氢酶(CAD)基因，该基因业已克隆到烟草中。Knight，M.E.，1992，植物分子生物学19，793-801(序列5和序列6)。转基因烟草植物使得CAD反义转录物具有较低的CAD含量，还能产生一种更容易提取的木质素，明显由于丁香基与邻甲氧苯基单体比例的提高，并由于醛单体相对醇残基整合量的增加。Halpin，C.等，1994，植物杂志6，339-350，因此，本发明的一种实施方案是通过导入移码、一个或几个框内终止密码子破坏诸如苜蓿、玉米、高粱和大豆的饲料作物和诸如短叶松(Pinusechinata)、长叶松(Pinus palustris)、湿地松(Pinus elliottii)、火炬松(Pinus taeda)、北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)和杨(Populus sp.)的纸浆树木的CAD基因，或破坏其启动子。

例5降低油用种子中的不饱和和聚不饱和酯类

源于诸如油菜(canola)、花生、向日葵和大豆的油用种子的植物油中，诸如油酸的不饱和脂肪酸和诸如亚油酸和亚麻酸的聚不饱和脂肪酸的存在，在长期储存和高温下会导致这种油氧化。因此，通常对植物油进行氢化。不过，化学氢化作用会导致转氢，这会产生非天然存在的立体异构体，这种异构体被认为是对健康有害的。

脂肪酸合成是以在乙酰载体蛋白(ACP)上合成饱和脂肪酸开始的，然后通过脱氢酶的作用除去氢对。因此，需要抑制油用种子中这种脱氢酶的活性。

油酸合成中的第一种酶是硬脂酰-ACP脱氢酶(EC1.14.99.6)。业已克隆了来自红花和蓖麻籽的硬脂酰-ACP脱氢酶，并进行了测序。Thompson，G.A.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，2578-2582(序列7)；Shanklin，J.&Somerville，C.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，2510-2514(序列8)；Knutzon，D.S.等，1991，植物生理学96，344-345。因此，本发明的一种实施方案是通过导入一个移码、一个或几个框内终止密码子破坏诸如大豆、红花、向日葵、大豆、玉米和油菜的油用种子作物的硬脂酰-ACP脱氢酶基因或破坏其启动子。

根据本发明可以破坏的第二种酶是ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3FAD)，这种酶能将亚油酸(一种二烯)转化成亚麻酸(一种三烯)。在拟南芥中存在两种ω-3FAD异构酶，本领域技术人员预计在大多数其它植物中也存在这两种异构酶。一种异构酶是对质体专一的，并且是合成种子的储存油类的相关异构酶。另一种是微粒体专一的。Iba.，K.等，1993，生物化学杂志268，24099-24105(序列9)披露了拟南芥质体ω-3FAD的克隆。根据本发明的一种实施方案，通过导入一个移码、一个框内终止密码子破坏诸如大豆、红花、向日葵、大豆、玉米和油菜的油料种子的质体ω-3FAD基因，或破坏其启动子。

例6灭活S等位基因，以便得到近交系

某些植物种业已形成了一种防止自花授粉的机制。在这些种中，例如小麦和稻，存在一个被称为S的基因座，该基因座具有多个等位基因。能表达S等位基因的植物不能用表达相同的S等位基因的花粉授粉。Lee，H-K.，1994，自然367，560-563；Murfett，J.等，1994，自然367，563。S基因座的产物是RNase。McClure，B.A.等，1989，自然342，955-957。对所述植物来说S基因座的产物并不重要。因此，本发明的一种实施方案是通过导入一个移码、一个或几个框内终止密码子破坏S基因座的基因或破坏其启动子，使得所述植物能够自交。

例7乙烯不敏感性

乙烯是一种气体植物激素，它参与植物生长和发育。乙烯作用的一个不希望的方面是使得果实、蔬菜过分成熟并使得花萎蔫，导致腐烂和损失。业已克隆了拟南芥的乙烯受体，并被命名为ETR-1。Chang，C.等，1993，科学262，539-544(序列10)，一种突变型Cys→Tyr⁶⁵会导致对乙烯的显性不敏感性。表达所述拟南芥突变ETR-1的转基因番茄植物也表现出对乙烯的不敏感性，这表明在大多数植物种中，Cys→Tyr⁶⁵突变是乙烯作用的显性抑制剂。根据本发明的该实施方案的一个方面，将Cys→Tyr⁶⁵突变插入ETR-1基因，以便延长突变的果实类蔬菜或花的寿命。

在该实施方案的另一方面，可以通过破坏编码乙烯合成的酶的一个基因对果实或鲜花进行防腐：即1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACC合酶)和ACC氧化酶。对本发明的该实施方案来说，可以完全消除乙烯合成量，因此，成熟过程是通过外源乙烯产生的，或者保留一定的乙烯产量，以便果实能自动成熟，但具有较长的储存寿命。因此，预计破坏ACC合酶或ACC氧化酶基因的一个等位基因能够导致乙烯合成水平的有用的降低。另外，本发明提供了破坏一个等位基因同时导入一种突变，这样会导致未被破坏的等位基因活性的部分丧失。

Abel，S.等1995，生物化学杂志270，19093一19099(序列12)和Gomez-Lim，M.A.等1993，基因134，217-221(序列11)分别披露了拟南芥ACC合酶和ACC氧化酶基因的序列，以上文献被收作本文参考文献。

例8卡那霉素抗性的恢复

植物重组DNA技术能够将源于一种植物的基因和细菌基因导入第二种植物。例如，Kinney，A.J.1996，自然生物技术14，946，披露了将月桂ACP-硫酯酶基因导入油菜种子以便获得富含月桂酸的植物油。所述转基因植物通常是使用一个卡那霉素抗性的抗生素抗性基因构建的，该抗性基因被作为选择性状同时插入所述转基因植物。所得到的转基因植物继续表达所述抗生素抗性基因，这样会产生大量的抗性产物，并且该基因会进入食物和/或环境中，这意味着存在着环境或健康危害。本发明的一种实施方案通过导入一个移码、一个或几个框内终止密码子破坏卡那霉素基因或破坏其启动子避免所述危险。

例9改变储存蛋白氨基酸含量

种子和块茎包括一类主要储存蛋白，例如马铃薯中的patatins和玉米中的玉米醇溶蛋白。所述储存蛋白的氨基酸组成通常不适合人类和动物的需要，这取决于作物的种类，例如，玉米缺少赖氨酸和甲硫氨酸，而马铃薯缺少甲硫氨酸。因此，本发明的一种实施方案是使粮食作物的储存蛋白发生突变，以便增加低含量氨基酸的量。Patatins是由一个多基因家族编码的，该基因家族由Mignery，G.A.等，1988，基因62，27-44鉴定，而玉米醇溶蛋白的结构由Marks，M.D.等，1985，生物化学杂志，260，16451459披露，以上文献被收作本文参考文献。另外，可以使甲硫氨酸或赖氨酸特异性tRNA的反密码子突变成更常见的氨基酸。

例10利用MDON确定一个基因的功能

克隆和测定组织特异性cDNA的序列的现有技术使得本领域技术人员能方便地获得许多基因的序列。用于确定这些基因功能的技术较少。在本发明的一种实施方案中，设计MDON，以便将移码或终止密码子导入编码未知功能的cDNA的基因。这样可以对所述基因进行特异性破坏。可以种植具有所述特异性“剔除”的植物，并可以观察剔除的作用，以便研究所述未知基因的功能。

4.8本发明的可育植物

本发明包括具有分离的选择点突变的可育植物，所述分离的选择突变不是罕见的多态性，即在大约10,000个体的群体中不会出现。在本文中，点突变是指取代不超过6个连续核苷酸的突变，优选不超过3个核苷酸，更优选1个核苷酸，或者缺失或插入1-5个核苷酸，优选1或2个核苷酸。在本文中，分离的突变是指在遗传学上不与任何其它突变密切连锁的突变，其中，可以理解的是，大于100Kb，优选大于40Kb和更优选大于23Kb的突变不是密切连锁的。

BIOLISTIC工作实施例

在下面的工作实施例中，培养基和方法披露于Gelvin，S.B.等的著述中，1991，植物分子生物学手册(Kluwer学术出版社)。按照以下方法用MDON涂敷金颗粒。首先制备用于涂敷的微粒，然后马上用嵌合质粒涂敷。为了制备所述微粒，将60mg金颗粒悬浮在1ml 100％乙醇中(参见注释4)。对该悬浮液进行三次超声处理，每次30秒，以便分散金颗粒。以12,000×g的速度离心30秒，弃上清液。加入1ml 100％乙醇，涡旋搅拌15秒，以12,000×g的速度离心5分钟，然后弃上清液。将洗涤过的金颗粒(直径1.0μm，60mg/ml)悬浮在水中的25μl悬浮液进行缓慢涡旋搅拌，顺序加入40μl MDON(50μg/ml)，75μl的2.5M氯化钙，75μl的0.1M亚精胺。对所有溶液进行冰镇。对完成的混合物再进行涡旋搅拌10分钟，并让金颗粒在室温下再沉淀10分钟。在100％乙醇中洗涤沉淀，并重新悬浮在50μl的无水乙醇中。用Biorad Biolistic枪进行biolistic输送，采用以下参数：箱内压力1100psi，破裂盘x2在900psi时破裂，颗粒悬浮体积5μl。

