JP2001512687A - 植物に局在性遺伝子変化を生じさせるための混合二本鎖オリゴヌクレオチドの使用 - Google Patents

植物に局在性遺伝子変化を生じさせるための混合二本鎖オリゴヌクレオチドの使用

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JP2001512687A JP2000506348A JP2000506348A JP2001512687A JP 2001512687 A JP2001512687 A JP 2001512687A JP 2000506348 A JP2000506348 A JP 2000506348A JP 2000506348 A JP2000506348 A JP 2000506348A JP 2001512687 A JP2001512687 A JP 2001512687A
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アルンツエン，チャールズ，ジェイ．
キップ，ピーター，ビー．
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キメラジェン，インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物細胞に部位特異的遺伝子改変を導入するための約25〜30塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドの使用に関する。このオリゴヌクレオチドは機械的（バイオリスティック）システムによりまたは植物プロトプラストのエレクトロポレーションにより送達される。その後、遺伝子改変を有する植物体が改変細胞から作出される。特定の実施形態において、本発明は、酸性インベルターゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ、またはetr-1もしくはetr-1の相同体をコードする遺伝子の改変、ならびにこの種の遺伝子中に孤立した点突然変異を有する植物体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 １．発明の利用分野 本発明の分野は、既存の植物の系統を改良する方法ならびに所望の特質を有す
る新系統の開発に関する。組換えDNA技術により遺伝的に改変された植物を取得 するという以前に利用可能な方法は、予め構築された外因性遺伝子のランダムな
非局在位置への導入、いわゆるトランスジーンを可能にした。これに対して、本
発明は、当業者が植物の特定の既存遺伝子の特異的改変をなし遂げることを可能
にする。本発明は、このような改変を達成するために、RNA様ヌクレオチドとDNA
様ヌクレオチドの混合物を有する二本鎖オリゴヌクレオチド（以後、「混合二本
鎖オリゴヌクレオチド」またはMDONという）を利用するものである。
【０００２】 ２．発明の背景 2.1 MDONおよび特異的遺伝子改変を達成するためのその使用 混合二本鎖オリゴヌクレオチド(mixed duplex oligonucleotide: MDON)および
真核細胞の遺伝子変化をもたらすためのその使用は、Kmiecの米国特許第5,565,3
50号(Kmiec I)に記載されている。Kmiec Iは特に２本の鎖を有するMDONを開示し
ており、第１鎖は、「介在DNAセグメント」と呼ばれる４〜約50個のDNA様ヌクレ
オチドの第３セグメントにより分離された、少なくとも８個のRNA様ヌクレオチ ドの２つのセグメントを含む。第１鎖のヌクレオチドは第２鎖のDNA様ヌクレオ チドに塩基対合されている。さらに、第１鎖と第２鎖は、それらが単一のオリゴ
ヌクレオチド鎖の一部となるように一本鎖ヌクレオチドのセグメントによりリン
クされている。Kmiec Iはさらに、標的遺伝子に特定の遺伝子変化を導入する方 法も教示している。Kmiec Iによると、RNAセグメントの配列は標的遺伝子の第１
断片と第２断片の配列に対し相同となるように、すなわち同一となるように選択
される。介在DNAセグメントの配列は、「異種領域」と呼ばれる差異領域を除き 、第１および第２断片間の標的遺伝子の配列と相同である。異種領域は挿入や欠
失を生じさせることができ、また、置換を起こすように標的遺伝子の配列と誤対
合する１個以上の塩基を含むことができる。Kmiec Iによると、標的遺伝子の配 列が異種領域によって指令されたとおりに改変され、その結果として標的遺伝子
がMDONの配列と相同になる。Kmiec Iは、リボースおよび2'-Oメチルリボース、 すなわち2'-メトキシリボースを含むヌクレオチドをMDON中で使用できること、 および天然のデオキシリボース含有ヌクレオチドをDNA様ヌクレオチドとして使 用できることを特に教示している。
【０００３】 1996年6月17日出願の米国特許出願第08/664,487号、現在の米国特許第5,731,1
81号(Kmiec II)は、植物細胞において遺伝子変化を生じさせるためのMDONの使用
を詳述しており、特定の標的遺伝子の改変に使用できるRNA様およびDNA様ヌクレ
オチドの類似体および誘導体の追加例を開示している。
【０００４】 介在DNAセグメントを有するMDONの使用を開示している科学文献としては、Yoo
nら, 1996, Proc. Natl.Acad. Sci. 93:2071-2076およびCole-Straus, A.ら, 19
96, SCIENCE 273: 1386-1389がある。これらの科学文献によれば、リポソーム媒
介送達を用いて10個の細胞のうち約１個という高い突然変異率が得られる。しか
し、こうした科学文献は、植物細胞に遺伝子変化を起こすためにMDONを使用でき
ることを開示していない。
【０００５】 本明細書ではMDONという用語を採用しているが、これはほかで使用される「キ
メラ突然変異ベクター」、「キメラ修復ベクター」および「キメラプラスト」(c
himeraplast)という用語と同義であることを理解すべきである。
【０００６】 2.2 トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物細胞からの植物 体の作出 標的細胞へのMDONの送達についてKmiec IおよびIIが教示した技法のうち、植 物細胞に最も応用される技法はプロトプラストのエレクトロポレーションである
。プロトプラスト培養物から繁殖力のある植物体を作出することは、双子葉植物
のいくつかの種、例えばNicotiana tobacum（タバコ）が米国特許第5,231,019号
およびFromm, M.E.ら, 1988, Nature 312, 791に、そしてダイズ変種 Clycine m
axがWidholm, J.M.のWO 92/17598に報じられている。しかし、非形質転換細胞を
使用して成功した例が単発的に報告されているものの(Prioli, L.M.ら, Bio/Tec
hnology 7, 589, Shillito, R.D.ら, 1989, Bio/Technology 7, 581)、形質転換
プロトプラスト培養物から繁殖可能な単子葉植物を作出することはルーチンな技
術の適用によっては得られないと考えられている。大抵の場合、単子葉植物の形
質転換プロトプラストは非再生性の組織をもたらすか、あるいは組織が再生され
るとしても、得られる植物は繁殖力をもたない。
【０００７】 キロベースサイズのプラスミドDNAを完全なまたは一部完全な細胞壁をもつ植 物細胞に導入することによって形質転換植物細胞を取得する技術はほかにも報告
されている。米国特許第4,945,050号、第5,100,792号および第5,204,253号は、 微粒子にプラスミドを付着させ、この微粒子を細胞壁からバリスティック(balli
stically)に導入することによる、無傷の細胞へのプラスミドの送達（以後「バ イオリスティック(biolistically)に形質転換された」細胞という）に関するも のである。例えば、米国特許第5,489,520号は、バイオリスティックに形質転換 された細胞から繁殖可能なトウモロコシ植物体を再生することを記述している。
無傷の細胞壁をもつ植物細胞の浮游液にプラスミドDNAを導入するその他の技法 は、シリコンカーバイド繊維を使って細胞壁に穴をあけるものである。例えば、
Coffee R.およびDunwell, J.M.の米国特許第5,302,523号を参照されたい。
【０００８】 複雑な細胞壁をもつトウモロコシ細胞のエレクトロポレーションを可能にする
技術は、Krzyzek, LaursenおよびP.C. Andersonの米国特許第5,384,253号に報告
されている。この技法は形質転換コンピテント細胞（真のプロトプラストよりも
容易に繁殖力のある植物体へと再生され得る）を作製するためにエンドペクチン
リアーゼ(E.C. 3.2.1.15)とエンドポリガラクツロナーゼ(E.C. 4.2.2.3)の組合 せ酵素を使用するものである。しかし、この技法は系統A188 x 系統B73の交配か
ら得られるF1細胞系にのみ有効であると報じられている。
【０００９】 ３．発明の概要 本発明は、このような植物細胞で使用するのに特に適しているMDONの新規な使
用方法を提供する。 したがって、本発明の一態様は、植物細胞の標的遺伝子に突然変異を起こさせ
るために、細胞壁を貫通して射出され細胞内でMDONを放出できる粒子にMDONを付
着させる技術である。この技法により導入され得る変異は、適切な条件下で変異
細胞に生育上の利点を付与する変異と、肉眼による検査で検出できる表現型をも