NT-1(烟草)，双子叶细胞悬浮液：在28℃下，在标准培养基上让含有500万个细胞的直径大约为5cm的NT-1的细胞集落生长3天。用ALS-1或ALS-2涂敷金颗粒，并按上述方法轰击。再培养所述细胞2.5天，悬浮，并转移到补充了15-50ppb chlorosulfuron(GLEAM^TM)的固体培养基上。在7-14天之后出现抗性集落。

所使用的MDON的序列如下：(在与靶基因不同源的核苷酸下面划线并加粗。小写字母表示2’-O甲基核糖核苷酸)

ALS-1

TGCGCG-guccaguucaCGTTGcauccaacuaT

T T

T T(序列13)

TCGCGC CAGGTCAAGTGCAACGTAGGATGATT

3′5′

ALS-2

TGCGCG-guccaguucaCGATGcauccaacuaT

T T

T T(序列14)

TCGCGC CAGGTCAAGTGCTACGTAGGATGATT

3′5′

ALS-1和ALS-2与ALS基因在Pro¹⁹⁷(CCA)密码子的第二个核苷酸上具有一个碱基的错配：ALS-1是CAA，而ALS-2是CTA。在对ALS-1和ALS-2衍变的抗性细胞系的基因进行PCR扩增和测序之后，分别发现所述靶密码子上的突变为Thr(ACA)和Ser(TCA)。观察到的突变相对根据MDON在哺乳动物细胞编码链上的作用预测的位点向5’方向移动一个核苷酸，并在非编码链上相对预期位点向3’方向移动一个核苷酸。总共鉴定了具有这种突变的3个ALS-1和5个ALS-2衍变体。未能从ALS-1DNA处理过的细胞获得愈伤组织。

为了筛选chlorosul furon抗性细胞，在轰击之后2天将细胞从每一个轰击板上转移到含有5ml液体CSM2的15ml中。将试管颠倒若干次，以便分散细胞块。然后将所述细胞转移到含有15ppbchlorosulfuron(Dupont，Wilmington，DE)的固化CSM培养基上。大约3-5周之后，选择活跃生长的细胞(突出的、有浅颜色的集落)，并转移到含有50ppb chlorosulfuron的固化CSM上。3-4周之后，选择活跃生长的细胞，然后转移到含有200ppb chlorosulfuron的固化CSM上。然后分析在该处理中存活的细胞。

培养基

1.NT-1细胞悬浮培养基(CSM)：Murashige和Skoog盐(GibcoBRL，Gland岛，NY)，500mg/l MES，1mg/l硫胺素，100mg/l肌醇，180mg/l磷酸二氢钾，2.21mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，30g/l蔗糖。用1M氢氧化钾或盐酸将pH调节到5.7，并高压灭菌。对于固化培养基来说，在高压灭菌之前加入8g/l琼脂-琼脂(Sigma，St.Louis，MO)。

2.铺开培养基(POM)：80％(v/v)CSM，0.3M甘露醇，20％(v/v)源于在原生质体分离之前NT-1细胞悬浮液的初级离心的上清液。

烟草叶片，一种双子叶植物：通过获得了bin19-衍生质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404对烟草品种Samsun叶片进行共转化，所述质粒含有nptII表达框，该表达框含有两个基因：一个基因编码卡那霉素抗性，和一个编码绿色荧光蛋白的基因的两种突变之一(GFP，Chui，W.1996，当代生物学6，325-330)。任何一种突变型GFP基因都不能产生GFP产物。在第六个密码子上含有G→T取代的突变会产生一个终止密码子或在同一个位点上产生一个核苷酸的缺失，分别称之为G-终止子和G-Δ。在选择性MS104培养基上培养之后，回收叶片，通过Northern印迹证实GFP基因的存在。

GFP的头8个密码子的序列为：

GFP ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG(序列15)

G-终止—————————T——————(序列16)

G-A —————————AGG AGCTGT(序列17)

所使用的MDON的序列如下：(在与G-终止子不同源的核苷酸下面划线并加粗。小写字母表示2’-O甲基核糖核苷酸)。

GFP-1

TGCGCG-cacucguuccCGCTCcucgacaaguT

T T

T T (序列18)

TCGCGC GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAT

3′5′

GFP-2

TGCGCG-acucguucccGAGCCucgacaagugT

T T

T T(序列19)

TCGCGC TGAGCAAGGGCTCGGAGCTGTTCACT

3′5′

在MS104选择培养基上培养G-终止子和G-Δ转基因植物的叶片，按上述方法通过两次连续的输送将G-1或G-1 biolistically导入。在导入MDON之后大约10天，在G-终止子和G-Δ叶片的G-1和G-2处理培养物中观察到具有GFP-样荧光的愈伤组织。用解剖刀分解较大的、生长较快的愈伤组织块，以便获得富含绿色荧光细胞的愈伤组织。在为期大约30天的观察阶段，所述荧光表型保持稳定。在G-1处理的G-终止子培养物中绿色荧光细胞的出现表明G-1不会导致除了错配核苷酸的5’末端的一个碱基之外的突变。

用IMT-2 Olympus显微镜通过标准FITC过滤装置观察绿色荧光。

电穿孔工作实施例

在烟草叶肉原生质体中转化GFP

植物材料

1.获得了GFP的缺失突变型的烟草植物转化体(Δ6)。

2.从5-6周龄体外生长小植株上获得叶片

原生质体分离

1.基本上按照Gallois等的方法1996，用质粒DNA或总基因组DNA进行烟草叶片原生质体的电穿孔。分子生物学方法，55卷：植物细胞电穿孔和电融合方法，编辑J.A.Nickolosf，Humana出版公司，Totowa，NJ.89-107页。

2.酶溶液：1.2％纤维素酶R-10“Onozuka”(Karlan，Santa Rosa，CA)，0.8％macerozyme R-10(Karlan，Santa Rosa，CA)，90g/l甘露醇，10mM MES，过滤除菌，以10ml等分试样形式在-20℃下保存。

3.切割距离中脉1-2mm的叶片。然后使远轴侧朝下，让其与10ml酶溶液在100×20mm的培养皿中接触。在每一个培养皿中总共放入1g叶片。

4.在25℃下在黑暗中培养所述培养皿16小时。

5.对消化过的叶片材料进行移液，并通过100μm的尼龙纱布(Small Parts公司，迈阿密湖，FL)过滤。然后将滤液转移到一个离心管中，并以1000rpm的速度离心10分钟。该方案的所有离心都是在这种条件下进行的。

6.原生质体集中在上部的一条带中。然后将该原生质体带转移到一个干净的离心管中，加入10ml洗涤溶液(0.4M蔗糖和80mM氯化钾)。对该原生质体进行温和地再悬浮，然后离心。

7.重复步骤6两次。

8.在经过最后一次洗涤之后通过将少量的样品分配到一个血细胞计数器上测定原生质体的密度。将所述原生质体以1×10⁶原生质体/ml的密度重新悬浮在电穿孔缓冲液(80mM氯化钾，4mM氯化钙，2mM磷酸钾，pH7.2，8％甘露醇)中，高压灭菌。在8℃下培养该原生质体2小时。

9.两小时之后，将0.3ml(1×10⁵原生质体)转移到每一个0.4cm的样品池中，然后放置在冰上。将GFP-2(0.6-4μg/ml)加入每一个样品池中，不进行电穿孔的对照除外。对原生质体进行电穿孔(250V，电容250μF，时间常数10-14ms)。

10.让原生质体在冰上恢复10分钟，然后转移到培养皿中(100×20mm)。35分钟之后，向每一个培养皿中加入10ml POM，参见上文。然后将培养皿转移到黑暗中，在25℃下培养24小时，然后转移到光照条件下。

11.然后按照上述Gallois的方法维持所述原生质体培养物。

荧光显微镜观察

1.在紫外线下，我们在3×10⁵个原生质体中观察到8个GFP转化的原生质体。

序列表

<110>1.Arntzen，Charles

2.Kipp，Peter B.

3.Kumar，Ramesh

4.May，Gregory D.

<120>用混合双链寡核苷酸在植物中实现定点遗传

改变的用途

<130>7991-023-999

<150>60/054，386

<151>1997-08-05

<160>19

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>2063

<212>DNA

<213>马铃薯

<220>

<221>CDS

<222>(3)...(1907)

<400>1

agtaccattc cagttatgac ccggaaaact ccgcctccca ttacacattc ctcccggatc 60

aacccgattc cggccaccgg aagtccctta aaatcatctc cggcattttc ctctcctctt 120

tccttttgct ttctgtagcc ttctttccga tcctcaacaa ccagtcaccg gacttgcaga 180

gtaactcccg ttcgccgccg ccgtcaagag gtgtttctca gggagtctcc gataagactt 240

ttcgagatgt cgtcaatgct agtcacattt cttatgcgtg gtccaatgct atgcttagct 300

ggcaaagaac tgcttaccat tttcaacctc aaaaaaattg gatgaacgat cctaatggtc 360

cattgtacca caagggatgg tatcatcttt tttatcaata caatccagat tcagctattt 420

ggggaaatat cacatggggc catgccgtat ccaaggactt gatccactgg ctctacttgc 480

cttttgccat ggttcctgat caatggtacg atattaacgg tgtctggact gggtccgcct 540

ccatcctacc cgatggtcag atcatgatgc tttataccgg tgtctctgat gattatgtac 600

aagtgcaaaa tcttgcgtac cccaccaact tatctgatcc tctccttcta gactgggtca 660

agtacaaagg caacccggtt ctggttcctc cacccggcat tggtatcaag gactttagag 720

acccgaccac tgcttggacc ggaccccaaa atgggcaatg gcttttaaca atcgggtcta 780

agattggtaa aacgggtatt gcacttgttt atgaaacttc caacttcaca agctttaagc 840

tattggatga agtgctgcat gcggttccgg gtacgggtat gtgggagtgt gtggactttt 900

acccggtatc gactgaaaaa acaaacgggt tggacacatc atataacggc ccgggtgtaa 960

agcatgtgtt aaaagcaagt ttagatgaca ataagcaaga tcactatgct attgggacgt 1020

atgacttgac aaagaacaaa tggacacccg ataacccgga attggattgt ggaattgggt 1080

tgaagctgga ttatgggaaa tattatgcat caaagacatt ttatgacccg aagaaacaac 1140

gaagagtact gtggggatgg attggggaaa ctgatagtga atctgctgac ctgcagaagg 1200

gatgggcatc tgtacagagt attccaagga cagtgcttta cgacaagaag acagggacac 1260

atctacttca gtggccagtt gaagaaattg aaagcttaag agtgggtgat cctattgtta 1320

agcaagtcaa tcttcaacca ggttcaattg agctactcca tgttgactca gctgcagagt 1380

tggatataga agcctcattt gaagtggaca aagtcgcgct ccagggaata attgaagcag 1440

atcatgtagg tttcagctgc tctactagtg gaggtgctgc tagcagaggc attttgggac 1500

catttggtgt cgttgtaatt gctgatcaaa agctatctga gctaacgcca gtttacttct 1560

acatttctaa aggagctgat ggtcgagctg agactcactt ctgtgctgat caaactagat 1620

cctcagaggc tccgggagtt gctaaacaag tttatggtag ttcagtaccc gtgttagacg 1680

gtgaaaaaca ttcgatgaga ttattggagg accactcaat tgtggagagc tttgcccaag 1740

gaggaagaac agtcataaca tcgcgaattt acccaacaaa ggcagtgaat ggagcagcac 1800

gactcttcgt tttcaacaat gccacagggg ctagcgtgac tgcttccgtc aagatttggt 1860

cacttgagtc ggctaatatt cgatccttcc ccttgcaaga cttgtaattc atcaagccat 1920

atcttcttca ttcttttttt catttgaagg ttatttcacc gatgtcccat caagaaaggg 1980

aagagaggga gaatatgtag tgttatactc tacttattcg ccattttagt gatttttcta 2040

ctggactttt gctattcgca aaa 2063

<210>2

<211>1958

<212>DNA

<213>马铃薯

<220>

<221>CDS

<222>(22)...(1815)

<400>2

tcttttgcgt tttgagcaat aatggcaagc ttgtgcaata gtagtagtac atctctcaaa 60

actcctttta cttcttcctc cacttcttta tcttccactc ctaagccctc tcaacttttc 120

atccatggaa aacgtaacca aatgttcaaa gtttcatgca aggttaccaa taataacggt 180

gaccaaaacc aaaacgttga aacaaattct gttgatcgaa gaaatgttct tcttggctta 240

ggtggtcttt atggtgttgc taatgctata ccattagctg catccgctgc tccagctcca 300

cctcctgatc tctcgtcttg tagtatagcc aggattaacg aaaatcaggt ggtgccgtac 360

agttgttgcg cgcctaagcc tgatgatatg gagaaagttc cgtattacaa gttcccttct 420

atgactaagc tccgtgttcg tcagcctgct catgaagcta atgaggagta tattgccaag 480

tacaatctgg cgattagtcg aatgaaagat cttgataaga cacaaccttt aaaccctatt 540

ggttttaagc aacaagctaa tatacattgt gcttattgta acggtgctta tagaattggt 600

ggcaaagagt tacaagttca taattcttgg cttttcttcc cgttccatag atggtacttg 660

tacttccacg agagaatcgt gggaaaattc attgatgatc caactttcgc tttaccatat 720

tggaattggg accatccaaa aggtatgcgt tttcctgcca tgtatgatcg tgaagggact 780

tcccttttcg atgtaacacg tgaccaaagt caccgaaatg gagcagtaat cgatcttggt 840

tttttcggca atgaagttga aacaactcaa ctccagttga tgagcaataa tttaacacta 900

atgtaccgtc aaatggtaac taatgctcca tgtcctcgga tgttctttgg cgggccttat 960

gatctcgggg ttaacactga actcccggga actatagaaa acatccctca cggtcctgtc 1020

cacatctggt ctggtacagt gagaggttca actttgccca atggtgcaat atcaaacggt 1080

gagaatatgg gtcattttta ctcagctggt ttggacccgg ttttcttttg ccatcacagc 1140

aatgtggatc ggatgtggag cgaatggaaa gcgacaggag ggaaaagaac ggatatcaca 1200

cataaagatt ggttgaactc cgagttcttt ttctatgatg aaaatgaaaa cccttaccgt 1260

gtgaaagtca gagactgttt ggacacgaag aagatgggat acgattacaa accaattgcc 1320

acaccatggc gtaacttcaa gcccttaaca aaggcttcag ctggaaaagt gaatacagct 1380

tcacttccgc cagctagcaa tgtattccca ttggctaaac tcgacaaagc aatttcgttt 1440

tccatcaata ggccgacttc gtcaaggact caacaagaga aaaatgcaca agaggagatg 1500

ttgacattca gtagcataag atatgataac agagggtaca taaggttcga tgtgttttcg 1560

aacgtggaca ataatgtgaa tgcgaatgag cttgacaagg cggagtttgc ggggagttat 1620

acaagtttgc cacatgttca tagagctggt gagactaatc atatcgcgac tgttgatttc 1680

cagctggcga taacggaact gttggaggat attggtttgg aagatgaaga tactattgcg 1740

gtgactctgg tgccaaagag aggtggtgaa ggtatctcca ttgaaggtgc gacgatcagt 1800

cttgcagatt gttaattagt ctctattgaa tctgctgaga ttacactttg atggatgatg 1860

ctctgttttt gttttcttgt tctgtttttt cctctgttga aatcagcttt gttgcttgat 1920

ttcattgaag ttgttattca agaataaatc agttacaa 1958

<210>3

<211>1460

<212>DNA

<213>烟草

<220>

<221>CDS

<222>(84)...(1178)

<400>3

tctgtttctt caactcacct taatttgccc aattgagtca ttgtaaaatc tgaaacagaa 60

ccaagagaga agagaaaaaa aatatgggtt caacaagcca gagccagagt aagagtctaa 120

ctcacacaga agacgaagcg ttcttatttg ccatgcaatt ggctagtgct tctgtacttc 180

ctatggtcct aaaatcagcg ttagaacttg accttcttga actcatggct aaagctggtc 240

caggtgcagc catttctcct tctgaattag ctgctcagct ctcaacccag aacccagaag 300

cacccgttat tcttgatcgg atgcttaggc tacttgctac ttactctgtt ctcaattgta 360

ctcttagaac actgtctgat ggcagtgttg agaggcttta tagtctggct ccggtttgta 420

agttcttgac taagaatgct gatggtgttt ctgttgcccc acttttgctt atgaatcaag 480

ataaagttct tatggagagc tggtaccact taaaagatgc agtactagat ggtggaatcc 540

cattcaacaa ggcctatgga atgacagcat ttgagtacca tggcacagat ccaagattca 600

acaaagtttt caaccgtgga atgtctgatc actccactat gtcaatgaaa aagattcttg 660

aggactacaa aggatttgaa ggcctaaatt ccattgttga tgttggtggt ggaactggcg 720

ctactgttaa catgattgtc tccaaacatc cctctattaa gggtattaac tttgatttac 780

cacatgttat tggagatgct ccagcttacc ctggtgtcga gcacgttggt ggcgacatgt 840

ttgccagtgt gccaaaagca gatgccattt tcatgaagtg gatttgtcat gattggagcg 900

acgagcattg cctaaaattc ttgaagaatt gctatgaagc actacctgca aatgggaagg 960

tgataatagc ggagtgcata cttccagagg ccccagatac atcacttgca actaagaata 1020

cagtacatgt tgatattgtg atgttagcac ataacccagg aggcaaagaa aggactgaga 1080

aggaatttga ggctttggct aagggcgctg gttttactgg attcgcaagg cttgttgcgc 1140

ttacaacact tgggtcatgg aattcaacaa ataattaatc gattcctttg gaggattaag 1200

caatatactg ttcattttgc attttgaaat tctacttttc acagagtggc tttactgcga 1260

aataaaagaa atatatagct tttaccttga aaagatcaat gttcaaaggg aaaaaaaaaa 1320

aggaagatga aataattgct ctcagaaaag cagtgtgtta ggaaaaagct ttttagctgg 1380

attttgaatt ttattgtatg tatttctgta atacacatgt attgaaggaa tactagtttt 1440

cgaccaatca tatttctttg 1460

<210>4

<211>1418

<212>DNA

<213>烟草

<220>

<221>CDS

<222>(59)...(1153)