たらす変異である。かかる変異は「選択可能な突然変異」と呼ばれる。
【００１０】 別の実施形態において、本発明は、植物細胞の標的遺伝子に選択可能な突然変
異以外の変異を導入する方法を包含し、この方法は、植物細胞に選択可能な突然
変異を導入する第１MDONと選択不可能な突然変異を起こさせる第２MDONとの混合
物を導入するステップを含む。
【００１１】 本発明はさらに、種子を生産する植物、それゆえに「繁殖可能な植物」を取得
するように本発明の前記実施形態に従って突然変異を起こさせた細胞の培養、な
らびにこのような繁殖可能な植物からの種子および追加の植物の生産を包含する
。 本発明はさらに、本発明の方法によって作出され得る新規な特性を有する繁殖
可能な植物を包含する。
【００１２】 4. 発明の詳細な説明 4.1. 組換え原性オリゴヌクレオ塩基及び混合二本鎖オリゴヌクレオチド 本発明は、MDONを用いて実施することができる。MDONのコンホメーション及び
化学組成は、Kmiec IまたはKmiec IIに記載されており、これらの文献はこの引 用により本明細書の一部とする。Kmiec I及び／またはKmiec IIのMDONは、2本の
相補鎖を含んでおり、その一方は少なくとも1つのRNA型ヌクレオチドのセグメン
ト(「RNAセグメント」)を有し、このRNAセグメントは他の鎖のDNA型ヌクレオチ ドと塩基対を形成する。
【００１３】 Kmiec IIには、プリン塩基及びピリミジン塩基を含む非ヌクレオチドを、ヌク
レオチドに代用できることが記載されている。譲受人が本出願と同一の1998年5 月12日出願の米国特許出願第09/078,063号及び1998年5月12日出願の米国特許出 願第09/078,064号(引用によりその全体を本明細書の一部とする)には、本発明の
ために用いることができる別の分子が記載されている。本明細書において使用す
る用語「組換え原性オリゴヌクレオ塩基」(recombinagenic oligonucleobase)は
、本発明において用いることができる分子を表す。組換え原性オリゴヌクレオ塩
基には、MDON、Kmiec IIに記載されている非ヌクレオチド含有分子、及び譲受人
が本出願と同一の上述の特許出願に記載されている分子が含まれる。
【００１４】 好ましい態様においては、MDONのRNA型ヌクレオチドは、2'-ヒドロキシルをフ
ルオロ、クロロ、またはブロモ官能基で置換するか、2'-Oに置換基を配置するこ
とによってRNアーゼ耐性を有するようにする。適当な置換基としては、Kmiec II
に記載されている置換基であるC1-6アルカンが挙げられる。別の置換基としては
、米国特許第5,334,711号(Sproat)に記載されている置換基や特許公開EP 629 38
7及びEP 679 657 (両方合わせてMartinの出願と称する)が挙げられる。これらの
文献はこの引用により本明細書の一部とする。本明細書で使用する、リボヌクレ
オチドの2'-フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはMartinの出願もし くはSproatに記載されている置換基で置換した2'-OHを有するリボヌクレオチド は、「2'-置換リボヌクレオチド」と称する。本明細書で使用する用語「RNA型ヌ
クレオチド」は、置換されていないホスホジエステル結合またはKmiec IまたはK
miec IIに記載されている非天然の結合によってMDONの他のヌクレオチドに結合 した2'-ヒドロキシルまたは2'-置換ヌクレオチドを意味する。本明細書において
使用する用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、置換されていないホスホジエ
ステル結合またはKmiec IもしくはKmiec IIに記載されている非天然の結合によ ってMDONの他のヌクレオチドに結合し得る2'-Hを有するヌクレオチドを意味する
。
【００１５】 本発明の特定の態様として、置換されていないホスホジエステル結合のみによ
って結合したMDONが挙げられる。別の態様は、置換されたホスホジエステル結合
、ホスホジエステル誘導体、及びKmiec IIに記載されているリンベースの結合で
ない結合を含む。別の特定の態様は、MDONであって、各RNA型ヌクレオチドが2'-
置換ヌクレオチドであるものを含む。2'-置換リボヌクレオチドの特定の好まし い態様は、2'-フルオロ、2'-メトキシ、2'-プロピルオキシ、2'-アリルオキシ、
2'-ヒドロキシルエチルオキシ、2'-メトキシエチルオキシ、2'-フルオロプロピ ルオキシ及び2'-トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。2'-
置換リボヌクレオチドのより好ましい態様は、2'-フルオロ、2'-メトキシ、2'- メトキシエチルオキシ及び2'-アリルオキシ置換ヌクレオチドである。ある態様 においては、MDONオリゴマーが置換されていないホスホジエステル結合で結合さ
れている。
【００１６】 1種類の型の2'-置換RNA型ヌクレオチドのみを有するMDONは合成しやすいが、 本発明は2種以上の型のRNA型ヌクレオチドを有するMDONにより実施できる。RNA セグメントの機能は、2つのRNA型トリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチド
を導入することによって生ずる中断の影響を受けないことがあり、従って用語RN
Aセグメントはそのような「中断されたRNAセグメント」を包含する。中断されて
いないRNAセグメントは、連続したRNAセグメントと称する。別の態様においては
、RNAセグメントが、交互に配置された、RNアーゼ耐性ヌクレオチドと置換され ていない2'-OHヌクレオチドとを含み得る。本発明のMDONは、好ましくは100個未
満のヌクレオチド、より好ましくは85個未満のヌクレオチドを有し、50個より多
いヌクレオチドを有する。第1鎖及び第2鎖はワトソン・クリックの塩基対を形成
している。ある態様においては、MDONの両鎖は、例えば1本鎖のヘキサ、ペンタ 、またはテトラヌクレオチドのようなリンカーで共有結合しており、第1鎖及び 第2鎖は、1個の3'末端及び1個の5'末端を有する1つのオリゴヌクレオチド鎖のセ
グメントとなっている。この3'末端及び5'末端は、「ヘアピンキャップ」を付加
して3'末端及び5'末端のヌクレオチドが隣接するヌクレオチドとワトソン・クリ
ックの塩基対を形成するようにすることによって保護することができる。さらに
第2のヘアピンキャップを3'末端及び5'末端から離れた位置にある第1鎖と第2鎖 の接合部に配置して第1鎖及び第2鎖のワトソン・クリックの塩基対形成を安定化
させることができる。
【００１７】 第1鎖及び第2鎖は、標的遺伝子の2つの断片に相同な、つまり標的遺伝子と同 一の配列を有する2つの領域を含んでいる。相同領域はRNAセグメントのヌクレオ
チドを含んでおり、結合DNAセグメントの1以上のDNA型ヌクレオチドを含み得、 また介在するDNAセグメントの中にないDNA型ヌクレオチドをも含み得る。この2 つの相同領域は、それぞれに隣接する「非相同領域」と称する標的遺伝子の配列
と異なる配列を有する領域によって分離されている。この非相同領域は、1個、2
個、または3個のミスマッチヌクレオチドを有し得る。このミスマッチヌクレオ チドは、連続して存在するか、あるいは標的遺伝子と相同な1個または2個のヌク
レオチドで分離された状態にあり得る。あるいは、非相同領域は1個、2個、3個 、または5個以下のヌクレオチドである挿入を含み得る。あるいは、MDONの配列 はMDONの配列からの1個、2個、3個、または5個以下のヌクレオチドが欠失してい
る点でのみ標的遺伝子の配列と異なっている場合もある。この場合、非相同領域
の長さ及び位置は、その非相同領域のなかにMDONのヌクレオチドが無くても、欠
失の長さであるとみなされる。1箇所の置換または複数の置換を意図する場合、2
つの相同領域に相補的な標的遺伝子の断片間の距離は非相同領域の長さに等しい
。非相同領域が挿入を含む場合、それにより非相同領域はMDON中でその相補的相
同断片が前記遺伝子中にある場合より離れた状態に分離され、非相同領域が欠失
をコードしている場合は、逆のことが言える。
【００１８】 MDONのRNAセグメント群は、それぞれ相同領域の一部、即ち標的遺伝子の断片 と配列が同一な領域である。このときセグメント群は全体として、好ましくは13
個以上のRNA型ヌクレオチドを含み、より好ましくは16〜25個のRNA型ヌクレオチ
ド、さらに好ましくは18〜22個のRNA型ヌクレオチド、最も好ましくは20個のヌ クレオチドを含む。ある態様においては、相同領域のRNAセグメントは、介在す るDNAセグメントによって分離され、それに隣接し、すなわち「結合」している 。ある態様においては、非相同領域の各ヌクレオチドは介在するDNAセグメント のヌクレオチドである。MDONの非相同領域を含む介在DNAセグメントは「ミュー テーターセグメント」と称する。
【００１９】 譲受人が本出願と同一の1998年5月12日出願の米国特許出願第09/078,063号及 び1998年5月12日出願の米国特許出願第09/078,064号には、鎖が標的遺伝子の配 列と同一の配列を有し、「相補的な」鎖の配列のみが非相同領域を含んでいる型
の二本鎖組換え原性オリゴヌクレオ塩基が開示されている。この構成により1箇 所またはそれ以上の塩基のミスマッチ、つまり「ヘテロ二本鎖」構造が得られる
。本発明において有用なヘテロ二本鎖組換え原性オリゴヌクレオ塩基の非相同領