<400>4

attccttcaa cttacccaat taagtcatcg aaaaatctga aacagaacta aaagtaaaat 60

gggttcaaca agcgagagcc agagtaacag tctcactcac acagaagacg aagctttctt 120

atttgccatg caattgtgta gtgcttctgt acttcctatg gtcctaaaat cagccgtaga 180

acttgacctt cttgagctaa tggctaaggc tggtccaggt gcagctattt ctccttctga 240

attagCtgct cagctctcaa ctcagaaccc agaagcacct gttatgcttg atcggatgct 300

taggctactt gcttcttact ctgttctcaa ttgtactctt agaacactgc ctgatagcag 360

tgttgagagg ctttatagtc tggctcccgt ctgtaagtac ttgactaaga atgctgatgg 420

tgtttctgtt gccccacttt tgcttatgaa tcaagataaa gttcttatgg agagctggta 480

ccacttaaaa gatgcagtac tagatggcgg aatcccattc aacaaagcct atggaatgac 540

agcatttgag taccatggca cagatccaag attcaacaaa gtgttcaacc gtggaatgtc 600

tgatcactcc actatgtcaa tgaagaagat tcttgaggac tacaaaggat ttgaaggcct 660

aaattccatt gttgatgttg gtggtggaac gggtgctact gttaacatga ttgtctctaa 720

atatccctct attaagggca ttaactttga tttgccacat gtaattggag atgctccaac 780

ttaccccggt gtcgagcacg ttggtggcga catgtttgct agtgtgccaa aagcagatgc 840

cattttcatg aagtggattt gtcatgattg gagcgatgag cattgcctaa aattcttgaa 900

gaattgctat gaagcactac ctgcaaatgg gaaggtgata attgcagagt gcatacttcc 960

agaggcccca gatacatcac ttgcaactaa gaatacagta catgttgata ttgttatgtt 1020

agcacataac ccaggaggca aagaaaggac tgagaaggaa tttgaggctt tggctaaggg 1080

cgctggtttt actggattcg caaggcttgt tgcgcttaca acacttgggt catggaattc 1140

aacaagtaat taatcgattc cttaatttga aggattaagc aatatactgt tcgttttgca 1200

tttggaaatt ctacttttct cagagtggct tgactgtgaa ataaaagaaa tatagctttt 1260

aacttgaaaa gattgatgtt caaaagaaaa aaaggaagat gaaataattg ctctcagaaa 1320

agcaatgtgt taggaaaaag cttttttagc tggattttga attttactgt atgtatttct 1380

gttatacaca tgtattgaag gaatactagt tttcgacc 1418

<210>5

<211>1419

<212>DNA

<213>烟草

<220>

<221>CDS

<222>(92)...(1165)

<400>5

atttctttct ctttcccttg aactgtgttt tcattttttc tgctctgaaa caatagtgtt 60

ttccttgtag attttaagtt aaaagaaaac catgggtagc ttggatgttg aaaaatcagc 120

tattggttgg gctgctagag acccttctgg tctactttca ccttatacct atactctcag 180

aaacacagga cctgaagatg tgcaagtcaa agttttgtat tgtggacttt gccacagtga 240

tcttcaccaa gttaaaaatg atcttggcat gtccaactac cctctggttc ctggacatga 300

agtggtggga aaagtagtgg aggtaggagc agatgtgtca aaattcaaag tgggggacac 360

agttggagtt ggattactcg ttggaagttg taggaactgt ggcccttgca agagagaaat 420

agagcaatat tgcaacaaga agatttggaa ttgcaatgat gtctacactg atggcaaacc 480

cacccaaggt ggttttgcta attctatggt tgttgatcaa aactttgtgg tgaaaattcc 540

agagggtatg gcaccagaac aagcagcacc tctattatgt gctggcataa cagtatacag 600

tccattcaac cattttggtt ttaatcagag tggatttaga ggaggaattt tgggattagg 660

aggagttgga catatgggag tgaaaatagc aaaggcaatg ggacatcatg ttactgtcat 720

tagttcttca aataagaaga gacaagaggc attggaacat cttggtgcag atgattatct 780

tgttagttca gacactgata aaatgcaaga agctgctgat tcacttgact atattattga 840

tactgtccct gttggccatc ctcttgaact ttatctttct ttgcttaaaa ttgatggcaa 900

acttatcttg atcggagtta tcaacacccc cttgcaattt atctctccca tggttatgct 960

cgggagaaag agcatcactg gaagctttat tggtagcatg aaggaaacag aggaaatgct 1020

agacttctgc aaagagaaag gtgtgacttc acagattgag atagtgaaaa tggattatat 1080

caacactgca atggagaggt tggagaaaaa tgatgtgagc tacagatttg ttgttgatgt 1140

tgctggaagc aagcttgacc agtaattgca caagaaaaac aacatggaat ggttcactat 1200

tatacaacaa ggctatgaga aaaatagtac tcctcaactt tgatgtcatc tttgttacct 1260

ttgttttatt ttccacctgt attatcatat ttggtggtcg agagtgacgt ttatgtatat 1320

tttctttctt caaaacaatc ttaaatgaat ttggatgttg gtgacgattt tgaaatatac 1380

caaccatgca aacttacttt ggtagaaaaa aaaaaaaaa 1419

<210>6

<211>1398

<212>DNA

<213>烟草

<220>

<221>CDS

<222>(88)...(1161)

<400>6

attcctcttt cccttgaact gtgttttcgt tttttctgct ctaaaacaat cgtgtgttcc 60

ttctagattt taagtttaaa gaacatcatg ggtggcttgg aagttgagaa aacaactatt 120

ggttgggctg ctagagaccc ttctggtgta ctttcacctt atacctatac tctcagaaac 180

acaggacctg aagatgtgga agtcaaagtt ttgtattgtg ggctctgtca cactgatctt 240

caccaagtta aaaatgatct tggcatgtcc aactaccctc tggttcctgg acatgaagtg 300

gtgggagaag tggtggaggt aggaccagat gtgtcaaaat tcaaagttgg ggacacagtt 360

ggagttggat tactcgttgg aagttgcagg aactgtggcc cttgcaagag agatatagag 420

caatattgca acaagaagat ttggaactgc aatgatgtct acactgatgg caaacccacc 480

caaggtggtt ttgctaaatc catggttgtt gatcaaaagt ttgtggtgaa aattccagag 540

ggtatggcac cagaacaagc agcacctcta ttatgtgctg gtataacagt atacagtcca 600

ttgaaccatt ttggtttcaa acagagtgga ttaagaggag gaattttggg attaggagga 660

gtgggacaca tgggagtgaa aatagcaaag gcaatgggac atcatgttac tgtcattagt 720

tcttcaaata agaagagaca agaggcattg gaacatcttg gtgcagatga ttatcttgtc 780

agttcagaca ctgataaaat gcaagaggct tctgattcac ttgactatat tattgatact 840

gtccctgttg gccatcctct tgaaccttat ctttctttgc ttaaaattga tggcaaactt 900

atcttgatgg gagttatcaa cacccccttg caatttatct cccccatggt tatgctcggg 960

agaaagagca tcacaggaag ctttattggt agcatgaagg aaacagagga aatgctagat 1020

ttctgcaaag agaaaggtgt gacttcacag attgagatag tgaaaatgga ttatatcaac 1080

actgcaatgg agaggttgga gaaaaatgat gtgaggtaca gatttgtggt tgatgttatt 1140

ggaagcaagc ttgaccagta attatattac acaagaaaaa caacatggaa tggttcacta 1200

ttatacaagg ctgtgagaat actaaacttt gatgtcgtct tttgtatcct tttgttttat 1260

ttgccacctg tattttctta tttggtgatc gagagtgacg tttatgtatt attttctttc 1320

ttcaaaacaa tttaatgtat gaatttggat gttggtgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1398

<210>7

<211>1533

<212>DNA

<213>红花

<220>

<221>CDS

<222>(106)...(1296)

<400>7

gctcacttgt gtggtggagg agaaaaacag aactcacaaa aagctttgcg actgccaaga 60

acaacaacaa caacaagatc aagaagaaga agaagaagat caaaaatggc tcttcgaatc 120

actccagtga ccttgcaatc ggagagatat cgttcgtttt cgtttcctaa gaaggctaat 180

ctcagatctc ccaaattcgc catggcctcc accctcggat catccacacc gaaggttgac 240

aatgccaaga agccttttca acctccacga gaggttcatg ttcaggtgac gcactccatg 300

ccaccacaga agatagagat tttcaaatcc atcgagggtt gggctgagca gaacatattg 360

gttcacctaa agccagtgga gaaatgttgg caagcacagg atttcttgcc ggaccctgca 420

tctgaaggat ttgatgaaca agtcaaggaa ctaagggcaa gagcaaagga gattcctgat 480

gattactttg ttgttttggt tggagatatg attacagagg aagccctacc tacttaccaa 540

acaatgctta ataccctaga tggtgtacgt gatgagactg gggctagcct tacgccttgg 600

gctgtctgga ctagggcttg gacagctgaa gagaacaggc atggcgatct tctccacacc 660

tatctctacc tttctgggcg ggtagacatg aggcagatac agaagacaat tcagtatctc 720

attgggtcag gaatggatcc tcgtaccgaa aacagcccct accttgggtt catctacaca 780

tcgtttcaag agcgtgccac atttgtttct cacggaaaca ccgccaggca tgcaaaggat 840

catggggacg tgaaactggc gcaaatttgt ggtacaatcg cgtctgacga aaagcgtcac 900

gagaccgctt atacaaagat agtcgaaaag ctattcgaga tcgatcctga tggcaccgtt 960

cttgcttttg ccgacatgat gaggaaaaag atctcgatgc ccgcacactt gatgtacgat 1020

gggcgtgatg acaacctctt cgaacatttc tcggcggttg cccaaagact cggcgtctac 1080

accgccaaag actacgccga catactggaa tttctggtcg ggcggtggaa agtggcggat 1140

ttgaccggcc tatctggtga agggcgtaaa gcgcaagatt atgtttgcgg gttgccacca 1200

agaatcagaa ggctggagga gagagctcaa gggcgagcaa aggaaggacc tgttgttcca 1260

ttcagctgga ttttcgatag acaggtgaag ctgtgaagaa aaaaaaaacg agcagtgagt 1320

tcggtttctg ttggcttatt gggtagaggt taaaacctat tttagatgtc tgtttcgtgt 1380

aatgtggttt tttttcttct aatcttgaat ctggtattgt gtcgttgagt tcgcgtgtgt 1440

gtaaacttgt gtggctgtgg acatattata gaactcgtta tgccaatttt gatgacggtg 1500

gttatcgtct cccctggtgt ttttttattg ttt 1533

<210>8

<211>1643

<212>DNA

<213>蓖麻

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1239)

<400>8

ttccggcaaa taacaaaaaa ccaaaagaaa aaggtaagaa aaaaaacaat ggctctcaag 60

ctcaatcctt tcctttctca aacccaaaag ttaccttctt tcgctcttcc accaatggcc 120

agtaccagat ctcctaagtt ctacatggcc tctaccctca agtctggttc taaggaagtt 180

gagaatctca agaagccttt catgcctcct cgggaggtac atgttcaggt tacccattct 240

atgccacccc aaaagattga gatctttaaa tccctagaca attgggctga ggagaacatt 300

ctggttcatc tgaagccagt tgagaaatgt tggcaaccgc aggatttttt gccagatccc 360

gcctctgatg gatttgatga gcaagtcagg gaactcaggg agagagcaaa ggagattcct 420

gatgattatt ttgttgtttt ggttggagac atgataacgg aagaagccct tcccacttat 480

caaacaatgc tgaatacctt ggatggagtt cgggatgaaa caggtgcaag tcctacttct 540

tgggcaattt ggacaagggc atggactgcg gaagagaata gacatggtga cctcctcaat 600

aagtatctct acctatctgg acgagtggac atgaggcaaa ttgagaagac aattcaatat 660

ttgattggtt caggaatgga tccacggaca gaaaacagtc cataccttgg gttcatctat 720

acatcattcc aggaaagggc aaccttcatt tctcatggga acactgcccg acaagccaaa 780

gagcatggag acataaagtt ggctcaaata tgtggtacaa ttgctgcaga tgagaagcgc 840

catgagacag cctacacaaa gatagtggaa aaactctttg agattgatcc tgatggaact 900

gttttggctt ttgctgatat gatgagaaag aaaatttcta tgcctgcaca cttgatgtat 960

gatggccgag atgataatct ttttgaccac ttttcagctg ttgcgcagcg tcttggagtc 1020

tacacagcaa aggattatgc agatatattg gagttcttgg tgggcagatg gaaggtggat 1080

aaactaacgg gcctttcagc tgagggacaa aaggctcagg actatgtttg tcggttacct 1140

ccaagaatta gaaggctgga agagagagct caaggaaggg caaaggaagc acccaccatg 1200

cctttcagct ggattttcga taggcaagtg aagctgtagg tggctaaagt gcaggacgaa 1260

accgaaatgg ttagtttcac tctttttcat gcccatccct gcagaatcag aagtagaggt 1320

agaattttgt agttgctttt ttattacaag tccagtttag tttaaggtct gtggaaggga 1380

gttagttgag gagtgaattt agtaagttgt tgatactgtt gtgttcttgt gttgtcatga 1440

gtctgcttga tagtgagttt cttttgtttc cttttgttgt gttcttttat ctggtctctc 1500

tctctctctc tctctctttt tctcttatcc caagtgtctc aagtataata agcaaacgat 1560

ccatgtggca attttgatga tggtgatcag tctcacaact tgatcttttg tcttctattg 1620

gaaacacagc ctgcttgttt gaa 1643

<210>9

<211>2569

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>外显子

<222>(236)...(729)

<223>外显子1

<221>外显子

<222>(1030)...(1119)

<223>外显子2

<221>外显子

<222>(1201)...(1267)

<223>3

<221>

<222>(1358)...(1450)

<223>外显子4

<221>外显子

<222>(1530)...(1715)

<223>外显子5

<221>外显子

<222>(1809)...(1889)

<223>外显子6

<221>外显子

<222>(1993)...(2130)

<223>外显子7

<221>外显子

<222>(2212)...(2403)

<223>外显子8

<400>9

cacaccatca ctaataaatt tccttctcct ttcaagttgt agctaactta tataagacat 60

aagcgtgcga accagagaca gagatagaaa ttgagagacg ataagcaaag tagaaaacac 120

aagtttctct cacacacatt atctctttct ctattaccac cactcattca taacagaaac 180

ccaccaaaaa ataaaaagag agacttttca ctctggggag agagctcaag ttctaatggc 240

gaacttggtc ttatcagaat gtggtatacg acctctcccc agaatctaca caacacccag 300

atccaatttc ctctccaaca acaacaaatt cagaccatca ctttcttctt cttcttacaa 360

aacatcatca tctcctctgt cttttggtct gaattcacga gatgggttca cgaggaattg 420

ggcgttgaat gtgagcacac cattaacgac accaatattt gaggagtctc cattggagga 480

agataataaa cagagattcg atccaggtgc gcctcctccg ttcaatttag ctgatattag 540

agcagctata cctaagcatt gttgggttaa gaatccatgg aagtctttga gttatgtcgt 600

cagagacgtc gctatcgtct ttgcattggc tgctggagct gcttacctca acaattggat 660

tgtttggcct ctctattggc tcgctcaagg aaccatgttt tgggctctct ttgttcttgg 720

tcatgactgg taaacttaaa aaccctaact tttttcttgt tttctcctct gctttagtct 780

cctttagcct ttgatttggt caactttgga tgattccaaa gaaccaatcg aacaaattgg 840

tctttatcca tatctcttca aatagcttta ggacataatt ggtctctcag gtaacaagct 900

gtcattatca tcatactcat catgttgcta gtagaccaac ccaattggca actgtttgtt 960

ggttttgcaa ctgtgtaatc tgctttgaat tgtgaacaaa attattgatt tatgttgatt 1020

acattgcagt ggacatggta gtttctcaaa tgatccgaag ttgaacagtg tggtcggtca 1080

tcttcttcat tcctcaattc tggtcccata ccatggctgg tgagttttgc tttcagacca 1140

ttcttctcta aaaccacttg cagaatctca tcttcttcat gtaaaaatat gactttgcag 1200

gagaattagt cacagaactc accaccagaa ccatggacat gttgagaatg acgaatcttg 1260

gcatcctgta agtcaaaaac gtattttttt ggttatcttg ttttagtcct gtggtgtttc 1320

ttagatgcag ttttattaac tgtttctgta actgcagatg tctgagaaaa tctacaatac 1380

tttggacaag ccgactagat tctttagatt tacactgcct ctcgtgatgc ttgcataccc 1440

tttctacttg gtaagaactc ctctatttgt tatggtaact taagctgcca caccaagtaa 1500

aaaagctcat gtctattctt ctgtttcagt gggctcgaag tccggggaaa aagggttctc 1560

attaccatcc agacagtgac ttgttcctcc ctaaagagag aaaggatgtc ctcacttcta 1620

ctgcttgttg gactgcaatg gctgctctgc ttgtttgtct caacttcaca atcggtccaa 1680

ttcaaatgct caaactttat ggaattcctt actgggtaat gcgccgctgt tactcccctg 1740

tttcagcctg agcaatttgt gtattatttc ctctgcctta ctcaaaaagg tttttatgtc 1800

aaatacagat aaatgtaatg tggttggact ttgtgactta cctgcatcac catggtcatg 1860

aagataagct tccttggtac cgtggcaagg taaaatacat attctctgct tccactgttc 1920

tttgactaca tcgctctttc ttttaaggtt aaagccaact ggtgtgtaaa tctcatgatt 1980

ctcccaaaac aggagtggag ttacctgaga ggaggactta caacattgga tcgtgactac 2040

ggattgatca ataacatcca tcatgatatt ggaactcatg tgatacatca tcttttcccg 2100

cagatcccac attatcatct agtagaagca gtaagtaaat tgaaagtaaa gactgtttgt 2160

gtttttggtg ttcatgctag tttccctgac tcttgctcca ctgttatgca gacagaagca 2220

gctaaaccag tattagggaa gtattacagg gagcctgata agtctggacc gttgccatta 2280

catttactgg aaattctagc gaaaagtata aaagaagatc attacgtgag cgacgaagga 2340

gaagttgtat actataaagc agatccaaat ctctatggag aggtcaaagt aagagcagat 2400

tgaaatgaag caggcttgag attgaagttt tttctatttc agaccagctg attttttgct 2460

tactgtatca atttattgtg tcacccacca gagagttagt atctctgaat acgatcgatc 2520

agatggaaac aacaaatttg tttgcgatac tgaagctata tataccata 2569

<210>10

<211>3879

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>外显子

<222>(780)...(1685)

<223>外显子1

<221>外显子

<222>(1761)...(2129)

<223>外显子2

<221>外显子

<222>(2207)...(2461)

<223>外显子3

<221>外显子

<222>(2544)...(2671)