域は、デオキシヌクレオチドを含む鎖に位置している。ある態様においては、こ
の非相同領域が5'末端ヌクレオチドを含む鎖に位置している。
【００２０】 4.2 MDONにより導入された変異の位置及び型 植物細胞で用いるためのMDONの設計では、Kmiec IまたはKmiec IIに記載され ている設計を変更しなければならないことが多い。哺乳動物及び酵母細胞では、
一箇所の位置について標的遺伝子と異なるMDONによって導入される遺伝子の変化
は、ミスマッチ位置にある標的遺伝子のヌクレオチドの、ミスマッチ位置にある
MDONのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドによる置換である。これに対して植
物細胞では、DNAミューテーターセグメントを含む鎖に相補的な鎖上のミスマッ チ位置の１塩基5'側のヌクレオチドの変化が存在し得る。標的遺伝子のヌクレオ
チドは、ミスマッチ位置においてDNAミューテーターセグメントのヌクレオチド に相補的なヌクレオチドによって置換される。その結果、変異した標的遺伝子は
2箇所の位置でMDONと異なるものとなる。
【００２１】 MDONによって標的遺伝子に導入される変異は、MDONの相同領域のリボヌクレオ
チド部分(以下「RNAセグメント」)に相同な標的遺伝子の領域の間に位置する。 導入される特定の変異は非相同領域の配列により決まる。標的遺伝子の挿入また
は欠失は、それぞれ挿入または欠失を含む非相同領域を用いて導入することがで
きる。標的遺伝子の置換は、MDONの非相同領域においてミスマッチを有するMDON
を用いて得ることができる。最も一般的な態様においては、このミスマッチによ
って標的遺伝子の既存の塩基をMDONのミスマッチ塩基に相補的な塩基に変換する
。標的遺伝子における置換の位置は、ミスマッチに対応する位置とするか、ある
いはより多くの場合、置換がミスマッチ位置の5'末端側に直接隣接する標的鎖上
の位置、即ちMDONのミスマッチ塩基の3'末端側に直接隣接するMDON上の位置に相
補的なものとするかの何れかである。
【００２２】 各位置におけるミスマッチを生じさせる置換発生の相対的頻度は、所与の遺伝
子及び細胞の型に特徴的なものとなる。従って、置換の位置が本発明の実施にお
いて重要であるとき、目的の遺伝子における置換の位置を決定するための予備的
調査が一般に必要となるということが当業者に理解されるであろう。
【００２３】 4.3 マイクロキャリア及びマイクロファイバーによるMDONの送達 DNAの大形の断片をセルロース細胞壁を有する植物細胞に発射物を貫通させて 導入するために、金属製マイクロキャリア(マイクロスフィア)を用いることは、
当分野では周知である(以下、バイオリスティック送達と称する)。米国特許第4,
945,050号、第5,100,792号、及び第5,204,253号は、マイクロキャリアの選択の ための一般的技術及びそれを発射するための装置に関するものである。
【００２４】 DNA断片をマイクロキャリアに付着させるために用いられる条件は、MDONの使 用には適さない。本発明は、マイクロキャリアに十分な量のMDONを付着させるた
めの技術を提供し、バイオリスティック送達を利用できるようにする。適当な技
術では、氷冷したマイクロキャリア(60 mg/ml)、MDON (60 mg/ml)、2.5M CaCl2
、及び0.1Mのスペルミジンをこの順に加える。この混合物を、例えばボルテック
スにより10分間静かに攪拌し、10分間室温に静置する。このマイクロキャリアを
5倍量のエタノールで希釈し、遠心分離して100%エタノールに再懸濁する。良い
結果は、付着溶液における濃度が8〜10μg/μlのマイクロキャリア、14〜17μg/
ｍlのMDON、1.1〜1.4 MのCaCl2、及び18〜22 mMのスペルミジンで得られる。最
適な結果は、8μg/μlのマイクロキャリア、16.5μg/ｍlのMDON、1.3 MのCaCl2
、及び21 mMのスペルミジンの条件で観察された。
【００２５】 本発明の実施のため、細胞壁及び細胞膜を貫通するマイクロファイバーを用い
て植物細胞にMDONを導入することもできる。Coffeeらに賦与された米国特許第5,
302,523号には、懸濁液のBlack Mexican Sweet種のトウモロコシ培養物を形質転
換するために、30 x 0.5μm及び10 x 0.3μmの炭化ケイ素ファイバーを用いるこ
とが記載されている。植物細胞の形質転換のためにマイクロファイバーを用いて
DNAを導入するのに利用することができる物理的技術は何れもトランス突然変異
を起こすためのMDONの送達に用いることができる。
【００２６】 MDONのマイクロファイバーによる送達のために適当な技術は以下の通りである
。滅菌したマイクロファイバー(2μg)を、約10μgのMDONを含む150μlの植物培 養液に懸濁する。懸濁培地を沈降させて、等量の沈降細胞と滅菌ファイバー／MD
ON懸濁液を10分間攪拌し、プレート化する。その特定の形質に適するように、選
択培地をその直後、あるいは最大約120時間後に適用する。
【００２７】 核遺伝子をトランス変異させるためのMDONの送達において用いることができる
技術は、植物細胞プラスチドの遺伝子のトランス突然変異を誘発させるためにも
用いることができる。プラスミドのバイオリスティック送達の後、そのプラスミ
ドの非正統的組換えとなる挿入を生じさせることによって高等植物の植物細胞プ
ラスチドを形質転換することは周知であり、Svab, Z.ら、1990, Proc. Natl. Ac
ad. Sci.87, 8526-8530に記載されている。最初の実験では、核形質転換率の10 〜100分の1の形質転換率であった。その後の実験で、スペクチノマイシン耐性を
与える細菌アミノグリコシド3'-アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子のような 優勢な選択形質を用いることによって、核形質転換率に匹敵するプラスミド形質
転換率が得られることが分かった。Svab, Z.及びMaliga, P., 1993, Proc. Natl
. Acad. Sci. 90,913-917を参照。
【００２８】 本発明によれば、上述したものと同一の技術によって、プラスチド遺伝子のト
ランス突然変異のためのMDONをプラスチドに導入することができる。導入したい
変異が選択可能な変異である場合は、MDONを単体で用いることができる。所望の
変異が選択不可能である場合は、関連するMDONを選択可能なプラスチド変異、例
えばトリアジン耐性を与えるpsbA遺伝子の変異を導入するMDONをともに、あるい
は選択形質を与える直鎖状または環状のプラスミドと組み合わせて導入すること
ができる。 上述の技術は、MDON以外の組換え原性オリゴヌクレオ塩基に使用するのに適合
させることができる。
【００２９】 4.4 プロトプラストのエレクトロポレーション 別の態様においては、植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレ
ーションによって組換え原性オリゴヌクレオ塩基を植物細胞に送達することがで
きる。プロトプラストは、植物の一部、特に葉を当業者に周知の技術に従って酵
素で処理することにより形成する。例えば、Galloisら、1996, Methods in Mole
cular Biology 55, 89-107 (Humana Press, Totowa, NJ)を参照されたい。この プロトプラストは、エレクトロポレーションの前に増殖培地で培養する必要はな
い。 エレクトロポレーションに適した条件は、MDON濃度が0.6〜4μg/mlで、総容量
0.3 ml中プロトプラスト3×105個である。
【００３０】 4.5 変異の導入 本発明は、植物細胞において、本明細書において「トランス突然変異」と称す
る遺伝子の変化を生じさせるために用いることができる。ある態様においては、
植物細胞が細胞壁を有し、すなわちプロトプラストではない。 植物細胞をトランス突然変異させるMDONの使用は、MDONが導入されていない細
胞からMDONが導入された細胞を区別及び分離(以下「選択」)することを容易にす
る形質を同時に導入することによって容易にすることができる。本発明のある態
様においては、選択形質、すなわちある条件下での生存を可能にする形質を与え
る遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子)の一過性の発現を生じさせるプラスミ
ドとMDONとの混合物を形成することによって選択を行う。このような条件の下で
選択形質を欠く細胞を除去することによってMDONが導入されていない細胞を取り
除く。選択形質を導入するために一過性発現プラスミドを用いることにより、1 つの標準的な選択プロトコルを繰り返し用いて植物細胞に複数の遺伝子の変化を
連続して導入することができる。
【００３１】 別の態様においては、トランス突然変異を用いて選択形質を導入することがで
きる。第1の標的遺伝子に選択可能な変異を生じさせる第1のMDONと、第2の標的 遺伝子に選択不可能な変異を生じさせる第2のMDONとの混合物を調製する。本発 明によれば、選択可能な変異を有する細胞の約1%以上が、第2のMDONによって導 入された第2の標的遺伝子における変異も有することになる。より多くの場合、 選択可能な変異を有する細胞の約10%以上が、第2の標的遺伝子における変異も有
する。
【００３２】 本発明のこの態様の1つの使用は、目的の遺伝子の機能を調べることである。 選択可能な変異を生じさせるMDONと、目的の遺伝子を「ノックアウトする」と予
想される変異、例えば停止コドンの挿入やフレームシフト変異を生じさせるMDON
の混合物を準備する。目的の遺伝子の1以上の数のコピーがノックアウトされた 細胞を選択可能な変異を有する集団から回収することができる。そのような細胞
を植物中に再生させ、目的の遺伝子の機能を決定することができる。
【００３３】 適当な選択条件下での選択的な増殖の有利性を生じさせ得る表現型の変化、あ
るいは、例えばカルスにおいて増殖する植物細胞における色の変化のような容易
に観察できる表現型の変化を生じさせる何らかの変異によって選択可能な形質を
得ることができる。選択可能な形質自体が、例えば除草剤耐性のような望ましい
形質となることもあり得る。あるいは選択可能な形質を、トランス突然変異によ
って導入された選択不可能な形質を有する植物の単離を促進するだけの目的で用
いることができる。所望の変異を生じさせるMDONと、選択可能な変異を生じさせ
るMDONとの混合物を用い、選択条件下で培養することによって所望の選択不可能
な形質を細胞に導入することができる。この方式による選択には、各選択された
細胞がMDONの混合物を受容するということのみならず、混合物を受容した細胞が
MDONによるトランス突然変異に感受性になるという利点がある。
【００３４】 ネガティブ選択変異と称する、適当な条件下で致死的な表現型の変化を生ずる
変異も本発明で用いることができる。そのような変異はネガティブ選択可能な形
質を生ずるものである。ネガティブ選択可能な形質の選択は、トランス突然変異
された細胞のレプリカプレートを作成し、レプリカの1つを選択し、選択されな かったレプリカから所望の特性を有するトランス突然変異された細胞を回収する
ことによって行うことができる。
【００３５】 4.6 トランス突然変異されて選択可能な形質を生じさせ得る特定の遺伝子 本発明のある態様においては、MDONを用いて、アセトヒドロキシアミノ酸シン
ターゼ(AHAS)遺伝子とも称する、アセトラクテートシンターゼ(ALS)遺伝子に変 異を導入する。スルホニル尿素除草剤及びイミダゾリン除草剤は野生型ALS酵素 の阻害剤である。植物にスルホニル尿素及びイミダゾリンの作用に対する耐性を
与える優勢な変異については文献に記載されている。米国特許第5,013,659号及 び第5,378,824号(Bedbrook)及びRajasekaran Kら、1996, Mol. Breeding, 2, 30
7-319 (Rajasekaran)を参照されたい。Bedbrookの文献の表2には、酵母ALS酵素 にスルホニル尿素除草剤に対する耐性を与えることが判明したいくつかの変異( 以下「Bedbrook変異」)が記載されている。Bedbrookは、各Bedbrook変異が植物A
LS遺伝子に導入されると植物にスルホニル尿素及びイミダゾリン除草剤に対する
耐性を与えると述べている。殆どの植物においてALSをコードする遺伝子が複製 されることがわかっている。ALS遺伝子の何れかの対立遺伝子に変異を導入する ことができる。
【００３６】 3種のBedbrook変異、すなわち置換Pro→Ala197、Ala→Asp205及びTrp→Leu591
は、実際に植物に除草剤に対する耐性を与えることが示された。Rajasekaranの 報告によれば、変異Trp→Ser591はスルホニル尿素及びイミダゾリンに対する耐 性を生じさせ、変異Ser→Asn660はイミダゾリン除草剤に対する耐性を生じさせ た。Rajasekaranの結果については本明細書においてはBedbrookによる配列のナ ンバリングを用いて報告する。異なる植物のALS遺伝子が異なる長さを有してい ることは当業者に理解されよう。判りやすくするために、種のそれぞれにおいて
相同な領域が同一の位置番号で示されるようなナンバリング方式を用いる。従っ
て指定される変異の位置は、それを取囲む配列によって決定される。例えば、Ra
jasekaranの変異Trp→Ser591は、綿のALS遺伝子の563番目の残基であるが、Bedb
rookの位置では591番目となる。変異したTrpが、Bedbrookの表2においてTrp591 を取囲む配列で囲まれているからである。本発明によれば、660番目の位置、す なわちBedbrook(引用により本明細書の一部とする)の表2に挙げられている位置 の1つでの天然のアミノ酸の置換を用いて、植物のALS遺伝子における選択可能な
変異を作り出すことができる。
【００３７】 本発明の別の態様においては、選択可能な変異が、光化学系IIのD1サブユニッ
トをコードするクロロプラスト遺伝子psbAにおける変異であり得る。Hirschberg
, J.ら、1984, Z. Naturforsch. 39, 412-420及びOhad, N.及びHirschberg, J.,
The Plant Cell 4, 273-282を参照されたい。Hirschbergらの報告によれば、変
異Ser→Gly264によって、トリアジン除草剤、例えば2-Cl-4エチルアミノ-6-イソ
プロピルアミノ-s-トリアジン(アトラジン)に対する耐性が得られる。アトラジ ン除草剤耐性を生ずるpsbAにおける他の変異は、Erickson J. M.ら、1989, Plan
t Cell 1, 361-371に記載されている(以下「Erickson変異」)。この文献は引用 により本明細書の一部とする。クロロプラストに第2の新たな形質を導入したい 場合、Erickson変異によって生ずる選択可能な形質を用いるのが好ましい。
【００３８】 選択可能な形質を生ずる他の変異を報告している科学文献がある。Ghislain M
.ら、1995, The PlantJournal 8, 733-743には、Nicotiana sylvestrisジヒドロ
ジピコリネートシンターゼ(DHDPS, EC 4.2.1.52)遺伝子におけるAsn→Ile104変 異により、S-(2-アミノエチル)L-システインに対する耐性が生ずることが報告さ
れている。Mourad, G.及びKing, J., 1995, Plant Physiology 109, 43-52には 、L-O-メチルスレオニンに対する耐性を生ずるArabidopsis thalianaのスレオニ
ンデヒドラターゼにおける変異が報告されている。Nelson, J.A.E.ら、1994, Mo
l. Cell. Biol. 14, 4011-4019には、翻訳阻害剤クリトプルエリン及びエメチン
に対する耐性を生ずる、S14/rp59リボソームタンパク質のC末端LeuのProによる 置換について記載されている。本発明の別の態様においては、前述の変異の何れ
かを用いて選択可能な形質を作り出すことができる。Ghislain、Mourad、及びNe
lsonの各文献は、上記引用により本明細書の一部とする。
【００３９】 4.7 変異により所望の選択不可能な形質を与えることができる遺伝子 実施例1 雄性不稔性 通常はハイブリッド種子から育てられる商業的に生産されている植物があり、
コーン(トウモロコシ、Zea maize)、トマト及びその他の多くの野菜が含まれる 。ハイブリッド種子の製造には、ある純血系統の植物に、他の純血系統の植物の
花粉のみを受粉させること、すなわち自家受粉が行われないようにすることが必
要である。しかし純血系統の親植物から花粉生成器官を取り除くことは、労力を
要しコストの嵩む作業である。従って、雄性不稔性を誘導する、すなわち花粉の
生成または機能を抑制する変異によりこのような作業を不要にする。 花粉の成熟や機能のために必要であるが、植物の他のプロセスには必要ではな
いいくつかの遺伝子が同定されている。カルコンシンターゼ(chs)は、花や花粉 に認められる色素であるフラボノイドの合成において重要な酵素である。ペチュ
ニアにおいてchsアンチセンス発現遺伝子の導入によってchsを阻害すると植物の
雄性不稔性が生ずる。Van der Meer, I.M.ら、1992, The Plant Cell 4, 253-26
2を参照。殆どの植物にはchs遺伝子ファミリーが存在する。例えば、Koes, R. E
.ら、1989, Plant Mol. Biol.12, 213-226を参照。同様に、転移可能なエレメン
トを挿入することによりトウモロコシにおけるカルコンシンターゼ遺伝子を破壊
すると雄性不稔性が生ずる。Coe, E. H., J. Hered. 72, 318-320を参照。トウ モロコシのカルコンシンターゼ及び重複遺伝子のwhpの構造は、Franken, P.ら、
1991, EMBO J. 10, 2605-2612に記載されている。通常、植物においては多重遺 伝子ファミリーの各メンバーは限定された範囲の組織のみで発現される。従って
本発明のこの態様においては、カルコンシンターゼ遺伝子の複数のコピーを有す
る種において、葯で発現される特定のchs遺伝子または遺伝子群を同定した上で 、フレームシフト、及び1以上のフレーム内終止コドンの導入、またはプロモー ターの中断によりその遺伝子を中断させる必要がある。
【００４０】 花粉形成に必要なものとしてトマトで同定された第2の遺伝子はLat52と称する
。Muschietti, J.ら、1994, The Plant Journal 6, 321-338を参照。LAT52はト リプシン阻害剤に関連を有する分泌糖タンパク質である。Lat52のホモログは、 トウモロコシ(Zm13と称する、Hanson D. D.ら、1989 Plant Cell 1,173-179; Tw
ell D.ら、1989, Mol. Gen. Genet. 217, 240-245)、イネ(Ps1と称する、Zou J.