<223>外显子4

<221>外显子

<222>(2762)...(2959)

<223>外显子5

<221>外显子

<222>(3088)...(3448)

<223>外显子6

<400>10

aaagatagta tttgttgata aatatgggga tatttatcct atattatctg tatttttctt 60

accattttta ctctattcct ttatctacat tacgtcatta cactatcata agatatttga 120

atgaacaaat tcatgcaccc accagctata ttaccctttt ttattaaaaa aaaacatctg 180

ataataataa caaaaaaatt agagaaatga cgtcgaaaaa aaaagtaaga acgaagaaga 240

agtgttaaac ccaaccaatt ttgacttgaa aaaaagcttc aacgctcccc ttttctcctt 300

ctccgtcgct ctccgccgcg tcccaaatcc ccaattcctc ctcttctccg atcaattctt 360

cccaagtaag cttcttcttc ctcgattctc tcctcagatt gtttcgtgac ttctttatat 420

atattcttca cttccacagt tttcttctgt tgttgtcgtc gatctcaaat catagagatt 480

gattaaccta attggtcttt atctagtgta atgcatcgtt attaggaact ttaaattaag 540

atttaatcgt taatttcatg attcggattc gaattttact gttctcgaga ctgaaatatg 600

caacctattt tttcgtaatc gttgtgatcg aattcgattc ttcagaattt atagcaattt 660

tgatgctcat gatctgtcta cgctacgttc tcgtcgtaaa tcgaagttga taatgctatg 720

tgtttgttac acaggtgtgt gtatgtgtga gagaggaact atagtgtaaa aaattcataa 780

tggaagtctg caattgtatt gaaccgcaat ggccagcgga tgaattgtta atgaaatacc 840

aatacatctc cgatttcttc attgcgattg cgtatttttc gattcctctt gagttgattt 900

actttgtgaa gaaatcagcc gtgtttccgt atagatgggt acttgttcag tttggtgctt 960

ttatcgttct ttgtggagca actcatctta ttaacttatg gactttcact acgcattcga 1020

gaaccgtggc gcttgtgatg actaccgcga aggtgttaac cgctgttgtc tcgtgtgcta 1080

ctgcgttgat gcttgttcat attattcctg atcttttgag tgttaagact cgggagcttt 1140

tcttgaaaaa taaagctgct gagctcgata gagaaatggg attgattcga actcaggaag 1200

aaaccggaag gcatgtgaga atgttgactc atgagattag aagcacttta gatagacata 1260

ctattttaaa gactacactt gttgagcttg gtaggacatt agctttggag gagtgtgcat 1320

tgtggatgcc tactagaact gggttagagc tacagctttc ttatacactt cgtcatcaac 1380

atcccgtgga gtatacggtt cctattcaat taccggtgat taaccaagtg tttggtacta 1440

gtagggctgt aaaaatatct cctaattctc ctgtggctag gttgagacct gtttctggga 1500

aatatatgct aggggaggtg gtcgctgtga gggttccgct tctccacctt tctaattttc 1560

agattaatga ctggcctgag ctttcaacaa agagatatgc tttgatggtt ttgatgcttc 1620

cttcagatag tgcaaggcaa tggcatgtcc atgagttgga actcgttgaa gtcgtcgctg 1680

atcaggtttt acattgctga gaatttctct tctttgctat gttcatgatc ttgtctataa 1740

cttttcttct cttattatag gtggctgtag ctctctcaca tgctgcgatc ctagaagagt 1800

cgatgcgagc tagggacctt ctcatggagc agaatgttgc tcttgatcta gctagacgag 1860

aagcagaaac agcaatccgt gcccgcaatg atttcctagc ggttatgaac catgaaatgc 1920

gaacaccgat gcatgcgatt attgcactct cttccttact ccaagaaacg gaactaaccc 1980

ctgaacaaag actgatggtg gaaacaatac ttaaaagtag taaccttttg gcaactttga 2040

tgaatgatgt cttagatctt tcaaggttag aagatggaag tcttcaactt gaacttggga 2100

cattcaatct tcatacatta tttagagagg taacttttga acagctctat gtttcataag 2160

tttatactat ttgtgtactt gattgtcata ttgaatcttg ttgcaggtcc tcaatctgat 2220

aaagcctata gcggttgtta agaaattacc catcacacta aatcttgcac cagatttgcc 2280

agaatttgtt gttggggatg agaaacggct aatgcagata atattaaata tagttggtaa 2340

tgctgtgaaa ttctccaaac aaggtagtat ctccgtaacc gctcttgtca ccaagtcaga 2400

cacacgagct gctgactttt ttgtcgtgcc aactgggagt catttctact tgagagtgaa 2460

ggttattatc ttgtatcttg ggatcttata ccatagctga aagtatttct taggtcttaa 2520

ttttgatgat tattcaaata taggtaaaag actctggagc aggaataaat cctcaagaca 2580

ttccaaagat tttcactaaa tttgctcaaa cacaatcttt agcgacgaga agctcgggtg 2640

gtagtgggct tggcctcgcc atctccaaga ggtttgagcc ttattaaaag acgttttttt 2700

ccaacttttt cttgtcttct gtgttgttaa aagtttactc ataagcgttt aatatgacaa 2760

ggtttgtgaa tctgatggag ggtaacattt ggattgagag cgatggtctt ggaaaaggat 2820

gcacggctat ctttgatgtt aaacttggga tctcagaacg ttcaaacgaa tctaaacagt 2880

cgggcatacc gaaagttcca gccattcccc gacattcaaa tttcactgga cttaaggttc 2940

ttgtcatgga tgagaacggg ttagtataag cttctcacct ttctctttgc aaaatctctc 3000

gccttacttc ttgcaaatgc agatattggc gtttagaaaa aacgcaaatt taatcttatg 3060

agaaaccgat gattattttg gttgcagggt aagtagaatg gtgacgaagg gacttcttgt 3120

acaccttggg tgcgaagtga ccacggtgag ttcaaacgag gagtgtctcc gagttgtgtc 3180

ccatgagcac aaagtggtct tcatggacgt gtgcatgccc ggggtcgaaa actaccaaat 3240

cgctctccgt attcacgaga aattcacaaa acaacgccac caacggccac tacttgtggc 3300

actcagtggt aacactgaca aatccacaaa agagaaatgc atgagctttg gtctagacgg 3360

tgtgttgctc aaacccgtat cactagacaa cataagagat gttctgtctg atcttctcga 3420

gccccgggta ctgtacgagg gcatgtaaag gcgatggatg ccccatgccc cagaggagta 3480

attccgctcc cgccttcttc tcccgtaaaa catcggaagc tgatgttctc tggtttaatt 3540

gtgtacatat cagagattgt cggagcgttt tggatgatat cttaaaacag aaagggaata 3600

acaaaataga aactctaaac cggtatgtgt ccgtggcgat ttcggttata gaggaacaag 3660

atggtggtgg tataatcata ccatttcaga ttacatgttt gactaatgtt gtatccttat 3720

atatgtagtt acattcttat aagaatttgg atcgagttat ggatgcttgt tgcgtgcatg 3780

tatgacattg atgcagtatt atggcgtcag ctttgcgccg cttagtagaa caacaacaat 3840

ggcgttactt agtttctcaa tcaacccgat ctccaaaac 3879

<210>11

<211>1200

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(53)...(1024)

<400>11

cgttgctgtc gaagttaggc caagaaaccc atttaaaaaa aaagagagag agatggagag 60

tttcccgatc atcaatctcg agaagcttaa tggagaagag agagcaatca ctatggagaa 120

gatcaaagac gcttgtgaaa actggggctt ctttgagtgt gtgaaccatg ggatttcact 180

cgagcttttg gacaaagtgg agaagatgac caaggaacat tacaagaagt gcatggaaga 240

gagattcaag gaatcgatta agaacagagg tcttgactct cttcgctctg aagtcaacga 300

cgttgactgg gaatccactt tctacctcaa gcaccttccc gtctctaata tctccgatgt 360

ccctgatctc gacgacgatt acagaacgtt aatgaaagac ttcgccggaa agatagagaa 420

gttgtcggag gagctactgg atctgctgtg cgagaatctc ggtttagaga agggttattt 480

aaaaaaggtg ttttacgggt cgaaaagacc gacttttgga accaaagtca gcaattatcc 540

accttgtcct aatccggacc tagtcaaggg tctccgagcc cacaccgacg ccggcggcat 600

catcctcctc ttccaagacg acaaagtcag tggacttcag cttcttaaag acggcgagtg 660

ggtcgatgtt cctccggtta agcattcaat cgtcgttaat ctcggcgatc aacttgaggt 720

gataaccaat gggaagtaca agagtgtgga acatagagtg ctatctcaga cagacggaga 780

aggaagaatg tcgatcgcat cattctataa tccgggaagc gactctgtta tttttccggt 840

gccggagctg atcggaaaag aagcagagaa ggagaagaaa gagaactatc cgagatttgt 900

gtttgaagat tacatgaaac tctactctgc tgtcaagttt caggccaagg aaccaaggtt 960

tgaagccatg aaagctatgg agacaactgt ggccaacaat gttggaccat tggccactgc 1020

gtgaatgata tgtaactggt taataaatat atatatatat atatatatag tctttatata 1080

atgtcttaga aacttgatta ttcactatac gaataatttt gttcatgttg ttgtatgttt 1140

aagtggtgaa tgtgttatat atgggaatta atgttttctg ttcgaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