ら、1994 Am. J. Bot. 81, 552-561)、及びオリーブ(O/e e/と称する、Villalba
, M.ら、1993, Eur. J. Biochem. 276, 863-869)において同定されている。従っ
て本発明のこの態様は、フレームシフト、1以上のフレーム内終止コドンの導入 によるLat52/Zm13遺伝子またはそのホモログの中断、またはプロモーターの中断
によって雄性不稔性を得る方法を提供する。
【００４１】 花粉形成に必要なものとして同定された第3の遺伝子は、フェニルアラニンア ンモニウムリアーゼ(PAL, EC 4.3.1.5)をコードする遺伝子である。PALは、フェ
ニルプロパノイド及びフラボノイド両方の生成に必要な酵素である。フェニルプ
ロパノイドが、疾病に対する耐性を与えるために必要不可欠であり得るリグニン
の前駆物質であることから、好適な態様においては、葯においてのみ発現される
PALアイソザイムを同定し、中断することによって雄性不稔性を得る。
【００４２】 実施例2 塊茎の糖質代謝の変更 ジャガイモ塊茎は収穫された後、貯蔵中に発病したり、縮みが生じたり、発芽
したりする。これらの損失を回避するため、貯蔵温度を35〜40゜Fまで下げる。 しかし低温では「コールドスイートニング」と称する、塊茎のデンプンが糖に変
わる現象が起こり、塊茎の商業的価値及び栄養価が低下する。コールドスイート
ニングプロセスでは、2種の酵素、すなわち酸インベルターゼ及びUDP-グルコー スピロホスホリラーゼが重要である。それぞれの酵素についてはZrenner, R.ら 、1996, Planta 198, 246-252及びSpychalla, J. P.ら、1994, J. Plant Physio
l. 144, 444-453をそれぞれ参照。ジャガイモの酸インベルターゼの配列は、EMB
Lデータベース受託番号X70368(配列番号1)にあり、ジャガイモのUDP-グルコース
ピロホスホリラーゼの配列は、Katsube, Tら、1991. Biochem. 30, 8546-8551に
報告されている。従って本発明のこの態様は、フレームシフト、1以上のフレー ム内終止コドンの導入によって酸インベルターゼまたはUDP-グルコースピロホス
ホリラーゼを中断し、またはプロモーターを中断することによるコールドスイー
トニングを防止する方法を提供する。
【００４３】 実施例3 PPOによる収穫後褐変の低減 ポリフェノールオキシダーゼ(PPO)は、高等植物における酵素的褐変の主な原 因物質である。PPOは、モノフェノールからo-ジフェノールへの転換、o-ジヒド ロキシフェノールからo-キノンへの転換を触媒する。その後キノンの産物が重合
し、細胞タンパク質のアミノ酸基と反応して変色が起こる。PPOによって誘導さ れる褐変の問題は、通常は亜硫酸塩を食品に添加することによって処理する。こ
の処理は健康上のリスクの可能性と関連があり、消費者が嫌うところであること
が知られている。PPOは通常、植物の病原体または害虫に対する防御において機 能するもので、植物の生存に必要不可欠なものではない。従って、本発明のこの
態様は、リンゴ、ブドウ、アボカド、西洋ナシ及びバナナにおいて、フレームシ
フト、1以上のフレーム内終止コドンの導入によってPPOを中断し、またはプロモ
ーターの中断することによる、酵素的褐変を防止する方法を提供する。
【００４４】 植物のゲノムにおけるPPO遺伝子の数は様々であり、トマトやジャガイモでは 、PPOが多重遺伝子ファミリーを形成している。Newman, S. M.ら、1993, Plant
Mol. Biol. 21, 1035-1051、Hunt, M. D.ら、1993, Plant Mol. Biol. 21, 59-6
8、Thygesen, P.W.ら、1995, Plant Physiol. 109, 525-531を参照。ブドウはた
だ1種のPPO遺伝子を含む。Dry, I. B.ら、1994, Plant Mol. Biol., 26, 495-50
2を参照。目的の植物の種がPPO遺伝子の複数のコピーを有するとき、商業的生産
物において通常発現されるPPO遺伝子を中断することが必要不可欠である。例え ば、収穫できるサイズのジャガイモにおいてはただ1種類のPPO遺伝子が発現され
、この遺伝子はPOT32と称し、その配列はGENBANK受託番号U22921(配列番号2)で 登録されている。この配列はこの引用により本明細書の一部とする。その他のジ
ャガイモPPOアイソザイムが配列決定されており、その配列が登録されている。 従って当業者はPOT32を特異的に不活化するMDONを設計することができる。
【００４５】 実施例4 飼料作物及び木材パルプにおけるリグニンの低減 リグニンは異種成分からなる複合芳香族ポリマーで、高等植物に耐水性を与え
、その細胞壁を強化している。リグニンはフェニルプロパノイドモノリグニンの
フリーラジカルのランダム重合から生ずる。リグニンは製紙産業において重要な
問題を起こす。木材パルプからそれらを除去するために製造時のコストと環境面
でのコストの両方を要するからである。同様に、飼料作物中のリグニン成分によ
り反芻動物による消化率が限定される。実際、サトウモロコシ (Porter, KS,ら 、1978, Crop Science 18, 205-218)及びトウモロコシ (Lechtenberg, V. L.ら 、1972, Agron, J. 64, 657-660)における「褐色中脈」と称する天然の変異が低
いリグニン含有量を有するものとして同定され、ウシの飼料として試験されてき
た。
【００４６】 トウモロコシにおけるこの褐色中脈変異にはO-メチルトランスフェラーゼ遺伝
子が関与する。Vignol, F.ら、1995, Plant Cell 7, 407-416を参照。多くの植 物種のO-メチルトランスフェラーゼ遺伝子がクローン化されている。Burgos, R.
C.ら、1991, Plant Mol. Biol. 17, 1203-1215(ハコヤナギ)、Gowri, G.ら、199
1, Plant Physiol. 97, 7-14(アルファルファ、Medicago sativa)及びJaeck, E.
ら、1992, Mol. Plant-Microbe Interact. 4, 294-300(タバコ)(配列番号3及び 配列番号4)を参照。従って、この態様のある形態においては、O-メチルトランス
フェラーゼ遺伝子を中断することによりトウモロコシまたはサトウモロコシの何
れかの品種、及び飼料作物の他の種、及び木材パルプの製造の用途に供する植物
における褐色中脈表現型を再現する。
【００４７】 リグニン産生に関与する第2の遺伝子は、シンナミルアルコールデヒドロゲナ ーゼ(CAD)遺伝子であり、タバコにおいてクローン化されている。Knight, M.E.,
1992, Plant Mol. Biol. 19, 793-801(配列番号5及び配列番号6)を参照。CADア
ンチセンス転写物を作り出すトランスジェニックタバコは、CADのレベルが低下 しており、また一層容易に抽出できるリグニンを生成する。リグニンが容易に抽
出できる理由は、シリンジル対グアヤシルモノマーの比の上昇及びアルコール残
基に対するアルデヒドモノマーの取り込みの上昇のためであると見られる。Halp
in, C.ら、1994, The Plant Journal 6, 339-350を参照。従って、本発明の1態 様においては、フレームシフト、1以上のフレーム内終止コドンの導入、または プロモーターの中断によって、例えばアルファルファ、トウモロコシ、サトウモ
ロコシ及びダイズのような飼料作物のCAD遺伝子、及び例えばキマツ(Pinus echi
nata)、ダイオウショウ(Pinus palustris)、エリオットマツ(Pinus elliottii) 、テーダマツ(Pinus taeda)、ハンテンボク(Liriodendron tulipifera)及びポプ
ラ(Populus sp.)のような紙パルプ木のCAD遺伝子を中断する。
【００４８】 実施例5 脂肪種子の不飽和及び多価不飽和脂質の低減 アブラナ、ピーナッツ、ヒマワリ及びダイズのような脂肪種子からの植物油に
おける不飽和脂肪酸(例えばオレイン酸)及び多価不飽和脂肪酸(例えばリノール 酸及びリノレン酸)の存在により、長期間の貯蔵中に高温下で油が酸化される。 従って植物油は水素化されることが多い。しかし化学的水素化によってトランス
水素化が起こり、非天然の立体異性体が作り出され、これには健康上のリスクが
あると考えられている。
【００４９】 脂肪酸合成は、アシルキャリアータンパク質(ACP)上で不飽和脂肪酸が合成さ れ、水素対を取り除くデサチュラーゼの作用によって進行する。従って、脂肪種
子におけるこれらのデサチュラーゼ酵素の活性を阻害するのが望ましい。
【００５０】 オレイン酸合成における第1の酵素は、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ(EC1.
14.99.6)である。ベニバナやトウゴマのステアロイル-ACPデサチュラーゼはクロ
ーン化され、配列決定されている。Thompson, G.A.ら、1991, Proc. Natl. Acad
. Sci. 88, 2578-2582(配列番号7)、Shanklin, J.及びSomerville,C., 1991, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 88, 2510-2514(配列番号8)、Knutzon, D.S.ら、1991, Pl
ant Physiology 96, 344-345を参照。従って、本発明の1つの態様においては、 フレームシフト変異、1以上のフレーム内終止コドンの導入、またはプロモータ ーの中断によって、例えばダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ
及びアブラナのような脂肪種子作物のステアロイル-ACPデサチュラーゼ遺伝子を
中断する。
【００５１】 本発明により中断され得る第2の酵素は、リノール酸、ジエンをリノレン酸、 トリエンに変換する酵素であるω-3脂肪酸デサチュラーゼ(ω-3 FAD)である。Ar
abidopsis thalianaには2種のω-3 FADアイソザイムが存在し、当業者は他の多 くの植物におけるその存在を予測している。アイソザイムの1つは、プラスチド に特異的であり、種子の貯蔵油合成の関連アイソザイムである。もう1つのもの はミクロソーム特異的なものである。Arabidopsis thalianaプラスチドω-3 FAD
のクローニングは、Iba., K.ら、1993, J. Biol. Chem., 268, 24099-24105に報
告されている(配列番号9)。従って本発明のある態様においては、フレームシフ ト、フレーム内終止コドンの導入、またはプロモーターの中断によって、例えば
ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ及びアブラナのような脂肪
種子作物のプラスチドω-3 FAD遺伝子を中断する。
【００５２】 実施例6 同系交配系を可能にするS対立遺伝子の不活性化 自家受精を防ぐための機構を発達させた植物種がある。このような種、例えば
コムギ及びイネでは、複数の対立遺伝子を有するSと称する遺伝子座が存在する 。S対立遺伝子を発現する植物は同一のS対立遺伝子を発現する花粉による受精が
できない。Lee, H-K.ら、1994, Nature 367, 560-563、Murfett, J.ら、1994, N
ature 367, 563を参照。このS遺伝子座の産物はRNアーゼである。McClure, B.A.