<210>12

<211>3438

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>外显子

<222>(1212)...(1358)

<223>Exon 1

<221>exon

<222>(1461)...(1592)

<223>Exon 2

<221>外显子

<222>(1660)...(1820)

<223>外显子3

<221>外显子

<222>(1909)...(2893)

<223>外显子4

<400>12

gttacttttc aaatcttccc tcatattata tagccattga tatcatagag gatgtgagtt 60

ttaacttaat atttacccgt ttgaaactag ctatttactt aaatatgaat tataatctag 120

tttaactacc aaaaacatca tatggggaca agaaaaagta ataaaacgta tggaaaattt 180

tgtagatgtt ataaatggat aattattcaa gtgataatct atcactttga tcttatctct 240

ttatccaatt taattacttt gtctctaagt gatttgcttc caaaatctaa gtgtagtcta 300

tcctatttct atcttatcct atcatataat cttctatata tatgtgagtc cgatgttgta 360

aagcgtacga gagagagtaa tgaagagtga agtgttatat tgttctctcg tccacttcca 420

ctctctcttt tatctcttac ttacttcttc gtaagatcat tacatataat aaataatatt 480

atttatgttt gtgttatatt taataacagt aaaaagtttt aaaacgttga aaaaattagc 540

cgacatagaa tacaaaagag ggttagcatc gggggagaaa cgtggaccaa catgatacac 600

cctccaaaat agtccccaag ttgaaacatt gacatgtttc gctttttctt ttctgtgtat 660

actttttttt tctgtgggtc acattattta atatttgtat acaagcagct attttacatg 720

gagatttcct gtcggtatag cgtcctcatt tctccatcgc ttccactttt ttcctatact 780

aatttgatct aattaattca tatgtcaaaa cattaagaaa atgaaactcg taattcatac 840

ttgaatttaa tagattaatt aaaatgctat ttattggcaa aataaactcg gtttatatct 900

aaattttaga atcactaaaa ctttttgccc aaaaaaaaat aaaaataaat cactaaaaca 960

aaaaacaatc aaaagaaaac ccatgttggt aaatcggata atgaaaataa ttagaatccc 1020

cgtcctttgt gtattttggc gtagcatgaa actatataat aaacatgcat tcattcttag 1080

acttctcgta gcttatcaac aacaacgcgc tcgatctctc tcagcctgtc tgacaactct 1140

ttctctagtt ctagagtttt caatttattg ttgagccttt tattaaaaaa aaaaaaacaa 1200

gaacaaaaga aatggttcaa ttgtcaagaa aagctacatg caacagccat ggccaagtct 1260

cttcgtattt ccttggttgg gaagagtacg agaagaatcc ttacgacgtt accaagaacc 1320

ctcaaggcat tatccagatg ggtcttgcgg aaaatcaggt aaacaaatat tattcaacag 1380

catgtgatat atatatactt atgtatatca tgacagagag actaatttaa agtatgttta 1440

attttattgg atttctgtag ctatgctttg atctactaga gtcatggctt gcacaaaaca 1500

cagacgcagc ctgtttcaag agagatggcc agtctgtttt ccgggaactc gctctctttc 1560

aagactacca tggcctctct tccttcaaaa atgtaagatt attaattgta tttatcaaat 1620

ttatttgtag gttgctgatc ttgctcgaat gattttcagg cctttgctga tttcatgtca 1680

gaaaatagag gaaatcgagt ttcttttgat tcaaacaacc ttgtgctcac tgctggagcc 1740

acttccgcaa acgagactct aatgttttgt cttgcagatc ccggtgacgc tttcttgctt 1800

cccacgccat attatccagg gttagtccac tgtttgctta cacgtaaaat ttccatcatt 1860

cctacgaact tgacttaact aaaactcatg tttatttttg tacttcaggt ttgataggga 1920

tctaaaatgg cgaaccgggg ttgagattgt accaatccaa agctcaagta ctaacgggtt 1980

tcgcataacg aaacttgcac tcgaagaagc ctacgagcaa gccaagaagc ttgacctaaa 2040

cgtcaaagga atactcatca ccaacccatc taaccctttg ggtacgacaa caacccaaac 2100

cgaactcaac attctatttg atttcatcac caagaataag aatatacatt tagtaagtga 2160

cgagatatat tcgggcacag tattcaactc ttcagaattc atcagcgtca tggagattct 2220

aaaaaataat caactcgaaa acaccgatgt tttgaaccga gtccacattg tttgtagctt 2280

atctaaagat ctaggcctcc ctggttttag agttggagcc atttactcca atgacaaaga 2340

tgtcatctct gccgctacaa aaatgtcaag tttcggcctt gtctcctccc agacacaata 2400

cctactatcc tcattattat ctgacaagaa gttcactaag aactacctta gagagaacca 2460

aaaacggctc aagaacagac agagaaagct cgtgttgggt ctagaggcca tcgggatcaa 2520

atgtctgaag agtaatgcgg gactcttttg ttgggtcgac atgagacctc tccttagatc 2580

taaaacgttc gaagcggaaa tggatctttg gaagaagatt gtttacgaag tgaagctcaa 2640

catctctcct ggttcgtggt gccattgtga agaaccgggt tggtttagag tttgtttcgc 2700

gaacatgatt gatgagacat taaagcttgc tttaaagaga ttgaagatgt tggttgatga 2760

tgaaaactca agtagaagat gccaaaagag taaaagcgaa agactaaacg gttcgaggaa 2820

gaagacgatg tcaaatgtct ctaactgggt tttccgacta tcgtttcacg accgtgaggc 2880

tgaggaacga tagtccggtt tttgttttga agttcttttt ttttgtttcc cacacattgc 2940

aagtgattct gtaatttttt ttatcacgag agagagtgta aaaaaatgga aatgcaacgt 3000

gcttactctg atcctagatt ttagaaaacc gttgaagact tcttagagca agtccatcgg 3060

cagtttttaa tgggtttcta atgggtttct agctaattaa aagtccaaaa ttaaatgaaa 3120

acccaactaa ataattagga tccatcccaa tattaggttt tttggatggg tttttagacg 3180

gcgacgtggt cgactgtgag tcgtcggaaa acaaaaaaaa tcacaacact catgttttcc 3240

tttttcctct cgtttttcac ttttttgttt tgtccgacgg ccggcgattc gaatcgattt 3300

gatctccggt gtatcgaaca tgaaatcggg agagaagagc caaatcatcg acgacttggt 3360

tcaccaattc cattcttcga accatactca tataagagtt tcttggcttc tctctaaaac 3420

tcttctaatt ttctgata 3438

<210>13

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸

<400>13

caggtcaagt gcaacgtagg atgattttta ucaaccuacg ttgcacuuga ccuggcgcgt 60

tttcgcgc 68

<210>14

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸

<400>14

caggtcaagt gctacgtagg atgattttta ucaaccuacg tagcacuuga ccuggcgcgt 60

tttcgcgc 68

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>水母

<400>15

atggtgagca agggcgagga gctg 24

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变

<400>16

atggtgagca agggctagga gctg 24

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变

<400>17

atggtgagca agggcaggag ctgt 24

<210>18

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸

<400>18

gtgagcaagg gcgaggagct gttcattttu gaacagcucc tcgcccuugc ucacgcgcgt 60

tttcgcgc 68

<210>19

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸

<400>19

tgagcaaggg ctcggagctg ttcacttttg ugaacagcuc cgagcccuug cucagcgcgt 60

tttcgcgc 68

Claims

1. 一种在植物细胞靶基因上产生定点突变的方法，包括以下步骤：

a.将一种基因修复寡核苷酸附着在一种颗粒上，该寡核苷酸包括一个第一同源区，该同源区具有一个与靶基因的第一个片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，和第二同源区，该同源区具有与所述靶基因的第二片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，以及一个插入区，该区至少含有一个与所述靶基因不同源的核碱基，该插入区连接所述第一同源区和第二同源区；

b.将所述颗粒导入一群植物细胞的细胞中；

c.从所述细胞群中鉴定在所述靶基因的第一和第二片段之间具有一个突变的细胞，

其中，所述附着步骤是在含有8-10μg/μl微载体、14-17μg/mlMDON、1.1-1.4M氯化钙和18-22mM亚精胺的溶液中进行的。

2. 如权利要求1的方法，所述基因修复寡核苷酸是MDON(混合双链寡核苷酸)，而每一个同源区含有至少6个RNA-型核苷酸的RNA片段。

3. 如权利要求2的方法，其中，所述插入区的长度至少为3个核苷酸。

4. 如权利要求2的方法，还包括培养鉴定的细胞以便产生植物的步骤。

5. 如权利要求2的方法，其中，所述第一RNA片段含有至少8个连续的2’-取代核糖核苷酸。

6. 如权利要求5的方法，其中，所述第二RNA片段含有至少8个连续的2’-取代核糖核苷酸。

7. 如权利要求2的方法，其中，所述突变靶基因的序列与MDON插入区的序列相同。

8. 如权利要求2的方法，其中，所述附着步骤是在含有8μg/μl微载体、1.3M氯化钙、21mM亚精胺和16.5μg/ml MDON的溶液中进行的。

9. 如权利要求2的方法，其中，所述靶基因是第一ALS(乙酰乳酸合酶)基因，第二ALS基因，psbA基因，苏氨酸脱水酶基因，二氢2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。

10. 如权利要求9的方法，其中，所述植物细胞是玉米、小麦、稻或莴苣细胞。

11. 如权利要求9的方法，其中，所述植物细胞是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花细胞。

12. 如权利要求2的方法，其中，所述靶基因选自编码以下酶的基因：酸性转化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶、etr-1或其同系物、ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合酶和ACC氧化酶。

13. 如权利要求12的方法，所述植物细胞源于玉米、小麦、稻或莴苣植物。

14. 如权利要求12的方法，其中，所述植物细胞源于马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物。

15. 如权利要求2的方法，还包括由所述植物或所述植物的后代生产种子。

16. 一种在具有细胞壁的植物细胞靶基因上产生定点突变的方法，包括以下步骤：

a.在一群植物细胞的细胞壁上开孔；

b.导入一种基因修复寡核苷酸，该寡核苷酸包括一个第一同源区，该同源区具有一个与靶基因的第一个片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，和一个第二同源区，该同源区具有与所述靶基因的第二片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，以及一个插入序列，该序列具有与所述靶基因不同源的至少一个核碱基，该插入区连接所述第一同源区和第二同源区；

c.从所述细胞群中鉴定在所述靶基因的第一和第二片段之间具有一个突变的细胞。

17. 如权利要求16的方法，其中，所述基因修复寡核苷酸是MDON，而每一个同源区含有一个至少有6个RNA-型核苷酸的RNA片段。

18. 如权利要求17的方法，还包括培养鉴定的细胞以便产生植物的步骤。

19. 如权利要求17的方法，其中，位于所述第一和第二片段之间的靶基因的序列与MDON的插入区的序列在一个错配核苷酸上不同，而所述靶基因的突变位于靠近所述错配核苷酸处。

20. 如权利要求17的方法，其中，位于所述第一和第二片段之间的靶基因的序列与MDON的突变片段的序列在一个错配核苷酸处不同，而所述靶基因的突变位于所述错配核苷酸处。

21. 如权利要求17的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，苏氨酸脱水酶基因，二氢2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。

22. 如权利要求21的方法，其中，所述植物细胞是玉米、小麦、稻或莴苣细胞。

23. 如权利要求21的方法，其中，所述植物细胞是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花细胞。

24. 如权利要求17的方法，其中，所述靶基因选自编码以下酶的基因：酸性转化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶的基因。

25. 如权利要求24的方法，其中，所述靶基因是源于玉米、小麦、稻或莴苣植物的基因。

26. 如权利要求24的方法，其中，所述靶基因是源于马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物的基因。

27. 如权利要求17的方法，还包括由所述植物或所述植物的后代生产种子。

28. 一种在植物细胞质体的靶基因上产生定点突变的方法，包括以下步骤：

a.导入一种基因修复寡核苷酸，该寡核苷酸包括一个第一同源区，该同源区具有一个与靶基因的第一个片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，和一个第二同源区，该同源区具有与所述靶基因的第二片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，以及一个插入区，该区具有与所述靶基因不同源的至少一个核碱基，该插入区连接所述第一同源区和第二同源区；

b.从所述细胞群中鉴定在所述靶基因的第一和第二片段之间具有一个突变的细胞。

29. 如权利要求28的方法，其中，所述基因修复寡核苷酸是MDON，而每一个同源区含有一个至少有6个RNA-型核苷酸的RNA片段。

30. 如权利要求29的方法，还包括培养鉴定的细胞以便产生植物的步骤。

31. 一种在植物细胞靶基因上产生定点的非选择性突变的方法，包括以下步骤：

a.将第一基因修复寡核苷酸和第二基因修复寡核苷酸的混合物导入一群细胞的细胞中，其中：

i.所述第一基因修复寡核苷酸包括第一同源区，该同源区具有与第一靶基因的第一片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，和第二同源区，该同源区具有与所述第一靶基因的第二片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，以及一个插入区，该区至少含有一个与所述靶基因不同源的核碱基，该插入区连接所述第一同源区和第二同源区，和

ii所述第二基因修复寡核苷酸包括第一同源区，该同源区具有与第二靶基因的第一片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，和第二同源区，该同源区具有与所述第二靶基因的第二片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，以及一个插入区，该区至少含有一个与所述靶基因不同源的核碱基，该插入区连接所述第一同源区和第二同源区；

b.从所述细胞群中筛选在所述第一靶基因的第一和第二片段之间具有一个选择性突变的细胞；和

c.鉴定在所述第二靶细胞的第一和第二片段之间具有一个非选择性突变的选定细胞。

32. 如权利要求31的方法，其中，所述基因修复寡核苷酸是MDON，而每一个同源区含有一个至少有6个RNA-型核苷酸的RNA片段。

33. 如权利要求32的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，苏氨酸脱水酶基因，二氢2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。

34. 如权利要求33的方法，其中，所述植物细胞是玉米、小麦、稻或莴苣细胞。

35. 如权利要求33的方法，其中，所述植物细胞是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花细胞。

36. 如权利要求32的方法，其中，所述第二靶基因选自编码以下酶的基因：酸性转化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶。

37. 如权利要求36的方法，其中，所述植物细胞是玉米、小麦、稻或莴苣细胞。

38. 如权利要求36的方法，其中，所述植物细胞是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花细胞。

39. 如权利要求32的方法，还包括培养鉴定的细胞以便产生植物的步骤。

40. 如权利要求39的方法，还包括由所述植物或所述植物的后代生产种子。

41. 如权利要求31的方法，其中，所述第二基因修复寡核苷酸是异源双链基因修复寡核苷酸，并且所述第二基因修复寡核苷酸的每一个同源区包括一个有至少6个RNA-型核苷酸的RNA片段。

42. 如权利要求41的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，苏氨酸脱水酶基因，二氢2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。

43. 如权利要求42的方法，其中，所述植物细胞是玉米、小麦、稻或莴苣细胞。

44. 如权利要求42的方法，其中，所述植物细胞是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花细胞。

45. 如权利要求41的方法，其中，所述第二靶基因选自编码以下酶的基因：酸性转化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶。

46. 如权利要求36、45的方法，其中，所述第二靶基因源于玉米、小麦、稻或莴苣植物。

47. 如权利要求36、45的方法，其中，所述第二靶基因源于马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物。

48. 如权利要求41的方法，还包括培养鉴定的细胞以便产生植物的步骤。

49. 如权利要求48的方法，还包括由所述植物或所述植物的后代生产种子。

50. 一种在植物细胞靶基因上产生定点突变的方法，包括以下步骤：

a.用纤维素酶消化植物部分，以便形成植物细胞原生质体；

b.将所述原生质体悬浮在含有基因修复寡核苷酸的溶液中，该寡核碱基含有第一同源区，该同源区具有与所述靶基因的第一片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，和第二同源区，该同源区具有与所述靶基因的第二片段的至少6个碱基对的序列相同的序列，以及一个插入区，该区包括至少一个与所述靶基因不同源的核碱基，该插入区连接所述第一同源区和第二同源区；

c.对所述悬浮液进行电穿孔，以便所述基因修复寡核苷酸进入该悬浮液的原生质体中；

d.培养所述原生质体；和

e.鉴定所述在所述靶基因的第一和第二片段之间具有一个突变的原生质体的后代。

51. 如权利要求50的方法，还包括培养鉴定的后代以便产生植物的步骤。

52. 如权利要求50的方法，所述基因修复寡核苷酸是MDON，而每一个同源区含有至少6个RNA-型核苷酸的RNA片段。

53. 如权利要求50的方法，其中，所述基因修复寡核苷酸是异源双链基因修复寡核苷酸。

54. 一种在一个基因上具有点突变的植物细胞，该突变在其野生型遗传位点上，所述基因选自编码以下酶的基因：酸性转化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶、ACC合酶和ACC氧化酶或etr-1或其同系物的基因，而所述突变的23KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列，该点突变产生一个终止密码子或者是一种移码突变，并且是通过权利要求1的方法产生的。

55. 如权利要求54的植物细胞，其中，所述点突变产生一个终止密码子。

56. 如权利要求55的植物细胞，其中，所述选择性突变40KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

57. 如权利要求55的植物细胞，其中，所述选择性突变100KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

58. 如权利要求55的植物细胞，其中，所述点突变是单碱基对突变。

59. 如权利要求55的植物细胞，它是玉米、小麦、稻或莴苣植物细胞。

60. 如权利要求55的植物细胞，它是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物细胞。

61. 如权利要求55的植物细胞，在第二个基因上还具有一个选择性点突变，选择性点突变23KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

62. 如权利要求61的植物细胞，其中，所述选择性突变40KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

63. 如权利要求61的植物细胞，其中，所述选择性突变100KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

64. 如权利要求54的植物细胞，其中，所述点突变是移码突变。

65. 如权利要求64的植物细胞，其中，所述选择性突变40KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

66. 如权利要求64的植物细胞，其中，所述选择性突变100KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

67. 如权利要求64的植物细胞，其中，所述点突变是单碱基对突变。

68. 如权利要求64的植物细胞，它是玉米、小麦、稻或莴苣植物细胞。

69. 如权利要求64的植物细胞，它是马铃薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物细胞。

70. 如权利要求64的植物细胞，在第二个基因上还具有一个选择性点突变，选择性点突变23KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

71. 如权利要求70的植物细胞，其中，所述选择性突变40KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。

72. 如权利要求70的植物细胞，其中，所述选择性突变100KB以内的基因组DNA序列是野生型DNA序列。