ら、1989, Nature 342, 955-957を参照。S遺伝子座の産物は植物において必要不
可欠なものではない。従って本発明のある態様においては、フレームシフト、1 以上のフレーム内終止コドンの導入によってS遺伝子座の遺伝子を中断し、また はプロモーターを中断して植物の同系交配を可能にする。
【００５３】 実施例7 エチレン非感受性 エチレンは植物の成長及び発生に関与する気体状植物ホルモンである。エチレ
ンの作用の望ましくない一面は、果実、野菜の過熟、花卉の萎れであり、これは
腐敗やロスを生じる。Arabidopsis thalianaのエチレン受容体はクローン化され
、ETR-1と呼ばれている。Chang, C.ら、1993, Science 262, 539-544(配列番号1
0)参照。変異体Cys→Tyr65はエチレンに対する優勢な非感受性を生じる。Arabid
opsis thaliana変異体ETR-1を発現するトランスジェニックトマト植物もエチレ ンに対する非感受性を示し、Cys→Tyr65変異は多くの植物種におけるエチレンの
作用の優勢なサプレッサーであり得ることを示している。従って、本発明のこの
態様の一つの形態は、Cys→Tyr65変異をETR-1遺伝子に挿入して変異果実、野菜 あるいは花卉の寿命を延長することである。
【００５４】 この態様の別の形態においては、エチレン合成のための酵素、すなわち1-アミ
ノシクロプロパン-1-カルボン酸シンターゼ(ACCシンターゼ)及びACCオキシダー ゼをコードする遺伝子を中断することにより果実あるいは花卉の保存が達成され
得る。本発明のこの態様については、エチレン合成量を完全に除去して成熟を外
部からのエチレンにより生成させるか、あるいはエチレン生成をいくらか残し、
果実は自然に熟するが保存期間が延長されるようにすることができる。従って、
ACCシンターゼあるいはACCオキシダーゼ遺伝子のいずれかの1つの対立遺伝子を 中断することによりエチレン合成のレベルの有用な減少を得ることができると予
想される。あるいは、本発明は1つの対立遺伝子の中断とともに、非中断対立遺 伝子の活性の部分的な喪失をもたらす変異を導入することを提供するものである
。
【００５５】 Arabidopsis thaliana ACCシンターゼ及びACCオキシダーゼ遺伝子の配列はAbe
l., S.ら、1995, J. Biol. Chem. 270, 19093-19099(配列番号12)及びGomez-Lim
, M.A.ら、1993, Gene 134, 217-221(配列番号11)にそれぞれ報告されている。 これらの文献は引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【００５６】 実施例8 カナマイシン耐性の復帰突然変異 組換えDNA技術により植物の1つの種からの遺伝子と細菌遺伝子とを第2の植物 の種へ導入することが可能である。例えば、Kinney, A.J., 1996, Nature Biote
ch, 14, 946は月桂樹ACP-チオエステラーゼ遺伝子をナタネに導入し、ラウリン 酸含量の多い植物油を得ることを記載している。このようなトランスジェニック
植物は通常、抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン耐性を用いて構築され、
これはトランスジェニック植物に選択可能形質として同時に導入される。得られ
たトランスジェニック植物は抗生物質耐性遺伝子を発現し続け、これにより多量
の耐性生成物と食品及び／または環境に入り込む遺伝子を生じ得、このような導
入は環境あるいは健康上のリスクを与え得る。本発明のある態様は、フレームシ
フト、1以上のフレーム内終結コドンを導入することによるカナマイシン遺伝子 の中断、あるいはプロモーターの中断によりそのリスクを回避するものである。
【００５７】 実施例9 貯蔵タンパク質アミノ酸含量の修飾 種子及び塊茎は主要な貯蔵タンパク質の一群、例えばジャガイモにおけるパタ
チン、トウモロコシのゼイン等を含む。そのような貯蔵タンパク質のアミノ酸組
成は、作物によりヒト及び動物の必要にあまり合致していないことが多く、例え
ばトウモロコシはリシン及びメチオニンが不足し、ジャガイモはメチオニンが不
足している。従って本発明の1つの態様は、低い含量のアミノ酸の量を増加させ る食品作物の貯蔵タンパク質の変異である。パタチンは、Mignery, G.A.ら、198
8, Gene 62, 27-44に特性化されている多重遺伝子ファミリーによりコードされ ており、ゼインの構造はMarks, M.D.ら、1985, J. Biol. Chem. 260, 16451459 に報告されている。これらの文献は引用により本明細書の一部とする。あるいは
、メチオニンあるいはリシン特異的tRNAのアンチコドンをより一般的なアミノ酸
のものに変異させることができる。
【００５８】 実施例10 遺伝子の機能を決定するためのMDONの使用 組織特異的cDNAのクローニング及び配列決定のために現在利用可能な技術によ
り、当業者であれば多数の遺伝子の配列を容易に得ることができる。しかしこれ
らの遺伝子の機能を決定するための技術は比較的少ない。本発明の1つの態様に おいては、MDONは未知の機能のcDNAをコードする遺伝子にフレームシフトあるい
はストップコドンを導入するように設計される。これにより遺伝子の特異的な中
断が可能となる。そのような特異的な「ノックアウト」を有する植物を成長させ
、未知の遺伝子の機能を調べるためにノックアウトの効果を観察することができ
る。
【００５９】 4.8 本発明の繁殖可能植物 本発明は、隔離された選択可能な点突然変異を有する繁殖可能な植物を包含す
る。この隔離された選択可能な変異は稀な多形性ではなく、すなわち約10,000の
個体の集団中にも見られないであろうものである。本明細書において使用する点
突然変異は、6、好ましくは3を越えない連続したヌクレオチド、より好ましくは
1のヌクレオチドの置換、あるいは1〜5ヌクレオチド、好ましくは1または2のヌ クレオチドの欠失又は挿入である変異である。本発明において使用する隔離され
た変異とは、その他の変異のいずれとも遺伝的に密接に関連していない変異であ
り、100 kb、好ましくは40 kb、より好ましくは23 kbより大きい変異は密接に関
連していないものと考えられる。
【００６０】 バイオリスティック実施例 以下の実施例においては、Gelvin, S.B.ら、(eds) 1991, PLANT MOLECULAR BI
OLOGY MANUAL (KluwerAcad. Pub.)に記載の培地及び方法に従った。以下の手順 に従って金粒子をMDONにより被覆した。被覆のためにまず微細投射物を製造し、
直ちにキメラプラストで被覆した。微細投射物を製造するために、60 mgの金粒 子を1 mlの100%エタノール中に懸濁する(注4参照)。懸濁物を30秒のバーストで3
回超音波処理し、粒子を分散させる。12,000 x gで30秒遠心分離し、上清を捨て
る。1 mlの100%エタノールを加え、15秒間ボルテックス混合し、12,000 x gで5 分間遠心分離し、その後上清を捨てる。H2O中の洗浄された金粒子(直径1.0μm、
60 mg/ml)の懸濁物の25μlをゆっくりとボルテックス混合し、これに40μlのMDO
N(50μg/ml)、75μlの2.5M CaCl2、75μｌの0.1Mスペルミジンを順次を加える。
全ての溶液は氷冷する。完成した混合物をさらに10分間ボルテックス混合し、さ
らに10分間室温で粒子を沈殿させる。ぺレットを100%EtOH中で洗浄し、50μlの 無水エタノール中に再懸濁する。Biorad Biolisticガンを使用して、タンク圧11
00 psi、900 psiで破断する破断ディスクx2、粒子懸濁物容量5μlの設定でバイ オリティック送達を行う。
【００６１】 NT-1(タバコ)、双子葉植物細胞懸濁物: 500万個の細胞を含む直径約5 cmのNT-
1のローンを28℃で標準的培地上で3日間増殖させた。金粒子をALS-1またはALS-2
で被覆し、上記のようにショットした。前記細胞をさらに2.5日間培養し、懸濁 し、15〜50 ppbクロロスルフロン(GLEAMTM)を加えた固体培地に移した。耐性コ ロニーは7〜14日後に現れた。
【００６２】 使用したMDONの配列は下記の通りである(標的遺伝子と相同でないヌクレオチ ドは下線を付し太字で示す。小文字は2'-O-メチルリボヌクレオチドを示す。)。
【００６３】 ALS-1及びALS-2はPro197(CCA)コドンの2番目のヌクレオチドにおいてALS遺伝 子との単一塩基のミスマッチを有する。すなわち、ALS-1はCAAであり、ALS-2はC
TAである。ALS-1及びALS-2トランス突然変異された耐性細胞系の遺伝子のPCR増 幅と配列決定により、変異が標的コドン中にあり、それぞれThr(ACA)及びSer(TC
A)であることが判った。観察された変異は、コード鎖上での哺乳動物細胞におけ
るMDONの作用に基づいて予測される位置の1ヌクレオチド5'側、非コード鎖上の 予測される位置の1ヌクレオチド3'側にシフトしていた。全部で3個のALS-1及び5
個のALS-2のこれらの変異を有するトランス変異体が同定された。ALS-1 DNA処理
細胞からは耐性カルスは得られなかった。
【００６４】 クロロスルフロン耐性細胞を選択するために、細胞をボンバードされた各プレ
ートから、ボンバードの2日後に5mlの液体CSMを含む15 mlに移した。管を数回反
転させ、細胞塊を分散させた。その後15 ppbクロルスルフロンを含む固化させた
CSM培地(Dupont, Wilmington, DE)に細胞を移した。約3〜5週間後、活発に増殖 する細胞(盛り上がった明るい色のコロニー)を選択し、50 ppbクロルスルフロン
を含む固化CSMに移した。3〜4週間後、活発に増殖する細胞を選択し、200 ppbク
ロルスルフロンを含む固化CSMに移した。その後この処理で生存した細胞を分析 した。
【００６５】 培地 1. NT-1細胞懸濁培地(CSM): Murashige及びSkoog塩(Gibco BRL, Grand Island,
NY)、500 mg/l MES、1mg/l チアミン、100 mg/lミオイノシトール、180 mg/l KH
2PO4、2.21 mg/L 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)、30 g/l スクロース。1M
KOHまたはHClでpHを5.7に調整し、オートクレーブ滅菌する。固化培地とするた
めに8 g/lのAgar-agar (Sigma, St. Louis, MO)をオートクレーブ滅菌の前に加 える。 2. 移植培地(POM): 80% (v/v) CSM、0.3 Mマンニトール、プロトプラスト単離前
のNT-1細胞懸濁物の最初の遠心分離からの20% (v/v)の上清。
【００６６】 タバコ葉、双子葉植物: Nicotiana tabacum v. Samsun葉ディスクを、2種の遺伝
子、すなわちカナマイシン耐性の遺伝子及び緑色蛍光タンパク質(GFP, Chui, W.
, 1996, Current Biol. 6, 325-330)をコードする遺伝子の2種の変異体の1つを 含むnptll発現カセットを含むbin 19誘導プラスミドを有するAgrobacterium tum
efaciens LBA 4404で同時形質転換した。いずれの変異体GFP遺伝子もGFP産物を 生成しなかった。変異体は6番目のコドンにストップ（停止）コドンをもたらすG
→T置換あるいは同じ位置の1ヌクレオチドの欠失を有しており、これらをそれぞ
れG-ストップ及びG-Δと称する。MS 104選択培地での培養の後、葉を回収し、GF
P遺伝子の存在をノーザンブロットにより確認した。
【００６７】 GFPの最初の8コドンの配列 GFP ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG (配列番号15) G-ストップ ―――――――――――― T ―――――― (配列番号16) G-Δ ―――――――――――― AGG AGC TGT (配列番号17)
【００６８】 使用したMDONの配列は以下の通りである(G-ストップと相同でないヌクレオチ ドは下線を付し太字で示す。小文字は2'-O-メチルリボヌクレオチドを示す。)。
【００６９】 G-ストップ及びG-Δトランスジェニック植物の葉ディスクをMS 104選択培地上
でインキュベートし、上記のように2回の連続的な送達によりバイオリスティッ ク法によりG-1またはG-1を導入した。MDON導入の約10日後、G-ストップ及びG-Δ
葉ディスクの両者のG-1及びG-2で処理された培養物においてGFP様の蛍光を示す カルスが見られた。より大きくより速く増殖するカルス化片をスカルペルでさら
に分割し、緑色蛍光細胞が濃縮されたカルスを得た。蛍光性の表現型は約30日の
全観察期間中安定に維持された。G-1処理G-ストップ培養物中の緑色蛍光性細胞 の存在は、G-1はミスマッチヌクレオチドのもっぱら1塩基5'側で変異を起こさな
いことを示している。 緑色蛍光はIMT-2 Olympus顕微鏡で標準的なFITCフィルターセットを使用して 観察した。
【００７０】 エレクトロポレーション実施例 タバコ葉肉プロトプラストにおけるGFPの変換 植物材料 1. GFPの欠失変異体を有するタバコ植物形質転換体(デルタ6) 2. 葉は5〜6週齢のin vitroで成長した苗から得た。
【００７１】 プロトプラストの単離 1. Galloisら、1996, Electroporation of tobacco leaf protoplasts using pl
asmid DNA or total genomic DNA（プラスミドDNAまたは全ゲノムDNAを用いたタ
バコ葉プロトプラストのエレクトロポレーション）, Method in Molecular Biol
ogy, Vol. 55: Plant Cell Electroporation and Electrofusion Protocols Edi
ted by: J.A. Nickoloff Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.89-107の手順に 基本的に従った。
【００７２】 2. 酵素溶液: 1.2%セルラーゼR-10 "Onozuka" (Karlan, Santa Rosa, CA)、0.8%
マセロザイム R-10 (Karlan, Santa Rosa, CA)、90 g/l マンニトール、10 mM M
ES、フィルター滅菌し、10 mlアリコートとして-20℃で貯蔵。 3. 葉は中葉脈から1〜2 mmごとに切り出した。これらを背軸側を下に100 x 20 m
mペトリプレート中の10 mlの酵素溶液に接触させて置いた。合計1 gの葉を各プ レートに置いた。 4. プレートを暗所で25℃において16時間インキュベートした。 5. 消化した葉材料をピペットで取り、100μmナイロンスクリーンクロス(Small
Parts, Inc., Miami Lakes, FL)を通した。濾液を遠心管に移し、1000 rpmで10 分間遠心分離した。この手順における遠心分離はいずれもこの条件で行った。
【００７３】 6. プロトプラストは最上部のバンドに集まった。その後プロトプラストのバン ドを清浄な遠心管に移し、10 mlの洗浄液(0.4 Mスクロース及び80 mM KCl)を加 えた。プロトプラストを穏やかに再懸濁し、その後遠心分離した。 7. ステップ6を2回繰り返した。 8. 最後の洗浄の後、少量のアリコートを血球計上にたらしてプロトプラスト密 度を測定した。プロトプラストをエレクトロポレーションバッファー(80 mM KCl
、4 mM CaCl2、2 mM リン酸カリウム、pH 7.2、8%マンニトール)中に1 x 106プ ロトプラスト/mlの密度で再懸濁し、オートクレーブにかけた。プロトプラスト を8℃で2時間インキュベートした。
【００７４】 9. 2時間後、0.3 ml(3 x 105プロトプラスト)を各0.4 cmキュベットに移し、そ の後氷上に置いた。GFP-2 (0.6〜4μg/ml)を、エレクトロポレーションを行わな
い対照を除いて各キュベットに加えた。プロトプラストをエレクトロポレーショ
ンにかけた(250 V、キャパシタンス250μF及び時間定数10〜14 ms)。 10. プロトプラストを氷上で10分間回復させ、その後ペトリプレート(100 x 20
mm)に移した。35分後、上記POMの10 mlを各プレートに加えた。プレートを25℃ の暗所に移して24時間置いた後、明所に移した。 11. プロトプラスト培養物を上記Calloisに従って維持した。
【００７５】 蛍光顕微鏡観察 1. UV光下、3 x 105個のプロトプラスト中、8個のGFP変換プロトプラストが観察
された。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 クマー，ラメッシュ アメリカ合衆国 08534 ニュージャージ ー州，ペニントン，ヤード ロード 60 (72)発明者 メイ，グレゴリー，ディー. アメリカ合衆国 14850 ニューヨーク州, イサカ，ザ パークウェイ 303 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA08 CB02 CD03 CD06 CD10 CD12 CD13 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 CA09 CA11 DA01 DA05 EA04 GA14 GA21 GA25 4B065 AA11X AA88Y AA89X AB01 BA03 CA53

Claims (72)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物細胞の標的遺伝子に局在性突然変異を導入する方法であ
    って、 a. 標的遺伝子の第１断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する 第１相同領域および標的遺伝子の第２断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の
    配列を有する第２相同領域と、標的遺伝子に対して異種のヌクレオ塩基を少なく
    とも１個含みかつ第１相同領域と第２相同領域を連結している介在領域を含む組
    換え原性オリゴヌクレオ塩基を粒子に付着させ、 b. 該粒子を植物細胞集団の細胞に導入し、 c. 標的遺伝子の第１断片と第２断片間の位置に突然変異を有する該集団の細 胞を同定する、 各ステップを含む上記方法。
  2. 【請求項２】 組換え原性オリゴヌクレオ塩基がMDONであり、相同領域のそ れぞれが少なくとも６個のRNA型ヌクレオチドからなるRNAセグメントを含む、請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 介在領域の長さが少なくとも３ヌクレオチドである、請求項 ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 同定した細胞を培養して植物体を作出させるステップをさら に含む、請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 第１RNAセグメントが少なくとも８個の連続した2'-置換リボ ヌクレオチドを含む、請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】 第２RNAセグメントが少なくとも８個の連続した2'-置換リボ ヌクレオチドを含む、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 突然変異を起こした標的遺伝子の配列がMDONの配列と相同で ある、請求項２記載の方法。
  8. 【請求項８】 付着ステップを、1.1〜1.4M NaClおよび18〜22μM スペルミ ジンおよび少なくとも14μg/mlのMDONを含有する溶液中で行う、請求項２記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 標的遺伝子が第１ALS遺伝子、第２ALS遺伝子、psbA遺伝子、 トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子、ま
    たはS14/rp59遺伝子である、請求項２記載の方法。
  10. 【請求項１０】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの細 胞である、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 の細胞である、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 標的遺伝子が酸性インベルターゼ、UDP-グルコースピロホ スホリラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、シ
    ンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、etr-1またはその相同体、ACCシンターゼ
    およびACCオキシダーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項 ２記載の方法。
  13. 【請求項１３】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタス植物 に由来する、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 植物に由来する、請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記植物またはその後代から種子を作ることをさらに含む 、請求項２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 細胞壁をもつ植物細胞の標的遺伝子に局在性突然変異を導 入する方法であって、 a. 植物細胞集団の細胞の細胞壁に穴をあけ、 b. 標的遺伝子の第１断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する 第１相同領域および標的遺伝子の第２断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の
    配列を有する第２相同領域と、標的遺伝子に対して異種のヌクレオ塩基を少なく
    とも１個含みかつ第１相同領域と第２相同領域を連結している介在領域を含む組
    換え原性オリゴヌクレオ塩基を導入し、 c. 標的遺伝子の第１断片と第２断片間の位置に突然変異を有する該集団の細 胞を同定する、 各ステップを含む上記方法。
  17. 【請求項１７】 組換え原性オリゴヌクレオ塩基がMDONであり、相同領域の それぞれが少なくとも６個のRNA型ヌクレオチドからなるRNAセグメントを含む、
    請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 同定した細胞を培養して植物体を作出させるステップをさ らに含む、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 第１断片と第２断片の間の標的遺伝子の配列がミスマッチ ヌクレオチドでMDONの介在領域の配列と相違しており、標的遺伝子の突然変異が
    ミスマッチヌクレオチドの隣に位置している、請求項１７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 第１断片と第２断片の間の標的遺伝子の配列がミスマッチ ヌクレオチドでMDONのミューテーターセグメントの配列と相違しており、標的遺
    伝子の突然変異がミスマッチヌクレオチドの隣に位置している、請求項１７記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 標的遺伝子が第１ALS遺伝子、第２ALS遺伝子、psbA遺伝子 、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子、
    またはS14/rp59遺伝子である、請求項１７記載の方法。
  22. 【請求項２２】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの細 胞である、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 の細胞である、請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 標的遺伝子が酸性インベルターゼ、UDP-グルコースピロホ スホリラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、シ
    ンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、etr-1またはその相同体、ACCシンターゼ
    およびACCオキシダーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項 １７記載の方法。
  25. 【請求項２５】 標的遺伝子がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタス植 物からの遺伝子である、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 標的遺伝子がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは 綿植物からの遺伝子である、請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記植物またはその後代から種子を作ることをさらに含む 、請求項１７記載の方法。
  28. 【請求項２８】 植物細胞の色素体の標的遺伝子に局在性突然変異を導入す る方法であって、 a. 標的遺伝子の第１断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する 第１相同領域および標的遺伝子の第２断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の
    配列を有する第２相同領域と、標的遺伝子に対して異種のヌクレオ塩基を少なく
    とも１個含みかつ第１相同領域と第２相同領域を連結している介在領域を含む組
    換え原性オリゴヌクレオ塩基を導入し、 b. 標的遺伝子の第１断片と第２断片間の領域に突然変異を有する細胞を同定 する、 各ステップを含む上記方法。
  29. 【請求項２９】 組換え原性オリゴヌクレオ塩基がMDONであり、相同領域の それぞれが少なくとも６個のRNA型ヌクレオチドからなるRNAセグメントを含む、
    請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 同定した細胞を培養して植物体を作出させるステップをさ らに含む、請求項１７記載の方法。
  31. 【請求項３１】 植物細胞の標的遺伝子に局在性の選択不可能な突然変異を 導入する方法であって、 a. 細胞集団の細胞に第１の組換え原性オリゴヌクレオ塩基と第２の組換え原 性オリゴヌクレオ塩基の混合物を導入し、ここで、 i. 第１の組換え原性オリゴヌクレオ塩基は、第１標的遺伝子の第１断片の 少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第１相同領域および第１標的遺
    伝子の第２断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第２相同領域
    と、標的遺伝子に対して異種のヌクレオ塩基を少なくとも１個含みかつ第１相同
    領域と第２相同領域を連結している介在領域を含むものであり、そして ii. 第２の組換え原性オリゴヌクレオ塩基は、第２標的遺伝子の第１断片の
    少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第１相同領域および第２標的遺
    伝子の第２断片の少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第２相同領域
    と、標的遺伝子に対して異種のヌクレオ塩基を少なくとも１個含みかつ第１相同
    領域と第２相同領域を連結している介在領域を含むものであり、 b. 第１標的遺伝子の第１断片と第２断片間の位置に選択可能な突然変異を有 する該集団の細胞を該集団から選択し、 c. 第２標的遺伝子の第１断片と第２断片間の位置に選択不可能な突然変異を 有する選択された細胞を同定する、 各ステップを含む上記方法。
  32. 【請求項３２】 それぞれの組換え原性オリゴヌクレオ塩基がMDONであり、 相同領域のそれぞれが少なくとも６個のRNA型ヌクレオチドからなるRNAセグメン
    トを含む、請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 第１標的遺伝子が第１ALS遺伝子、第２ALS遺伝子、psbA遺 伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝
    子、またはS14/rp59遺伝子である、請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの細 胞である、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 の細胞である、請求項３３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 第２標的遺伝子が酸性インベルターゼ、UDP-グルコースピ ロホスホリラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ
    、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、etr-1またはその相同体、ACCシンタ
    ーゼおよびACCオキシダーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される、請 求項３２記載の方法。
  37. 【請求項３７】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの細 胞である、請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 の細胞である、請求項３６記載の方法。
  39. 【請求項３９】 同定した細胞を培養して植物体を作出させるステップをさ らに含む、請求項３２記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記植物またはその後代から種子を作ることをさらに含む 、請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 第２の組換え原性オリゴヌクレオ塩基がヘテロ二本鎖の組 換え原性オリゴヌクレオ塩基であり、第２の組換え原性オリゴヌクレオ塩基の相
    同領域のそれぞれが少なくとも６個のRNA型ヌクレオチドからなるRNAセグメント
    を含む、請求項３１記載の方法。
  42. 【請求項４２】 第１標的遺伝子が第１ALS遺伝子、第２ALS遺伝子、psbA遺 伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝
    子、またはS14/rp59遺伝子である、請求項４１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの細 胞である、請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 の細胞である、請求項４２記載の方法。
  45. 【請求項４５】 第２標的遺伝子が酸性インベルターゼ、UDP-グルコースピ ロホスホリラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ
    、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、etr-1またはその相同体、ACCシンタ
    ーゼおよびACCオキシダーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される、請 求項４１記載の方法。
  46. 【請求項４６】 植物細胞がトウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの細 胞である、請求項３６または４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 植物細胞がジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿 の細胞である、請求項３６または４５記載の方法。
  48. 【請求項４８】 同定した細胞を培養して植物体を作出させるステップをさ らに含む、請求項４１記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記植物またはその後代から種子を作ることをさらに含む 、請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 植物細胞の標的遺伝子に局在性突然変異を導入する方法で あって、 a. 植物の一部をセルラーゼで消化して植物細胞のプロトプラストを形成させ 、 b. 該プロトプラストを、標的遺伝子の第１断片の少なくとも６塩基対の配列 と同一の配列を有する第１相同領域および標的遺伝子の第２断片の少なくとも６
    塩基対の配列と同一の配列を有する第２相同領域と、標的遺伝子に対して異種の
    ヌクレオ塩基を少なくとも１個含みかつ第１相同領域と第２相同領域を連結して
    いる介在領域を含む組換え原性オリゴヌクレオ塩基を含む溶液中に浮遊させ、 c. 該浮游液をエレクトロポレーションにかけて、組換え原性オリゴヌクレオ 塩基を該浮游液のプロトプラストに導入し、 d. 該プロトプラストを培養し、 e. 標的遺伝子の第１断片と第２断片間の位置に突然変異を有する該プロトプ ラストの後代を同定する、 各ステップを含む上記方法。
  51. 【請求項５１】 同定した後代を培養して植物体を作出させるステップをさ らに含む、請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 組換え原性オリゴヌクレオ塩基がMDONであり、相同領域の それぞれが少なくとも６個のRNA型ヌクレオチドからなるRNAセグメントを含む、
    請求項５０記載の方法。
  53. 【請求項５３】 組換え原性オリゴヌクレオ塩基がヘテロ二本鎖の組換え原 性オリゴヌクレオ塩基である、請求項５０記載の方法。
  54. 【請求項５４】 酸性インベルターゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ 、ポリフェノールオキシダーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、シンナミルアル
    コールデヒドロゲナーゼ、ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ、またはetr-1 もしくはその相同体をコードする遺伝子からなる群より選択される野生型遺伝子
    位置にある遺伝子中に点突然変異を有する植物または種子であって、該突然変異
    の23KB以内のゲノムDNAの配列が野生型DNAの配列であり、該点突然変異が停止コ
    ドンを形成するかまたはフレームシフト突然変異である、上記植物または種子。
  55. 【請求項５５】 点突然変異が停止コドンを形成する、請求項５４記載の植 物または種子。
  56. 【請求項５６】 選択可能な突然変異の40KB以内のゲノムDNAの配列が野生型
    DNAの配列である、請求項５５記載の植物または種子。
  57. 【請求項５７】 選択可能な突然変異の100KB以内のゲノムDNAの配列が野生 型DNAの配列である、請求項５５記載の植物または種子。
  58. 【請求項５８】 点突然変異が単一塩基対の変異である、請求項５５記載の 植物または種子。
  59. 【請求項５９】 トウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの植物または種 子である、請求項５５記載の植物または種子。
  60. 【請求項６０】 ジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿の植物また は種子である、請求項５５記載の植物または種子。
  61. 【請求項６１】 第２の遺伝子中に選択可能な点突然変異をさらに有し、選 択可能な点突然変異の23KB以内のゲノムDNAの配列が野生型DNAの配列である、請
    求項５５記載の植物または種子。
  62. 【請求項６２】 選択可能な突然変異の40KB以内のゲノムDNAの配列が野生型
    DNAの配列である、請求項６１記載の植物または種子。
  63. 【請求項６３】 選択可能な突然変異の100KB以内のゲノムDNAの配列が野生 型DNAの配列である、請求項６１記載の植物または種子。
  64. 【請求項６４】 点突然変異がフレームシフト突然変異である、請求項５４ 記載の植物または種子。
  65. 【請求項６５】 選択可能な突然変異の40KB以内のゲノムDNAの配列が野生型
    DNAの配列である、請求項６４記載の植物または種子。
  66. 【請求項６６】 選択可能な突然変異の100KB以内のゲノムDNAの配列が野生 型DNAの配列である、請求項６４記載の植物または種子。
  67. 【請求項６７】 点突然変異が単一塩基対の変異である、請求項６４記載の 植物または種子。
  68. 【請求項６８】 トウモロコシ、コムギ、イネまたはレタスの植物または種 子である、請求項６４記載の植物または種子。
  69. 【請求項６９】 ジャガイモ、トマト、カノラ、ダイズまたは綿の植物また は種子である、請求項６４記載の植物または種子。
  70. 【請求項７０】 第２の遺伝子中に選択可能な点突然変異をさらに有し、選 択可能な点突然変異の23KB以内のゲノムDNAの配列が野生型DNAの配列である、請
    求項６４記載の植物または種子。
  71. 【請求項７１】 選択可能な突然変異の40KB以内のゲノムDNAの配列が野生型
    DNAの配列である、請求項７０記載の植物または種子。
  72. 【請求項７２】 選択可能な突然変異の100KB以内のゲノムDNAの配列が野生 型DNAの配列である、請求項７０記載の植物または種子。
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